CN102634539A - 一种将抗根结线虫的rna干扰基因导入黄瓜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法”，涉及黄瓜转基因技术。其特征在于：在转化过程中，利用含有外源基因载体pCAGC1341-dsMiMpkl，在农杆菌悬液中和共培养培养基中均添加硫辛酸100mg/L和乙酰丁香酮50mg/L以提高农杆菌转化效率，此外本发明还采用了潮霉素梯度筛选的方法以及相应的培养基方案，进一步提高了获得黄瓜阳性转化体的效率。

Description

一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法

技术领域

本发明涉及黄瓜转基因技术，特别是一种获得表达干扰线虫MiMpkl基因的RNA干扰片段的黄瓜转基因方法。 

背景技术

近些年随着保护地栽培大面积推广，加之重茬严重，根结线虫对黄瓜生产的危害日趋严峻。而现有资源中缺乏抗南方根结线虫的种质资源，目前利用传统育种手段尚无法解决此问题，因此需通过转基因技术引入新的抗原，拓宽栽培黄瓜的遗传基础。在专利号为：ZL200810118726.X，名称为：“一种RNA干扰载体及其应用”的专利中公开了以南方根结线虫的MiMpkl基因为靶标构建的MiMpkl RNA干扰载体，并将该载体转入蕃茄中，使蕃茄获得了较好的对线虫的抗性，体外饲喂实验也证明该RNA干扰载体能够有效干预线虫体内的一个信号转导酶MARK蛋白的合成，阻碍线虫的生长和发育，从而达到防治线虫的目的。可以预知，将载有该基因的RNA干扰载体转入黄瓜中获得抗线虫的转基因黄瓜品系，将是一种缓解目前黄瓜受线虫危害的有效方法，但是为顺利实现此目的，须借助高效的转基因体系。虽然在蕃茄，大豆等作物上，都有转基因转化率高的报道，同时未有报道将干扰载体转化于黄瓜中，通过沉默线虫自身基因达到防治线虫的目的。 

黄瓜的遗传转化研究始于1986年，但在黄瓜抗线虫的遗传转化方面的研究仍然很少，于玉梅(2008)从被根结线虫侵染的黄瓜根系cDNA中扩增出根结线虫的保守基因16D10，构建植物表达载体，通过花粉管通道法将16D10转入黄瓜，得到的抗性苗经PCR检测，1株扩增出特异条带。朱妍妍(2008)采用相同的方法扩增得到基因16D10，构建了抗根结线虫的RNAi植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法和花粉管通道法转化黄瓜，但最终未得到转基因植株。魏爱民等(2006)用农杆菌介导法将抗虫基因eqkam导入黄瓜，仅对抗虫基因转化黄瓜的影响因素进行了研究说明，未说明是否获得再生植株，后其又采用花粉管通道法将抗虫基因eqkam转化黄瓜，经卡那霉素抗性筛选，获得了再生植株，但转化率仅为0.14％。 

在植物遗传转化研究中，常通过使用乙酰丁香酮(AS)来辅助农杆菌转化，因为AS是一种酚类物质，可诱导农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上的Vir区基因的活化和表达，促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移，从而提高转化效率。AS尤其对单子叶植物的遗传转化非常必要，而双子叶植物由于在外植体受伤后会自行合成酚类物质，因此不必外加酚类物质就可以使Vir区基因活化，但实验证明加入适量AS依然可以提高转化率。AS被广泛应用于目前的 植物转基因技术中，在黄瓜的遗传转化中利用AS辅助转化的报道也较多，将100mg/LAS添加到共培养培养基中，再生频率高达83.3％，但对转化效率的影响并不大，有待进一步改进。因此随着对双子叶植物转基因研究的深入和技术的改进，迫切需要开发辅助转化效果更明显、对外植体伤害更小的试剂。以往的研究曾发现抗氧化剂对促进植物外植体分化、缓解褐化有较好的作用，近些年硫辛酸(lipoic acid，下文简写为LA)作为一种超强型抗氧化剂被运用到植物组织培养研究中，并获得了较好的试验效果。而目前LA也被应用到大豆和番茄的遗传转化研究中，结果显示转化效率分别从0.6％和29.8％显著增加到3.7％和87％，并可显著降低大豆和番茄的假阳性率；小麦的转化率从2.8％提高到5.7％；在棉花上，可以使草甘膦抗性芽率由41.4％增长到61.2％。而目前在黄瓜的遗传转化中利用AS辅助转化的报道较多，将100mg/L AS添加到共培养培养基中，再生频率高达83.3％。 

发明内容

本发明根据上述领域的需求和空白，提供一种改进的黄瓜遗传转化体系，使黄瓜的遗传转化率显著提高，高效地获得了能够表达干扰线虫MiMpkl基因的转基因黄瓜，该遗传转化体系能减少在遗传转化筛选过程中所耗费的时间和人力成本，提高遗传转化的工作效率。同时，通过黄瓜表达MiMpkl基因，可有效的沉默根结线虫的MiMpkl基因，影响其正常发育，减少对黄瓜的危害。本发明的方案如下： 

一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法，包括以下步骤： 

(1)预培养黄瓜外植体子叶或子叶节； 

(2)准备用于浸染的含有外源基因载体的农杆菌液； 

(3)将所述外植体置于所述农杆菌悬液中浸染15～20mins； 

(4)浸染后的外植体接种于共培养培养基中，25℃黑暗条件下培养2～3d； 

(5)共培养后的外植体置于初步选择培养基中初步筛选2～3周，筛选抗生素为潮霉素； 

(6)初步筛选出的外植体转入到再次选择培养基中再次筛选1周，筛选抗生素为潮霉素； 

(7)再次筛选出的保持绿色的外植体接种到添加0.5mg/L GA的BPM培养基中伸长培养； 

(8)生根培养获得再生植株； 

其特征在于：所述含有外源基因载体为pCAGC1341-dsMiMpkl，(2)中的农杆菌悬液中和共培养培养基中含有硫辛酸50～100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。 

所述外植体为子叶，所共培养培养基为：MS+2.0mg/L BA+1.0mg/L ABA+50～100mg/L LA+50mg/L AS pH＝5.4。 

所述外植体为子叶节，所共培养培养基为：MS+0.5mg/L BA+2.0mg/L AgNO₃+50～ 100mg/L LA+50mg/l AS pH＝5.4。 

所述外植体为子叶，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为10mg/L，25mg/L。 

所述外植体为子叶节，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为7mg/L，15mg/L。 

所述外植体为子叶，所述初步选择培养基为：MS+2.0mg/L BA+1.0mg/L ABA+10mg/L Hyg+400mg/L cef，pH＝5.4，再次选择培养基为：MS+25mg/L Hyg+400mg/L cef pH＝5.4。 

所述外植体为子叶节，所述初步选择培养基为：MS+0.5mg/L BA+2.0mg/L AgNO3+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH＝5.4，再次选择培养基为：MS+15mg/L Hyg+400mg/l cef pH＝5.4。 

所述(1)中，所述预培养指：外植体为子叶，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中生长1～2天后，切除胚根，子叶部分十字对切成4块，获得子叶外植体；或所述外植体为子叶节，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中，种子萌发后转入光下培养4～5天，当子叶呈直立状态时切取，去除1/2子叶仅留2mm的下胚轴，并在预培养基PM上培养2天得到子叶节外植体。 

本发明为了获得抗线虫转基因黄瓜，以专利号为：ZL200810118726.X，名称为：“一种RNA干扰载体及其应用”中公开的RNA干扰载体pCAGC1341-dsMiMpkl为外源基因载体转化黄瓜，希望获得抗线虫的转基因黄瓜品种。鉴于目前报道的黄瓜遗传转化方法不够高效难以获得转基因再生植株的现状，发明人对于现有的黄瓜转基因方法进行了改进。在外源基因载体转化到外植体的阶段，本发明在浸染菌液与共培养培养基中都加硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS)，显著提高了获得转化效率，转化效率(％)＝PCR或southern blot检测为的阳性植株数/再生植株总数×100％。 

本发明的实验数据表明，在适当浓度的如50～100mg/L LA搭配适当浓度的如50mg/L AS的情况下，二者共同作用于农杆菌转化时，抗性芽率相比对照或者单独使用LA或AS时都有显著提高，且Southern-blot检验下的转化效率也有所增长，证明LA与AS协同作用更有利于黄瓜的遗传转化，其中LA可缓解自由基对细胞的伤害、减缓组织的氧化过程，而AS促进Vir区基因的活化，两者共同作用下使转化率得以提高。但是，本发明的实验数据同时也表明，LA与AS之间的合作协调作用仅限于非常小的浓度范围内，超过某些阈值，可能二者之间的作用存在相互拮抗，因为在一些情况下，如表3和表4所示，搭配使用的结果出人意料地比单独使用AS或LA都低。 

本发明还提供了含有AS和LA的共培养培养基的配方，以使本发明的遗传转化体系得到整体上的优化和改进。 

本发明还研究了在对转化体初步筛选及再次筛选中，采用潮霉素进行筛选的方案，现有技术中一般都采用从一而终的高浓度潮霉素筛选抗性转化体。本发明的研究发现，采用梯度 筛选即先低浓度后高浓度的潮霉素对初步转化体进行选择，与对照相比，能够显著降低假阳性率，提高获得阳性再生植株的比例。本研究中发现，不同的外植体对于潮霉素的耐受力不相同，因此，不同的外植体采用不同的梯度设置，如以子叶为外植体时，潮霉素筛选梯度为10mg/L，25mg/L。如以子叶节为外植体时，潮霉素筛选梯度为7mg/L，15mg/L。 

附图说明

图1黄瓜子叶节的遗传转化过程 

1：预培养；2：选择培养；3：抗性植株；4：对照。 

图2不同选择压对子叶节遗传转化的影响 

每组柱形图从左到右依次为对照、15mg/L Hyg筛选、梯度Hyg筛选。 

图3黄瓜抗性植株的PCR检测 

图4黄瓜抗性植株的southern blot检测 

图5黄瓜MiMPKl转化植株的根结线虫田间接种试验 

1对照；2黄瓜转化植株 

图6黄瓜转基因植株田间接种根结线虫鉴定结果 

纵坐标表示平均根结数(根结数/株) 

图7不同LA/AS处理对黄瓜子叶节再生频率的影响 

左纵坐标表示再生频率(％)，右纵坐标表示再生芽数/外植体(个) 

图8PCR验证黄瓜子叶节再生植株转化效率 

具体实施方式

以下通过实验具体描述本发明的技术方案，但以下实验不应被解释为对本发明的限制。 

试验材料： 

本试验所用的试验材料是新泰密刺黄瓜，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜育种课题组提供。 

根癌农杆菌菌株为EHA105。质粒载体为pCAGC1341-dsMiMpkl，含有潮霉素抗性基因和线虫基因MiMPKl，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所植物病理实验室惠赠。 

以上生物材料，本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。 

其它试剂：MS基本培养基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS)购自Sigma(上海)生物技术公司，6-BA、ABA、IAA、AgNO3、头孢霉素(Cef)、卡纳霉素(Km)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白胨均购自北京拜尔迪生物技术公司。 

所配制的MS固体(液体)培养基和LB固体(液体)培养基高压灭菌后常温保存备用；试验所需试剂配制为母液后用一次性过滤器(0.22um)过滤除菌，-20℃保存备用，培养基配方如表1所示。 

表1本发明最终确定的黄瓜遗传转化用优化培养基 

实验方法： 

实施例1.黄瓜遗传转化方法的建立 

1.1外植体准备 

饱满的黄瓜种子预浸泡2-3h，剥除种皮后用75％酒精消毒约30s，而后6.5％的次氯酸钠消毒15mins，消毒期间需经常摇动，最后用灭菌的去离子水反复冲洗5次，将种子接种在MS培养基上，置于黑暗中培养。种子在培养基中生长1～2d后，切除胚根，子叶部分十字 对切成4块，以获得子叶外植体。子叶节做受体时要待种子萌发后转入光下培养4～5d，当子叶呈直立状态时切取，去除1/2子叶仅留2mm的下胚轴，并在预培养基PM上培养2d待用。 

1.2菌液准备 

取出含有目的基因载体pCAGC1341-dsMiMpkl的农杆菌单菌落EHA105，接种于含有50mg/L Rif和50mg/L Kan的LB液体培养基中进行摇菌，250rpm，28℃过夜，分时段检测菌液浓度，当OD＝0.6～0.8时收集菌液，10000rpm，离心8-10min，弃去上清液，用等体积MS液体培养基重悬菌体，再离心，重复以上步骤得农杆菌悬浊液备用。 

1.3遗传转化和再生植株驯化 

1)收集新鲜切好的黄瓜子叶外植体或在预培养基PM上培养2d的子叶节外植体，于农杆菌悬浊液中侵染15～20mins。 

2)外植体从菌液中取出后用无菌滤纸吸干表面残留菌液，接种于不同的共培养培养基，25℃黑暗条件下培养2～3d。 

3)共培养后，将子叶和子叶节分别转接到选择培养基中进行初步筛选，本发明的优化方案中Hyg的浓度分别为7mg/l，10mg/l。 

4)子叶经过约3周而子叶节经过约2周的初步筛选，便转入高浓度抗生素选择培养基进行再次筛选，本发明的优化方案中，Hyg浓度分别提高到15和25mg/l。 

5)经高浓度Hyg筛选1周，利用添加0.5mg/l GA的BPM培养基对保持绿色的再生抗性芽进行伸长培养。 

6)伸长培养2周后的再生抗性芽可进行生根培养，2～3周后能获得生长正常的黄瓜再生植株。 

相同培养条件下经农杆菌侵染但未使用Hyg筛选的黄瓜再生植株为对照。培养条件为16小时光照/8小时黑暗，培养温度25±1℃。 

发育正常的黄瓜再生植株首先进行瓶中驯化，经3-5d可将培养瓶的封口膜逐步去掉，以降低瓶中的湿度。然后将根系间的培养基清洗干净，移植到花盆中时，需要在植株上扣一个玻璃器皿保湿，不至湿度降低过快。1周后移走覆盖器皿，黄瓜再生植株便可在温室条件下生长。 

1.4转化植株的检测 

PCR检测：以获得的黄瓜转化植株和阴性对照植株的总DNA为模板，根据MiMpkl基因设计PCR扩增引物，上游引物序列为5′-TGGAGAAGGTGCTTATGGAATG-3′，下游引物序列为：5′-CATAATTTCAGGCGCTCGATAC-3′，由上海生工公司合成，预扩增片段大小为 525bp；反应程序为：94℃4min；94℃30s，53℃30s，72℃2min，32次循环；72℃10min。PCR扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶成像仪观察扩增出的目的条带，并拍照。 

Southern blot检测：实验步骤按照Sambroook等的方法。用EcoRI酶切约15-20μg的黄瓜基因组DNA，37℃温浴过夜，在浓度为1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，用20×SSC转膜，于120℃下固定20min，杂交过夜，利用Roche地高辛标记试剂盒标记含目的片段的质粒DNA的PCR产物作为探针进行杂交，最后洗膜、显色和定影。 

转基因植株的抗虫性鉴定：采用田间接种寄生根结线虫活体的方法进行鉴定。每株黄瓜接种约100条新孵化的寄生根结线虫，接种在距离黄瓜植株茎部约3cm的土壤中，共接种12个株系，每株系8株，共计96株，其中包括2个阴性对照株系，共16株。种植黄瓜用的营养钵底部套有不漏水的塑料杯，每次浇水后将营养钵中渗出的多余水分重新倒回营养钵中，避免根结线虫的流失。接种50d后计数每株黄瓜植株根部的线虫结节数量，参比阴性对照，并拍照。 

1.5数据调查与统计分析 

再生频率(％)＝分化外植体数/接种外植体总数×100％ 

每外植体抗性芽数(个/外植体)＝抗性芽数/外植体总数 

转化效率(％)＝PCR或southern blot阳性植株数/再生植总数×100％ 

根结线虫结节数(个/株)＝∑每株根结线虫结节数/总植株数 

根结节数相对降低率(％)＝(每株根结节数-对照根结节数)/对照根结节数×100％ 

试验数据采用Duncan新复级差法进行显著性差异分析。 

实施例2潮霉素对于转化体筛选的影响实验 

转化方法同实施例1的1.1～1.5，其中步骤(5)(6)中潮霉素采用方案为：外植体为子叶时潮霉素浓度分别10mg/L，25mg/L。外植体为子叶节时：潮霉素浓度分别7mg/L，15mg/L 

2.1黄瓜再生植株的获得 

子叶外植体在初步选择培养基中经过约3周的培养便可以发育出小芽点。在转入高浓度抗生素培养基筛选后，一些假阳性的再生芽会变黄并止生长。经过1个月的梯度选择后，可以得到始终保持绿色的再生芽。将再生芽转入伸长培养基，培养2-3周后发育正常的再生芽将会成长为发育完全的小植株，并分化出极少量根。最后，将再生植株转入生根培养基。在子叶的再生过程中，丛生芽点多但是较难伸长，需要进行长时间的诱导。 

子叶节在低浓度抗生素筛选2周后可肉眼见到发育出的小芽点，转入高浓度筛选培养基 1周后，便可以获得发育较完全的再生芽。将持续保持绿色的再生芽切离外植体后转入伸长培养基，培养1-2周后茎会伸长，基部也会分化出少量根系，基本可以直接转入MS培养基驯化，且不必进行生根培养。与子叶诱导再生过程相比子叶节的再生周期较短，且茎的伸长和生根都较容易。图1为黄瓜子叶节的遗传转化过程。 

2.2Hyg梯度选择对子叶和子叶节的阳性再生植株的筛选效果 

黄瓜子叶外植体在10mg/l的Hyg选择浓度下经3周的初步筛选，再生频率高达76.5％，大量属于伸长困难的丛生芽；将再生芽转入25mg/l Hyg培养基中继续选择，部分假阳性的再生芽开始黄化；最后仍保持绿色的抗性芽率降低到8.8％。对抗性植株进行PCR和Southern-blot检测的阳性率分别为27.8％和13.9％，而对照未进行Hyg筛选，阳性率仅为22.4％和4.1％。黄瓜子叶节外植体在7mg/l Hyg选择压力下经过2周的初步筛选，再生率可以达到51.8％，分化出的再生芽基本保持深绿色，且生长健壮，发育停滞的很少；后经15mg/l的高选择压后，一些再生芽会迅速变黄或停止发育，甚至白化；最终的抗性芽率仅为29.6％，抗性植株的PCR和Southern-blot阳性率分别为19.3％和6.9％，同样高于未进行Hyg筛选的子叶节对照。表2数据说明适当的Hyg选择梯度可以降低假阳性率。 

表2不同选择压对黄瓜抗性芽率的影响 

通过SAS软件对数据进行分析也发现，以子叶为外植体通过Hyg梯度筛选获得的抗性植株的PCR阳性率比不使用Hyg选择的对照有显著提高，而Southern-blot阳性率比对照的提高程度更达到了极显著水平。在子叶节试验中得到类似的结果，通过Hyg梯度选择获得抗性植 株的Southern-blot阳性率极显著高于不使用Hyg选择的对照。筛选结果的统计分析证明，提高抗生素浓度可有效剔除子叶和子叶节分化出的部分假阳性非转化植株，以降低黄瓜遗传转化的假阳性率。 

2.3Hyg梯度选择对黄瓜子叶节再生过程的影响 

在农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化研究中，还尝试了始终采用15mg/l Hyg高浓度进行抗性芽的筛选，其试验结果见图2。与不采用Hyg筛选的对照相比，持续以高浓度Hyg筛选和先低后高的Hyg梯度选择都会显著降低再生植株的再生率。但SAS软件分析后发现，经Hyg梯度筛选的Southern-blot阳性率极显著高于对照和采用15mg/l Hyg高浓度筛选的结果，再次证明了对黄瓜子叶节抗性芽进行7和15mg/l Hyg梯度筛选的有效性。 

2.4PCR验证Hyg梯度选择下不同外植体的再生植株阳性率 

提取通过诱导子叶和子叶节获得的黄瓜再生植株的DNA，对基因组DNA进行目标条带的扩增，将PCR产物进行琼脂糖电泳，阳性对照为质粒DNA，阴性对照是未经农杆菌侵染的黄瓜植株，试验结果见图3。 

经过10和25mg/l Hyg浓度梯度对子叶再生植株进行筛选后，共获得36株再生植株，PCR产物有10株可以扩增出目标条带，阳性率为27.8％。而经7和15mg/l Hyg浓度梯度对子叶节再生植株进行筛选后，可获得57株再生植株，PCR产物中11株可以扩增出目标条带，阳性率为19.3％。通过试验结果可见，虽然通过黄瓜子叶再生诱导途径获得的再生苗数没有通过子叶节途径获得的多，且Hyg抗性芽率也没有子叶节高，但PCR阳性率27.8％高于子叶节的阳性率19.3％，初步证明以黄瓜子叶外植体为介质进行农杆菌遗传研究的转化效率更高。 

2.5Southern-blot验证Hyg梯度选择下不同外植体的再生植株阳性率 

将PCR阳性的10株子叶再生植株提取基因组总DNA，用Roche地高辛试剂盒标记探针，进行Southern blot检测，结果其中5株出现了杂交信号(图4)，阳性率为13.9％。同时通过杂交条带数可看出MiMpkl基因插入基因组中的拷贝数均为1。将PCR阳性的11株子叶节再生植株提取基因组DNA，同样进行Southern blot检测，结果有4株出现了杂交信号，阳性率为6.9％。 

通过Southern-blot验证黄瓜子叶节再生植株的阳性率的结果可以证明，遗传转化后虽然诱导子叶节比诱导子叶更容易获得再生植株，但Souther-blot阳性率依旧是经子叶诱导途径较高，这一变化趋势与PCR的验证结果一致。 

2.6抗虫性鉴定和结果分析 

从Southern-blot阳性的T0代转基因植株上的获得的T1代种子进行田间播种、栽培，与未经农杆菌转化的对照植株共同接种根结线虫活体。由于根结线虫危害和机械伤等原因，个 别植株在生长过程中死亡。接种50d后，对仍存活的转基因植株进行根系结节数调查统计，数据详见图5，6。结果发现各株系较对照根结数降低18.8-49.4％之间，其中T24-1、T31-2和T31-1的根结数较对照降低均在40％以上，特别是T24-1降低率高达49.4％。值得注意株系中T22平均每株的根结数量比对照还高6.8％，说明MiMPKl虽然已经整合进基因组，但由于某种原因基因并没有顺利表达。 

实施例3.硫辛酸对黄瓜遗传转化的影响 

转化方法同实施例1的1.1～1.5，其中步骤(5)，(6)中潮霉素采用方案为：潮霉素浓度始终用15mg/L进行筛选。对LA和AS的添加方案及浓度进行如表3所示的调整得到14个处理，其中处理2为现有技术中常规使用且公认效果比较好的处理。 

表3侵染过程中LA和AS的浓度配比 

3.1黄瓜子叶节抗性芽的再生过程 

在见光以前，从幼苗上切取的子叶节的颜色保持浅绿色，直到转为光下培养才开始变深，且见光后子叶节体积明显增大，叶片增厚。接种约1周后，在切口处开始有微量愈伤组织出现。约在10-14d后，子叶节开始出现新分化出的深绿色芽点。经过2-3周左右的培养，小 芽点进一步发育、变大，这时子叶节外植体为深绿色，切口处的愈伤组织也明显增多变厚。培养3周后可以肉眼观察到分化好的小芽。接种4-5周后再生的小芽伸长生长，未分化出芽点的子叶节外植体开始变黄。 

3.2不同LA/AS处理对黄瓜子叶节再生频率的影响 

在培养基和菌液中添加LA和AS的各处理试验结果见图7。添加浓度相同的情况下，只在培养基中加入LA处理的再生频率和抗性芽数均比只在菌液中加入LA的各处理高。在菌液中加入100mg/L LA时再生频率为55.0％，而同浓度的LA添加在培养中的处理再生率可提高到76.7％，达到了极显著的水平，200mg/L的LA同样可以使再生率得以显著提高。只在培养基中加入LA的处理3-5中，用100mg/L LA侵染子叶节后获得的Hyg抗性芽数和再生频率在3个浓度的处理中最高，当采用50mg/L的LA时再生频率极显著下降到50.0％，而当LA浓度提高到200mg/L时，抗性芽数和再生频率比LA为50mg/L时更低，但未达到显著水平，这种变化趋势同样出现在LA只加入菌液的处理6～8中。以上分析说明LA单独使用时100mg/L是较合适的浓度，且添加到培养基中可更有助于农杆菌的转化。 

所有处理中，以在培养基和菌液中都加入50～100mg/L的LA与50mg/L的AS的处理10再生频率最高，达到86.7％，平均每外植体的抗性芽数为1.12个，对照只有0.47个，其中处理2为现有技术中常规使用且效果比较好的处理，可以看出处理10和9极显著高于2及其他处理。此外，采用100mg/LAS搭配50、100和200mg/L LA的处理12、13和14的再生频率比较采用50mg/L AS搭配50、100和200mg/L LA的处理9、10、11分别有极显著水平的下降；在培养基和菌液中只使用100mg/L AS的处理2的再生频率可达到70.0％，同样极显著高于100mg/L AS搭配各浓度LA的其他处理，也极显著高于50mg/L AS搭配200mg/L LA的处理11。综上所述，与对照相比单独使用100mg/L的AS的再生频率较高，但与LA搭配使用的转化效率低于单独使用的效率，适当降低AS的浓度再搭配LA辅助进行农杆菌转化则有助于转化效率的显著提高。 

3.3PCR验证LA/AS对黄瓜子叶节转化效率的影响 

以黄瓜转化植株的基因组DNA为模板，经PCR扩增检测，部分抗性植株得到了约525bp的特异性条带，与阳性对照质粒的扩增结果相同，阴性对照没有特异性扩增条带，具体实验结果见图8。PCR检测结果初步表明MiMPKl基因已经整合到黄瓜基因组中。 

对Hyg抗性植株进行PCR检测后发现，添加浓度相同的情况下，只在培养基中加入LA的处理的转化效率均比只在菌液中加入同浓度LA的各处理高，在培养基中加入100mg/L LA的处理4与在菌液中加入100mg/L LA的处理7相比可显著提高PCR阳性率。此外，在培养基中加入50、100、200mg/L LA的3个处理之间，只有采用100mg/L LA的转化率显著高于 200mg/L LA，其他处理间的转化效率差异均不显著。这一情况与只在菌液中添加LA的变化趋势相同。 

在所有处理中，以培养基和菌液中都添加50mg/L AS和100mg/L LA的处理10的转化效率最高，达到20.9％，与对照相比可以极显著提高转化效率。采用50mg/L AS搭配50、100mg/L LA的处理9、10的转化效率分别比只在培养基中添加50、100mg/L LA的处理3、4的转化效率有明显提高，和采用100mg/L AS搭配50、100mg/L LA的处理12、13之间存在显著差异，转化效率分别从12.9％和15.8％提高到17.8％和20.9％。由此可见，在培养基中添加LA比添加到菌液中更利于转化效率的提高，LA浓度采用50～100mg/L比100以上至200mg/L能获得更多的PCR阳性植株，50mg/L AS和100mg/L LA搭配使用可以提高转化效率。 

3.4Southern-blot验证LA/AS对黄瓜子叶节转化效率的影响 

选取PCR阳性的黄瓜转化植株，提取基因组总DNA，用Roche公司的地高辛试剂盒标记探针，进行Southern blot检测，有25株出现了杂交信号 

通过Southern-blot验证黄瓜子叶节再生植株的阳性率时发现，转化过程中使用50mg/L AS和100mg/L LA后转化效率最高，可以达到7.5％，其次是50mg/l AS搭配50mg/l LA的转化效率为6.7％，对照的阳性率为0。 

表4Southern-blot验证黄瓜子叶节再生植株转化频率 

Claims (8)

1.一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法，包括以下步骤：

(1)预培养黄瓜外植体子叶或子叶节；

(2)准备用于浸染的含有外源基因载体的农杆菌液；

(3)将所述外植体置于所述农杆菌悬液中浸染15～20mins；

(4)浸染后的外植体接种于共培养培养基中，25℃黑暗条件下培养2～3d；

(5)共培养后的外植体置于初步选择培养基中初步筛选2～3周，筛选抗生素为潮霉素；

(6)初步筛选出的外植体转入到再次选择培养基中再次筛选1周，筛选抗生素为潮霉素；

(7)再次筛选出的保持绿色的外植体接种到添加0.5mg/L GA的BPM培养基中伸长培养；

(8)生根培养获得再生植株；

其特征在于：所述含有外源基因载体为pCAGC1341-dsMiMpkl，(2)中的农杆菌悬液中和共培养培养基中含有硫辛酸50～100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，所述外植体为子叶，所共培养培养基为：MS+2.0mg/LBA+1.0mg/L ABA+50～100mg/L LA+50mg/L AS pH＝5.4。

3.根据权利要求1所述的方法，所述外植体为子叶节，所共培养培养基为：MS+0.5mg/LBA+2.0mg/L AgNO₃+50～100mg/L LA+50mg/L AS pH＝5.4。

4.根据权利要求1所述的方法，所述外植体为子叶，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为10mg/L，25mg/L。

5.根据权利要求1所述的方法，所述外植体为子叶节，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为7mg/L，15mg/L。

6.根据权利要求4所述的方法，所述初步选择培养基为：MS+2.0mg/L BA+1.0mg/LABA+10mg/L Hyg+400mg/L cef，pH＝5.4，再次选择培养基为：MS+25mg/L Hyg+400mg/L cefpH＝5.4。

7.根据权利要求5所述的方法，所述初步选择培养基为：MS+0.5mg/L BA+2.0mg/LAgNO3+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH＝5.4，再次选择培养基为：MS+15mg/L Hyg+400mg/Lcef pH＝5.4。

8.根据权利要求1～7任一所述的方法，(1)中所述预培养指：外植体为子叶，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中生长1～2天后，切除胚根，子叶部分十字对切成4块，获得子叶外植体；或所述外植体为子叶节，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中，种子萌发后转入光下培养4～5天，当子叶呈直立状态时切取，去除1/2子叶仅留2mm的下胚轴，并在预培养基PM上培养2天得到子叶节外植体。

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