CN101899470A - 一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法。本发明首先利用发根农杆菌K599侵染黄瓜子叶，高频诱导出不定根，离体子叶生根频(转基因频率)达90％，诱导出的不定根在荧光显微镜下能发出强烈的绿色荧光。利用诱导出的黄瓜不定根对南方根结线虫进行了繁殖，成功形成了根结，达到了繁殖根结线虫的目的，可为研究根结线虫的防控提供大量的、均一的根结线虫实验材料，克服了实生苗繁殖根结线虫受到季节限制和土壤环境生物因子的影响。而且，有利于根结线虫的长期保存、可以随要随取，并且不同种的根结线虫之间易于标识、操作中不易混淆，为快速、高效繁殖和分离根结线虫提供了一条新途径。

Description

一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法。

(二)背景技术

根结线虫主要包括南方根结线虫(Meloidogyne incognite)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)四种，根结线虫是葫芦科、茄科、豆科作物的一种毁灭性虫害。根结线虫的危害主要表现在形成根结，造成根系发育受阻和腐烂，植株地上部衰弱和枯死；同时，根结线虫的危害又加重了枯萎病、根腐病等土传性真菌病害和部分细菌病害的发生。根据联合国粮农组织的估计，每年线虫给蔬菜作物造成的损失超过产量的20％。为了研究根结线虫的防控以及接种鉴定根结线虫，需要繁殖分离根结线虫。目前对根结线虫的繁殖通常利用烟草、番茄等植物的实生苗作为宿主，在适宜的季节或者利用温室、人工气候室进行，这是一项繁杂、费时、费力的工作，受到季节和试验条件的限制(刘维志，《植物病原线虫学》，中国农业出版社，2000年，第414～428页；冯志新，《植物线虫学》，中国农业出版，2001年，第68～203页。)

另一方面，发根农杆菌侵染植物形成转基因不定根，不定根具有快速生长繁殖的特性；不定根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；不定根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性；不定根在适宜条件下可以再生出完整植株；不定根可以作为生物活性物质的发生器(Guillon S，Tremouillaux-Guiller J，Pati P K，Rideau M，Gantet P.Hairy root research：recent scenario and exciting prospects.Curr Opin Plant Biol，2006，9(3)：341-346.Georgiev M I，Pavlov A I，Bley T.Hairy root type plant in vitrosystems as sources of bioactive substances.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74(6)：1175-1185.)。

目前还未有利用转基因不定根繁殖根结线虫的报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法，实现对根结线虫了快速、简便、大量、均一的繁殖。

一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法，所述方法包括：

(1)用发根农杆菌K599侵染带有伤口的黄瓜子叶，侵染后的黄瓜子叶于含乙酰丁香酮25mg/L的MS培养基中共培养2～3天后，用含头孢霉素500mg/L的MS培养基清洗，再转入含卡那霉素50mg/L+头孢霉素500mg/L的MS培养基中进行诱导培养，诱导出的不定根经除菌和繁殖，获得转基因不定根于不含任何植物激素和抗生素的MS培养基中繁殖保存；

(2)挑取根结线虫的卵囊，经消毒后接种至培养于MS培养基中的转基因不定根上，于20～25℃下进行培养30～50天，在形成的根结中获得根结线虫。

具体的，所述步骤(2)方法如下：番茄苗接种根结线虫，常规条件培养40～50天后，挑取根上的根结线虫卵囊，用0.1％升汞消毒5min，无菌水清洗后，接种至转基因不定根进行培养。培养条件为：温度20～25℃，湿度75％以上，12h/8h光照黑暗交替，光强1200～2400Lux。

所述发根农杆菌K599可为野生型发根农杆菌K599，为便于检测，也可为带有标记基因的重组发根农杆菌K599，所述重组发根农杆菌K599可含有本领域常规用作植物转基因表达载体的质粒，具体可为下列之一：(1)pBIN-35S-GFP、(2)pBI121、(3)pCAMBIAL300、(4)pCHS、(5)pKH200等。

作为优选的技术方案，所述发根农杆菌K599可选用含有质粒pBIN-35S-GFP的重组发根农杆菌K599。

所述质粒pBIN-35S-GFP为含CaMV 35S启动子驱动和gfp基因(GenBank登记号：U17997)的植物转基因表达载体，可参照《含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达》(徐纪明，向太和，2008年)中的方法进行构建，具体构建过程见图1。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是海洋动物水母(Aequorea victoria)体内的一种发光蛋白。其编码基因gfp作为一种新颖的非酶性标记基因具有许多优点：检测方便，只需要荧光显微镜或激发光源；材料无需前处理，可以活体检测；无需任何底物或辅助因子；对细胞本身几乎无毒；植物本身不含有GFP，不会出现假阳性；对于一些使用抗生素或除草剂会降低转基因效率的物种，GFP可以作为替代的选择标记；由于GFP分子量较小，不影响与其融合的蛋白的生物学活性，所以GFP在研究蛋白的亚细胞定位方面也是一个很好的工具。

转基因不定根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；不定根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性；不定根在适宜条件下可以再生出完整植株。

本发明首先利用带质粒pBIN-35S-GFP的发根农杆菌K599侵染黄瓜子叶，高频诱导出不定根，离体子叶生根频(转基因频率)达90％，诱导出的不定根在荧光显微镜下能发出强烈的绿色荧光。利用诱导出的黄瓜不定根对南方根结线虫进行了繁殖，成功形成了根结，达到了繁殖根结线虫的目的。

本发明可为研究根结线虫的防控提供大量的、均一的根结线虫实验材料，克服了实生苗繁殖根结线虫受到季节限制和土壤环境生物因子的影响。而且，有利于根结线虫的长期保存、可以随要随取；此外，不同种的根结线虫之间易于标识、操作中不易混淆，为快速、高效繁殖和分离根结线虫提供了一条新途径。

(四)附图说明

图1为载体pBIN-35S-GFP构建示意图；

图2为质粒pBIN19-GFP DNA经EcoR I和BamH I酶切结果；M1：1kbDNA ladder标准分子量标记；1：pBIN19被EcoR I+BamH I酶切；2：pBIN19-GFP被EcoR I+BamH I酶切；3：pGFP被EcoR I+BamH I酶切；M₂：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记；

图3为质粒pBIN-35S-GFP DNA经HindIII和Xba I酶切结果；M1：1kbDNA ladder标准分子量标记；1：pBIN19-GFP被HindIII+Xba I酶切；2：pBIN-35S-GFP被HindIII+Xba I酶切；3：pCHS被HindIII+Xba I酶切；M₂：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记；

图4为黄瓜子叶诱导出的转基因不定根；

图5为快速生长的转基因不定根；

图6为利用rolB和gfp基因引物对获得的转基因不定根进行PCR扩增鉴定的结果；1～8是rolB基因引物扩增的结果，9～16是gfp基因引物扩增的结果；M：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记；1：野生型发根农杆菌K599Ri质粒；2～7：转基因不定根；8：非转基因根；9：质粒pBIN-35S-GFP-T；10～15：转基因不定根；16：非转基因根；

图7为转基因不定根的荧光检测；

图8为利用黄瓜转基因不定根繁殖南方根结线虫，形成明显可见的根结；

图9为从根结中分离获得的大量根结线虫；

图10为转基因不定根繁殖的根结线虫接种于黄瓜实生苗形成了根结。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：重组发根农杆菌K599的获得

1、材料

野生型发根农杆菌K599、质粒pBIN19和pGFP均由杭州师范大学植物学重点实验室保存；质粒pCHS由中国台湾中央研究院生物农业科学研究所陶建英博士惠赠。质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自上海Sangon公司。Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自美国Promega公司。抗生素和乙酰丁香酮购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

2、方法

(1)含gfp基因植物转基因表达载体的构建

质粒DNA小量提取、酶切、片段回收均参照产品说明书进行；连接、转化克隆的筛选鉴定按照《分子克隆实验指南》进行。转基因表达载体的构建分2步进行：第一步，质粒pGFP经EcoR I+BamH I酶切后回收含gfp基因的小片段，与质粒pBIN19经EcoR I+BamH I酶切后的大片段连接得到新质粒pBIN19-GFP；第二步，质粒pCHS经HindIII+Xba I酶切后回收含CaMV 35S启动子的小片段，与质粒pBIN19-GFP经HindIII+Xba I酶切后的大段连接得到新质粒pBIN-35S-GFP(图1)。

(2)pBIN-35S-GFP导入发根农杆菌K599

发根农杆菌K599感受态的制备和质粒的提取均参照文献(向太和，杨剑波，Somers DA，野生型发根农杆菌K599的解毒，遗传，2001，23(4)：336-340)的方法进行。用冻融法将pBIN-35S-GFP导入发根农杆菌K599，即在100μL K599感受态细胞中加入约0.1μg纯化质粒DNA，混匀，0℃冰上放置10min，置于液氮速冻5min，立即用28℃水浴热激5min，加入500μL LB液体培养基，在28℃缓慢振荡培养2h。取100μL菌液分别涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/L+Str(链霉素)50mg/L固体培养基上，28℃培养约48h筛选抗性菌落，得重组发根农杆菌K599。

3、结果与分析

质粒pGFP经EcoR I+BamH I酶切后回收含gfp基因的小片段，与质粒pBIN19经EcoR I+BamH I酶切后的大片段连接，得到新质粒pBIN19-GFP。pBIN19-GFP经EcoR I+BamH I酶切鉴定得到约10kb和750bp的两个片段，表明构建正确(图2)。

质粒pCHS经Hind III+Xba I酶切后回收含CaMV 35S启动子的小片段，与质粒pBIN19-GFP经Hind III+Xba I酶切后的大片段连接得到新质粒pBIN-35S-GFP。质粒pBIN-35S-GFP经Hind III+Xba I酶切鉴定得到约10.7kb和900bp的两个片段，说明构建正确(图3)。

实施例2：转基因不定根的获得及根结线虫的繁殖

1材料与方法

1.1实验材料

黄瓜(Cucumis sativus)中农6号等种子，带有质粒pBIN-35S-GFP的重组发根农杆菌K599(按实施例1方法获得)，均由杭州师范大学植物学重点实验室保存。

1.2转基因不定根的诱导、鉴定和繁殖

黄瓜种子用无菌水冲洗3次后，于75％的酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，再用20％的市售安替福民(次氯酸钠)溶液处理20min，期间每隔5min搅拌一次，最后用无菌水冲洗3次，接种于1/2MS培养基(大量元素浓度减半的MS培养基)上，温度24±2℃，遮光培养，培养7d后种子萌发出的子叶，用解剖刀划出伤口，用于农杆菌侵染诱导不定根。

重组发根农杆菌K599于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L平板中划线28℃活化后，挑取单克隆于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中28℃、200r/min培养24h。取1mL菌液移入50mL的含LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中28℃、200r/min培养至A₆₀₀为0.5，离心管收集菌液并用MS液体培养基悬浮清洗3次。随后侵染带有伤口的黄瓜子叶10min，用无菌的滤纸吸去子叶上的菌液，再转入MS+As(乙酰丁香酮)25mg/L固体培养基共培养2～3d后，经MS+Cef(头孢霉素)500mg/L液体培养基清洗3次后转入MS+Km 50mg/L+Cef 500mg/L的筛选培养基中；同时将未经侵染带有伤口的子叶转于相同的培养基中作为阴性对照。诱导出的不定根长为5cm左右时，剪成2段转移到MS+Km 50mg/L+Cef500mg/L除菌和繁殖。经过鉴定后无菌的转基因不定根在不添加任何植物激素的MS培养基中繁殖保存，每隔25～30d转接一次。

用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导出的不定根进行荧光检测，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录，首先对获得的不定根进行快速鉴定。

此外，根据GenBank登记号EF433766.1序列，设计扩增rolB基因的引物rolB-P1：5′-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3′，rolB-P2：5′-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3′；根据GenBank登记号U17997.1序列，设计扩增gfp基因引物GFP-P1：5′-GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG-3′，GFP-P2：5′-AAAGGGCAGATTGTGTGGAC-3′。

扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。

1.3利用不定根对根结线虫的繁殖

首先分离根结线虫卵囊，即：番茄品种苏红2003种子在20～25℃黑暗条件下萌芽3天破白后，移入直径9～15cm的陶土盆钵中的土壤里。每盆钵种1～2株。盆钵中的土壤为灭菌的蛭石：腐植土或沙：腐植土(1∶1)。配好后的土壤高温高压灭菌(121℃、20min)。种植的植株放入人工气候室或玻璃房中，温度20～25℃，湿度75％以上，12h/8h光照黑暗交替，光强1200～2400Lux。移栽或播种后的30天每盆浇1次100mL 1/4MS培养基的大量元素和微量元素。按照常规方法(冯志新，《植物线虫学》，中国农业出版社，2001年，第200页)接种南方根结线虫(根结线虫由南京农业大学李红梅博士惠赠)。番茄苗接种线虫50d后，用解剖针挑取根上的线虫卵囊，用0.1％升汞消毒线虫卵囊5min，用无菌水离心清洗3次后，消毒后的卵囊直接接种于在MS培养基(不添加任何植物激素)上培养的转基因不定根。

2结果

2.1转基因不定根的诱导、鉴定和繁殖

离体子叶在发根农杆菌K599/pBIN-35S-GFP侵染后10d左右，切口边缘长出白色小突起；15d左右，切口边缘长出明显可见的白色不定根(图4)。离体子叶感染生根频率(转基因频率)达90％(36/40)；而未经发根农杆菌侵染的子叶虽也有少量的不定根出现，但该不定根在MS+Cef500mg/L+Km 50mg/L培养基上褐化死亡。此外，诱导出的不定根根据形态特征，可以分为2种类型，一种是毛状分支多的较细的不定根，其生长速度快(图5)；另一种是较粗的极少分枝的不定根，生长速度较慢。选取生长快的不定根用于根结线虫的繁殖。

根据rolB基因序列设计的引物rolB-P1和rolB-P2对野生型发根农杆菌K599自身携带的Ri质粒和随机选取的6个系的转基因不定根均扩增出约450bp大小的条带；同时，根据gfp基因序列设计的引物GFP-P1和GFP-P2对质粒pBIN-35S-GFP和随机选取的6个系的转基因不定根均扩增出约550bp的条带；而对照非转基因的不定根基因组DNA均未扩增出任何条带(图6)。

用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导出的不定根进行荧光检测，在检测的不定根中均可以看到强烈的绿色荧光(图7)。

上述结果表明，rolB基因和gfp基因已经共同整合到不定根的基因组中，并且gfp基因实现了高效表达，因此，获得的不定根为真正的转基因不定根。

2.2根结线虫在不定根上的繁殖

从番茄实生苗根上挑取根结线虫的卵囊，经过消毒后的卵囊直接接种于在MS(0)培养基上培养的转基因不定根，在20d后即可明显观察到不定根形成根结(图8)。采用漏斗分离法(冯志新，《植物线虫学》，中国农业出版社，2001年，第170页)平均从每个根结中可以获得100-300条根结线虫(图9)。因此，本发明成功地利用转基因不定根繁殖了南方根结线虫。

实施例3：转基因不定根的获得及根结线虫的繁殖

野生型发根农杆菌K599由杭州师范大学植物学重点实验室保存。野生型发根农杆菌K599于LB+Str 50mg/L平板中划线28℃活化后，挑取单克隆于LB+Str 50mg/L液体培养基中28℃、200r/min培养24h。取1mL菌液移入50mL的含LB+Str 50mg/L液体培养基中28℃、200r/min培养至A600为0.5，离心管收集菌液并用MS液体培养基悬浮清洗3次。随后侵染带有伤口的黄瓜子叶10min，用无菌的滤纸吸去子叶上的菌液，再转入MS+As(乙酰丁香酮)25mg/L固体培养基共培养2-3d后，经MS+Cef(头孢霉素)500mg/L液体培养基清洗3次后转入MS+Cef 500mg/L的筛选培养基中；同时将未经侵染带有伤口的子叶转于相同的培养基中作为阴性对照。诱导出的不定根长为5cm左右时，剪成2段转移到MS+Cef 500mg/L除菌和繁殖。经过鉴定后无菌的转基因不定根在不添加任何植物激素的MS培养基中繁殖保存，每隔25～30d转接一次。

此外，根据GenBank登记号EF433766.1序列，设计扩增rolB基因的引物rolB-P1：5′-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3′，rolB-P2：5′-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3′。

扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。经过鉴定获得的不定根为转基因不定根。

同实施例2方法中的1.3的方法繁殖根结线虫，结果成功繁殖根结线虫。

实施例4：转基因不定根的获得及根结线虫的繁殖

野生型发根农杆菌K599由杭州师范大学植物学重点实验室保存。质粒pKH200由美国华盛顿大学Doty博士惠增。按照实施例1中2方法(2)，将质粒pKH20转入野生型发根农杆菌K599获得重组发根农杆菌K599。

发根农杆菌K599(带有质粒pKH200)于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L平板中划线28℃活化后，挑取单克隆于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中28℃、200r/min培养24h。取1mL菌液移入50mL的含LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中28℃、200r/min培养至A600为0.5，离心管收集菌液并用MS液体培养基悬浮清洗3次。随后侵染带有伤口的黄瓜子叶10min，用无菌的滤纸吸去子叶上的菌液，再转入MS+As(乙酰丁香酮)25mg/L固体培养基共培养2～3d后，经MS+Cef(头孢霉素)500mg/L液体培养基清洗3次后转入MS+Km 50mg/L+Cef 500mg/L的筛选培养基中；同时将未经侵染带有伤口的子叶转于相同的培养基中作为阴性对照。诱导出的不定根长为5cm左右时，剪成2段转移到MS+Km 50mg/L+Cef 500mg/L除菌和繁殖。经过鉴定后无菌的转基因不定根在不添加任何植物激素的MS培养基中繁殖保存，每隔25-30d转接一次。

此外，根据GenBank登记号EF433766.1序列，设计扩增rolB基因的引物rolB-P1：5′-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3′，rolB-P2：5′-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3′；根据GenBank登记号AF354045，设计扩增gus基因引物GUS-P1：5′-CTGCGACGCTCACACCGAT-3′，GUS-P2：5′-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3′。

扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。经过鉴定获得的不定根为转基因不定根。

按照实施例2方法中的1.3的方法繁殖根结线虫，结果成功繁殖根结线虫。

实施例5：应用实例

从安徽省青阳县收集的农家种植的黄瓜自交系Qingyang01，为了鉴定其对南方根结线虫的抗性，首先将种子播种于人工气候室，生长到4叶期后，利用漏斗法分离按照实施例2方法在转基因不定根上繁殖的根结线虫，直接接种到黄瓜苗的根部，在30～40天之间形成了明显可见的根结(图10)。鉴定结果表明黄瓜自交Qingyang01高感南方根结线虫。

Claims (3)

1.一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法，所述方法包括：

(1)用发根农杆菌K599侵染带有伤口的黄瓜子叶，侵染后的黄瓜子叶于含乙酰丁香酮25mg/L的MS培养基中共培养2～3天后，用含头孢霉素500mg/L的MS培养基清洗，再转入含卡那霉素50mg/L+头孢霉素500mg/L的MS培养基中进行诱导培养，诱导出的不定根经除菌和繁殖，获得转基因不定根于MS培养基中繁殖保存；

(2)分离根结线虫的卵囊，经消毒后接种至培养于MS培养基中的转基因不定根上，于20～25℃下进行培养30～50天，在形成的根结中获得根结线虫。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)方法如下：番茄苗接种根结线虫培养40～50天后，挑取根上的根结线虫卵囊，用0.1％升汞消毒5min，无菌水清洗后，接种至转基因不定根进行培养。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发根农杆菌K599为野生型发根农杆菌K599或重组发根农杆菌K599，所述重组发根农杆菌K599含有下列之一的质粒：(1)pBIN-35S-GFP、(2)pBI121、(3)pCAMBIAL300、(4)pCHS、(5)pKH200。

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