CN103756975B

CN103756975B - 一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用

Info

Publication number: CN103756975B
Application number: CN201310653591.8A
Authority: CN
Inventors: 智海剑; 高乐; 李凯; 任锐; 仲勇坤; 翟锐
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2033-12-05
Also published as: CN103756975A

Abstract

本发明公开了一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用。使用保藏号为CCTCC NO：V201349的大豆花叶病毒分离物侵染本氏烟草获得感染烟草的大豆花叶病毒。按照本发明所述的方法获得感染烟草的大豆花叶病毒在验证抗大豆花叶病毒抗性候选基因中的应用。本发明从众多分离物中筛选获得了能够侵染烟草的大豆花叶病毒，通过将该分离物侵染烟草并通过调查发病症状、南农1138-2回接实验、ELISA以及RT-PCR检测手段进行了证实。该发明获得了感染烟草的大豆花叶病毒，使得在烟草上验证大豆抗SMV候选基因功能成为现实，打破了大豆遗传转化难的限制。

Description

一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用。

背景技术

大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus，SMV）病是全球最主要的大豆病害之一，分布十分广泛，大豆种植区几乎都有发生。SMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，大豆感染SMV后，会产生花叶和坏死等症状，造成大豆光合面积减少和光合能力降低，植株矮化，生长量下降，籽粒出现褐斑，一般造成大豆减产15%，甚至绝收。

培育抗病品种是控制SMV最有效方法，除了传统的抗病育种方法以外，大豆转基因技术已成为快速培育抗病品种的方法之一。转基因育种以及阐明抗病机理的理论研究都需要抗性功能明确的抗病基因作为物质基础。大豆起源于中国，许多大豆种质资源存在抗SMV基因，人们通过精细定位、酵母双杂交、生物信息学分析等技术手段能从抗性种质中获得SMV抗性候选基因.另外，人们也从其它物种中获得一些可能对SMV具有抗性的基因。这些候选抗性基因可在烟草等模式植物上进行基因功能的间接验证或者直接转化大豆验证这些基因的功能，在大豆上验证功能的同时也有机会获得转基因大豆抗病材料用于培育抗病品种。

目前,农杆菌介导遗传转化已成为大豆遗传转化的主要方法。尽管科学家们已经通过多种手段不断改进转化体系以提高大豆转化效率。但转化周期长、转化效率低、嵌合体比率高、成本高、工作量大等瓶颈问题还没有彻底解决，转化过程始终受到供体基因型、农杆菌菌株、载体、外植体类型、筛选剂、暗培养条件、操作手法等多方面的因素的限制，使得大豆仍然是世界上公认最难转化的作物之一。因此，大豆抗SMV候选基因直接转化大豆进行功能验证难度非常大。而烟草的遗传转化体系已经非常成熟，它具有省时、省力、花费低、成功率高等优点。但由于SMV的寄主范围较窄，主要侵染豆科植物，如大豆、四季豆、豇豆、豌豆、蚕豆、紫云英等。至今未发现可以侵染烟草的SMV类型。烟草虽然转化容易，但由于SMV不能侵染烟草，人们一直无法通过转化烟草验证大豆抗SMV候选基因的功能。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法。

本发明的另一目的是提供感病烟草的应用。

一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法，使用保藏号为CCTCC V201349的大豆花叶病毒分离物侵染本氏烟草获得感染烟草的大豆花叶病毒。

本发明所述的感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法，优选具体步骤如下：

（1）在感病大豆品种南农1138-2上人工接种保藏号为CCTCC V201349的大豆花叶病毒分离物，并进行繁殖，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片加入0.1mol/L、pH=7.3～7.4的磷酸缓冲液，再加600目的金刚砂，在研钵中研成匀浆；

（2）人工气候箱中培养本氏烟草，25℃，光照16小时，黑暗8小时，湿度60%，确保气候箱中无蚜虫，以防止蚜虫传毒造成株系交叉侵染，待本氏烟长至5～6叶时期，用毛刷将步骤（1）制备的匀浆涂到每一片烟叶上，顶端嫩叶不接种，接种后用装有自来水的喷壶冲洗本氏烟，2～3周后观察发病情况，侵染反应划分为3种类型：

a.无症状：接种后没有症状或只在接种叶上出现局部枯斑而上位叶无症状；

b.坏死：接种后上位叶或顶端生长点出现坏死；

c.花叶：接种后上位叶出现花叶、皱缩、卷曲等：

在上位叶上出现坏死或花叶的视为感染大豆花叶病毒；

（3）通过本氏烟草中SMV的血清检测、SMV CP基因RT-PCR以及染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2进行检测，结果呈阳性，说明烟草确实感染了大豆花叶病毒。

其中，步骤（1）中每1g新鲜叶片加5ml所述的磷酸缓冲液。

所述的本氏烟草中SMV的双抗体夹心酶联免疫吸附分析方法优选：待烟草出现典型发病症状后，选取新鲜的、具有典型症状的叶片1～2片进行双抗体夹心酶联免疫吸附分析DAS—ELISA实验，每个样本3次重复，并设置阳性、阴性、空白对照，显色1小时后，将显色的酶标板放入酶标仪中，测定OD=405nm的吸光度，并参照以下标准分析实验结果：

a.底物孔OD值＜0.15

b.阳性对照OD值/阴性对照OD值＞10

c.样品OD值=原始值-底物孔OD值

d.样品OD值≥2倍阴性对照OD值，判为阳性，

e.样品OD值＜2倍阴性对照OD值，判为阴性；

之后，再次人工接种本氏烟对所述的大豆花叶病毒分离物进行验证，设置8次重复，每一个重复均通过ELISA检测到大豆花叶病毒。

所述的SMV CP基因RT-PCR检测方法优选：分别取经过8次重复的本氏烟叶各100mg,在液氮中充分研磨后提取总RNA，用引物Oligo dT合成cDNA第一链，以2×Taq mix聚合酶以反转录后的染病本氏烟草cDNA为模板，采用SMV CP基因的一对引物CP-F：SEQ ID NO.1/CP-R:SEQ ID NO.2进行PCR反应，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察产物的扩增情况，8个样本均在正确的位置出现了CP条带，证明样品中含有病毒。

所述的染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2方法优选：将大豆花叶病毒侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2,2～3周后出现典型花叶症状，然后通过DAS—ELISA实验和SMV CP基因RT-PCR扩增均能检测到大豆花叶病毒，证实烟草确实感染了SMV。

按照本发明所述的方法获得的感染烟草的大豆花叶病毒在验证抗大豆花叶病毒抗性候选基因中的应用。

一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用，将大豆花叶病毒抗性候选基因构建到植物表达载体，利用植物表达载体侵染通过本发明所述的方法获得的感染大豆花叶病毒的转基因烟草，通过观察烟草的感病情况，或者分析相关基因的表达从而验证候选基因对大豆花叶病毒的抗性。

一种能够侵染烟草的SMV分离物SMV-S9，于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V201349。

有益效果：

本发明从本技术所获得的众多SMV分离物中筛选获得了能够侵染烟草的大豆花叶病毒，通过将该分离物侵染烟草并通过调查发病症状、南农1138-2回接实验、ELISA以及RT-PCR检测手段进行了证实。该发明获得了感染烟草的大豆花叶病毒，使得在烟草上验证大豆抗SMV候选基因功能成为现实，打破了大豆遗传转化难的限制。

说明书附图

图1本氏烟感染大豆花叶病毒后的症状，A:野生型本氏烟;B:SMV感染引起的花叶症状。

图2本氏烟草叶片双抗体夹心酶联免疫吸附分析实验，其中S9、S10以及阳性对照孔呈亮黄色，其余孔呈无色。

图3本氏烟草叶片双抗体夹心酶联免疫吸附分析实验，其中，可侵染SMV分离物再次接种本氏烟8次重复和阳性对照孔呈亮黄色，其余孔呈无色。

图4RT-PCR检测本氏烟中SMV的CP基因

M：markerD2000;+：染病的南农1138-2作为阳性对照;wt：野生型本氏烟为阴性对照;1-8：SMV接种本氏烟8个样品。

图5SMV侵染本氏烟草后回接南农1138-2的症状

A：野生型南农1138-2；B感病烟草回接的南农1138-2的症状

图6SMV接种本氏烟后回接南农1138-2双抗体夹心酶联免疫吸附分析实验，其中回接南农1138-2的发病叶片和阳性对照孔呈亮黄色，其余孔呈无色。

图7RT-PCR检测南农1138-2中SMV的CP基因

M：markerD2000，1～8泳道分别为SMV侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2。

图8SMV病样的单斑分离纯化

注：接种SMV病样后，离体的Topcrop叶片上出现叶脉坏死斑，每个坏死斑被定义为一个纯化的分离物。

生物样品保藏信息

SMV-S9，分类命名为：马铃薯Y病毒属大豆花叶病毒SMV-S9（Soybean mosaic virus SMV-S9），于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC V201349。

具体实施方式

实施例1

1、可侵染本氏烟草的SMV分离物获得

（1）从全国大豆产区分离鉴定出37个SMV分离物（表1），这些分离物人工接种在感病大豆品种南农1138-2上繁殖，发病后取症状典型的叶片加入0.1mol/L、pH=7.3～7.4的磷酸缓冲液（约每1g新鲜叶片加5ml缓冲液）再加少许金刚砂（约600目）在研钵中研成匀浆。

（2）人工气候箱中培养本氏烟草，25℃，光照16小时，黑暗8小时，湿度60%，确保气候箱中无蚜虫，以防止蚜虫传毒造成株系交叉侵染，待本氏烟草长至5～6叶时期，人工接种SMV。

用毛刷将匀浆涂到每一片烟叶上，顶端嫩叶不接种，接种后用装有自来水的喷壶冲洗本氏烟草。2～3周后观察发病情况，侵染反应划分为3种类型：

a.无症状（接种后没有症状或只在接种叶上出现局部枯斑而上位叶无症状）；

b.坏死（接种后上位叶或顶端生长点出现坏死）

c.花叶（接种后上位叶出现花叶、皱缩、卷曲等）。

在上位叶上出现坏死或花叶的（类型b、c）视为感染SMV，即该病毒可侵染本氏烟。结果发现S9、S10两个分离物可侵染本氏烟并在上位叶呈现出花叶症状（表1，图1）。

表1

注：-：无症状；M:花叶；接种叶/上位叶

2、本氏烟草感染SMV的鉴定

为确认SMVS9、S10两个分离物已感染本氏烟，用3种技术进行了检测，获得了一致的结果，证实了SMV两个分离物对本氏烟的侵染。

（1）本氏烟草中SMV的血清检测

待烟草出现典型发病症状后，选取新鲜的、具有典型症状的叶片1～2片进行双抗体夹心酶联免疫吸附分析（DAS—ELISA）实验（试剂购买自美国ACD公司，货号为V094-R1），每个样本3次重复，并设置阳性、阴性、空白对照。显色1小时后，将显色的酶标板放入酶标仪中，测定OD=405nm的吸光度，并参照以下标准分析实验结果：

a.底物孔OD值＜0.15

b.阳性对照OD值/阴性对照OD值＞10

c.样品OD值=原始值-底物孔OD值

d.样品OD值≥2倍阴性对照OD值，判为阳性

e.样品OD值＜2倍阴性对照OD值，判为阴性

结果上述2个分离物所侵染的本氏烟草均为SMV阳性（图2、表2）。之后，再次人工接种本氏烟草对此分离物进行验证，设置8次重复，每一个重复均通过DAS—ELISA检测到了大豆花叶病毒（图3、表3）。将分离物S9送交CCTCC保藏，保藏编号为CCTCC V201349。

表2Elisa96孔板于酶标仪中在OD=405nm下的吸光度

SMV分离物	P（OD_405nm)	P/N	SMV分离物	P（OD_405nm)	P/N
						S1	0.118	1.00（—）	S20	0.118	1.00（—）
S2	0.115	0.97（—）	S21	0.115	0.97（—）

S3	0.116	0.98（—）	S22	0.114	0.97（—）
						S4	0.113	0.96（—）	S23	0.114	0.97（—）
S5	0.118	1.00（—）	S24	0.113	0.96（—）
						S6	0.115	0.97（—）	S25	0.113	0.96（—）
S7	0.139	1.18（—）	S26	0.084	0.71（—）
						S8	0.116	0.98（—）	S27	0.115	0.97（—）
S9	3.253	27.57（+）	S28	0.112	0.95（—）
						S10	3.314	28.08（+）	S29	0.117	0.99（—）
S11	0.116	0.98（—）	S30	0.113	0.96（—）
						S12	0.115	0.97（—）	S31	0.113	0.96（—）
S13	0.114	0.97（—）	S32	0.117	0.99（—）
						S14	0.116	0.98（—）	S33	0.115	0.97（—）
S15	0.125	1.06（—）	S34	0.115	0.97（—）
						S16	0.107	0.91（—）	S35	0.115	0.97（—）
S17	0.113	0.96（—）	S36	0.113	0.96（—）
						S18	0.113	0.96（—）	S37	0.116	0.98（—）
S19	0.122	1.03（—）

注：P：接种SMV烟草样品的OD_405nm，取三次重复的平均值；

N：阴性对照，其OD_405nm三次重复的平均值=0.118；

+：SMV阳性；—：SMV阴性

表3Elisa96孔板于酶标仪中在OD=405nm下的吸光度

侵染本氏烟重复	P（OD_405nm)	P/N
			1	1.175	11.30（+）
2	1.234	11.87（+）
			3	1.138	10.94（+）
4	1.231	11.84（+）
			5	1.169	11.24（+）
6	1.405	13.51（+）
			7	1.429	13.74（+）
8	1.352	13.00（+）

注：P：再次验证SMV侵染烟草的OD_405nm，取三次重复的平均值；

N：阴性对照，其OD_405nm三次重复的平均值=0.104；

+：SMV阳性；—：SMV阴性

（2）SMV CP基因RT-PCR检测

分别取上述8次重复的本氏烟叶各100mg,在液氮中充分研磨后提取总RNA，用引物OligodT合成cDNA第一链。合成过程为：65℃放置5min，冰上迅速冷却，加入逆转录酶PrimeScrip及其他试剂并且缓慢混匀后，42℃保持30～60min，95℃保温5min使酶失活，置于冰上冷却，cDNA保存于-20℃备用。

采用Primer Premier5.0软件设计SMV CP基因的一对引物：

上游引物CP-F:ATGCTCAGACAAGTGAGCT（SEQ ID NO.1）

下游引物CP-R:CTCCCTGCCATTCATAAAC（SEQ ID NO.2）

在上述引物的作用下，采用2×Taq mix聚合酶以反转录后的cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系为25μL。PCR反应液如下：上、下游引物各1μL，cDNA1μL，mix酶12.5μL,无菌超纯水9.5μL。循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min10s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察产物的扩增情况，8个样本均在正确的位置出现了CP条带（图4），证明样品中含有SMV病毒。

（3）本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2

将SMV侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2(采用人工接种法，同上),2～3周后出现典型花叶症状（图5），然后通过ELISA实验（图6、表4）和SMV CP基因RT-PCR扩增均能检测到大豆花叶病毒（图7），证实烟草确实感染了SMV。

表4Elisa96孔板于酶标仪中在OD=405nm下的吸光度

回接南农1138-2	P（OD_405nm)	P/N
			1	3.719	23.39
2	3.664	23.04
			3	3.353	21.09
4	3.621	22.78
			5	3.356	21.11
6	3.644	22.92
			7	3.748	23.57
8	3.653	22.97

注：P：感病烟草回接南农1138-2的OD_405nm，取三次重复的平均值；

N：阴性对照，其OD_405nm三次重复的平均值=0.159；

+：SMV阳性；—：SMV阴性

实施例2

送交CCTCC保藏的SMV分离物为S9，保藏号为CCTCC V201349。SMV S9分离物来自于河北田间的发病叶片，由于田间病毒组成较复杂，每个病样可能为一个或者多个SMV株系复合侵染的产物，甚至可能是多种病毒复合侵染的结果。因此，每份病样均采取Topcrop单斑分离纯化和DAS‐ELISA血清鉴定，以确保用来鉴定的每个分离物为纯化的SMV。由于株系鉴定结果易受蚜虫、环境尤其是温度影响，本实验所有病毒接种试验均在防虫网室或温室进行，温度控制在20‐30℃。所有的SMV分离物在10个鉴别寄主上均进行重复验证两次或以上，以确保株系鉴定结果的准确性

1病样的采集与保存

病样的采集于大豆发病盛期。将采集的新鲜病叶用锡箔纸包裹好，用marker笔做好标记，置于装有液氮的液氮罐中保存。

2病样的接种鉴定与繁殖

病毒接种实验均在防虫温室及网室中进行，接种前，研钵、研棒用洗洁精洗净，放入微波炉中，高温消毒5分钟，接种用的扁刷用洗洁剂洗净后，在紫外灯下灭菌至少半小时。毒源繁殖期间，定期打药杀灭蚜虫，以保证试验所用毒源的纯度。

在防虫温室及网室内盆播感病品种南农1138‐2，出苗后拔除不能接种的弱苗，留苗8～10株。待第一对真叶完全展开时进行接种，将采集的病样在研钵中用少量0.01M PH7.4的磷酸缓冲液（磷酸氢二钾与磷酸二氢钠的混合液，PH=7.4）和600目金刚砂研磨至匀浆状，戴一次性手套，用扁刷蘸取接种体均匀摩擦接种于南农1138‐2的真叶上，接种后立即用清水冲洗叶片上多余的汁液。待南农1138‐2出现典型症状后进一步的分离。

3病样的生物学纯化

病样生物学纯化及枯斑寄主采用菜豆品种Topcrop。首先，于防虫网室或温室将种子盆播，待第一对真叶充分展开，黑暗处理24小时以增强对病毒的敏感性。接着将待纯化病样分别用灭菌的研钵和研棒用3‐5ml0.01M磷酸缓冲液(磷酸氢二钾与磷酸二氢钠的混合液，PH=7.4)制成匀浆状接种物。接种物里加微量600目金刚砂，用刷子蘸取接种物采用半叶法离体摩擦接种菜豆Topcrop叶片，纯水快速冲洗，最后将接种叶片放入铺有浸湿滤纸的培养皿里，人工气候箱HPG‐320H(温度：25‐30℃,湿度：90%,光照：48‐72h)内保湿培养2‐3天，待出现明显叶脉坏死或局部坏死斑（图5A），用消毒剪刀剪取单个坏死斑分别回接在感病寄主南农1138‐2上进行繁殖。单个坏死斑被定为一个纯化的分离物。

4SMV分离物的血清学检测

本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析（DAS‐ELISA）进行血清学检测SMV分离物，检测结果显示S9分离物确为大豆花叶病毒，将其送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏标号为CCTCC V201349。

Claims

1.一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法，其特征在于使用保藏号为CCTCC NO.V201349的大豆花叶病毒分离物侵染本氏烟草获得感染烟草的大豆花叶病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体步骤如下

（1）在感病大豆品种南农1138-2上人工接种保藏号为CCTCC NO.V201349的大豆花叶病毒分离物，并进行繁殖，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片加入0.1 mol/L、pH=7.3～7.4的磷酸缓冲液，再加600目的金刚砂，在研钵中研成匀浆；

b.坏死：接种后上位叶或顶端生长点出现坏死；

c.花叶：接种后上位叶出现花叶、皱缩、卷曲等：

在上位叶上出现坏死或花叶的视为感染大豆花叶病毒；

（3）通过本氏烟草中SMV的双抗体夹心酶联免疫吸附分析检测、SMV CP基因RT-PCR以及染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2进行检测，结果呈阳性，说明烟草确实感染了大豆花叶病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（1）中每1 g新鲜叶片加5 ml所述的磷酸缓冲液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的本氏烟草中SMV的双抗体夹心酶联免疫吸附分析检测方法为：待烟草出现典型发病症状后，选取新鲜的、具有典型症状的叶片1～2片进行双抗体夹心酶联免疫吸附分析DAS—ELISA实验，每个样本3次重复，并设置阳性、阴性、空白对照，显色1小时后，将显色的酶标板放入酶标仪中，测定OD=405nm的吸光度，并参照以下标准分析实验结果：

a.底物孔OD值＜0.15

b.阳性对照OD值/阴性对照OD值＞10

c.样品OD值=原始值-底物孔OD值

d.样品OD值≥2倍阴性对照OD值，判为阳性，

e.样品OD值＜2倍阴性对照OD值，判为阴性；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的SMV CP基因RT-PCR检测方法为：分别取权利要求4中经过8次重复的本氏烟叶各100 mg,在液氮中充分研磨后提取总RNA，用引物Oligo dT合成cDNA第一链，以2×Taq mix聚合酶以反转录后的染病本氏烟草cDNA为模板，采用SMV CP基因的一对引物CP-F：SEQ ID NO.1/CP-R: SEQ ID NO.2进行PCR反应， PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察产物的扩增情况，8个样本均在正确的位置出现了CP条带，证明样品中含有病毒。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2 方法为：将权利要求4中大豆花叶病毒侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2, 2～3周后出现典型花叶症状，然后通过双抗体夹心酶联免疫吸附分析和SMV CP基因RT-PCR扩增均能检测到大豆花叶病毒，证实烟草确实感染了SMV。

7.按照权利要求1所述的方法获得的感染烟草的大豆花叶病毒在验证抗大豆花叶病毒抗性候选基因中的应用。

8.一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用，其特征在于将大豆花叶病毒抗性候选基因构建到植物表达载体，利用植物表达载体侵染通过权利要求1所述的方法获得的感染大豆花叶病毒的转基因烟草，通过观察烟草的感病情况，或者分析相关基因的表达从而验证候选基因对大豆花叶病毒的抗性。

9.一种能够侵染烟草的SMV分离物SMV-S9，于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.V201349。