CN110396503B - 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法 - Google Patents

一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110396503B
CN110396503B CN201910660873.8A CN201910660873A CN110396503B CN 110396503 B CN110396503 B CN 110396503B CN 201910660873 A CN201910660873 A CN 201910660873A CN 110396503 B CN110396503 B CN 110396503B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
aphids
obtaining
myzus persicae
brassica
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910660873.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110396503A (zh
Inventor
韩成贵
左登攀
王颖
李大伟
于嘉林
张宗英
王献兵
张永亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201910660873.8A priority Critical patent/CN110396503B/zh
Publication of CN110396503A publication Critical patent/CN110396503A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110396503B publication Critical patent/CN110396503B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用桃蚜(Myzus persicae)获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus，BrYV)的方法，具体步骤为：S1：获得携带芸薹黄化病毒的病毒转基因植株；S2：获得饲毒用无毒蚜虫；S3：用所述无毒桃蚜从含有病毒基因组的转基因植株和冷冻病叶中获得病毒；S4：检测获毒后所述桃蚜的传毒能力。采用本发明建立的芸薹黄化病毒等马铃薯卷叶属病毒获毒方法可以很好地克服采用患病植株饲毒桃蚜中存在的植株难以长期保存、占用空间、不便于运送和毒源易混杂等的技术瓶颈，拓宽了介体昆虫获毒及品种抗性鉴定等的简便性、快速性和可靠性。

Description

一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法
技术领域
本发明属于农业科学技术领域，研究出一种利用桃蚜(Myzus persicae)从转病毒全长cDNA基因拟南芥植株及冷冻病叶中获得马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒(Brassicayellows virus，BrYV)的方法。
背景技术
芸薹黄化病毒(BrYV)是马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)一种新发现的病毒，也有学者将其称为芜菁黄化病毒(Turnip yellows virus)的一个株系，在中国大陆11个省市均有分布，BrYV主要侵染卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、大白菜(B.pekinensis)、菜花(B.oleracea var.botrytis)、芥菜(B.juncea)、萝卜(Raphanussativus var.oleifera)等多种十字花科作物，在田间引起作物黄化和叶片卷曲症状(Xiang et al.,2011)。Wang等报道该病毒还能侵染田间茄科植物烟草(Nicotianatabacum L.)(Wang et al.,2015)。该病毒主要有三种基因型：BrYV-A，BrYV-B和BrYV-C(Xiang et al.,2011；Zhang et al.,2014)，一致性在93％左右。Zhang等(Zhang et al.,2015)分别构建了这三种基因型的全长侵染性cDNA克隆，能够系统侵染本生烟。Chen等(Chen et al.,2018)成功将BrYV-C型病毒全长cDNA转入拟南芥获得稳定遗传转病毒基因组拟南芥株系，分别命名为BrYV111#和BrYV412#。转化BrYV全长的拟南芥株系表现出一系列与Col-0野生型拟南芥不一致的发育表型，例如：植株矮化、顶端优势丧失、腋生叶增多、果荚变短和叶片变紫等症状。这与病毒自然情况下侵染症状基本一致，并且病毒转基因拟南芥植株BrYV能够正常复制和表达蛋白。
马铃薯卷叶属病毒(Poleroviruses)为正义单链RNA(+ssRNA)病毒，病毒粒子为球形，直径约为25-35nm，无包膜，病毒粒子由外壳蛋白和病毒基因组RNA(genomic RNA,gRAN)组成。Polerovirus在世界范围内分布广泛，可以侵染十字花科、藜科、葫芦科、禾本科等多种植物，引起严重病害和经济损失。马铃薯卷叶病毒属病毒侵染时局限于寄主植物组织的韧皮部，病毒不能机械接种，只能通过介体蚜虫以持久非增殖型方式、农杆菌浸润或者嫁接等方式进行传播(Domier,2011；Mayo and Ziegler-Graff,1996；Taliansky et al.,2003)。
防治病毒病最实用的方法是选育和利用抗病品种，因此首先需要建立科学实用的抗性鉴定方式对品种进行客观的抗性评价。BrYV传播方式特殊也在于不能进行机械接种。研究者多利用发病植株饲喂无毒蚜虫以获得病毒进行接种，而发病植株往往受到病毒侵染难以长期保存，需在采集后尽快饲毒，并且在田间采集的发病植株往往不是单一病毒侵染，极大地限制了研究时间和可靠性，这给围绕BrYV等马铃薯卷叶属病毒开展的抗病遗传育种及选育带来一定的难度。Zhang等对灰飞虱传播的水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)的研究中发现采用冷冻方法保存的病叶中病毒仍然具有侵染性，可用于病毒的接种(Zhanget al.,2007)。Zhou等在同为灰飞虱传播的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streakeddwarf virus,RBSDV)的研究中也采用冷冻病叶方式保存RBSDV，并通过灰飞虱从冷冻病叶中获得具有侵染性的病毒(Zhou et al.,2010)。而对于利用蚜虫从冷冻病叶中获得具有侵染性马铃薯卷叶属病毒尚未见报道，而且利用转病毒全长基因组的转基因植物作为毒源的成功应用也未见正式报道。BrYV自然条件下只能通过蚜虫传播，尽管有病毒侵染性cDNA克隆由农杆菌介导侵染，但存在接种效率不稳定和不能完全取代自然介体接种条件，因此需要解决毒源保存并可以进行蚜虫传毒的方法。因此，本研究采用BrYV全长cDNA转基因拟南芥种子来源的植株和冷冻病叶进行无毒蚜虫饲毒及获毒后病毒传播能力试验，明确此方法简便、准确、可行，以期望为芸薹黄化病毒等马铃薯卷叶属病毒的抗病育种及此类病毒与寄主互作研究以及所致病毒病防控试验提供基础技术手段。
发明内容
为实现上述目的，本发明首先提供一种利用桃蚜(Myzus persicae)获得马铃薯卷叶属芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus，BrYV)的方法，具体步骤为：
S1：获得携带芸薹黄化病毒的病毒转基因植株；
S2：获得饲毒用无毒蚜虫；
S3：用所述无毒桃蚜从含有病毒基因组的转基因植株和冷冻病叶中获得病毒；
S4：检测获毒后所述桃蚜的传毒能力。
其中，所述病毒转基因植株是BrYV病毒全长cDNA转基因拟南芥株系植株，可使用长成的转基因植株、预先采集发病叶片或保存的冷冻病叶；
进一步地，所述冷冻病叶获得是将转基因拟南芥种子播种之后，植株生长至3-4周采集或者农杆菌接种发病及田间采集发病植株并进行预先冷冻处理，冷冻温度为-20℃-30℃；
其中，步骤S2进一步包括：鉴定传毒蚜虫为桃蚜、分离获得无毒单克隆系桃蚜的步骤；
进一步地，所述鉴定传毒蚜虫为桃蚜的步骤为：提取单头蚜虫DNA，利用蚜虫线粒体通用引物LEP-F：ATTCAACCAATCATAAAGATATTG(SEQ ID NO:1)，LEP-R：AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA(SEQ ID NO:2)，扩增蚜虫细胞色素氧化酶基因，扩增出的目的条带测序后在NCBI上进行Blast鉴定，对比与桃蚜(Myzus persicae strain YL-cabbage)的COI基因同源性为99％；
进一步地，所述分离获得无毒单克隆系桃蚜的步骤为：将所述已鉴定为桃蚜的蚜虫进行单头扩繁，分离初产若蚜转接于健康植物中进行大量扩繁，采用RT-PCR法检测确定蚜虫是否携带病毒；
其中，所述步骤S3具体为：选取生长至3-4周的芸薹黄化病毒转基因拟南芥，取适量病叶或者整株植物和已冻存于-20℃冷冻病叶作为毒源置于玻璃瓶中进行饲毒，每组处理接入60只2-4龄无毒的桃蚜，饲毒48小时后将存活的桃蚜移出并记录桃蚜存活的数量；
其中，步骤S4中检测获毒后所述桃蚜的传毒能力具体是采用RT-PCR方法检测接种后拟南芥发病率，检测所采用的的引物为：BrY4964F:CATAAAGCCCTTGTCGGCGAG(SEQ ID NO:3)；Br/Tu5635R:GTAGAACACTCGTTGCCTATCC(SEQ ID NO:4)。本发明还提供利用桃蚜(Myzuspersicae)获得马铃薯卷叶属芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus，BrYV)的方法的应用，具体应用在芸薹黄化病毒等马铃薯卷叶属病毒的生物学基础研究、十字花科品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究中。
通过本发明提供的使用桃蚜从芸薹黄化病毒基因组转基因植株及冷冻病叶中获得芸薹黄化病毒的方法，可以很好地克服蚜虫釆用感病植株获毒方法中患病植株难以长期保存、占用空间和毒源易混杂等的技术瓶颈，拓宽了介体昆虫获毒开展病毒-介体-寄主植物三者关系研究方法以及品种抗性鉴定时间和准确性。这一保存、获毒和传毒的简便方法可以广泛应用于芸薹黄化病毒等马铃薯卷叶属病毒的生物学基础研究、十字花科品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
附图说明
图1为BrYV转基因拟南芥及冷冻病叶饲毒桃蚜示意图；
图2为桃蚜从新鲜病叶及冷冻病叶中获取芸薹黄化病毒获毒率检测(M为Marker)；
图3为从新鲜病叶及冷冻病叶中获毒的桃蚜接种健康拟南芥后发病率检测(M为Marker)；
图4为蚜虫获毒后接种健康拟南芥14天后发病症状图；
图5为RT-PCR检测不同头数带毒蚜虫接种效率结果(M为Marker)。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例：桃蚜从病毒转基因拟南芥及冷冻病叶中获得芸薹黄化病毒的方法
①携带芸薹黄化病毒的病毒转基因植株的获得。
实验室陈相儒博士已利用农杆菌介导的拟南芥蘸花法将芸薹黄化病毒的全长cDNA侵染性克隆导入拟南芥基因组中，获得稳定遗传的纯合转基因拟南芥种子(BrYV111#，BrYV412#)。将携带芸薹黄化病毒的转基因种子播种之后，3-4周后挑选长势良好病毒转基因拟南芥，收集拟南芥叶片或者整株拟南芥，冻存于-20℃-30℃冰箱中。
②饲毒用无毒蚜虫的获得。
首先成功鉴定传毒蚜虫为桃蚜(Myzus persicae strain YL-cabbage)。2017年10月从中国农业大学园艺楼433室中采集蚜虫，挑选单头蚜虫提取DNA，蚜虫DNA提取方法为CTAB法：将单头新鲜的蚜虫置于1.5mL的离心管中，作好标记，备用。在离心管中加入300ulCTAB DNA提取buffer，充分振荡混匀。将离心管置于65℃加热器上30min，期间颠倒混匀几次，加入等体积Tris-酚仿充分混匀，12000rpm离心15min，吸取上清300ul。加入等体积氯仿异戊醇(24：1)，12000rpm离心15min，吸取上清200ul，加入等体积异丙醇室温沉淀10min，分别加入600ul 75％和100％乙醇各洗一次超净台吹干，加入30ul得到ddH2O溶解。随后利用蚜虫线粒体通用引物(通用引物为：LEP-F：ATTCAACCAATCATAAAGATATTG；LEP-R：AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA，扩增基因为蚜虫细胞色素氧化酶基因COI)，进行PCR扩增，PCR扩增体系为DNA模板1ul，在反应体系中加入2.5ul的10×Taq缓冲液，2ul的5M dNTPs(5mM each)，10uM的上下游引物各1ul，1.25U Taq DNA聚合酶，ddH2O补至25ul。94℃充分变性2min；之后94℃变性30sec，55℃退火30sec(复性温度根据所用引物的Tm值确定)，72℃延伸25sec(延伸时间根据所扩增片段的长度确定)，扩增30-35个循环；最后72℃充分延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(扩增目的条带约为708bp)。将扩增出的目的条带从琼脂糖上割下，并回收送测序公司测序，将测序公司测序结果在NC BI上进行Blast鉴定结果与桃蚜(Myzus persicae strain YL-cabbage)的COI基因同源性达到99％。
进一步成功分离获得无毒单克隆系桃蚜。首先将已鉴定为桃蚜的蚜虫进行单头扩繁，分离初产若蚜转接于健康植物中进行大量扩繁，采用RT-PCR法检测确定蚜虫是否携带病毒。参照Trizol(Reagent)提取接种植物及蚜虫的RNA。反转录体系按照M-MLV反转录酶(Promega)说明书进行。检测引物为：BrY5 149F:CATAAAGCCCTTGTCGGCGAG；Br/Tu5635R:GTAGAACACTCGTTGCCTATCC。PCR扩增体系为cDNA模板1ul，在反应体系中加入2.5ul的10×Taq缓冲液，2ul的5M dNTPs(5mM each)，10uM的上下游引物各1ul，1.25U Taq DNA聚合酶，ddH2O补至25ul。94℃充分变性2min；之后94℃变性30sec，55℃退火30sec(复性温度根据所用引物的Tm值确定)，72℃延伸45sec(延伸时间根据所扩增片段的长度确定)，扩增30-35循环；最后72℃充分延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增(扩增阳性对照条带约486bp)。因此，确定蚜虫后代不携带BrYV获得无毒单克隆系桃蚜命名为M433#，此后每次实验从群体中随机抽取进行饲毒和传毒实验。
③桃蚜从含有病毒基因组的转基因植株和冷冻病叶中获得病毒
首先分别选取生长至3-4周的芸薹黄化病毒转基因拟南芥，取适量病叶或者整株植物作为新鲜毒源放置于玻璃瓶中进行饲毒，取已冻存于-20℃(芸薹黄化病毒转基因拟南芥叶片，储存时间为180天和270天)的芸薹黄化病毒转基因拟南芥冷冻病叶作为毒源进行饲毒。取出后4℃放置3小时后，后移入玻璃瓶中，同时取等量的新鲜的健康叶片作为对照。每组处理接入60只2-4龄无毒的桃蚜，饲毒48小时后将存活的桃蚜移出并记录桃蚜存活的数量。每组实验重复3次。饲毒2天后，冷冻180天病叶、冷冻270天病叶、新鲜病叶和健康叶片存活桃蚜数平均为35.33，30.33，55.33和51.33，存活率分别为58.89％，50.56％，92.22％和85.56％。其中新鲜病叶饲毒桃蚜的存活率最高(为92.22％)，在冷冻病叶上饲毒的桃蚜存活率较低(为50.56％)，有一半以上的桃蚜能在冷冻病叶上存活两天。从每组处理饲毒存活的桃蚜中挑出16头接种健康拟南芥，采用单苗单虫方法接种于生长3周的拟南芥，注意拟南芥幼苗的生长和管理，14天以后开始观察拟南芥是否具有芸薹黄化病毒典型症状，如拟南芥下位叶片叶脉开始变紫等。接种3天后全部移出接种的蚜虫，提取单头蚜虫RNA并反转录进行RT-PCR检测，检测引物为BrY5149F和Br/Tu5635R，PCR扩增体系为cDNA模板1ul，在反应体系中加入2.5ul的10×Taq缓冲液，2ul的5M dNTPs(5mM each)，10uM的上下游引物各1ul，1.25U Taq DNA聚合酶，ddH2O补至25ul。94℃充分变性2min；之后94℃变性30sec，55℃退火30sec(复性温度根据所用引物的Tm值确定)，72℃延伸45sec(延伸时间根据所扩增片段的长度确定)，扩增30-35循环；最后72℃充分延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增(扩增阳性对照条带约671bp)每组实验3次重复。结果表明，冷冻180天病叶饲毒的桃蚜样本16头桃蚜移出之后提取RNA，经反转录反应后，PCR扩增出目的基因条带分别有13头，12头和15头，平均带毒率为87.5％；冷冻270天病叶饲喂的桃蚜样本扩增出目的基因条带分别有12头，13头和12头，平均带毒率为77.08％。新鲜病叶饲毒的桃蚜扩增出目的条带分别为15头，14头和16头，平均带毒率为93.75％(检测结果如图2A，2B)(表1)。这表明桃蚜能从病毒转基因植物及保存180天和270天的冷冻病叶上获得芸薹黄化病毒，3种处理之间桃蚜的获毒率没有显著差异。
表1冷冻病叶及对照饲毒后桃蚜存活率及带毒率
Figure BDA0002138517160000071
Figure BDA0002138517160000081
④获毒后桃蚜的传毒能力
将③中病毒转基因拟南芥新鲜病叶和冷冻180天和270天病叶饲毒的桃蚜，每组选取16只桃蚜，采用单苗单虫方法接种于生长3周的拟南芥上，每组重复实验3次，注意拟南芥幼苗的生长和管理，14天后开始观察拟南芥是否具有芸薹黄化病毒典型症状，如拟南芥下位叶片叶脉开始变紫等。RT-PCR方法检测接种后拟南芥发病率，检测引物为：BrY4964F:CATAAAGCCCTTGTCGGCGAG；Br/Tu5635R:GTAGAACACTCGTTGCCTATCC。结果显示，病毒转基因拟南芥新鲜毒源叶片饲毒桃蚜接种后发病植株分别为3棵、5棵和8棵，发病率为33.33％，180天冷冻病叶饲毒桃蚜接种后发病植株分别为1棵、4棵和3棵，发病率为16.67％，270天冷冻病叶饲毒桃蚜接种后发病植株分别为1棵、2棵和2棵，发病率为10.42％。扩增出目的条带的拟南芥均有典型的芸薹黄化病毒症状，检测无目的条带的拟南芥均无典型发病症状(表2，图4)。
表2冷冻病叶及对照饲毒后桃蚜接种拟南芥发病率
Figure BDA0002138517160000082
Figure BDA0002138517160000091
为了保证最佳传毒效率，开展了接种不同头数蚜虫处理的传毒效率试验，分别在健康拟南芥上接种1头、2头、4头、6头和10头带毒蚜虫，每次接种10棵拟南芥，重复3次，接种两天后杀虫剂喷杀蚜虫，14dpi后RT-PCR检测结果表明，当使用1头带毒蚜虫接种拟南芥发病率为30％，2头带毒蚜虫接种发病率为80％，4头带毒蚜虫接种发病率为90％，6头和10头蚜虫接种拟南芥发病率均为100％(表3)。
表3不同头数带毒蚜虫取食拟南芥发病率
接种蚜虫头数(头) 接种拟南芥数目(棵) 发病植株(棵) 发病率(％)
1 30 9 30
2 30 24 80
4 30 27 90
6 30 30 100
10 30 30 100
表明当使用6头及以上的带毒蚜虫可使病毒接种效率达到100％。以上实验表明桃蚜能够从病毒转基因拟南芥及冷冻病叶上获得芸薹黄化病毒后可以接种于拟南芥等寄主植物上，只需接种6头蚜虫即可保证病毒发病率达100％。
本发明主要服务于针对芸薹黄化病毒等马铃薯卷叶病毒属开展的应用于病毒-介体-寄主植物三者互作等基础生物学研究、十字花科品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域，能够加快研究的进程，具有简便性、快速性和准确性特点。
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attcaaccaa tcataaagat attg 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacttctgg atgtccaaaa aatca 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cataaagccc ttgtcggcga g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtagaacact cgttgcctat cc 22

Claims (6)

1.一种利用桃蚜(Myzus persicae)获得马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒(Brassicayellows virus，BrYV)的方法，具体步骤为：
S1：获得携带芸薹黄化病毒的病毒转基因植株；
S2：获得饲毒用无毒蚜虫；
S3：用所述无毒桃蚜从含有病毒基因组的转基因植株和冷冻病叶中获得病毒；
S4：检测获毒后所述桃蚜的传毒能力；
其中，步骤S2进一步包括：鉴定传毒蚜虫为桃蚜、分离获得无毒单克隆系桃蚜的步骤，所述鉴定传毒蚜虫为桃蚜的步骤为：提取单头蚜虫DNA，利用蚜虫线粒体通用引物LEP-F：ATTCAA CCAATCATAAAGATATTG，LEP-R：AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA，扩增蚜虫细胞色素氧化酶基因，扩增出的目的条带测序后在NCBI上进行Blast鉴定，对比与桃蚜Myzus persicaestrain YL-cabbage的COI基因同源性；
所述步骤S3具体为：选取生长至3-4周的芸薹黄化病毒转基因拟南芥，取适量病叶或者整株植物和已冻存于-20℃冷冻病叶作为毒源置于玻璃瓶中进行饲毒，每组处理接入60只2-4龄无毒的桃蚜，饲毒48小时后将存活的桃蚜移出并记录桃蚜存活的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒转基因植株是BrYV病毒全长cDNA转基因拟南芥株系植株，可使用长成的转基因植株、预先采集发病叶片或保存的冷冻病叶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷冻病叶获得是将转基因拟南芥种子播种之后，植株生长至3-4周采集或者农杆菌接种发病及田间采集发病植株并进行预先冷冻处理，冷冻温度为-20℃-30℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述分离获得无毒单克隆系桃蚜的步骤为：将所述已鉴定为桃蚜的蚜虫进行单头扩繁，分离初产若蚜转接于健康植物中进行大量扩繁，采用RT-PCR法检测确定蚜虫是否携带病毒。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中检测获毒后所述桃蚜的传毒能力具体是采用RT-PCR方法检测接种后拟南芥发病率，检测所采用的的引物为：BrY4964F:CATAAAGCCCTTGTCGGCGAG；Br/Tu5635R:GTAGAACACTCGTTGCCTATCC。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在马铃薯卷叶属芸薹黄化病毒的品种抗性评价和抗病品种选育中的应用。
CN201910660873.8A 2019-07-22 2019-07-22 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法 Active CN110396503B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910660873.8A CN110396503B (zh) 2019-07-22 2019-07-22 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910660873.8A CN110396503B (zh) 2019-07-22 2019-07-22 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110396503A CN110396503A (zh) 2019-11-01
CN110396503B true CN110396503B (zh) 2021-07-30

Family

ID=68324849

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910660873.8A Active CN110396503B (zh) 2019-07-22 2019-07-22 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110396503B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113575518A (zh) * 2021-07-27 2021-11-02 四川省农业科学院植物保护研究所 昆虫薄膜饲毒的方法及其应用
CN113913555B (zh) * 2021-11-09 2022-09-27 中国科学院西北生态环境资源研究院 一种芸薹黄化病毒的检测卡及检测试剂盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101168782A (zh) * 2007-10-23 2008-04-30 中国农业大学 一种蚜虫或植物感染RhPV病毒的检测方法
CN101401562B (zh) * 2008-11-13 2010-12-08 江苏省农业科学院 接种水稻黑条矮缩病毒专用灰飞虱的获得方法
CN101633908B (zh) * 2009-09-01 2011-04-13 江苏省农业科学院 灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法
CN101775373B (zh) * 2009-12-16 2012-05-23 中国农业科学院植物保护研究所 水稻黑条矮缩病毒冰冻毒源的活化方法
CN102134599B (zh) * 2010-12-28 2013-04-03 红云红河烟草(集团)有限责任公司 一种快速鉴别棉铃虫和烟青虫的分子生物学方法
CN103756975B (zh) * 2013-12-05 2015-09-23 南京农业大学 一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用
CN105746439B (zh) * 2016-03-09 2018-07-06 中国科学院微生物研究所 使灰飞虱获得水稻条纹病毒的方法及其人工饲料

Also Published As

Publication number Publication date
CN110396503A (zh) 2019-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9068195B2 (en) Methods for enhancing stress tolerance in plants and compositions thereof
Miyatake et al. Detailed mapping of a resistance locus against Fusarium wilt in cultivated eggplant (Solanum melongena)
WO2019154373A1 (zh) 抗虫耐除草剂玉米转化事件
Koeda et al. Inoculation of capsicums with Pepper yellow leaf curl Indonesia virus by combining agroinoculation and grafting
CN110396503B (zh) 一种利用桃蚜获取马铃薯卷叶病毒属芸薹黄化病毒的方法
CN107090464B (zh) 抗虫抗除草剂玉米转化事件及其创制方法和检测方法
Alcaide et al. Long-term cocirculation of two strains of pepino mosaic virus in tomato crops and its effect on population genetic variability
CN115976040A (zh) 本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
BR112014029381B1 (pt) Método para produzir uma planta de soja recombinante, método para produzir semente de soja híbrida, método para reprodução de plantas de soja e constructo
Obermeier et al. Characterization of distinct tombusviruses that cause diseases of lettuce and tomato in the western United States
Leibman et al. A transgenic RNAi approach for developing tomato plants immune to Pepino mosaic virus
CN109371055B (zh) 一种选育广谱抗马铃薯y病毒属病毒的烟草植物的方法
Maliogka et al. Criniviruses infecting vegetable crops
CN112312763B (zh) 烟草花叶病毒属抗性茄科植物
CN116515868A (zh) 玉米耐旱基因ZmMAPKKK1及其耐旱分子标记InDel-720和应用
Gramazio et al. Detection, molecular characterisation and aspects involving the transmission of tomato chlorotic dwarf viroid in eggplant
Zhang et al. Expression of the tomato pot-1 gene confers potato virus Y (PVY) resistance in susceptible potato varieties
CN111057707B (zh) 转基因抗虫玉米2hvb4外源插入片段的旁侧序列及其检测方法
CN112980874A (zh) GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用
CN111635906A (zh) 海岛棉GbCYP72A2基因、其编码蛋白和应用
Hsu et al. Resistance to Tomato mosaic virus (ToMV) in sweet pepper (Capsicum annuum L.)
WO2022262179A1 (zh) 无连锁累赘的抗斑萎病烟草植物及其选育方法
Shen et al. Screening and identification of tobacco mutants resistant to tobacco and cucumber mosaic viruses
CN117025834B (zh) 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用
Bhat et al. Production of Virus-Resistant Plants Through Transgenic Approaches

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant