CN102134599B - 一种快速鉴别棉铃虫和烟青虫的分子生物学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴别棉铃虫和烟青虫的方法，属于分子生物学领域。该法采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA；利用DNA条形码引物扩增线粒体CO1前部序列作为标记；进行物种鉴别的序列特征比对（diagnosticcharactersofnucleotides）。本发明能对同种棉铃虫和烟青虫的不同生物型以及其幼虫或残缺个体进行鉴定，具有迅速、便捷的特点，且比传统的形态学鉴别更准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，更具体地说，本发明涉及一种可快速鉴别棉铃虫和烟青虫的分子生物学方法。
背景技术
烟草是我国财政的重要支柱之一，烟青虫（Helicoverpa assulta）和棉铃虫（H. armigera）均是烟草生产上的主要害虫。二者为同域发生近缘种，同属鳞翅目夜蛾科。二者在形态学、行为学和生态学方面都极其相似，它们的鉴定一直是棉铃虫和烟青虫研究中一个困难的技术瓶颈。而准确的物种鉴定是物种分布调查及种群发生动态研究的前提，也是深入开展生物学、综合防治等研究的基础。
传统的鉴定棉铃虫和烟青虫方法主要依赖于它们的形态特征，但存在较大的局限：(1)近缘种之间的区别特征少且不明显，传统方法容易造成错误鉴别；(2)用传统的方法几乎无法做到鉴定同种害虫的不同生物型；(3)传统的鉴定方法难以提供针对两种害虫幼虫或残缺个体的鉴别。因此，传统鉴定两种近缘种的方法不仅费时费力，且常受主观因素干扰，极易混淆出错。
二十世纪九十年代，随着分子生物学的迅速发展，尤其是PCR技术的日趋完善，越来越多的分子生物学技术应用于物种鉴定和分类，但这些研究没有统一的分子标记，因而适用范围极为有限。近年来，基于分子鉴定，DNA条形码应运而生，旨在形成一种快速、精确、可自动化以及全球通用的分类鉴定工具，以满足不同研究领域和行业对于物种鉴定的迫切需求。
DNA条形码，也称DNA条形编码，类似于超级市场商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，是利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cytochrome C oxidase I，COI）的前部长约650bp序列作为标记来实现快速、准确和自动化地对物种进行鉴定和分类。DNA条形码可以检测物种间及同种个体间的细微差别，为近缘种及种下阶元的分类鉴定提供了新的手段，弥补了传统形态鉴定的诸多不足。但是目前国内外尚无利用DNA条形码作为分子标记区别鉴定烟青虫和其近缘种棉铃虫的报道。
发明内容
本发明的目的是针对棉铃虫和烟青虫形态鉴定不准确，科学鉴别手段缺乏的不足，提供了一种科学有效、简便快捷、准确的分子生物学鉴定方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明提供了一种快速鉴别棉铃虫和烟青虫的分子生物学方法，该法包括下述顺序的步骤：
（1） 采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取棉铃虫和烟青虫总DNA；
（2） 利用DNA条形码引物COIF: 5' –ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' 和 COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'进行PCR扩增和测序；
（3） 依据附表1的序列特征变异位点进行物种鉴别。
步骤（1）中，为避免真菌和线虫的污染，舍去腹部，翅部以及触角，只从头、胸以及腿部提取DNA。
步骤（2）中，PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl2，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位。加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系。 PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟。35个循环后，72℃再延伸10分钟。测序反应按厂家建议的条件，使用Applied公司的BigDye Terminator kit（V2.0）在ABI 377 自动测序仪（Applied Biosystems）上电泳测序。
步骤（3）中，依据表1，与棉铃虫的序列特征位点一致的为棉铃虫，与烟青虫的序列特征位点一致的为烟青虫。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.本棉铃虫和烟青虫分子生物学鉴别方法能对两种害虫不同生物型以及幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷的特点，通常2天即可完成，相比传统的形态特征鉴定方法，既可节省时间又可减少费用。
2. 本棉铃虫和烟青虫分子生物学鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
3. 本棉铃虫和烟青虫分子生物学鉴别方法从根本上解决了当前棉铃虫和烟青虫较难进行准确鉴定的难题，填补了行业空白，具有重要意义。
附表说明
表1显示了棉铃虫和烟青虫的核苷酸序列特征变异位点。位点的序号以本片段核苷酸位置为基准。
表1.
| 031 | 040 | 085 | 088 | 169 | 181 | 217 | 262 | 274 | 286 | 313 | 340 | 368 | 385 | 386 | 400 | |
| 棉铃虫 | A | R | Y | A | A | K | A | R | Y | R | Y | C | R | Y | C | T |
| 烟青虫 | T | A | T | G | T | T | R | A | C | A | T | T | G | T | T | C |
| 418 | 439 | 451 | 477 | 478 | 496 | 499 | 536 | 539 | 547 | 562 | 565 | 595 | 601 | 616 | 631 | 646 | |
| 棉铃虫 | C | Y | T | G | C | R | A | Y | Y | A | A | T | Y | T | Y | T | T |
| 烟青虫 | T | T | A | A | T | R | T | T | T | T | T | A | T | C | C | A | C |
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进行进一步详细描述。
实施例1
——采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取棉铃虫和烟青虫总DNA。
为避免真菌和线虫的污染，本发明舍去了腹部，翅部以及触角，只从头、胸以及腿部提取DNA。 DNA提取参照标准酚-氯仿法（the standard phenol/chloroform protocol）或直接利用DNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）提取。
实施例2
——利用DNA条形码引物PCR扩增线粒体COI基因片段和序列测定，具体包括以下步骤：
①PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl2，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位。加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系。反应在RoboCycler Gradient 40 (Stratagene)热循环仪上完成。
②PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟。35个循环后，72℃再延伸10分钟。测序反应按厂家建议的条件，使用Applied公司的BigDye Terminator kit（V2.0）在ABI 377 自动测序仪（Applied Biosystems）上电泳测序。正、反链均测。
③PCR扩增和测序所用引物为
COIF: 5' –ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'。
实施例3
——依据序列特征变异位点进行物种鉴别。
经测序仪分析的电泳图谱用DNASTAR中的Seqman结合人工作正反链拼接，用Clustal W排序，序列变异分析用MEGA 2.1进行。
表2显示了棉铃虫和烟青虫的核苷酸序列特征变异位点。位点的序号以本片段核苷酸位置为基准。相关的简并碱基（degenerate bases）代码为R= （A/G），Y=（C/T），K=（G/T）。
表2.
| 031 | 040 | 085 | 088 | 169 | 181 | 217 | 262 | 274 | 286 | 313 | 340 | 368 | 385 | 386 | 400 | |
| 棉铃虫 | A | R | Y | A | A | K | A | R | Y | R | Y | C | R | Y | C | T |
| 烟青虫 | T | A | T | G | T | T | R | A | C | A | T | T | G | T | T | C |
| 418 | 439 | 451 | 477 | 478 | 496 | 499 | 536 | 539 | 547 | 562 | 565 | 595 | 601 | 616 | 631 | 646 | |
| 棉铃虫 | C | Y | T | G | C | R | A | Y | Y | A | A | T | Y | T | Y | T | T |
| 烟青虫 | T | T | A | A | T | R | T | T | T | T | T | A | T | C | C | A | C |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种快速鉴别棉铃虫和烟青虫的分子生物学方法，其特征在于，该方法包括下述顺序的步骤：
（1）采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取棉铃虫和烟青虫总DNA；
（2）利用DNA条形码引物扩增线粒体CO1前部序列作为标记， 其中，所使用的引物为COIF: 5'-ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' 和 COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'；
（3）进行物种鉴别的序列特征比对,其中，是按下表所示的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别：
。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤1 中为避免真菌和线虫的污染，舍去腹部，翅部以及触角，只从其头、胸及腿部提取DNA。
3.据权利要求1所述的快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤2的PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl2，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位；具体操作为，加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系；PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟；5个循环后，72℃再延伸10分钟；测序反应按厂家建议的条件，使用Applied公司的BigDye Terminator kit（V2.0）在ABI 377 自动测序仪（Applied Biosystems）上电泳测序。
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