CN102373292A - 一种快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴别斜纹夜蛾和其它两种夜蛾科害虫（棉铃虫和烟青虫）的分子生物学方法。该法采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA；利用DNA条形码引物扩增线粒体CO1前部序列作为标记；进行物种鉴别的序列特征比对（diagnosticcharactersofnucleotides）。本发明能对同种斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫的不同生物型以及其幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷的特点，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可快速鉴别斜纹夜蛾和其它两种夜蛾科害虫（棉铃虫和烟青虫）的分子生物学方法。
背景技术
斜纹夜蛾（Spodoptera litura (Fabricius)），是一种多食性、暴食性的世界性农业害虫，为我国十大经济害虫之一，危害植物包括重要的能源作物玉米，木薯和芋头等。由于斜纹夜蛾、棉铃虫（Helicoverpa armigera）和烟青虫（H. assulta）同属鳞翅目夜蛾科，卵、幼虫和蛹无论是体型还是颜色和花纹都十分相似，很难鉴定；昆虫分类学家通常根据三者成虫的外生殖器（genitalia）特征进行鉴别。但这种传统的物种鉴定主要依赖于专业的昆虫分类学家花费大量时间和精力整理积累后所描述的形态特征，存在较大的局限，不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错。其次，传统的鉴定方法难以开展针对三者幼虫或残缺个体的鉴别。
快速而准确的物种鉴定是科学经济地防治害虫的必要前提和基础。由于我国大部分地区农业生产均采取间混套作(intercropping/interplanting)模式，使得这三种害虫常常得以同域混合发生。因此有必要寻找一些快速、准确鉴别这三种害虫的方法，从而及时有效地控制其给能源作物生产带来的危害。
近年来，DNA条形码为物种分类鉴定提供了新的研究方法和手段。DNA条形码，也称DNA条形编码，类似于超级市场商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，是利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cytochrome C oxidase I，COI）的前部长约650bp序列作为标记来实现快速、准确和自动化地对物种进行鉴定和分类。DNA条形码快速而精确的特点弥补了传统形态鉴定的诸多不足，使其广泛应用于动物分类鉴定中。但是目前国内外尚无利用DNA条形码作为分子标记区别鉴定斜纹夜蛾、烟青虫和棉铃虫的报道。
因此，本发明首次通过DNA条形码，即扩增测定其线粒体DNA的COI基因序列，结合相关软件进行分析处理，实行快速简捷，经济实惠地对三种害虫进行物种鉴定；最终为及时有效地控制斜纹夜蛾的危害，从而保护其危害的能源植物，提高能源作物产量，降低能源作物产业成本提供必要的前提和基础。
发明内容
本发明的目的是针对斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫形态鉴定不准确，科学鉴别手段缺乏的不足，提供一种科学有效、简便快捷、准确的夜蛾科害虫的分子生物学鉴定方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明的分子生物学方法包括以下步骤：
（1）采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫总DNA；
（2）利用DNA条形码引物COIF: 5' –ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' 和 COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'进行PCR扩增和测序；
（3）依据斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫的核苷酸的序列特征变异位点进行物种鉴别，位点的序号以本片段核苷酸位置为基准。（如表1）
表1显示了斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫的核苷酸序列特征变异位点。位点的序号以本片段核苷酸位置为基准。
表1.
| 031 | 040 | 049 | 059 | 070 | 079 | 081 | 085 | 088 | 091 | 127 | 169 | 181 | 190 | 217 | 220 | 238 | 241 | 242 | |
| 斜纹夜蛾 | A | A | C | Y | T | A | Y | A | G | A | A | T | A | A | A | T | A | T | T |
| 棉铃虫 | A | R | T | T | A | T | A | Y | A | T | T | A | K | T | A | C | C | A | A |
| 烟青虫 | T | A | T | T | A | T | A | T | G | T | T | T | T | T | R | C | C | A | A |
| 262 | 263 | 265 | 266 | 268 | 271 | 274 | 283 | 286 | 289 | 298 | 313 | 319 | 325 | 340 | 346 | 349 | 352 | 364 | |
| 斜纹夜蛾 | A | C | T | T | A | A | T | C | A | A | T | T | R | T | C | C | C | C | T |
| 棉铃虫 | R | T | A | C | T | C | Y | T | R | T | A | Y | A | A | C | A | T | A | A |
| 烟青虫 | A | T | A | C | T | C | C | T | A | T | A | T | A | A | T | A | T | A | A |
| 368 | 370 | 385 | 386 | 400 | 401 | 403 | 406 | 407 | 418 | 436 | 439 | 442 | 451 | 467 | 468 | 477 | 478 | 484 | |
| 斜纹夜蛾 | G | T | T | T | C | C | T | C | Y | T | T | T | C | T | C | G | A | T | A |
| 棉铃虫 | R | A | Y | C | T | T | A | T | T | C | A | Y | T | T | A | A | G | C | T |
| 烟青虫 | G | A | T | T | C | T | A | T | T | T | A | T | T | A | A | A | A | T | T |
| 496 | 499 | 506 | 536 | 539 | 547 | 553 | 562 | 565 | 578 | 580 | 586 | 595 | 596 | 598 | 601 | 607 | 616 | 619 | |
| 斜纹夜蛾 | A | T | G | T | T | T | T | T | A | T | A | T | T | T | A | T | A | T | R |
| 棉铃虫 | R | A | A | Y | Y | A | A | A | T | C | T | A | Y | C | T | T | T | Y | T |
| 烟青虫 | R | T | A | T | T | T | A | T | A | C | T | A | T | C | T | C | T | C | T |
| 620 | 622 | 623 | 631 | 634 | 641 | 643 | 646 | |
| 斜纹夜蛾 | K | A | K | T | C | C | T | T |
| 棉铃虫 | G | T | G | T | T | T | A | T |
| 烟青虫 | G | T | G | A | T | T | A | C |
步骤（1）中，为避免真菌和线虫的污染，舍去腹部，翅部以及触角，只从头、胸以及腿部提取DNA。
步骤（2）中，PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl2，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位。加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系。 PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟。35个循环后，72℃再延伸10分钟。测序反应按厂家建议的条件，使用Applied公司的BigDye Terminator kit（V2.0）在ABI 377 自动测序仪（Applied Biosystems）上电泳测序。
步骤（3）中，依据表1，与斜纹夜蛾的序列特征位点一致的为斜纹夜蛾；与棉铃虫的序列特征位点一致的为棉铃虫；与烟青虫的序列特征位点一致的为烟青虫。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.本斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫分子生物学鉴别方法能对三种害虫不同生物型以及幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷的特点，通常2天即可完成，相比传统的形态特征鉴定方法，既可节省时间又可减少费用。
2. 本斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫分子生物学鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
3. 本斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫分子生物学鉴别方法从根本上解决了当前棉铃虫和烟青虫较难进行准确鉴定的难题，填补了行业空白，具有重要意义。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进行进一步详细描述。
实施例1
1、采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫总DNA。为避免真菌和线虫的污染，本发明舍去了腹部，翅部以及触角，只从头、胸以及腿部提取DNA。 DNA提取参照标准酚-氯仿法（the standard phenol/chloroform protocol）或直接利用DNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）提取。
2、利用DNA条形码引物PCR扩增线粒体COI基因片段和序列测定，具体包括以下步骤：
①PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl2，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位。加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系。反应在RoboCycler Gradient 40 (Stratagene)热循环仪上完成。
②PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟。35个循环后，72℃再延伸10分钟。测序反应按厂家建议的条件，使用Applied公司的BigDye Terminator kit（V2.0）在ABI 377 自动测序仪（Applied Biosystems）上电泳测序。正、反链均测。
③PCR扩增和测序所用引物为
COIF: 5' –ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'。
3、依据序列特征变异位点进行物种鉴别。
经测序仪分析的电泳图谱用DNASTAR中的Seqman结合人工作正反链拼接，用Clustal W排序，序列变异分析用MEGA 2.1进行。
表1显示了斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫的核苷酸序列特征变异位点。位点的序号以本片段核苷酸位置为基准。
表1.
| 031 | 040 | 049 | 059 | 070 | 079 | 081 | 085 | 088 | 091 | 127 | 169 | 181 | 190 | 217 | 220 | 238 | 241 | 242 | |
| 斜纹夜蛾 | A | A | C | Y | T | A | Y | A | G | A | A | T | A | A | A | T | A | T | T |
| 棉铃虫 | A | R | T | T | A | T | A | Y | A | T | T | A | K | T | A | C | C | A | A |
| 烟青虫 | T | A | T | T | A | T | A | T | G | T | T | T | T | T | R | C | C | A | A |
| 262 | 263 | 265 | 266 | 268 | 271 | 274 | 283 | 286 | 289 | 298 | 313 | 319 | 325 | 340 | 346 | 349 | 352 | 364 | |
| 斜纹夜蛾 | A | C | T | T | A | A | T | C | A | A | T | T | R | T | C | C | C | C | T |
| 棉铃虫 | R | T | A | C | T | C | Y | T | R | T | A | Y | A | A | C | A | T | A | A |
| 烟青虫 | A | T | A | C | T | C | C | T | A | T | A | T | A | A | T | A | T | A | A |
| 368 | 370 | 385 | 386 | 400 | 401 | 403 | 406 | 407 | 418 | 436 | 439 | 442 | 451 | 467 | 468 | 477 | 478 | 484 | |
| 斜纹夜蛾 | G | T | T | T | C | C | T | C | Y | T | T | T | C | T | C | G | A | T | A |
| 棉铃虫 | R | A | Y | C | T | T | A | T | T | C | A | Y | T | T | A | A | G | C | T |
| 烟青虫 | G | A | T | T | C | T | A | T | T | T | A | T | T | A | A | A | A | T | T |
| 496 | 499 | 506 | 536 | 539 | 547 | 553 | 562 | 565 | 578 | 580 | 586 | 595 | 596 | 598 | 601 | 607 | 616 | 619 | |
| 斜纹夜蛾 | A | T | G | T | T | T | T | T | A | T | A | T | T | T | A | T | A | T | R |
| 棉铃虫 | R | A | A | Y | Y | A | A | A | T | C | T | A | Y | C | T | T | T | Y | T |
| 烟青虫 | R | T | A | T | T | T | A | T | A | C | T | A | T | C | T | C | T | C | T |
| 620 | 622 | 623 | 631 | 634 | 641 | 643 | 646 | |
| 斜纹夜蛾 | K | A | K | T | C | C | T | T |
| 棉铃虫 | G | T | G | T | T | T | A | T |
| 烟青虫 | G | T | G | A | T | T | A | C |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于该方法按以下述步骤进行：
（1）采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取夜蛾科害虫总DNA；
（2）利用DNA条形码引物扩增线粒体CO1前部序列进行PCR扩增和测序作为标记；
（3）依据害虫的核苷酸的序列特征变异位点进行物种鉴别。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于所述步骤（1）中为避免真菌和线虫的污染，舍去腹部，翅部以及触角，只从其头、胸及腿部提取DNA。
3.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于所述步骤（2）的PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl2，1mM dNTP，2 μg/μl BSA，正、反向引物各2 pM，TaqDNA 聚合酶1个单位；具体操作为，加去离子水调至终体积50μl，以石蜡油封盖体系；PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃ 变性1分钟，50℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟；5个循环后，72℃再延伸10分钟，上电泳测序。
4.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于步骤（2）中利用DNA条形码引物为COIF: 5' –ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' 和 COIR: 5'-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3'。
5.根据权利要求1所述的快速鉴别夜蛾科害虫的分子生物学方法，其特征在于所述步骤（3）是按下表所示的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别：
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