RU2807352C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров для генотипирования грибов видового комплекса colletotrichum acutatum - Google Patents
Набор олигонуклеотидных праймеров для генотипирования грибов видового комплекса colletotrichum acutatum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807352C1 RU2807352C1 RU2022133328A RU2022133328A RU2807352C1 RU 2807352 C1 RU2807352 C1 RU 2807352C1 RU 2022133328 A RU2022133328 A RU 2022133328A RU 2022133328 A RU2022133328 A RU 2022133328A RU 2807352 C1 RU2807352 C1 RU 2807352C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- insdqualifier
- insdseq
- insdfeature
- species
- Prior art date
Links
- 241001123536 Colletotrichum acutatum Species 0.000 title claims abstract description 39
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 29
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 51
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102100040428 Chitobiosyldiphosphodolichol beta-mannosyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 101100098899 Epichloe typhina TUBB gene Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101000891557 Homo sapiens Chitobiosyldiphosphodolichol beta-mannosyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101150083762 TUBB2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101150048667 tub-2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101150058497 ANPEP gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims description 10
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 241001306236 Colletotrichum lupini Species 0.000 abstract description 59
- 240000000894 Lupinus albus Species 0.000 abstract description 30
- 235000010649 Lupinus albus Nutrition 0.000 abstract description 12
- 244000045959 Lupinus luteus Species 0.000 abstract description 10
- 235000010648 Lupinus luteus Nutrition 0.000 abstract description 8
- 241000950636 Colletotrichum nymphaeae Species 0.000 abstract description 7
- 241001001311 Colletotrichum costaricense Species 0.000 abstract description 6
- 241001001314 Colletotrichum cuscutae Species 0.000 abstract description 6
- 241001001934 Colletotrichum melonis Species 0.000 abstract description 6
- 241000952517 Colletotrichum paranaense Species 0.000 abstract description 6
- 241001405243 Colletotrichum simmondsii Species 0.000 abstract description 6
- 241001001910 Colletotrichum tamarilloi Species 0.000 abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018783 Dacrycarpus dacrydioides Nutrition 0.000 abstract description 2
- 240000007263 Pinus koraiensis Species 0.000 abstract description 2
- 235000008578 Pinus strobus Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 33
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 7
- 240000005265 Lupinus mutabilis Species 0.000 description 6
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 4
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 240000005776 Lupinus angustifolius Species 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 244000193629 Cyphomandra crassifolia Species 0.000 description 2
- 235000000298 Cyphomandra crassifolia Nutrition 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- -1 ACT Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150026868 CHS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 235000017165 Caryocar brasiliense Nutrition 0.000 description 1
- 241000176785 Caryocar brasiliense Species 0.000 description 1
- 241000723377 Coffea Species 0.000 description 1
- 241000207901 Cuscuta Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000629490 Glomerellales Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 241000861927 Lupinus mexicanus Species 0.000 description 1
- 235000008755 Lupinus mutabilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219815 Lupinus polyphyllus Species 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000005205 Pinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000218602 Pinus <genus> Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241001326533 Sordariomycetes Species 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003967 crop rotation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии. Предложен способ определения видовой принадлежности изолятов и/или штаммов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum в образце, включающий следующие этапы: выделяют общую ДНК из образца, предположительно содержащего мицелий гриба; проводят ПЦР с праймерами и методом секвенирования определяют последовательности нуклеотидов ампликонов локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1; методом выравнивания последовательностей и филогенетического сравнения c генетическими базами данных, содержащими последовательности по локусам ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 для грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, определяют качественный видовой и внутривидовой состав грибов рода Colletotrichum в анализируемом образце. Изобретение позволяет расширить набор средств для амплификации и прицельного секвенирования нового поколения фрагментов локусов (ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1) различных изолятов вида Colletotrichum lupini, возбудителя антракноза люпина белого и люпина жёлтого, а также близких ему видов комплекса Colletotrichum acutatum (C.tamarilloi, C.costaricensis, C.melonis, C.cuscutae, C.paranaense, C.nymphaeae, C.simmondsii, C.acutatum). Также изобретение позволяет повысить точность и скорость установления видовой принадлежности моноспоровых и мультиспоровых изолятов видов комплекса Colletotrichum acutatum, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации сельскохозяйственно значимых изолятов антракноза, фитосанитарного контроля распространения патогенных штаммов, контроля инфекционного фона на селекционных и семеноводческих участках люпина белого и люпина жёлтого. 3 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил., 2 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, молекулярной биологии, фитопатологии, в частности относится к контролю распространения возбудителя антракноза Colletotrichum lupini. В частности, относится к селекции люпина белого и люпина желтого на устойчивость к антракнозу, где используется для контроля инфекционного фона.
Уровень техники
Антракноз люпина, вызываемый по всему миру несовершенными грибами вида Colletotrichum lupini, обладающими высокой агрессивностью и вирулентностью по отношению растению-хозяину и приводящий к потерям до 90% урожая в отдельные годы, остается неразрешенной проблемой (Thomas G., et al., Application of fungicides to reduce yield loss in anthracnose-infected lupins. Crop Prot. 2008; 27, 1071–1077). Это препятствует включению в севооборот и увеличению посевных площадей люпина белого и люпина желтого. На сегодняшний момент проводится активный мониторинг распространения возбудителя антракноза по районам возделывания люпина, с целью определения регионов видообразования Colletotrichum lupini и определения карантинных зон, из-за наличия в них наиболее вредоносных изолятов гриба. Одной из основных задач для селекционеров, занимающихся люпином, остается поиск источников устойчивости к антракнозу, а также определение локусов в геноме, связанных с устойчивостью к данному заболеванию (Alkemade J.A., et al., Genetic diversity of Colletotrichum lupini and its virulence on white and Andean lupin. Sci Rep 11, 13547 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-92953-y). Однако, чтобы ставить контролируемые эксперименты по картированию локусов устойчивости и контролировать инфекционный фон в селекционных питомниках, необходимо обладать инструментом для точного определения генотипов грибов вида C. lupini.
Род Colletotrichum (тип Ascomycota, подтип Sordariomycetes, порядок Glomerellales) содержит по меньшей мере 150 видов, разделенных на десять основных клад. Одним из крупнейших из них является видовой комплекс Colletotrichum acutatum, в который входит вид Colletotrichum lupini, включает грибковые патогены, поражающие большое разнообразие растений в естественных и управляемых экосистемах. Видовой комплекс имеет очень широкий спектр хозяев, и штаммы были связаны с болезнями более чем 90 родов растений и по меньшей мере трех видов насекомых (Lardner, R., et al., Morphological and Molecular Analysis of Colletotrichum Acutatum Sensu Lato. Mycological Research 103, no. 3 (March 1999): 275–85. https://doi.org/10.1017/S0953756298007023). Согласно опубликованным данным, для генотипирования изолятов антракноза используют тест-системы, основанные на классической ПЦР, ПЦР в реальном времени с гибридизационными пробами (TaqMan), секвенирование по Сэнгеру (Kamber, Tim, et al., A QPCR Assay for the Fast Detection and Quantification of Colletotrichum Lupini. Plants 10, no. 8 (July 28, 2021): 1548. https://doi.org/10.3390/plants10081548). Классические ПЦР системы основаны на отсутствии/наличии фрагмента ДНК заведомо известного размера, определяемого с использованием агарозного или акриламидного гель-электрофореза после проведения реакции. При наличии фрагмента требуемого размера диагностируется принадлежность изучаемого образца к виду Colletotrichum lupini. Также для генотипирования и решения филогенетичских задач были созданы системы, основанные на определении количества повторов в микросателлитных последовательностях (Pecchia, Susanna, et al., Molecular Detection of the Seed-Borne Pathogen Colletotrichum Lupini Targeting the Hyper-Variable IGS Region of the Ribosomal Cluster. Plants 8, no. 7 (July 14, 2019): 222. https://doi.org/10.3390/plants8070222). Для выявления абсолютного и относительного уровня инфицирования растения-хозяина патогеном используются ПЦР-системы в реальном времени, основанные на гибридизации пробы (TaqMan) с флюорофором и гасителем к комплементарной матрице. Для решения филогенетических задач наиболее точным способом генотипирования, однако имеющим свои ограничения, остается метод секвенирования по Сенгеру нескольких локусов (ITS, GAPDH, TUB2, CHS-1, ACT, HIS3, HMG, APN/MAT1) как совместно, так и отдельно и обладающих высоким полиморфизмом среди видового комплекса Colletotrichum acutatum (Dubrulle, Guillaume, et al., Phylogenetic Diversity and Effect of Temperature on Pathogenicity of Colletotrichum Lupini. Plant Disease 104, no. 3 (March 2020): 938–50. https://doi.org/10.1094/PDIS-02-19-0273-RE). Однако в случае необходимости генотипирования большого количества образцов затраты на секвенирование методом Сенгера всех перечисленных локусов будут существенными. Так же данный метод возможно использовать только на моноспоровых культурах или линиях грибов, из-за этого время, требующееся для проведения анализа, значительно увеличивается.
Сущность изобретения
Одним из способов решения вышеозначенной проблемы является разработка набора олигонуклеотидных праймеров, специфически комплементарных консервативным участкам геномов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, подходящих для идентификации сельскохозяйственно значимых видов рода Colletotrichum, в том числе возбудителя антракноза люпина белого и люпина желтого Colletotrichum lupini, продукты амплификации которых обладают размером не более 400 п. н., и их возможно использовать для последующего секвенирования нового поколения.
Задача определения видовой принадлежности грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum решается путем создания набора специфичных праймеров, представляющими собой набор из олигонуклеотидных последовательностей длинной от 20 до 30 дезокирибонуклеотидов, к консервативным участкам локусов, обладающих видоспецифичными полиморфизмами и подходящими для секвенирования нового поколения (GTseq, AmpSeq, CleanPlex и др.).
Описанный в данном изобретении набор олигонуклеотидов разработан на основании анализа нуклеотидного разнообразия вариабельных участков моноспоровых линий грибов, в том числе патогенных, видового комплекса Colletotrichum acutatum.
Указанная задача решается путем создания набора праймеров для определения видовой принадлежности изолятов и/или штаммов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, включающего следующие стадии:
1. Выделяют общую ДНК из образца или образцов, предположительно содержащих мицелий гриба.
2. К патентуемым праймерам (SEQ _ID_NO:1, SEQ _ID_NO:2, SEQ _ID_NO:3, SEQ _ID_NO:4, SEQ _ID_NO:5, SEQ _ID_NO:6, SEQ _ID_NO:7, SEQ _ID_NO:8, SEQ _ID_NO:9, SEQ _ID_NO:10, SEQ _ID_NO:11, SEQ _ID_NO:12, SEQ _ID_NO:13, SEQ _ID_NO:14, SEQ _ID_NO:15, SEQ _ID_NO:16, SEQ _ID_NO:17, SEQ _ID_NO:18, SEQ _ID_NO:19, SEQ _ID_NO:20) со стороны 5’- конца добавляется служебная последовательность, необходимая для присоединения технических последовательностей (последовательностей-адаптеров) (Yang, S., Fresnedo-Ramírez, J., Wang, M. et al. A next-generation marker genotyping platform (AmpSeq) in heterozygous crops: a case study for marker-assisted selection in grapevine. Hortic Res 3, 16002 (2016). https://doi.org/10.1038/hortres.2016.2; Campbell, N.R., Harmon, S.A. and Narum, S.R. (2015), Genotyping-in-Thousands by sequencing (GT-seq): A cost effective SNP genotyping method based on custom amplicon sequencing. Mol Ecol Resour, 15: 855-867. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12357), зависящих от типа приготовляемой ДНК-библиотеки для секвенирования нового поколения и для последующего демультиплексирования и анализа образцов.
3. Методом мультиплексной ПЦР с использованием набора праймеров создается ДНК-библиотека ампликонов для всех исследуемых образцов.
4. Методом секвенирования нового поколения определяется последовательность нуклеотидов для каждого ампликона с двух сторон с длинной прочтений с каждой стороны не менее 150 нуклеотидов одновременно для всех образцов.
5. Биоинформатическими методами выравнивания последовательностей и филогенетического сравнения c генетическими базами данных, содержащими последовательности по локусам ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 для грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, определяется качественный видовой и внутривидовой состав в анализируемых образцах.
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что для каждого из образцов последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 или каждого из локусов в отдельности можно определить с помощью секвенирования по Сэнгеру, но без необходимости добавления к 5’-концам праймеров технических последовательностей.
Таким образом, в рамках настоящего изобретения разработан набор олигонуклеотидных последовательностей, праймеров, для идентификации сельскохозяйственно значимых изолятов гриба Colletotrichum lupini, являющегося возбудителем антракноза люпина белого и люпина желтого, методом секвенирования ДНК путем амплификации и последующего определения нуклеотидных последовательностей фрагментов внутреннего транскрибируемого региона и 5.8S рРНК между генами малой (18S), большой субъединицы (23S) рибосомальной РНК (ITS1, ITS2), гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), гена бета-тубулина (TUB2), межгенной последовательности Apn2-Mat1-2-1 (APN/MAT1). Указанный набор содержит 20 олигонуклеотидов, обладающих праймерной активностью, комплементарных нуклеотидным последовательностям консервативных участков перечисленных локусов (ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1) грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum.
Настоящее изобретение позволяет расширить набор средств для амплификации и прицельного секвенирования, в том числе с применением методов секвенирования нового поколения фрагментов локусов (ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1) различных изолятов вида Colletotrichum lupini, возбудителя антракноза люпина белого и люпина желтого, а также близких ему видов комплекса Colletotrichum acutatum (C.tamarilloi, C.costaricensis, C.melonis, C.cuscutae, C.paranaense, C.nymphaeae, C.simmondsii, C.acutatum).
Также изобретение позволяет повысить точность и скорость установления видовой принадлежности моноспоровых и мультиспоровых изолятов видов комплекса Colletotrichum acutatum, изучения их филогенетического родства на видовом уровне и идентификации сельскохозяйственно значимых изолятов антракноза, фитосанитарного контроля распространения патогенных штаммов, контроля инфекционного фона на селекционных и семеноводческих участках люпина белого и люпина желтого.
Краткое описание рисунков
Фигура 1. Филогенетическое дерево, с исследуемыми образцами и образцами сравнения из видового комплекса Colletotrichum acutatum, построенное на основании нуклеотидных последовательностей локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1
Фигура 2. Схема расположения набора прямых и обратных праймеров на локусах а) ITS б) GAPDH в) TUB2 г) APN/MAT1
Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Изолятом гриба называется первое односпоровое (моноспоровое) или чистое выделение грибов из любого источника, субстрата. Линия - внешне однородная популяция, выравненность которой поддерживается отбором. Термин «линия» применяют к группе особей, отличающихся от остальных характерным признаком или группой признаков и сохраняющих это отличие в течение ряда поколений. Обычно большинство особей линии гомозиготно по генам, определяющим характерные для нее признаки, но не исключено наличие гетерозигот по другим признакам. Штамм - чистая культура бактерий, грибов и иных микроорганизмов, выделенная из определенного источника и идентифицированная по тестам современной классификации. В рамках описания данного изобретения, термины изолят, линия и штамм являются взаимозаменяемыми, поскольку раскрываемый в данном изобретении способ определения вида на основе подобранного набора праймеров применим как к различным изолятам, так и к линиям и штаммам грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum.
Номера нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO) в тексте описания соответствуют таковым в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, являющемуся частью настоящего описания изобретения. В случае наличия разночтений в структуре последовательностей между текстом описания и соответствующей последовательностью в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, приоритетными являются данные, представленные в тексте описания.
Данное изобретение описывает набор праймеров для установления видовой принадлежности изолятов грибов рода видового комплекса Colletotrichum acutatum.
Описанный в данном изобретении набор праймеров создан на основании анализа естественной вариабельности в популяции штаммов грибов рода видового комплекса Colletotrichum acutatum, выделенных с различных растений-хозяев в различных регионах Мира. Позиции под праймеры были выбраны в консервативных участках локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, представленных в (Фигура 2), и являются специфичными. Решение, предлагаемое в данном изобретении, состоит в создании набора праймеров, при помощи которых в процессе ПЦР образуются ампликоны длиной не более 400 нуклеотидов, пригодные для секвенирования нового поколения с длиной прочтения не менее 150 пар нуклеотидов при прочтении в обе стороны. Такой набор праймеров позволяет в относительно короткие сроки создавать ДНК-библиотеку из десятков образцов изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum и секвенировать ее методом нового поколения.
Олигонуклеотидные последовательности были разработаны in silico на основании консервативной референсной последовательности, указанной в Таблице 2, полученной при выравнивании последовательностей локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 программой UGENE V44.0 алгоритмом MUSCLE V5, взятых из базы нуклеотидных последовательностей GenBank, для 50 штаммов грибов рода Colletotrichum, перечисленных в Таблице 1. Также олигонуклеотидные последовательности отбирали с учетом гуанин-цитозинового состава – от 40 до 60 %. Температуры плавления подбираемых праймеров находились в пределах от 55°C до 60°C. Для определения последовательностей ампликонов используют метод AmpSeq или подобный ему, включающем два раунда ПЦР. В первом раунде происходит амплификация вариабельного участка и добавление линкерных последовательностей, а во втором к линкерным последовательностям добавляют уникальные для каждого образца баркоды. Полученный пул ампликонов секвенируется по протоколу Illumina. Анализ результатов секвенирования проводится стандартными биоинформатическими методами. После чего последовательности от каждого образца выравниваются, собираются в одну и подвергаются филогенетическому анализу совместно с последовательностями 50 штаммов различных видов видового комплекса Colletotrichum acutatum (C. lupini, C. tamarilloi, C. costaricensis, C. melonis, C. cuscutae, C. paranaense, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. acutatum) или аналогичным набором последовательностей. На основании проведенного выравнивания были рассчитаны апостериорные вероятности по алгоритму MrBayes с применением цепей Маркова и построено филогенетическое дерево в программном обеспечении UGENE V44.0. В полученной филограмме определяется в какую кладу, то есть к каким видами, попадет исследуемый образец, и на этом основании определяется его вид.
Структура 20 олигонуклеотидных последовательностей (10 пар праймеров в сочетаниях SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:10):
SEQ ID NO:1
CGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGG
SEQ ID NO:2
GCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCT
SEQ ID NO:3
ATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCT
SEQ ID NO:4
TAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCT
SEQ ID NO:5
TTCGTCTGCTGCCTTAGGCCGA
SEQ ID NO:6
GACCTGCCTATGTGGATCATCAGCTAT
SEQ ID NO:7
GAAATGTATAGACTACGACGCTTGA
SEQ ID NO:8
ATAATGGAATCATAATGTTCATGTCTCATT
SEQ ID NO:9
CGAAAGGATAGAGCAATTCGCGT
SEQ ID NO:10
AACCGGAGGAGCACTTCAGCCT
SEQ ID NO:11
TTCATTGAGACCAAGTACGCTGT
SEQ ID NO:12
GAGCGTACTTGAGCATGTAGGCCT
SEQ ID NO:13
GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA
SEQ ID NO:14
TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGA
SEQ ID NO:15
GACGTCGTGTAAATAGAGTTTGGTTTCCT
SEQ ID NO:16
TTTACGGCAAGAGTCCCTCCG
SEQ ID NO:17
GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCT
SEQ ID NO:18
GGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATG
SEQ ID NO:19
TAGACGCTCATGCGCTCGAGCTG
SEQ ID NO:20
GGAACGTACTTGTTGCCGGAGGCCT
Также каждому праймеру было присвоено название:
SEQ ID NO:1 - LCG_Sk_F1; SEQ ID NO:2 - LCG_Sk_F10; SEQ ID NO:3 - LCG_Sk_F11; SEQ ID NO:4 - LCG_Sk_F12; SEQ ID NO:5 - LCG_Sk_R10; SEQ ID NO:6 - LCG_Sk_R3; SEQ ID NO:7 - LCG_Sk_R4; SEQ ID NO:8 - LCG_Sk_R5; SEQ ID NO:9 - LCG_Sk_R6; SEQ ID NO:10 - LCG_Sk_R7; SEQ ID NO:11 - LCG_Sk_F5; SEQ ID NO:12 - LCG_Sk_R2; SEQ ID NO:13 - LCG_Sk_F2; SEQ ID NO:14 - LCG_Sk_F9; SEQ ID NO:15 - LCG_Sk_R1; SEQ ID NO:16 - LCG_Sk_R8; SEQ ID NO:17 - LCG_Sk_F6; SEQ ID NO:18 - LCG_Sk_F7; SEQ ID NO:19 - LCG_Sk_R11; SEQ ID NO:20 - LCG_Sk_R9.
| Таблица 1. Набор видов видового комплекса Colletotrichum acutatum, использовавшийся для поиска консервативных участков ДНК в локусах ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1. | ||||||
| Название линии, GenBank | Видовое название | Вид растения-хозяина | Номер доступа GenBank | |||
| Локус ITS | Локус GAPDH | Локус TUB2 | Локус APN/MAT1 | |||
| CBS 109216 | C. lupini | L. mutabilis | MT741840 | MW342515 | MW342537 | MW342559 |
| CBS 109221 | C. lupini | L. albus | MW342494 | MW342516 | MW342538 | MW342560 |
| CBS 109225 | C. Lupini | L. albus | MW342495 | MW342517 | MW342539 | MW342561 |
| CBS 109226 | C. lupini | L. albus | MW342496 | MW342518 | MW342540 | MW342562 |
| CBS 122122 | C. simmondsii | Carica papaya | MW342497 | MW342519 | MW342541 | MW342563 |
| CBS 129814 | C. tamarilloi | Solanum betaceum | MW342498 | MW342520 | MW342542 | MW342564 |
| CBS 129955 | C. tamarilloi | Solanum betaceum | MW342499 | MW342521 | MW342543 | MW342565 |
| CBS 130239 | C. nymphaeae | Fragaria x ananassa | MW342500 | MW342522 | MW342544 | MW342566 |
| CBS 134730 | C. melonis | Malus domestica | MW342501 | MW342523 | MW342545 | MW342567 |
| CBS 211.78 | C. costaricensis | Coffea sp. | MW342502 | MW342524 | MW342546 | MW342568 |
| CBS 369.73 | C. acutatum | L. angustifolius | MW342503 | MW342525 | MW342547 | MW342569 |
| CBS 370.73 | C. acutatum | Pinus Aridata | MW342504 | MW342526 | MW342548 | MW342570 |
| CBS 509.97 | C. lupini | L. albus | MW342505 | MW342527 | MW342549 | MW342571 |
| IMI 304,802 | C. cuscutae | Cuscuta sp. | MW342506 | MW342528 | MW342550 | MW342572 |
| IMI 360928 | C. nymphaeae | Fragaria x ananassa | MW342507 | MW342529 | MW342551 | MW342573 |
| IMI 375715 | C. lupini | L. albus | MW342508 | MW342530 | MW342552 | MW342574 |
| IMI 384185 | C. paranaense | Caryocar brasiliense | MW342509 | MW342531 | MW342553 | MW342575 |
| JA01 | Colletotrichum lupini | Lupinus albus | MW342510 | MW342532 | MW342554 | MW342576 |
| JA02 | C. lupini | L. albus | MW342511 | MW342533 | MW342555 | MW342577 |
| JA03 | C. lupini | L. albus | MW342512 | MW342534 | MW342556 | MW342578 |
| JA04 | C. lupini | L. albus | MW342513 | MW342535 | MW342557 | MW342579 |
| JA05 | C. lupini | L. albus | MW342514 | MW342536 | MW342558 | MW342580 |
| JA06 | C. lupini | L. albus | JQ948156 | JQ948486 | JQ949807 | MW342581 |
| JA07 | C. lupini | L. angustifolius | JQ948169 | JQ948499 | JQ949820 | MK478328 |
| JA08 | C. lupini | L. luteus | JQ948155 | JQ948485 | JQ949806 | MK478329 |
| JA09 | C. lupini | L. albus | JQ948158 | JQ948488 | MK478189 | MK478316 |
| JA10 | C. lupini | L. albus | JQ948159 | JQ948489 | JQ949810 | MK478355 |
| JA11 | C. lupini | L. albus | JQ948161 | JQ948491 | JQ949812 | MK478341 |
| JA12 | C. lupini | L. albus | MK463722 | KM252117 | MK478186 | MK478308 |
| JA13 | C. lupini | L. mutabilis | MH865693 | JQ948508 | JQ949829 | MK478310 |
| JA14 | C. lupini | L. hartwegii | MK463723 | KM252194 | KM251944 | MK478313 |
| JA15 | C. lupini | L. albus | MK463726 | MK463750 | MK478190 | MK478317 |
| JA16 | C. lupini | L. angustifolius | MK463727 | MK463751 | MK478191 | MK478318 |
| JA17 | C. lupini | L. albus | MK463728 | MK463752 | MK478192 | MK478319 |
| JA18 | C. lupini | L. mutabilis | JQ948172 | JQ948502 | JQ949823 | MK478320 |
| JA19 | C. lupini | L. mutabilis | MK463729 | MK463753 | MK478193 | MK478321 |
| JA20 | C. lupini | L. mutabilis | MK463730 | KM252203 | KM251951 | MK478322 |
| JA21 | C. lupini | L. mutabilis | MK463733 | MK463756 | MK478196 | MK478345 |
| JA22 | C. lupini | L. mutabilis | MK463738 | MK463761 | MK478201 | MK478350 |
| RB020 | C. lupini | L. albus | JQ948184 | JQ948514 | JQ949835 | MW342584 |
| RB042 | C. lupini | Cinnamonium zeylanicum | JQ948189 | JQ948519 | JQ949840 | MK478307 |
| RB116 | C. lupini | L. polyphyllus | JQ948181 | JQ948511 | JQ949832 | MK478333 |
| RB122 | C. lupini | L. luteus | KC204997 | KC205031 | KC205065 | MK478357 |
| RB123 | C. lupini | L. albus | JQ948195 | JQ948525 | JQ949846 | MK478340 |
| RB124 | C. lupini | L. albus | JQ948191 | JQ948521 | JQ949842 | MK478342 |
| RB125 | C. lupini | L. albus | JQ948250 | JQ948580 | JQ949901 | MW342583 |
| RB127 | C. lupini | Olea europaea | JQ948243 | JQ948573 | JQ949894 | MK478326 |
| RB147 | C. lupini | Lupinus sp. | JQ948276 | JQ948606 | JQ949927 | MK478332 |
| RB221 | C. lupini | Lupinus sp. | JQ948350 | JQ948681 | JQ950001 | MW342582 |
| RB226 | C. lupini | Lupinus sp. | JQ948351 | JQ948682 | JQ950002 | MK478335 |
| Таблица 2. Консервативные последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, полученные после выравнивания 50 изолятов видового комплекса Colletotrichum acutatum. Прочерками в последовательностях обозначены не консервативные участки. | ||
| Название локуса | Длина фрагмента, п. н. | Последовательность нуклеотидов, 5’-3’ |
| ITS (SEQ ID NO:21) |
496 | TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAAC-TACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCC-TCCCCTCCCGGCGCCG--CCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATG-GAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCA-ACGTGGGCCCTT-AAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACG-CTCGCAC-GGGAT-CGGAGGGACTCTTGCCGTAAA-CCCCC--A-TT-TTTACAG |
| GAPDH (SEQ ID NO:22) |
259 | TTCATTGAGACCAAGTACGCTGT-AGTA-CA-CC-ACTTTACCCCTCCATC-TG-TATC-CGTCT-CCAC-ATAACACCAGCTTCGTCG-TA-C--C-GG-AAAAGAGT--G--CTAGC---CTC-AC-T-TTT--CCCC--GGTTTCGA-TGGGCT-GTTGTA--GA--CGACGTGA-ACAA-C-TGC-GAAACA-CC-AGAC--AA-TTGCTGAC-AGACA-AT----CAC-AGGCCTACATGCTCAAGTACGCTCC |
| TUB2 (SEQ ID NO:23) |
431 | GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCC--CGA-GCGGCGAT---GA-ATTTGACACGATCTCG-ACT-A--TT-G--ACAGGCA-AACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTC-C--GTCCTC-AG-G-GGC--CC-C-TGGACC-A--AGCTAATCA---CA-AGGTACAACGGCACTTCCGAGCT-CAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTA-TTCAACGAAGTTTGTTA-CCTAGT-CCCCAGTGTGCAGGCAA-CCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCC-CGCGCCGT-CTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTT-GGCCA-CTTTTCCGCCCCGACAAC |
| APN/MAT1 (SEQ ID NO:24) |
1183 | GCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTA-AC-------------CCAAC------------CAC-C----CA-ACA-ACG-CC--A-CCCCTT-TT---CTC-TTTATGCG-CCACCGAGGCC----G-CC-ACCCTC-TCTC--TC--T-CCCCGACATAT-CCGA-CTTTC--G-------------------C--C-TT-ATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTC--TT-T-CAT-TGCGC-CGTCCT-TGGGGAAATC-GGAGAAAAGGAAAA-G-GACGGAGTGGAG-TGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAA-AA-AGCCA---TCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTC--AAGG-GCGA--T--AG-C--GCG--A-TCG--G-A--G--TGT-A-GAG-TG----C-T-AC--T-GAAAA-AGA-A--T-GGTA-TTTAG--GTGCAGAA-AAGA-GAT--A---AATGAGACATGAACATTATGATTCCATTAT-GTT---G-AA-TCT-TCAA-CA-T-TATATCG-T-TTGTG-T-GCTCATC-T---ATCATGGCAG---TAGACATCC-A--CTT-GGCA-C-A--ACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCT--T-G-AGT-GC-CACT-TTTGC-TGAAC-CCATCAAGAG-G-CGC-ACCG-C-CC-C-C-AT-AT-CGTCC---AT--------------------------------------------------------C-C-AA----AGCCT-TC-T-G-CT--A--GG-CC-TAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCT---GCTGA-----------------------CACGGCATGTCT-CTTAGT--T-GCCC-A-C-TC--GTG-TGGTGTT-TTT-GACTT-CT-GGCGC-A-CTGGGA-A-GGCT-TGA-GG-AG--GAGG-A-A-TCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGT-CTCCTTCGC-GCAACTT-TA-TCGC--A--TT-TTGCAC-GT-AT-G-GAC-T-GCA-GGTAG-AAC---TG-AGCGACG-TGTGATGG--CG-TTCTTG-TCC-A-GATCCTT---CTCCATCT--A-AAC-G-G-TG---G-GA---T-AGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC |
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Применение набора праймеров для определения вида изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum методом секвенирования нового поколения
Для демонстрации возможности использования набора праймеров при определении вида изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, были взяты 3 образца мицелия реизолированного с листьев, семян и створок бобов, с признаками антракноза, на картофельно-декстрозном агаре и морфологически подходящих под описание грибов рода Colletotrichum. С использованием набора праймеров были определены нуклеотидные последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 у трех образцов сои на платформе MiniSeq Illumina. Этапы определения вида описаны ниже.
1. На первом этапе были выделены препараты ДНК из воздушного мицелия трех образцов, реизолированных со створок бобов и семян на картофельно-декстрозном агаре, собранных в полях люпина белого.
2. На втором этапе была проведена подготовка образцов ДНК гриба к дальнейшей работе, которая включала несколько последовательных этапов:
a) Мультиплексная ПЦР с набором из 10 пар праймеров для каждого образца в отдельности. При прохождении реакции происходит многократное увеличение количества вариабельных участков локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1. Этапы и условия проведения реакции включали: первичную денатурацию один цикл 1 минуту; 35 циклов состоящих из денатурации 30 секунд при 95°C, отжига праймеров при 58°C 30 секунд, элонгация при 72°C 30 секунд; 1 цикл 5 минут элонгации при 72°C.
b) Проведение второй реакции ПЦР для добавления индексных последовательностей к ампликонам каждого образца в отдельности. В качестве праймеров используются известные, специально подобранные, последовательности, которые совпадают с последовательностями на 5'-концах ампликонов, получившихся в результате первой ПЦР-реакции. Целью данного этапа является добавление индивидуальных последовательностей (индексов) к каждому ампликону, так как в последующем, при одновременном секвенировании всех образцов, остается возможность отнесения полученных последовательностей ДНК к определенному образцу изолята гриба.
c) Очистка каждого из 3 пулов ампликонов от ненужных на последующих этапах солей, неиспользованных нуклеотидов и т.д., с применением силико-колонок (Qiagen) и их перерастворение в 0,1х TE буфере.
d) Для получения библиотеки выполнили равномерное (по концентрации) смешивание трех пулов ампликонов.
3. В последующем, библиотека подготавливалась и секвенировалась согласно протоколам производителя секвенатора, в данном случае - Illumina.
Результаты определения последовательностей, полученных с помощью набора праймеров для локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, трех образцов в соединенном виде приведены в Таблице 3.
| Таблица 3. Собранные последовательности ДНК экспериментальных трех образцов в порядке ITS (1-496), GAPDH (497-755), TUB2 (756-1186), APN/MAT1 (1187-2369). | |
| Номер образца |
Последовательность нуклеотидов локусов ITS (1-496), GAPDH (497-755), TUB2 (756-1186), APN/MAT1 (1187-2369); 5’-3’ |
| 1 (SEQ ID NO:25) |
TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC |
| 2 (SEQ ID NO:26) |
TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC |
| 3 (SEQ ID NO:27) |
TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC |
В последующем последовательности образцов были выравнены с использованием алгоритма MUSCLE V5 совместно с 50 другими последовательностями из Таблицы 1, относящимися к видам C. lupini, C. tamarilloi, C. costaricensis, C. melonis, C. cuscutae, C. paranaense, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. acutatum. На основании проведенного выравнивания были рассчитаны апостериорные вероятности по алгоритму MrBayes с применением цепей Маркова и построено филогенетическое дерево в программном обеспечении UGENE V44.0.
Последовательности образцов №1, №2 и №3 попали в кладу, содержащую последовательности, принадлежащие к разным по происхождению моноспоровым линиям гриба Colletotrichum lupini (Фиг. 2). Это позволило нам определить вид грибов в искомых образцах как Colletotrichum lupini. Полученные последовательности исследуемых образцов не содержали внутри образца вариабельности и были одинаковыми между собой, из чего можно сделать вывод о том, что собранные изоляты одинаковы или очень близки по генотипу. Полученные результаты показывают возможность успешного применения представленного набора праймеров для определения видовой принадлежности изолятов в видовом комплексе Colletotrichum acutatum методом секвенирования нового поколения.
Пример 2. Применение набора праймеров для определения вида изолятов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum методом севенирования по Сэнгеру
Для демонстрации возможности использования набора праймеров для определения последовательности нуклеотидов моноспоровой культуры гриба видового комплекса Colletotrichum acutatum, был взят 1 образец мицелия реизолированного с семян с признаками антракноза, на картофельно-декстрозном агаре и морфологически подходящего под описание. С использованием набора праймеров для определения вида грибов были определены нуклеотидные последовательности локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 у образца методом секвенирования по Сэнгеру. Этапы определения последовательности описаны ниже:
1. На первом этапе был выделен препарат ДНК из воздушного мицелия моноспоровой культуры, реизолированной с зараженных антракнозом семян люпина белого.
2. На втором этапе была проведена подготовка образца ДНК гриба к дальнейшей работе, которая включала несколько последовательных этапов:
a) Провели ПЦР с каждой из 10 пар праймеров в отдельной пробирке с ДНК интересующего образца. При прохождении реакции происходит многократное увеличение количества вариабельных участков локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1. Этапы и условия проведения реакции включали первичную денатурацию один цикл 1 минуту; 35 циклов состоящих из денатурации 30 секунд при 95°C, отжига праймеров при 58°C 30 секунд, элонгация при 72°C 30 секунд; 1 цикл 5 минут элонгации при 72°C.
b) Очистили продукты всех ПЦР, проведенных в предыдущем шаге, от ненужных на последующих этапах солей, неиспользованных нуклеотидов и т.д., с применением силико-колонок (Qiagen), и их перерастворение в 0,1х TE буфере.
c) Провели вторую реакцию терминирующего секвенирования для всех продуктов ПЦР с соответствующими им праймерами.
3. Провели отдельный капиллярный электрофорез для всех продуктов реакций терминирующего секвенирования.
Собранная последовательность локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1, для образца в объединенном виде приведена в Таблице 4.
| Таблица 4. Последовательность ДНК моноспоровой культуры гриба рода Colletotrichum исследуемого образца 1. | |
| Номер Образца |
Последовательность нуклеотидов локусов ITS (1-496), GAPDH (497-755), TUB2 (756-1186), APN/MAT1 (1187-2369); 5’-3’ |
| 1 (SEQ ID NO:28) |
TGAGTTACCGCTCTATAACCCTTTGTGAACGTACCTAACCGTTGCTTCGGCGGGCAGGGGAAGCCTCTCGCGGGCCTCCCCTCCCGGCGCCGGCCCCCACCACGGGGACGGGGCGCCCGCCGGAGGAAACCAAACTCTATTTACACGACGTCTCTTCTGAGTGGCACAAGCAAATAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGCATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCGCTTGGTTTTGGGGCCCCACGGCACACGTGGGCCCTTGAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTAACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTCTTTACAGTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACTTTACCCCTCCATCATGATATCACGTCTGCCACGATAACACCAGCTTCGTCGGTACCCACGGCAAAAGAGTCAGAACTAGCACCCTCGACTTTTTTGCCCCAAGGTTTCGATTGGGCTTGTTGTAATGACACGACGTGACACAATCATGCCGAAACAGCCGAGACAAAACTTGCTGACAGACAATCATCACAGGCCTACATGCTCAAGTAGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTCTGGTGCGTAGCCAACCGCCAACGACGCGGCGATTTCGATATTTGACACGATCTCGAACTGACCTTGATACAGGCAGAACATCTCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGCGTGTATGTCACTTGTCCTCCAGTGCGGCATCCTCATGGACCCAGCAGCTAATCACACCACAGGTACAACGGCACTTCCGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTCTATTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGTCCCCCAGTGTGCAGGCAATCCTATTGACGAATGCTGACCTTCTCACCCAACCAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCCTTTGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACGCCGGGCGTCAACTGTGGTAAGTCTAAACCCAACCACACCACACACACGCCTTACCCCCTTCTTACTCGTTTATGCGTCCACCGAGGCCTCTGTCCTACCCTCCTCTCTCTCGTCCCCCGACATATCCCGATCTTTCTGCCCCCGCCCCCCCTCGACCCCCATTCATAGCTGATGATCCACATAGGCAGGTCGTTTTTCATCTGCGCCCGTCCTCTGGGGAAATCCGGAGAAAAGGAAAAGGGGACGGAGTGGAGGTGCGGTACTTTTATATGGAGCAGTGATTGGAAAAAGAGCCAGTCTCAAGCGTCGTAGTCTATACATTTCTAAGGGGCGATGTGGAGTCACGCGAGATTCGACGAACAGTGTGACGAGCTGTAACCGTTACTATCGAAAAGAGACAGCTAGGTAGTTTAGTCGTGCAGAAGAAGAAGATTAAGGCAATGAGACATGAACATTATGATTCCATTATCGTTTTAGTAAATCTATCAAGCATTCTATATCGGTCTTGTGGTGGCTCATCTTCGCATCATGGCAGAGTTAGACATCCGATTCTTCGGCAGCGACGACGCGAATTGCTCTATCCTTTCGAGTCTTGCTCTGCTTGAAGTAGCTCACTCTTTGCTTGAACCCCATCAAGAGCGTCGCCACCGTCTCCGCCCAATGATGCGTCCGGAATTCGCCCATCTTGTGAGTAGAGCAGGTAAAACTCCACGAAGTGGCTTTGGAGCCTTACACGAATTCGAGCCTTTCCTGGTCTCGACAGGCCCCTAAGTTAGCAGAAGAAGTCTCTTTTGCTCCGGCTGAGCATGGTAAGGGTGAGTGCCGGGCACGGCATGTCTGCTTAGTTCTGGCCCAAACATCAAGTGTTGGTGTTTTTTCGACTTTCTCGGCGCGAGCTGGGACATGGCTCTGAGGGAAGACGAGGCATACTCGGCCTAAGGCAGCAGACGAAGGTGCTCCTTCGCGGCAACTTGTAGTCGCGAAAATTCTTGCACAGTCATTGAGACCTAGCATGGTAGGAACTAATGCAGCGACGTTGTGATGGATCGCTTCTTGCTCCTACGATCCTTGATCTCCATCTCTAGAACGGGGTGGCAGGGACGATTAGGCTGAAGTGCTCCTCCGGTTGCGACGACGCTTC |
В последующем последовательности образцов были выравнены с использованием алгоритма MUSCLE V5 совместно с 50 другими последовательностями из Таблицы 1, относящимися к видам C. lupini, C. tamarilloi, C. costaricensis, C. melonis, C. cuscutae, C. paranaense, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. acutatum. На основании проведенного выравнивания были рассчитаны апостериорные вероятности по алгоритму MrBayes с применением цепей Маркова и построено филогенетическое дерево в программном обеспечении UGENE V44.0.
Последовательности образца №1 попали в кладу, содержащую последовательности принадлежащие к разным по происхождению моноспоровым линиям гриба Colletotrichum lupini. Это позволило нам определить вид грибов в искомых образцах как Colletotrichum lupini.
Полученные результаты показывают возможность успешного применения представленного набора праймеров для амплификации и последующего определения последовательности ДНК в локусах ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 моноспоровых культур видового комплекса Colletotrichum acutatum.
--->
This XML file does not appear to have any style information
associated with it. The document tree is shown below.
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Colletotrichum
acutatum.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.0.0"
productionDate="2022-12-16">
<ApplicantFileReference>481972</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский
институт радиологии и агроэкологии"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Scientific Institution
"All-Russian Research Institute of Radiology and
Agroecology"</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Набор олигонуклеотидных праймеров
для генотипирования грибов видового комплекса Colletotrichum
acutatum</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>28</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cggtacttttatatggagcagtgattgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gccgggcgtcaactgtggtaagtct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>attgctctatcctttcgagtcttgctct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taagttagcagaagaagtctcttttgct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttcgtctgctgccttaggccga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gacctgcctatgtggatcatcagctat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaaatgtatagactacgacgcttga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ataatggaatcataatgttcatgtctcatt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgaaaggatagagcaattcgcgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaccggaggagcacttcagcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttcattgagaccaagtacgctgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagcgtacttgagcatgtaggcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q13">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaacgcagcgaaatgcgataagtaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q15">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gacgtcgtgtaaatagagtttggtttcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttacggcaagagtccctccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q17">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtaaccagattggtgctgccttct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtctcgacagcaatggcgtgtatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tagacgctcatgcgctcgagctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggaacgtacttgttgccggaggcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>496</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..496</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacntacctaaccgttgcttcggcg
ggcaggggaagcctctcgcgggccntcccctcccggcgccgnnccccaccacggggacggggcgcccgcc
ggaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaac
aacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgngaattgcagaat
tcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagc
gtcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcanacgtgggcccttnaaggtagtgg
cggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgnctcgcacngggatncggagggactcttgccg
taaancccccnnanttntttacag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>259</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..259</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q23">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttcattgagaccaagtacgctgtnagtancanccnactttacccctccatcn
tgntatcncgtctnccacnataacaccagcttcgtcgntancnncnggnaaaagagtnngnnctagcnnn
ctcnacntntttnnccccnnggtttcgantgggctngttgtannganncgacgtganacaancntgcnga
aacanccnagacnnaanttgctgacnagacanatnnnncacnaggcctacatgctcaagtacgctcc</I
NSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>431</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..431</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtaaccagattggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccnncgangcg
gcgatnnnganatttgacacgatctcgnactnannttngnnacaggcanaacatctctggcgagcacggt
ctcgacagcaatggcgtgtatgtcncnngtcctcnagngnggcnnccncntggaccnannagctaatcan
nncanaggtacaacggcacttccgagctncagctcgagcgcatgagcgtctanttcaacgaagtttgtta
ncctagtnccccagtgtgcaggcaancctattgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggc
aacaagtacgttccncgcgccgtnctcgtcgacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtc
ccttnggccancttttccgccccgacaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1183</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1183</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q25">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gccgggcgtcaactgtggtaagtctanacnnnnnnnnnnnnnccaacnnnnn
nnnnnnncacncnnnncanacanacgnccnnanccccttnttnnnctcntttatgcgnccaccgaggccn
nnngnccnaccctcntctcnntcnntnccccgacatatnccganctttcnngnnnnnnnnnnnnnnnnnn
ncnncnttnatagctgatgatccacataggcaggtcnnttntncatntgcgcncgtcctntggggaaatc
nggagaaaaggaaaangngacggagtggagntgcggtacttttatatggagcagtgattggaanaanagc
cannntcaagcgtcgtagtctatacatttcnnaaggngcganntnnagncnngcgnnantcgnngnanng
nntgtnangagntgnnnncntnacnntngaaaanagananntnggtantttagnngtgcagaanaagang
atnnannnaatgagacatgaacattatgattccattatngttnnngnaantctntcaancantntatatc
gntnttgtgntngctcatcntnnnatcatggcagnnntagacatccnanncttnggcancnannacgcga
attgctctatcctttcgagtcttgctctnntngnagtngcncactntttgcntgaacnccatcaagagng
ncgcnaccgncnccncncnatnatncgtccnnnatnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncncnaannnnagcctntcntngnctnnannggnccntaagttagcagaa
gaagtctcttttgctnnngctgannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncacggcatgtctncttagtnntng
cccnancntcnngtgntggtgttntttngacttnctnggcgcnanctgggananggctntganggnagnn
gaggnanantcggcctaaggcagcagacgaaggtnctccttcgcngcaacttntantcgcnnannttntt
gcacngtnatngngacntngcanggtagnaacnnntgnagcgacgntgtgatggnncgnttcttgntccn
angatccttnnnctccatctnnanaacngngntgnnngngannntnaggctgaagtgctcctccggttgc
gacgacgcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2313</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2313</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacgtacctaaccgttgcttcggcg
ggcaggggaagcctctcgcgggcctcccctcccggcgccggcccccaccacggggacggggcgcccgccg
gaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaaca
acggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt
cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagcg
tcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcacacgtgggcccttgaaggtagtggc
ggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgtctcgcactgggatccggagggactcttgccgt
aaaaccccccaattctttacagttcattgagaccaagtacgctgtgagtatcaccccactttacccctcc
atcatgatatcacgtctgccacgataacaccagcttcgtcggtacccacggcaaaagagtcagaactagc
accctcgacttttttgccccaaggtttcgattgggcttgttgtaatgacacgacgtgacacaatcatgcc
gaaacagccgagacaaaacttgctgacagacaatcatcacaggcctacatgctcaagtaggtaaccagat
tggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccaacgacgcggcgatttcgatatttgacacgatctcgaa
ctgaccttgatacaggcagaacatctctggcgagcacggtctcgacagcaatggcgtgtatgtcacttgt
cctccagtgcggcatcctcatggacccagcagctaatcacaccacaggtacaacggcacttccgagctcc
agctcgagcgcatgagcgtctatttcaacgaagtttgttatcctagtcccccagtgtgcaggcaatccta
ttgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggcaacaagtacgttcctcgcgccgtcctcgtc
gacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtccctttggccagcttttccgccccgacaacg
ccgggcgtcaactgtggtaagtctaaacccaaccacaccacacacacgccttacccccttcttactcgtt
tatgcgtccaccgaggcctctgtcctaccctcctctctctcgtcccccgacatatcccgatctttctgcc
cccgccccccctcgacccccattcatagctgatgatccacataggcaggtcgtttttcatctgcgcccgt
cctctggggaaatccggagaaaaggaaaaggggacggagtggaggtgcggtacttttatatggagcagtg
attggaaaaagagccagtctcaagcgtcgtagtctatacatttctaaggggcgatgtggagtcacgcgag
attcgacgaacagtgtgacgagctgtaaccgttactatcgaaaagagacagctaggtagtttagtcgtgc
agaagaagaagattaaggcaatgagacatgaacattatgattccattatcgttttagtaaatctatcaag
cattctatatcggtcttgtggtggctcatcttcgcatcatggcagagttagacatccgattcttcggcag
cgacgacgcgaattgctctatcctttcgagtcttgctctgcttgaagtagctcactctttgcttgaaccc
catcaagagcgtcgccaccgtctccgcccaatgatgcgtccggaattcgcccatcttgtgagtagagcag
gtaaaactccacgaagtggctttggagccttacacgaattcgagcctttcctggtctcgacaggccccta
agttagcagaagaagtctcttttgctccggctgagcatggtaagggtgagtgccgggcacggcatgtctg
cttagttctggcccaaacatcaagtgttggtgttttttcgactttctcggcgcgagctgggacatggctc
tgagggaagacgaggcatactcggcctaaggcagcagacgaaggtgctccttcgcggcaacttgtagtcg
cgaaaattcttgcacagtcattgagacctagcatggtaggaactaatgcagcgacgttgtgatggatcgc
ttcttgctcctacgatccttgatctccatctctagaacggggtggcagggacgattaggctgaagtgctc
ctccggttgcgacgacgcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2313</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2313</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q27">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacgtacctaaccgttgcttcggcg
ggcaggggaagcctctcgcgggcctcccctcccggcgccggcccccaccacggggacggggcgcccgccg
gaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaaca
acggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt
cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagcg
tcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcacacgtgggcccttgaaggtagtggc
ggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgtctcgcactgggatccggagggactcttgccgt
aaaaccccccaattctttacagttcattgagaccaagtacgctgtgagtatcaccccactttacccctcc
atcatgatatcacgtctgccacgataacaccagcttcgtcggtacccacggcaaaagagtcagaactagc
accctcgacttttttgccccaaggtttcgattgggcttgttgtaatgacacgacgtgacacaatcatgcc
gaaacagccgagacaaaacttgctgacagacaatcatcacaggcctacatgctcaagtaggtaaccagat
tggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccaacgacgcggcgatttcgatatttgacacgatctcgaa
ctgaccttgatacaggcagaacatctctggcgagcacggtctcgacagcaatggcgtgtatgtcacttgt
cctccagtgcggcatcctcatggacccagcagctaatcacaccacaggtacaacggcacttccgagctcc
agctcgagcgcatgagcgtctatttcaacgaagtttgttatcctagtcccccagtgtgcaggcaatccta
ttgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggcaacaagtacgttcctcgcgccgtcctcgtc
gacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtccctttggccagcttttccgccccgacaacg
ccgggcgtcaactgtggtaagtctaaacccaaccacaccacacacacgccttacccccttcttactcgtt
tatgcgtccaccgaggcctctgtcctaccctcctctctctcgtcccccgacatatcccgatctttctgcc
cccgccccccctcgacccccattcatagctgatgatccacataggcaggtcgtttttcatctgcgcccgt
cctctggggaaatccggagaaaaggaaaaggggacggagtggaggtgcggtacttttatatggagcagtg
attggaaaaagagccagtctcaagcgtcgtagtctatacatttctaaggggcgatgtggagtcacgcgag
attcgacgaacagtgtgacgagctgtaaccgttactatcgaaaagagacagctaggtagtttagtcgtgc
agaagaagaagattaaggcaatgagacatgaacattatgattccattatcgttttagtaaatctatcaag
cattctatatcggtcttgtggtggctcatcttcgcatcatggcagagttagacatccgattcttcggcag
cgacgacgcgaattgctctatcctttcgagtcttgctctgcttgaagtagctcactctttgcttgaaccc
catcaagagcgtcgccaccgtctccgcccaatgatgcgtccggaattcgcccatcttgtgagtagagcag
gtaaaactccacgaagtggctttggagccttacacgaattcgagcctttcctggtctcgacaggccccta
agttagcagaagaagtctcttttgctccggctgagcatggtaagggtgagtgccgggcacggcatgtctg
cttagttctggcccaaacatcaagtgttggtgttttttcgactttctcggcgcgagctgggacatggctc
tgagggaagacgaggcatactcggcctaaggcagcagacgaaggtgctccttcgcggcaacttgtagtcg
cgaaaattcttgcacagtcattgagacctagcatggtaggaactaatgcagcgacgttgtgatggatcgc
ttcttgctcctacgatccttgatctccatctctagaacggggtggcagggacgattaggctgaagtgctc
ctccggttgcgacgacgcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2313</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2313</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacgtacctaaccgttgcttcggcg
ggcaggggaagcctctcgcgggcctcccctcccggcgccggcccccaccacggggacggggcgcccgccg
gaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaaca
acggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt
cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagcg
tcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcacacgtgggcccttgaaggtagtggc
ggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgtctcgcactgggatccggagggactcttgccgt
aaaaccccccaattctttacagttcattgagaccaagtacgctgtgagtatcaccccactttacccctcc
atcatgatatcacgtctgccacgataacaccagcttcgtcggtacccacggcaaaagagtcagaactagc
accctcgacttttttgccccaaggtttcgattgggcttgttgtaatgacacgacgtgacacaatcatgcc
gaaacagccgagacaaaacttgctgacagacaatcatcacaggcctacatgctcaagtaggtaaccagat
tggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccaacgacgcggcgatttcgatatttgacacgatctcgaa
ctgaccttgatacaggcagaacatctctggcgagcacggtctcgacagcaatggcgtgtatgtcacttgt
cctccagtgcggcatcctcatggacccagcagctaatcacaccacaggtacaacggcacttccgagctcc
agctcgagcgcatgagcgtctatttcaacgaagtttgttatcctagtcccccagtgtgcaggcaatccta
ttgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggcaacaagtacgttcctcgcgccgtcctcgtc
gacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtccctttggccagcttttccgccccgacaacg
ccgggcgtcaactgtggtaagtctaaacccaaccacaccacacacacgccttacccccttcttactcgtt
tatgcgtccaccgaggcctctgtcctaccctcctctctctcgtcccccgacatatcccgatctttctgcc
cccgccccccctcgacccccattcatagctgatgatccacataggcaggtcgtttttcatctgcgcccgt
cctctggggaaatccggagaaaaggaaaaggggacggagtggaggtgcggtacttttatatggagcagtg
attggaaaaagagccagtctcaagcgtcgtagtctatacatttctaaggggcgatgtggagtcacgcgag
attcgacgaacagtgtgacgagctgtaaccgttactatcgaaaagagacagctaggtagtttagtcgtgc
agaagaagaagattaaggcaatgagacatgaacattatgattccattatcgttttagtaaatctatcaag
cattctatatcggtcttgtggtggctcatcttcgcatcatggcagagttagacatccgattcttcggcag
cgacgacgcgaattgctctatcctttcgagtcttgctctgcttgaagtagctcactctttgcttgaaccc
catcaagagcgtcgccaccgtctccgcccaatgatgcgtccggaattcgcccatcttgtgagtagagcag
gtaaaactccacgaagtggctttggagccttacacgaattcgagcctttcctggtctcgacaggccccta
agttagcagaagaagtctcttttgctccggctgagcatggtaagggtgagtgccgggcacggcatgtctg
cttagttctggcccaaacatcaagtgttggtgttttttcgactttctcggcgcgagctgggacatggctc
tgagggaagacgaggcatactcggcctaaggcagcagacgaaggtgctccttcgcggcaacttgtagtcg
cgaaaattcttgcacagtcattgagacctagcatggtaggaactaatgcagcgacgttgtgatggatcgc
ttcttgctcctacgatccttgatctccatctctagaacggggtggcagggacgattaggctgaagtgctc
ctccggttgcgacgacgcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2313</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2313</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q29">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagttaccgctctataaccctttgtgaacgtacctaaccgttgcttcggcg
ggcaggggaagcctctcgcgggcctcccctcccggcgccggcccccaccacggggacggggcgcccgccg
gaggaaaccaaactctatttacacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataattaaaacttttaaca
acggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt
cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgctcgccagcattctggcgagcatgcctgttcgagcg
tcatttcaaccctcaagcaccgcttggttttggggccccacggcacacgtgggcccttgaaggtagtggc
ggaccctcccggagcctcctttgcgtagtaactaacgtctcgcactgggatccggagggactcttgccgt
aaaaccccccaattctttacagttcattgagaccaagtacgctgtgagtatcaccccactttacccctcc
atcatgatatcacgtctgccacgataacaccagcttcgtcggtacccacggcaaaagagtcagaactagc
accctcgacttttttgccccaaggtttcgattgggcttgttgtaatgacacgacgtgacacaatcatgcc
gaaacagccgagacaaaacttgctgacagacaatcatcacaggcctacatgctcaagtaggtaaccagat
tggtgctgccttctggtgcgtagccaaccgccaacgacgcggcgatttcgatatttgacacgatctcgaa
ctgaccttgatacaggcagaacatctctggcgagcacggtctcgacagcaatggcgtgtatgtcacttgt
cctccagtgcggcatcctcatggacccagcagctaatcacaccacaggtacaacggcacttccgagctcc
agctcgagcgcatgagcgtctatttcaacgaagtttgttatcctagtcccccagtgtgcaggcaatccta
ttgacgaatgctgaccttctcacccaaccaggcctccggcaacaagtacgttcctcgcgccgtcctcgtc
gacttggagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtccctttggccagcttttccgccccgacaacg
ccgggcgtcaactgtggtaagtctaaacccaaccacaccacacacacgccttacccccttcttactcgtt
tatgcgtccaccgaggcctctgtcctaccctcctctctctcgtcccccgacatatcccgatctttctgcc
cccgccccccctcgacccccattcatagctgatgatccacataggcaggtcgtttttcatctgcgcccgt
cctctggggaaatccggagaaaaggaaaaggggacggagtggaggtgcggtacttttatatggagcagtg
attggaaaaagagccagtctcaagcgtcgtagtctatacatttctaaggggcgatgtggagtcacgcgag
attcgacgaacagtgtgacgagctgtaaccgttactatcgaaaagagacagctaggtagtttagtcgtgc
agaagaagaagattaaggcaatgagacatgaacattatgattccattatcgttttagtaaatctatcaag
cattctatatcggtcttgtggtggctcatcttcgcatcatggcagagttagacatccgattcttcggcag
cgacgacgcgaattgctctatcctttcgagtcttgctctgcttgaagtagctcactctttgcttgaaccc
catcaagagcgtcgccaccgtctccgcccaatgatgcgtccggaattcgcccatcttgtgagtagagcag
gtaaaactccacgaagtggctttggagccttacacgaattcgagcctttcctggtctcgacaggccccta
agttagcagaagaagtctcttttgctccggctgagcatggtaagggtgagtgccgggcacggcatgtctg
cttagttctggcccaaacatcaagtgttggtgttttttcgactttctcggcgcgagctgggacatggctc
tgagggaagacgaggcatactcggcctaaggcagcagacgaaggtgctccttcgcggcaacttgtagtcg
cgaaaattcttgcacagtcattgagacctagcatggtaggaactaatgcagcgacgttgtgatggatcgc
ttcttgctcctacgatccttgatctccatctctagaacggggtggcagggacgattaggctgaagtgctc
ctccggttgcgacgacgcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (12)
1. Способ определения видовой принадлежности изолятов и/или штаммов грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum в образце, включающий следующие этапы:
a) выделяют общую ДНК из образца, предположительно содержащего мицелий гриба;
b) проводят ПЦР с праймерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20 и методом секвенирования определяют последовательности нуклеотидов ампликонов локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1;
c) методом выравнивания последовательностей и филогенетического сравнения c генетическими базами данных, содержащими последовательности по локусам ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 для грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum, определяют качественный видовой и внутривидовой состав грибов рода Colletotrichum в анализируемом образце.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на этапе b) последовательности нуклеотидов локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 определяют с помощью секвенирования нового поколения, включающего следующие стадии:
1) к последовательности каждого праймера SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20 со стороны 5’-конца добавляют служебную последовательность, обеспечивающую возможность присоединения последовательностей-адаптеров, зависящих от типа приготовляемой ДНК-библиотеки для секвенирования нового поколения и для последующего, при анализе, демультиплексирования образцов;
2) методом мультиплексной ПЦР с использованием набора праймеров создают ДНК-библиотеку ампликонов исследуемого образца;
3) методом секвенирования нового поколения определяют последовательность нуклеотидов для каждого ампликона с двух сторон с длиной прочтений с каждой стороны не менее 150 нуклеотидов одновременно для всех ампликонов.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на этапе b) последовательности нуклеотидов локусов ITS, GAPDH, TUB2, APN/MAT1 определяют при помощи секвенирования по Сэнгеру, включающего следующие стадии:
1) методом ПЦР проводят 10 отдельных реакций с парами праймеров SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:10;
2) проводят секвенирование по Сэнгеру всех полученных продуктов ПЦР.
4. Способ по п.2, характеризующийся тем, что определение видовой принадлежности проводят одновременно в более чем одном образце.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2807352C1 true RU2807352C1 (ru) | 2023-11-14 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PECCHIA, SUSANNA et al. Molecular Detection of the Seed-Borne Pathogen Colletotrichum Lupini Targeting the Hyper-Variable IGS Region of the Ribosomal Cluster. Plants 8, no. 7 (July 14, 2019): 222. https://doi.org/10.3390/plants8070222. Campbell N R et al. Genotyping-in-Thousands by sequencing (GT-seq): A cost effective SNP genotyping method based on custom amplicon sequencing, Molecular Ecology Resources,Volume15, Issue4, July 2015, Pages 855-867 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/1755-0998.12357. КОКАЕВА Л.Ю. Микобиота пораженных листьев solanum tuberosum l., s. lycopersicum l. и s. dulcamara L, диссертация, Москва, 2016, с. 130-157. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lei et al. | Identification and fine mapping of two blast resistance genes in rice cultivar 93-11 | |
| Feng et al. | Genome-wide genetic diversity detection and population structure analysis in sweetpotato (Ipomoea batatas) using RAD-seq | |
| Kim et al. | Development of cultivar-specific DNA markers based on retrotransposon-based insertional polymorphism in Japanese pear | |
| Fang et al. | Selection of differential isolates of Magnaporthe oryzae for postulation of blast resistance genes | |
| Medina et al. | A survey on occurrence of Cladosporium fulvum identifies race 0 and race 2 in tomato-growing areas of Argentina | |
| de Oliveira et al. | Race identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici isolates obtained from tomato plants in Nova Friburgo, Brazil | |
| RU2807352C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров для генотипирования грибов видового комплекса colletotrichum acutatum | |
| Musial et al. | Identification of QTL for resistance and susceptibility to Stagonospora meliloti in autotetraploid lucerne | |
| Uhls et al. | Grapevine vein clearing virus is prevalent and genetically variable in grape aphid (Aphis illinoisensis Shimer) populations | |
| KR101876273B1 (ko) | 배추 뿌리혹병 판별용 분자마커 및 이를 이용한 배추 뿌리혹병 판별방법 | |
| CN111705160B (zh) | 龙舌兰麻cpSSR标记引物及其应用 | |
| KR102414947B1 (ko) | 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 | |
| CN110438135B (zh) | 美洲黑杨抗叶锈病的抗病基因PdGsSRK、表达蛋白、克隆引物对及其应用 | |
| JP6945200B2 (ja) | Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット | |
| JP3118572B2 (ja) | Ｒｔ−ｐｃｒによるカンキツタターリーフウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法 | |
| KR101949903B1 (ko) | 옥수수 노균병 저항성 개체 선별용 마커 및 이를 이용한 선별방법 | |
| Kyrychenko et al. | Typing of Plum pox virus isolates in the central Ukraine | |
| Lu et al. | Genetic variation of single nucleotide polymorphisms identified at the mating type locus correlates with form-specific disease phenotype in the barley net blotch fungus Pyrenophora teres | |
| Badr et al. | Genetic diversity in white clover and its progenitors as revealed by DNA fingerprinting | |
| KR102629167B1 (ko) | 고추에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 | |
| Brown et al. | Model-based community analyses identify fungal endophytes that may modulate symptom development of charcoal rot disease in soybean | |
| KR102069123B1 (ko) | 인삼뿌리썩음병원균(Ilyonectria mors-panacis) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 식별방법 | |
| Asif Raheem et al. | Molecular Markers as a Diagnostic Tool | |
| CN108085407B (zh) | 与棉花隐性芽黄基因v1紧密连锁的SSR标记及其应用 | |
| Mráček | Investigation of interspecific genome-plastome incompatibility in Oenothera and Passiflora |