JP6945200B2 - Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット - Google Patents
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Description
本発明は、Clostridium difficileのクローン同定法および／又は菌株識別法ならびにこれに用いるプライマーセットに関する。
Clostridium difficileは、病院で院内感染の原因として問題となっている病原細菌である。特に、病院内での集団下痢症の主要な病原体として、重要な感染制御の対象菌種となっている。
欧州や米国の医療機関では、高病原性クローンの流行が知られ、高病原性クローンによる下痢症は死亡率が高いことから、蔓延を防ぐことも重要である。
欧州や米国の医療機関では、高病原性クローンの流行が知られ、高病原性クローンによる下痢症は死亡率が高いことから、蔓延を防ぐことも重要である。
なお、Clostridium difficileは近年分類が見直され、Clostridioides属に分類される見込みであるが、ここではClostridium difficileと記載する。
また、院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌株が同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これをタイピングという。
Clostridium difficileのタイピングの方法としては、従来、PCR-ribotyping法が多用されている。PCR-ribotyping法は菌のゲノム中に複数存在する16S-rRNAと23s-rRNA遺伝子のスペーサー領域の長さに多型性があることを利用し、そのPCR増幅産物の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、比較的短時間で実施が可能で、再現性があることからClostridium difficileの菌株識別の定法とされる。
Clostridium difficileのタイピングの方法としては、従来、PCR-ribotyping法が多用されている。PCR-ribotyping法は菌のゲノム中に複数存在する16S-rRNAと23s-rRNA遺伝子のスペーサー領域の長さに多型性があることを利用し、そのPCR増幅産物の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、比較的短時間で実施が可能で、再現性があることからClostridium difficileの菌株識別の定法とされる。
しかし、PCR-ribotyping法は、複雑なバンドパターンを比較することにより判定する必要があるため、主観的な要素が入りがちである。そのため同時に泳動した菌株でさえも遺伝子型が同一か否かを判断するには熟練者が必要となる。したがって、異なる時刻または別の実験室で得られたPCR-ribotypingの結果を比較することで、複数の分離株の遺伝子型が同等か否かを判定することは非常に困難であった。
他方、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献２には、緑膿菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献３には、アシネトバクター属菌の遺伝子型別法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献４には、大腸菌の遺伝子型別法およびこれに用いるプライマーセットが記載されている。
Clostridium difficileは菌交代症における下痢症の起炎菌として知られる。また、院内感染の原因菌としても知られ、院内感染が疑われる事例では菌のクローナルな伝播を確認するため、PCR-ribotypingという方法が用いられることが多い。PCR-ribotypingはPCRによるタイピング方法であるため、迅速性はある。しかし、複雑なバンドパターンの比較を行う必要があるため、同時に電気泳動した株以外を比較するには専用のソフトウェアが必要であり、医療現場で実施することは困難である。また菌株識別能が低く、特定のPCR-ribotyping型が多く検出される傾向にある。
本発明は、上記実情に鑑みて、迅速かつ容易なClostridium difficileの菌株識別のための手法を開発し、より実際の産業（医療現場）利用に適したClostridium difficileの菌株識別のための方法を提供することを目的としている。また本発明は、さらに上記菌株識別のための方法に用いるプライマーセットを提供することをもその目的としている。
前記したようにClostridium difficileタイピングの標準法であるPCR-ribotypingは菌株識別能が低いが、全ゲノムデータを比較検討するとClostridium difficileのPCR-ribotyping型が同一となるような近縁なクローンの場合ゲノムの多様性が低いことが示されている。従って、単純に外来遺伝子islandを検出しただけでは菌株識別能を上げることは困難であり、hyper variableな検出部位を探す必要がある。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、データベース上に蓄積されつつあるClostridium difficileゲノムを比較検討し、臨床分離株におけるORFの保有パターンを調査した結果、PCR-ribotypingレベル及び株レベルでの識別に成功した。具体的には、本発明者は、（１）染色体上の、genomic isletを構成するORFならびに（２）染色体上のgenomic island中に存在するhyper variableなORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うことにより、より有効にClostridium difficileの遺伝子型別を行うことができることを見出した。
即ち、本発明によれば、Clostridium difficileゲノム上の、（１）genomic isletを構成するORF、および（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、Clostridium difficileの菌株識別のための方法が提供される。
本発明のClostridium difficileの菌株識別のための方法においては、前記（１）のgenomic isletを構成するＯＲＦがCD196_0620、CD630_36250、CD196_1458、CD630_33700、CD196_1802、CD630_25270、CD630_06080、CD630_31360、配列番号１、CD196_2957、CD196_0710および配列番号２からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも４種、特に好ましくはCD196_0620、CD630_36250、CD196_1458、CD630_33700、CD196_1802、CD630_25270、CD630_06080、CD630_31360、配列番号１およびCD196_2957の１０種）の遺伝子であることが好ましく、前記（２）のgenomic island中に存在するhyper variableなORFがCD196_0825、CD630_09400、CD630_09720、CD630_09290、CD196_1456、CD630_09360、CD630_09380、CD196_2048、CD630_09120、配列番号３、CD630_09270、CD630_09310、CD196_1456およびCD196_1096からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも３種、特に好ましくはCD196_0825、CD630_09400、CD630_09720、CD630_09290、CD196_1456、CD630_09360の６種）の遺伝子であることが好ましい。
また、本発明の菌株識別のための方法は配列表の配列番号４と５、配列番号６と７、配列番号８と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（１）のＯＲＦの検出を行い、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８と２９、配列番号３０と３１、配列番号３２と３３、配列番号３４と３５に示された６組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる６組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（２）のＯＲＦの検出を行うことによって実施することができる。
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
前記PCR法としてマルチプレックスPCR法を採用すると、遺伝子型別分類のコストを抑えることができる。
前記（１）及び（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化すると、検出結果が数値化され見やすくなる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
さらに本発明によれば、列番号４と５、配列番号６と７、配列番号８と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマー、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８と２９、配列番号３０と３１、配列番号３２と３３、配列番号３４と３５に示された６組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる６組のプライマーを含む、Clostridium difficileの遺伝子型別分類用プライマーセットが提供される。
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
本発明によれば、Clostridium difficileの菌株識別を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便に、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、Clostridium difficile院内感染を速やかに検出し、院内感染の広がりの防止を達成することができる。
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に係るClostridium difficileは菌株識別のための方法は、Clostridium difficileの染色体上の、（１）genomic isletを構成するORF、および（２）染色体上のgenomic island中に存在するhyper variableなORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
本発明に係るClostridium difficileは菌株識別のための方法は、Clostridium difficileの染色体上の、（１）genomic isletを構成するORF、および（２）染色体上のgenomic island中に存在するhyper variableなORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
［（１）genomic isletを構成するＯＲＦ］
（Clostridium difficileの遺伝的特徴）
Clostridium difficileの遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、PCR-ribotypingやmultilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。
（Clostridium difficileの遺伝的特徴）
Clostridium difficileの遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、PCR-ribotypingやmultilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。
MLST解析では7カ所のハウスキーピング遺伝子(adk, atpA, dxr, glyA, recA, soda, tpi)の塩基配列を決定し、sequence type (ST)を決めることでクローンの同定を行う。また近縁なSTの集団を集めたclonal complex (ＣＣ)としてクローンを同定することもある。なお、ST型またはＣＣを推定するにはgenomic isletの保有パターンを検出することが有効であることが黄色ブドウ球菌、緑膿菌、アシネトバクター属菌および大腸菌では示されていたが、Clostridium difficileでも同様の手法が有効であるか否かはこれまでは不明であった。
Clostridium difficileにはさまざまな遺伝的バックグラウンドを持つものが存在する。実際の野生株における遺伝的バックグラウンドの調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献として個々の研究施設における断片的な情報として利用できるが、それのみでは、最低限のＯＲＦを検出することによりClostridium difficileの菌株識別法を開発するには十分でない。
そこで本発明者は、臨床分離されたClostridium difficileを収集しMLST解析を行い、それらの遺伝的バックグラウンドの調査を行った。その結果、日本で臨床分離されるClostridium difficileには多様なST型に分類される株が存在することが判明し、流行クローン同定のためにはST型を識別できる程度の菌株識別能を実現する必要がある。
（genomic isletを構成するＯＲＦ）
前記のST型を区別するためには、Clostridium difficileにおいてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった（下記表１参照）。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
前記のST型を区別するためには、Clostridium difficileにおいてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった（下記表１参照）。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
臨床分離株におけるgenomic islet保有状況を調査した結果を表１に示す。
表１は臨床分離株のST型およびPCR-ribotyping型と（１）genomic isletを構成するORFの関係を調査した結果である。表１からわかるように、Clostridium difficileのST型またはPCR-ribotyping型の異なる株ではgenomic islet (CD196_0620〜配列番号２)の保有パターンが異なっている。
Clostridium difficileにおいては多様なクローンが臨床分離されることが示されており、集団感染の解析においては、主にgenomic islet検出によるタイピングによって菌株識別能が得られる。
なお、たとえばCD196_0620は、GenBankにおいて公開されているCD196株の620番目の遺伝子である、ということを意味するが、この遺伝子はCD196株のみにしか存在しないわけではなく、例えば菌株番号３においても検出され、それから派生した菌株や、それとは異なる系統のClostridium difficileにおいても存在する可能性がある。
なお、遺伝子CD196_0620は、配列表の配列番号４（フォワード）および５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_36250は、配列表の配列番号６（フォワード）および７（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1458は、配列表の配列番号８（フォワード）および９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_33700は、配列表の配列番号１０（フォワード）および１１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1802は、配列表の配列番号１２（フォワード）および１３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_25270は、配列表の配列番号１４（フォワード）および１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_06080は、配列表の配列番号１６（フォワード）および１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子CD630_36250は、配列表の配列番号６（フォワード）および７（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1458は、配列表の配列番号８（フォワード）および９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_33700は、配列表の配列番号１０（フォワード）および１１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1802は、配列表の配列番号１２（フォワード）および１３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_25270は、配列表の配列番号１４（フォワード）および１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_06080は、配列表の配列番号１６（フォワード）および１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子CD630_31360は、配列表の配列番号１８（フォワード）および１９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子配列番号１は、配列表の配列番号２０（フォワード）および２１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_2957は、配列表の配列番号２２（フォワード）および２３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_0710は、配列表の配列番号３６（フォワード）および３７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子配列番号２は、配列表の配列番号３８（フォワード）および３９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にST型の区別ができる。
遺伝子配列番号１は、配列表の配列番号２０（フォワード）および２１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_2957は、配列表の配列番号２２（フォワード）および２３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_0710は、配列表の配列番号３６（フォワード）および３７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子配列番号２は、配列表の配列番号３８（フォワード）および３９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にST型の区別ができる。
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
以上では、ＰＣＲ法によりgenomic isletのＯＲＦ（１）を検出することを主に説明してきたが、genomic isletのＯＲＦ（１）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
［（２）genomic islandを構成するORF］
Clostridium difficileの中には、比較的分離頻度の高いクローンが存在することが知られている。分離頻度の高いクローンは関連性の見いだされない事例間においても分離されることがしばしばあるため、クローン識別より高い識別能力が必要な菌株識別法が必要となる。
Clostridium difficileの中には、比較的分離頻度の高いクローンが存在することが知られている。分離頻度の高いクローンは関連性の見いだされない事例間においても分離されることがしばしばあるため、クローン識別より高い識別能力が必要な菌株識別法が必要となる。
近年ゲノムの解読が進み、Clostridium difficileには５〜１００個の外来遺伝子からなる遺伝子クラスターが見いだされる。このクラスターをgenomic islandという。genomic islandには溶原ファージや病原アイランド、耐性アイランドに加え機能が不明なものが含まれる。個々のgenomic islandはおよそ５ｋｂｐ程度、またはそれ以上の大きさで、５〜１００個のORFから構成されている。genomic islandにはモザイク状にORFが組み合わされ、genomic island内のORFの構成に多様性が見られる場合と、株が異なってもORF構成がほとんど同じで多様性が見られない場合がある。
しかし、Clostridium difficileにはさまざまな株が存在する。実際の野生株における遺伝子型の調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献あるいはゲノム塩基配列データベースとして個々の断片的な情報として利用できるが、それのみでは最低限のＯＲＦを検出することによるClostridium difficileの菌株同定法を開発するには十分でない。
そこで本発明者はGenBankのClostridium difficileについての公開遺伝子情報および臨床分離株のドラフトゲノムデータを利用し、多くのgenomic islandのORFを検出するためのプライマーを設計し、多様な遺伝的バックグラウンドを持つClostridium difficileについて、それらの保有するgenomic island遺伝子のORFの構成について検討した。
ゲノムデータベース登録株における全ゲノムデータの精査、および臨床分離株によるORF保有確認実験を繰り返した結果、genomic island遺伝子のORFをいくつか組み合わせて検出することが、Clostridium difficileの菌株識別に有効であることが明らかとなった。
その結果CD196_0825、CD630_09400、CD630_09720、CD630_09290、CD196_1456、CD630_09360を検出の対象とすると、Clostridium difficileの菌株を高精度で分類することができることを本発明者は見出した（下記表２参照）。上記のORFを検出することによって、比較的分離頻度の高いクローンにおいて高い菌株識別能力が得られる。これらのgenomic islandを構成するORFをすべて検出することで最大の菌株識別能力を実現する。
なお、たとえば前記CD196_0825は、GenBankにおいて公開されているCD196株の825番目の遺伝子ということを意味するが、この遺伝子はそれぞれCD196株のみにしか存在しないわけではなく、例えばCD196_0825は菌株番号１においても見いだされるなど、菌株によって保有している場合と、保有していない場合がある。
なお、genomic islandは複数のＯＲＦから構成されるが、Clostridium difficileではgenomic islandするＯＲＦのうち、限られたものだけが菌株間において保有状態に十分な差が見られる傾向が、臨床分離株を利用した実験から明らかになった。これを染色体上のgenomic island中に存在するhyper variableなＯＲＦとした。hyper variableなＯＲＦの中から、そのサイズやプライマーの作りやすさ、増幅のしやすさについて、臨床分離株を用いて検討し、決定した。
臨床分離株におけるgenomic island保有状況を調査した結果を表２に示す。臨床分離株においても菌株に特異的なORF保有パターンとなった。
なお、遺伝子CD196_0825は、配列表の配列番号２４（フォワード）および２５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09400は、配列表の配列番号２６（フォワード）および２７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09720は、配列表の配列番号２８（フォワード）および２９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09290は、配列表の配列番号３０（フォワード）ならびに３１（リバース）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1456は、配列表の配列番号３２（フォワード）および３３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09360は、配列表の配列番号３４（フォワード）および３５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09380は、配列表の配列番号４０（フォワード）および４１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_2048は、配列表の配列番号４２（フォワード）および４３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09120は、配列表の配列番号４４（フォワード）および４５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子配列番号３は、配列表の配列番号４６（フォワード）および４７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09270は、配列表の配列番号４８（フォワード）および４９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09310は、配列表の配列番号５０（フォワード）および５１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1456は、配列表の配列番号５２（フォワード）および５３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1096は、配列表の配列番号５４（フォワード）および５５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子CD630_09400は、配列表の配列番号２６（フォワード）および２７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09720は、配列表の配列番号２８（フォワード）および２９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09290は、配列表の配列番号３０（フォワード）ならびに３１（リバース）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1456は、配列表の配列番号３２（フォワード）および３３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09360は、配列表の配列番号３４（フォワード）および３５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09380は、配列表の配列番号４０（フォワード）および４１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_2048は、配列表の配列番号４２（フォワード）および４３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09120は、配列表の配列番号４４（フォワード）および４５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子配列番号３は、配列表の配列番号４６（フォワード）および４７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09270は、配列表の配列番号４８（フォワード）および４９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09310は、配列表の配列番号５０（フォワード）および５１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1456は、配列表の配列番号５２（フォワード）および５３（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1096は、配列表の配列番号５４（フォワード）および５５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
以上では、ＰＣＲ法によりgenomic islandを構成するＯＲＦ（２）を検出することを主に説明してきたが、genomic islandを構成するＯＲＦ（２）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
［ORF検出手段］
上述した、Clostridium difficileの染色体上の、genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
上述した、Clostridium difficileの染色体上の、genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
＜ＰＣＲ＞
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、Clostridium difficileのDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、Clostridium difficileのDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
また、複数のORF毎にまとめて検出する場合には、たとえば、Clostridium difficileマーカーとしてCD196_0948を検出するプライマー（配列表の配列番号５６と５７）、binary toxin (cdtA) を検出するプライマー（配列表の配列番号５８と５９）、toxin A (tcdA)を検出するプライマー（配列表の配列番号６０と６１）およびtoxin B (tcdB)を検出するプライマー（配列表の配列番号６２と６３）を加えた、複数のORFにそれぞれ対応する複数組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの組）を混合し、同一の反応系に入れてPCR反応を行うマルチプレックスPCRが実施可能である。この場合には、各ORFに対応するPCR増幅産物の有無は、反応後の液を電気泳動、たとえば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などで泳動して得られたバンドの有無によって確認する。
全てのORFを同時に検出する場合には、たとえばmicro arrayを応用してＯＲＦを検出する。micro arrayによる検出では、各ＯＲＦとハイブリダイズするプローブをmicro arrayの各wellに作成しておき、培養菌からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをハイブリダイズさせ、未反応のＤＮＡを洗浄した後、２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光色素でラベルし、蛍光を捉える機械で測定することで目的のＯＲＦが検出可能となる。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
（プライマーの設計）
Clostridium difficileゲノムはATリッチであるため、メルティング温度が低く、マルチプレックスPCRに適したプライマーを設計するには、GC比が比較的高い領域から、プライマーを設計し、実際にPCRおよびマルチプレックスPCRに使用し、機能することを確認しながら設計を進める必要がある。さらに、上記genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどのClostridium difficileに汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
Clostridium difficileゲノムはATリッチであるため、メルティング温度が低く、マルチプレックスPCRに適したプライマーを設計するには、GC比が比較的高い領域から、プライマーを設計し、実際にPCRおよびマルチプレックスPCRに使用し、機能することを確認しながら設計を進める必要がある。さらに、上記genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどのClostridium difficileに汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
上記genomic isletを構成するORF（１）およびgenomic islandを構成するORF（２）に加え、Clostridium difficile共通マーカーとしてのCD196_0948を検出するプライマー、binary toxin (cdtA) を検出するプライマー、toxin A (tcdA)を検出するプライマーおよびtoxin B (tcdB)を検出するプライマーの設計にあたっては、プライマー自身が折れ曲がって相補的になっている部分が結合して２重鎖を形成したり、異なるプライマー同士が、互いに相補的になっている部分において結合して２量体またはそれ以上の結合体を形成したりしないような配列にする。
さらに、マルチプレックスPCRで検出することを考慮し、プライマーのGC比をおよそ50％とし、Tm値を合わせるよう工夫することが好ましい。また、増幅効率と、電気泳動の際に短時間で分離可能なよう、PCR増幅産物サイズがおよそ50bp〜700bp、好ましくは70bp〜600bpとなるように調整することが望ましい。なお、同じ反応系で検出するＯＲＦにおいては、ＰＣＲ増幅産物のサイズが同じにならないようにプライマーを設計することが重要である。
上記のような条件を設定することでマルチプレックスPCRにおいて再現性の高い増幅結果が得られるプライマーおよびプライマーセットを得ることができる。このようなプライマーの設計は、市販のソフトウェアあるいはウエブを通じて自由に入手し利用可能なソフトウェアにより行うことができるが、実際にPCRを行い、増幅を確認することで、実用的なプライマーとなる。
具体的には、上記（１）〜（２）のORFの項目でそれぞれ述べたように、
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして１０組のプライマー、
（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFためのプライマーとして６組のプライマー、
の合計１６組のプライマー（配列表の配列番号４〜３５）を本発明者は設計した。
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして１０組のプライマー、
（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFためのプライマーとして６組のプライマー、
の合計１６組のプライマー（配列表の配列番号４〜３５）を本発明者は設計した。
なお、上記プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、下記表３にprimer mixtureとして示すように、１０組のプライマーセットにClostridium difficileのマーカーとしてCD196_0948を検出するプライマー（配列表の配列番号５６と５７）を加えた１１組のプライマーを組み合わせて混合した反応系、および下記表４にprimer mixtureとして示すように、６組のプライマーセットにClostridium difficileのマーカーとしてCD196_0948を検出するプライマー（配列表の配列番号５６と５７）、binary toxin (cdtA) を検出するプライマー（配列表の配列番号５８と５９）、toxin A (tcdA)を検出するプライマー（配列表の配列番号６０と６１）およびtoxin B (tcdB)を検出するプライマー（配列表の配列番号６２と６３）を加えた１０組のプライマーを組み合わせて混合した反応系にてＰＣＲを実施することが望ましい。なお、Clostridium difficileのクローン識別と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
なお、配列番号５６および５７で示された増幅ＯＲＦのCD196_0948とは、機能は未確認だがアミノ酸への翻訳が予想される遺伝子であり、Clostridium difficileに普遍的に見出されるので、Clostridium difficileを識別する共通マーカーとして用いることができる。
以上に示した具体的なプライマーは、標的ＯＲＦを増幅するために最適化された配列であり、これらのプライマーに２塩基程度の付加、置換、欠失及び／又は挿入といった変更があっても、プライマーとしての機能は失われず、ＰＣＲによって標的ＯＲＦを増幅することができる。付加とは、表に示されたプライマーの５’側または３’側の末端に塩基が追加されることをいい、挿入とは、前記の末端ではなく、プライマーの内側において、塩基と塩基の間に塩基が追加されることを言う。但し、塩基配列の３’末端に２塩基以下の塩基の付加又は置換を有する場合は、付加又は置換後の塩基配列の３’末端の塩基は標的ＯＲＦと相補的であることが好ましい。
プライマーとして高い性能を発揮する観点からは、前記変更は、２塩基以下の付加、置換、欠失、挿入であることが好ましく、２塩基以下の付加または２塩基以下の５’側または３’側の末端における欠失であることがより好ましく、１塩基以下の標的ＯＲＦと相補的な塩基の付加または５’側または３’側の末端における１塩基以下の欠失であることが特に好ましい。一般的に、５’側の変更はプライマーとしての機能を失わせにくく、３’側の変更はプライマーの機能を失わせやすい傾向がある。
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（Clostridium difficile）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（Clostridium difficile）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
［ORF検出菌種同定およびクローン同定、並びに菌株識別法の実施方法］
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明のClostridium difficileのクローン同定法及び菌株同定の手順を説明する。
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明のClostridium difficileのクローン同定法及び菌株同定の手順を説明する。
（菌種の同定）
便などの患者由来の検体から、CCMA培地などのClostridium difficileを分離可能な培地を用いてClostridium difficileを分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および毒素産生性の確認により、Clostridium difficileと同定する。
便などの患者由来の検体から、CCMA培地などのClostridium difficileを分離可能な培地を用いてClostridium difficileを分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および毒素産生性の確認により、Clostridium difficileと同定する。
Clostridium difficileであると同定された菌株を、Clostridium difficileを増殖可能な液体培地、あるいは寒天培地（ブルセラHK培地、CCMA培地等）を用いて37℃で二晩培養する。
（DNA抽出）
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料（テンプレート）とする。
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料（テンプレート）とする。
（PCR反応）
マルチプレックスPCRで上記表３および４に記載の、genomic isletを構成するORF １０個、genomic islandを構成するORF ６個に加え、Clostridium difficileマーカーとしてのCD196_0948、及びbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)の検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１１組および１０組の２群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、菌種同定およびクローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
マルチプレックスPCRで上記表３および４に記載の、genomic isletを構成するORF １０個、genomic islandを構成するORF ６個に加え、Clostridium difficileマーカーとしてのCD196_0948、及びbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)の検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１１組および１０組の２群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、菌種同定およびクローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
（電気泳動）
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
（結果判定）
最大１１本または１０本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
最大１１本または１０本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
このコードは（１）〜（２）の各ＯＲＦおよびbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)ごとに作成してもよいし、または、すべてをまとめて一つのコードとして作成してもよいし、あるいは（１）〜（２）のＯＲＦおよびbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)をまとめて作成するなどしてもよい。本発明の菌種同定およびクローン同定法が実際の医療の現場で使用される場合には、（１）〜（２）のＯＲＦおよびbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)すべてをまとめて一つのコードとして作成すると、桁数が大きくなって見にくいことから、いくつかのＯＲＦの結果はまとめて一つのコードとして作成することが好ましい。
ここで上述のとおり、（１）のＯＲＦの保有パターンはST型との相関が高く、ST型を推定するのに役立つ。（２）のORFの保有パターンを比較することで菌株識別が可能となる。
したがって、（１）のＯＲＦ検出結果を一つのコードとして作成することが好ましく、（２）のＯＲＦ検出結果は一つコードとして作成することが好ましい。
そして、たとえばこのようにして作成された２進法のコードを、より桁数を少なくして見やすくするため、たとえば１０進法に変換し、遺伝子型コードとする。以上のコード作成の一例を下記表５に示す。表５の例は図1の分離株番号１のものである。
まず、適切なプライマーを使用したＰＣＲおよび電気泳動により、試験対象のClostridium difficileにおける各ＯＲＦの有無を検出し、それを２進法によりコード化する。そして、このコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードを得る（コード）。
表５に示された例において、コード１は（１）のORFの検出結果をまとめたものであるので、複数のClostridium difficileについて遺伝子型コードを作成した場合に、Clostridium difficileのST型に相当する数値となる。この数値から世界流行クローンであるかどうかを判断することができる。コード２は菌株に固有のコードであり、計算上512種類の遺伝子型に分けることが可能である。コード２はほとんどのClostridium difficileにおける菌株識別能が高くなるようORFが選択されている。
具体的には、たとえば、Clostridium difficile臨床分離株１６株における１６個のORF（CD196_0620〜CD630_09360）およびbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)の保有の有無を、上記と同様にして２進法コード化、さらに１０進法コード化すると、下記表６のとおりである。
表６において、一番上の行は菌株の番号、上から２番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型、３番目の行はPCR-ribotyping型である。
このように得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
このように得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
さらに、本発明で検出の対象としているＯＲＦの大部分は、Clostridium difficileの病原性等に関連しないＯＲＦである。病原性に関連するなど、特定の機能を有する遺伝子は、そのClostridium difficileが宿主内で増殖する確率を上げたり、あるいはその遺伝子産物が宿主の免疫システムのターゲットとなり、反対に生存確率を下げることがある。つまりこのような遺伝子は、Clostridium difficileの多くが持っている、あるいは反対にほとんど持っていないと考えられる。本発明では、このようなバイアスがかからないように適切なＯＲＦを選択して遺伝子型別分類を行っているのである。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
ある病院で臨床分離されたClostridium difficile１６株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
ある病院で臨床分離されたClostridium difficile１６株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
（Clostridium difficileの培養）
Clostridium difficileであると同定された１６の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
Clostridium difficileであると同定された１６の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
（DNA抽出）
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１１組及び１０組を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、２１個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表７及び８のとおりである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（ASTEC社製、GeneAtlas G02）に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
サーマルサイクラー（ASTEC社製、GeneAtlas G02）に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで65分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで65分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表５と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表６に示す。
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表５と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表６に示す。
表６において、前述のようにコード１からST型が判明するが、コード２によって同一ST型の株がさらに識別されていることがわかる。
実施例２
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離されたClostridium difficile１６株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離されたClostridium difficile１６株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
（Clostridium difficileの培養）
Clostridium difficileであると同定された１６の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
Clostridium difficileであると同定された１６の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
（DNA抽出）
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
プライマーは１１組及び１０組を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、２１個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表９及び１０のとおりである。
なお、配列番号６４は配列番号４に対して３塩基を付加したものであり、配列番号６５は配列番号５に対して１塩基を置換したものであり、配列番号６６は配列番号６に対して２塩基を置換したものであり、配列番号６７は配列番号７に対して１塩基を置換したものであり、配列番号６８は配列番号８に対して１塩基を置換したものであり、配列番号６９は配列番号９に対して３塩基を付加したものであり、配列番号７０は配列番号１０に対して３塩基を付加したものであり、配列番号７１は配列番号１１に対して１塩基を挿入したものであり、配列番号７２は配列番号１２に対して１塩基を挿入したものであり、配列番号７３は配列番号１３に対して２塩基を付加したものであり、配列番号７４は配列番号１４に対して２塩基を欠失したものであり、配列番号７５は配列番号１５に対して２塩基を欠失したものであり、配列番号７６は配列番号１６に対して３塩基を付加したものであり、配列番号７７は配列番号１７に対して１塩基を挿入させたものであり、配列番号７８は配列番号１８に対して３塩基を付加させたものであり、配列番号７９は配列番号１９に対して３塩基を付加したものであり、配列番号８０は配列番号２０に対して１塩基を欠失したものであり、配列番号８１は配列番号２１に対して２塩基を置換したものであり、配列番号８２は配列番号２２に対して１塩基を挿入したものであり、配列番号８３は配列番号２３に対して１塩基を欠損させたものである。
配列番号８４は配列番号２４に対して２塩基を付加したものであり、配列番号８５は配列番号２５に対して１塩基を置換したものであり、配列番号８６は配列番号２６に対して２塩基を挿入したものであり、配列番号８７は配列番号２７に対して２塩基を置換したものであり、配列番号８８は配列番号２８に対して２塩基を付加したものであり、配列番号８９は配列番号２９に対して２塩基を置換したものであり、配列番号９０は配列番号３０に対して２塩基を欠失したものであり、配列番号９１は配列番号３１に対して２塩基を置換したものであり、配列番号９２は配列番号３２に対して３塩基を付加したものであり、配列番号９３は配列番号３３に対して２塩基を付加したものであり、配列番号９４は配列番号３４に対して１塩基を挿入したものであり、配列番号９５は配列番号３５に対して２塩基を置換したものである。
（PCR反応）
サーマルサイクラー（ASTEC社製、GeneAtlas G02）に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
サーマルサイクラー（ASTEC社製、GeneAtlas G02）に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで65分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで65分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
（結果判定）
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表５と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
１反応につき最大１１本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表５と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
表６において、前述のようにコード１からST型が判明するが、コード２によって同一ST型の株がさらに識別されていることがわかる。
結果を図２に示す。図１および表６と同様の結果が得られた。
結果を図２に示す。図１および表６と同様の結果が得られた。
Claims (8)
- Clostridium difficileの染色体上の、
（１）genomic isletを構成するORF、および
（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFを構成するORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、Clostridium difficileの菌株識別のための方法であって、前記（１）のＯＲＦにおける genomic isletがCD196_0620、CD630_36250、CD196_1458、CD630_33700、CD196_1802、CD630_25270、CD630_06080、CD630_31360、配列番号１およびCD196_2957からなる１０種の遺伝子であり、前記（２）のgenomic island中に存在するhyper variableなORFがCD196_0825、CD630_09400、CD630_09720、CD630_09290、CD196_1456およびCD630_09360からなる６種の遺伝子である、方法。 - 配列表の配列番号４と５、配列番号６と７、配列番号８と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（１）のＯＲＦの検出を行い、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８と２９、配列番号３０と３１、配列番号３２と３３、配列番号３４と３５に示された６組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる６組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行う、請求項１に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項２に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 前記PCR法がマルチプレックスPCR法である、請求項２又は３に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 前記（１）及び（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化する、請求項１〜４の何れか１項に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化する、請求項５に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 配列表の配列番号４と５、配列番号６と７、配列番号８と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーと、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８と２９、配列番号３０と３１、配列番号３２と３３、配列番号３４と３５に示された６組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる６組のプライマーを含むClostridium difficileの菌株識別のためのプライマーセット。
- 上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項７に記載のClostridium difficileの菌株識別のためのプライマーセット。
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