KR101955329B1 - 클로스트리디움 디피실리 균주 검출용 조성물과 키트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

클로스트리디움 디피실리 균주 검출용 조성물과 키트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 검출용 조성물, 키트 및 이를 이용한 클로스트리디움 디피실리 검출 방법이 개시되었다. 상기 검출 방법은 시료에서 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 높은 정확도와 민감도로 검출할 수 있다.

Description

클로스트리디움 디피실리 균주 검출용 조성물과 키트 및 이를 이용한 검출 방법{Compositions and kits for detection and analysis of strains of Clostridium difficile, and methods using the same}
클로스트리디움 디피실리 균주 또는 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물과 키트 및 이를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 방법에 관한 것이다.
클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)는 클로스트리디움 속의 그람 양성 세균 종이다. 클로스트리디아(Clostridia)는 혐기성의 포자 형성균이다.
클로스트리디움 디피실리는 항생제 관련 설사의 가장 심각한 원인이고, 위막성 대장염(pseudomembranous colitis), 결장의 심각한 감염을 유도하여 종종 항생제에 의한 정상 장내균총을 제거한다. 체내에 자연적으로 존재하는 클로스트리디움 디피실리 세균은 과성장하게 된다. 과성장한 세균은 복부 통증을 갖는 더부룩함, 변비 및 설사를 유발할 수 있는 독소를 방출하기 때문에 유해하다. 잠복 증상은 종종 몇몇 독감 유사 증상처럼 보인다. 원인이 되는 항생제 치료의 중단으로 종종 치유된다.
클로스트리디움 디피실리 감염은 무증상으로부터 심각한 및 특히 고령자에서 생명을 위협하는 정도까지 중증도가 다양할 수 있다. 사람들은 대부분 종종 병원, 양로원 또는 보호시설에서 감염되지만, 지역 외래환자 진료시의 클로스트리디움 디피실리 감염이 증가하고 있다. 클로스트리디움 디피실리 취득 비율은 2주 이하의 병원 입원 환자에서 13% 및 4주 이상의 병원 입원 환자에서 50%인 것으로 평가된다. 클로스트리디움 디피실리 대장염의 빈도 및 중증도는 높은 상태이고, 사망률 증가와 관련되는 것 같다. 초기의 개입 및 집중 관리가 회복의 주요 인자이다.
클로스트리디움 디피실리의 독성은 독소A, 독소B, 이원 독소 및 고도 독성이 있다. 독소A는 엔테로톡신으로서 유전자 tcdA에 의해 암호화된다. 독소B는 엔테로톡신으로서 유전자 tcdB에 의해 암호화된다. 이원 독소(binary toxin)는 cdtA와 cdtB 유전자에 의해 암호화되고, 독성의 작용 기작은 아직 밝혀지지 않았다. 아울러, 고도 독성(hypervirulent)은 병독성인 균주 NAP1/BI/027과 관련된 독소로서, △117 tcdC SNP에 의한 것으로서, 2005년에, 북아메리카에서 지리학적으로 확산된 발병을 유발하는, 시프로(Cipro; 시프로플록사신) 및 레바퀸(Levaquin; 레보플록사신) 등의 플루오로퀴놀론 항생제에 내성이 있는 클로스트리디움 디피실리의 새로운 고독성 균주의 출현이 보고되었다.
이러한 병원성 유전자를 분자적 진단에 이용할 경우 유전자 변이로 인한 오류 발생 가능성이 있고, 변종으로 인한 거짓 양성(false positive) 판정을 할 가능성이 있기 때문에 여러 계통(strain)의 클로스트리디움 디피실리 균주에서 공통적으로 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자를 이용하여 클로스트리디움 디피실리를 검출할 필요가 있다.
또한, 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리는 포자(spore)를 형성하여 접촉성 감염을 유발하고 환자는 격리가 필요하므로 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 특이적으로 검출함으로써 정확하고 신속한 진단을 할 필요가 있다.
따라서, 변이가 적고 여러 계통에서 공통적으로 발현되는 유전자를 이용하여 클로스트리디움 디피실리를 일차적으로 검출하고, 그 중 독성을 가진 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간내에 높은 정확도와 민감도로 검출하여 진단할 수 있는 방법이 요구된다.
클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 조성물을 제공한다.
클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 키트를 제공한다.
클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 프라이머 세트를 이용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 방법을 제공한다.
하기 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 조성물이 제공된다:
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드: 및
서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드. 또한, 상기 조성물은 서열번호 3 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 6의 표적 핵산 서열은 gluD(glutamate dehydrogenase, GDH) 유전자일 수 있다. gluD 유전자에 의하여 암화화되는 gluD 단백질은 클로스트리디움 디피실리에서 발현되는 대사성 효소로서, 독성이 없는 클로스트리디움 디피실리 및 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리에서 모두 발현되기 때문에, 클로스트리디움 디피실리의 독성 유무와 관계없이 gluD 유전자를 검출함으로써 다양한 계통의 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 또한, gluD 유전자를 검출함으로써 병원성 유전자의 유전자 변이로 인한 오류 발생 가능성 또는 거짓 양성(false positive) 판정 가능성을 줄일 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 14 내지 16의 표적 핵산 서열은 tcdB(toxin B Clostridium difficile) 유전자일 수 있다. tcdB 유전자에 의하여 암화화되는 tcdB 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 단백질이다. tcdB 유전자는 다양한 계통에서 보존된 영역이 적으나, tcdB 유전자에 대해 민감도가 향상된 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 28 내지 30의 표적 핵산 서열은 Δ117 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 포함하는 tcdC 유전자일 수 있다. tcdC 유전자의 117번 위치의 SNP는 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리에서 확인된 독성 유전자이다. Δ117 SNP을 포함하는 tcdC 유전자를 검출하기 위하여 대립형질 특이적인 디자인으로서 추가적인 프라이머 또는 프로브가 없이도 검출할 수 있는 프라이머 세트를 사용함으로써 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드; 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 9, 24 및 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7 내지 9의 표적 핵산 서열은 tcdA(toxin A Clostridium difficile) 유전자일 수 있다. tcdA 유전자에 의하여 암화화되는 tcdA 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 단백질이다. tcdA 유전자에 대해 민감도가 향상된 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 22 내지 24의 표적 핵산 서열은 이원 독소를 암호화하는 cdtA 유전자일 수 있다. cdtA 유전자에 대해 고유한 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 이원 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 25 내지 27의 표적 핵산 서열은 이원 독소를 암호화하는 cdtB 유전자일 수 있다. cdtB 유전자에 대해 고유한 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 이원 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트들에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
또한, 예를 들면 프로브가 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 쌍으로 표지된 것일 수 있다. 아울러, 예를 들면 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, 및 NED로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 마커로 표지되거나, 프로브의 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, 및 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 퀀처(fluorescent quencher)로 표지될 수 있다.
상기 프라이머 세트는 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는데 있어서, 고유 디자인의 서열로 자가-이량체(self-dimer) 발생을 억제시키고 교차-반응성이 존재하지 않아 검출 효율 민감도를 향상시키며, 한개 이상의 복수개의 유전자의 조합으로 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출함으로써 특이성을 향상시킬 수 있다. 또한 각각의 유전자에 대해 앰플리콘의 크기가 100bp 이하로 생성되므로 빠른 시간 내에 특이적으로 증폭이 가능할 수 있다. 한 개 이상의 복수 개의 유전자 조합을 하나 또는 그 이상의 공간에서 동시에 실시간 검출가능함으로써 검출 시간을 최소화시킬 수 있다.
상기 용어, "뉴클레오티드(nucleotide) 서열"은 이중 가닥 DNA 또는 cDNA, 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA이며, 달리 기재되어 있지 않은 한, 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(예를 들면, 화학적 합성)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 상업적으로 구입할 수 있다.
용어, "뉴클레오티드 서열"는 일부 경우에서, "핵산 서열", "프라이머", "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"와 혼용될 수 있다.
뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(예를 들면, 화학적 합성)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드는 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 버퍼 내에서 적합한 조건(예를 들면, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-35개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "정방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
상기 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
용어 "프로브(probe)"는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형된 단량체(monomer) 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머(oligomer)를 의미한다. 예를 들어, 상기 프로브는 혼성화의 효율을 높일 수 있도록 단일 가닥일 수 있다.
상기 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다.
용어 "실질적으로 상보적인 서열(substantially complementary sequence)"은 당업계에 공지된 엄격 조건 하에서 주형이 되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 엄격 조건(stringent conditions)은 온도, 이온 세기(버퍼 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 a) 50℃ 온도 및 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트로 세척하거나, b) 혼성화 버퍼(50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어질 수 있다.
용어 "표적(target) DNA" 또는 "표적(target) RNA" 또는 "표적 핵산(target nucleic acid)" 또는 "표적 핵산 서열(target nucleic acid sequence)"은 DNA 증폭에 의해 표적이 되는 핵산을 의미한다. 표적 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공될 수 있다. 표적 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA일 수 있다.
상기 조성물은 표적 핵산을 증폭하기 위한 조성물일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥 치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상의 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다.
하기 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 키트가 제공된다:
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드: 및
서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드. 또한, 상기 키트는 서열번호 3 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 6의 표적 핵산 서열은 gluD(glutamate dehydrogenase, GDH) 유전자일 수 있다. gluD 유전자에 의하여 암화화되는 gluD 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 세포 표면에 존재하는 단백질로서, gluD 유전자를 검출함으로써 다양한 계통의 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 또한, gluD 유전자를 검출함으로써 병원성 유전자의 유전자 변이로 인한 오류 발생 가능성 또는 거짓 양성(false positive) 판정 가능성을 줄일 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 14 내지 16의 표적 핵산 서열은 tcdB(toxin B Clostridium difficile) 유전자일 수 있다. tcdB 유전자에 의하여 암화화되는 tcdB 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 단백질이다. tcdB 유전자는 다양한 계통에서 보존된 영역이 적으나, tcdB 유전자에 대해 민감도가 향상된 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 28 내지 30의 표적 핵산 서열은 Δ117 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 포함하는 tcdC 유전자일 수 있다. tcdC 유전자의 117번 위치의 SNP는 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리에서 확인된 독성 유전자이다. Δ117 SNP을 포함하는 tcdC 유전자를 검출하기 위하여 대립형질 특이적인 디자인으로서 추가적인 프라이머 또는 프로브가 없이도 검출할 수 있는 프라이머 세트를 사용함으로써 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드; 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 서열번호 9, 24 및 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7 내지 9의 표적 핵산 서열은 tcdA(toxin A Clostridium difficile) 유전자일 수 있다. tcdA 유전자에 의하여 암화화되는 tcdA 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 단백질이다. tcdA 유전자에 대해 민감도가 향상된 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 22 내지 24의 표적 핵산 서열은 이원 독소를 암호화하는 cdtA 유전자일 수 있다. cdtA 유전자에 대해 고유한 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 이원 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 25 내지 27의 표적 핵산 서열은 이원 독소를 암호화하는 cdtB 유전자일 수 있다. cdtB 유전자에 대해 고유한 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 이원 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트들에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
또한, 예를 들면 프로브가 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 쌍으로 표지된 것일 수 있다. 아울러, 예를 들면 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, 및 NED로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 마커로 표지되거나, 프로브의 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, 및 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 퀀처(fluorescent quencher)로 표지될 수 있다.
상기 키트는 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.
또한, 상기 키트는 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성 (exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 키트는 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적 핵산을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.
하기 단계를 포함하는, 시료 중 클로스트리디움 디피실리 균주를 실시간으로 검출하는 방법이 제공된다:
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드: 및
서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계;
표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계; 및
증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계.
또한, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 3 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 6의 표적 핵산 서열은 gluD(glutamate dehydrogenase, GDH) 유전자일 수 있다. gluD 유전자에 의하여 암화화되는 gluD 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 세포 표면에 존재하는 단백질로서, gluD 유전자를 검출함으로써 다양한 계통의 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 또한, gluD 유전자를 검출함으로써 병원성 유전자의 유전자 변이로 인한 오류 발생 가능성 또는 거짓 양성(false positive) 판정 가능성을 줄일 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
상기 방법은 시료로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 14 내지 16의 표적 핵산 서열은 tcdB(toxin B Clostridium difficile) 유전자일 수 있다. tcdB 유전자에 의하여 암화화되는 tcdB 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 단백질이다. tcdB 유전자는 다양한 계통에서 보존된 영역이 적으나, tcdB 유전자에 대해 민감도가 향상된 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
상기 방법은 시료로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 28 내지 30의 표적 핵산 서열은 Δ117 SNP를 포함하는 tcdC 유전자일 수 있다. tcdC 유전자의 117번 위치의 SNP는 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리에서 확인된 독성 유전자이다. Δ117 SNP을 포함하는 tcdC 유전자를 검출하기 위하여 대립형질 특이적인 디자인으로서 추가적인 프라이머 또는 프로브가 없이도 검출할 수 있는 프라이머 세트를 사용함으로써 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
상기 방법은 시료로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드; 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 9, 24 및 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7 내지 9의 표적 핵산 서열은 tcdA(toxin A Clostridium difficile) 유전자일 수 있다. tcdA 유전자에 의하여 암화화되는 tcdA 단백질은 클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 단백질이다. tcdA 유전자에 대해 민감도가 향상된 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 22 내지 24의 표적 핵산 서열은 이원 독소를 암호화하는 cdtA 유전자일 수 있다. cdtA 유전자에 대해 고유한 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 이원 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 25 내지 27의 표적 핵산 서열은 이원 독소를 암호화하는 cdtB 유전자일 수 있다. cdtB 유전자에 대해 고유한 디자인의 프라이머 세트를 사용함으로써 이원 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 민감도가 우수하게 검출할 수 있다. 아울러, 상기 프라이머 세트들에 의해 PCR 증폭되는 생성물의 크기가 40bp 내지 100bp로서 빠른 시간 내에 특이적으로 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
프로브는 검출 가능한 표지로 표지될 수 있고, 예를 들면 FRET 쌍으로 표지될 수 있다. 아울러, 예를 들면 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, 및 NED로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 마커로 표지되거나, 프로브의 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, 및 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 퀀처(fluorescent quencher)로 표지될 수 있다.
상기 시료로부터 얻어진 핵산 시료는 분변, 솜막대로 채취한 시료, 체액 또는 조직 절편으로부터 추출된 게놈 DNA 또는 정제된 게놈 DNA일 수 있다.
상기 혼성화시키는 단계에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 용어 "어닐링(annealing)"과 혼용될 수 있다. 혼성화는 하나의 핵산과 다른 핵산이 염기쌍 형성 상호 작용에 의해 듀플렉스, 트리플렉스(triplex), 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는 것을 의미한다. 염기쌍 형성 상호 작용은, 예를 들어, A/T 및 G/C와 같이, 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴-유형(Hoogsteen-type) 수소 결합에 의한 염기 특이적인 염기쌍 형성일 수 있다. 또한, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호 작용이 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다.
상기 방법은 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함한다.
표적 핵산 서열은 DNA 증폭에 의해 표적이 되는 핵산을 의미한다. 표적 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공될 수 있다. 표적 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA일 수 있다.
증폭된 표적 핵산 서열의 크기는 40bp 내지 100bp로서, 증폭 및 검출에 최소한의 시간이 소요되어 빠른 검출이 가능할 수 있다.
증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다. 상기 PCR은 당업계에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, PCR 과정은 1) 표적 DNA 분자를 배출시키기 위하여 시료를 처리하여 추출물을 얻는 단계; 2) 효소, 버퍼, dNTP, 및 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 수성 용액을 첨가하는 단계; 3) 상기 반응 혼합물을 2 또는 3 온도 사이에서 열순환(thermal cycling)(예를 들면, 90℃ 내지 96℃, 37℃ 내지 65℃ 및 72 ℃)하는 단계 및 4) 증폭 DNA를 검출하는 단계를 거칠 수 있다. 상기 PCR은 폴리프로필렌 튜브, 96-웰 플레이트 또는 실리콘-기초 마이크로 PCR 칩에서 수행될 수 있다. 또한, 증폭은 멀티플렉스(multiplex) PCR일 수 있다. 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 방법은 복수개의 프라이머 세트를 동일한 챔버에서 동시에 PCR을 수행하는 것을 말한다.
상기 방법은 증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
검출하는 단계는 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출기로 측정하는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 자기적 신호, 전기적 신호, 형광, 라만 등의 발광 신호, 산란광 신호, 및 방사능 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호를 측정할 수 있다. 검출하는 단계는 표적 서열에 표지된 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출하는 것일 수 있다. 예를 들면, 검출하는 단계는 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의해 발생하는 신호를 검출하여 표적 핵산의 존재 여부를 검출할 수 있다.
검출하는 단계는 실시간(real time)으로 증폭되는 핵산 서열을 실시간으로 검출하는 것일 수 있다. 이에 의하여 빠른 시간 내에 표적 핵산 서열을 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 조성물 또는 키트에 의하면, 변이가 적은 gluD 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 독성 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 독성 또는 고도 독성인 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 특이적으로 높은 정확도와 민감도 하는 검출 방법에 효과적으로 이용할 수 있다.
또한 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 방법에 의하면, 변이가 적은 gluD 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 독성 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 독성 또는 고도 독성인 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 특이적으로 높은 정확도와 민감도 하는 검출 방법에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1의 (a) 및 (c)는 일 실시예에 따른 gluD 유전자 검출을 위한 서열 번호: 1 내지 3을 사용하고, (b) 및 (d)는 일 실시예에 따른 gluD 유전자 검출을 위한 서열 번호: 4 내지 6을 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 및 도 3의 (a)는 일 실시예에 따른 tcdA 표적 유전자 검출을 위한 서열 번호: 7 내지 9를 사용하고, (b)는 참고-tcdA로서 서열번호: 10 내지 11의 프라이머와 서열번호: 12 또는 13의 프로브를 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 및 도 5의 (a)는 일 실시예에 따른 tcdB 표적 유전자 검출을 위한 서열 번호: 14 내지 16을 사용하고, (b)는 참고-tcdB로서 서열번호: 17 또는 18의 정방향 프라이머, 서열번호: 19 또는 20의 역방향 프라이머와 서열번호: 21의 프로브를 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 및 도 7의 (a)는 일 실시예에 따른 cdtA 표적 유전자 검출을 위한 서열 번호: 22 내지 24를 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출한 결과이고, (b)는 cdtB 표적 유전자 검출을 위한 서열 번호: 25 내지 27을 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 및 도 9는 (a)Δ117 SNP를 포함하지 않는 야생형(wild type) tcdC 유전자, (b) Δ117 SNP를 포함하는 돌연변이(mutant) tcdC 유전자에 대하여 서열 번호: 25 내지 27을 사용하여 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출한 결과 Δ117 SNP를 포함하는 tcdC 유전자를 특이적으로 구별할 수 있음을 나타내는 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
클로스트리디움 디피실리의 검출용 프라이머와 프로브의 선발 및 PCR 평가
병원성 유전자를 분자적 진단에 이용하는 경우에는 유전자 변이로 인하여 오류가 발생할 수 있고 잘못된 양성 판정을 할 수 있는 가능성이 있다. 따라서, 유전적 변이가 적고 여러 계통에서 공통적으로 발현되는 유전자를 분자적 진단에 이용하는 것이 필요하다.
글루타메이트 이하이드로게나제(glutamate dehydrogenase, gluD)는 여러 계통(strain)의 클로스트리디움 디피실리에서 공통적으로 발현되고 변이가 적은 단백질이므로, gluD를 검출함으로써 클로스트리디움 디피실리의 독성 유무와 관계없이 여러 계통의 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
이에 gluD 단백질을 암호화하는 gluD 유전자를 특이적으로 증폭시킴으로써 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하기 위한 각각 2종의 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브를 NCBI를 통해 디자인하고 상호 작용성을 분석 및 검증하였다.
프라이머 세트 및 프로브는,
정방향 프라이머: 5'-GCTGCATTAGAAAACTCTATAAC-3' (서열 번호: 1),
역방향 프라이머: 5'-CAGCCTCTGGAGTAGTTG-3' (서열 번호: 2), 및
프로브: 5'-CCATTAGCAGCTCACAA-3'(밑줄은 LNA)(서열 번호: 3)이다.
또는 프라이머 세트 및 프로브는,
정방향 프라이머: 5'-GCTGAATCTATAAAAGCTAAATTAG-3' (서열 번호: 4),
역방향 프라이머: 5'-CCTCTTTCAGCAAATACTTC-3' (서열 번호: 5) 및
프로브: 5'-TAGTTGGTCCATTAGCAGCCTCACA-3' (서열 번호: 6)이다.
클로스트리디움 디피실리를 실시간 PCR 분석한 결과를 도 1에 나타내었다.
서열번호 1 및 2의 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 gluD 유전자의 크기는 97bp이고, 서열번호 4 및 5의 세트에 의해 PCR 증폭되는 gluD 유전자의 크기는 85bp이다. 상기 프라이머 세트들에 의해 1 카피(copy) 이상의 gluD 유전자 검출이 가능하였다. 따라서, 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 민감도가 우수하게 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리 균주의 독소A 검출용 프라이머와 프로브의 선발 및 PCR 평가
클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 독소 A를 검출함으로써 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리의 독소A 유전자인 tcdA를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브를 NCBI를 통해 디자인하고 상호 작용성을 분석 및 검증하였다. 제작된 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브는 민감도가 향상되도록 디자인하였다.
정방향 프라이머: 5'-GCGGAGTATATTTAGATGTTG-3' (서열 번호: 7),
역방향 프라이머: 5'-ACGGTCTAGTCCAATAGA-3' (서열 번호: 8), 및
프로브: 5'-ATGCTTCCAGGTATTCACT-3' (서열 번호: 9).
참고-tcdA는 하기 프라이머 세트에 의하여 증폭한 것이다(J Microbiol Methods 83:59-65(2010)) 참조).
정방향 프라이머: 5'-TTGTATGGATAGGTGGAGAAGTCAGT-3' (서열 번호: 10)
역방향 프라이머: 5'-AATATTATATTCTGCATTAATATCAGCCCAT-3' (서열 번호: 11)
프로브 1: 5'-FAM-ATATTGCTCTTGAATACATAAA-NFQ-MGB-3' (서열 번호: 12)
프로브 2: 5'-FAM-TATTGTTCTTGAATACATAAAAC-NFQ-MGB-3' (서열 번호: 13)
클로스트리디움 디피실리를 실시간 PCR 분석한 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
서열번호 7 및 8의 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 산물의 크기는 92bp이다. 또한, 참고-tcdA에 비하여 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트에 의해 1 카피(copy) 이상의 tcdA 유전자 검출이 가능하였다. 따라서, tcdA에 의한 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 민감도가 우수하게 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리의 독소 B 검출용 프라이머와 프로브의 선발 및 PCR 평가
클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 독소 B를 검출함으로써 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
독소 B 유전자인 tcdB는 보존된(conserved) 영역이 적은 유전자로서, tcdB를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브를 NCBI를 통해 디자인하고 상호 작용성을 분석 및 검증하였다.
제작된 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브는 민감도가 향상되도록 디자인하였다.
정방향 프라이머: 5'-GGTGGTATGTATTTAGATGTTGA-3' (서열 번호: 14),
역방향 프라이머: 5'-TCCACTGTTACTGAACTAGG-3' (서열 번호: 15), 및
프로브: 5'-CCAGGAATACAACCAGACT-3' (서열 번호: 16).
참고-tcdB는 하기 프라이머 세트에 의하여 증폭한 것이다(J Microbiol Methods 83:59-65(2010)) 참조).
정방향 프라이머: 5'-GAAACAGGATGGACACCAGGTT-3' (서열 번호: 17) 또는,
5'-AAGAGGATGGACGCCAGGTT-3' (서열번호: 18)
역방향 프라이머: 5'-ACGGTCTAACAGTTTTGTGCCA-3' (서열번호: 19) 또는,
5'-CTGCCCTTCATAATGATCTCTTATACG-3' (서열번호: 20)
프로브: 5'-FAM-AAGAAGCTTAGAAAATG-NFQ-MGB-3' (서열 번호: 21)
클로스트리디움 디피실리를 실시간 PCR 분석한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
서열번호 14 및 15의 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 산물의 크기는 89bp이다.
참고-tcdB에 비하여 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트에 의해 1 카피(copy) 이상의 tcdB 유전자 검출이 가능하였다. 따라서, tcdB에 의한 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 민감도가 우수하게 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리의 이원 독소 검출용 프라이머와 프로브의 선발 및 PCR 평가
클로스트리디움 디피실리의 독성을 유발하는 이원 독소를 검출함으로써 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
이원 독소 유전자인 cdtA 및 cdtB를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브를 NCBI를 통해 디자인하고 상호 작용성을 분석 및 검증하였다. 제작된 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브는 각각의 유전자에서 고유한 디자인을 적용하였다.
PCR에 의해 증폭되는 cdtA 및 cdtB 앰플리콘의 크기는 각각 99bp 및 72bp이다.
cdtA 유전자에 대하여,
정방향 프라이머: 5'-GCATCTGTTGTAAGTAGTCTTG-3' (서열 번호: 22),
역방향 프라이머: 5'-AGGTGTTAATTTATTACTCCAATCATTA-3'(서열 번호: 23), 및
프로브: 5'-AATTTGCTTTACCCCAAGAGTCCCC-3' (서열 번호: 24)이다.
cdtB 유전자에 대하여,
정방향 프라이머: 5'-ACTCCCAAACAATGGATTA-3' (서열 번호: 25),
역방향 프라이머: 5'-GGTGCCATTAATTTTAAATCTTTA-3' (서열 번호: 26), 및
프로브: 5'-AGTGCTCATCTGTGAAATAATATCCCA-3' (서열 번호: 27)이다.
클로스트리디움 디피실리를 실시간 PCR 분석한 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
PCR에 의해 증폭되는 cdtA 및 cdtB 증폭 생성물의 크기는 각각 99bp 및 72bp이다. 상기 프라이머 세트들에 의해 각각 1 카피(copy) 이상의 cdtA 또는 cdtB 유전자 검출이 가능하였다. 따라서, 이원 독소에 의한 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 민감도가 우수하게 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리의 고도 독성( hypervirulent ) 검출용 프라이머와 프로브의 선발 및 PCR 평가
클로스트리디움 디피실리의 Δ117 SNP를 포함하는 tcdC는 시프로플록사신 및 레보플록사신 등 플루오로퀴놀론 항셍제이 내성이 있는 고독성 균주에 나타난다. Δ117 SNP를 포함하는 tcdC를 검출함으로써 고도 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리를 검출할 수 있다.
고도 독성을 유발하는 클로스트리디움 디피실리를 검출하기 위하여 Δ117 SNP를 포함하는 tcdC 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브를 NCBI를 통해 디자인하고 상호 작용성을 분석 및 검증하였다.
제작된 프라이머 세트 및 실시간 PCR 검출용 프로브는 대립형질(allel) 특이적 디자인으로서 대립형질 특이적인 서열을 하나의 프라이머 세트로 추가적인 프라이머 및 프로브가 없이도 고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 검출 가능하도록 디자인하였다.
정방향 프라이머: 5'-GCACAAAGGATATTGCTCTA-3' (서열 번호: 28),
역방향 프라이머: 5'-CCTCATGGTCTTCAGAAC-3' (서열 번호: 29), 및
프로브: 5'-TGGCATTTATTTTGGTGTGTTTTTTG-3' (서열 번호: 30).
고도 독성을 갖는 클로스트리디움 디피실리를 실시간 PCR 분석한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
PCR에 의해 증폭되는 Δ117 SNP을 포함하는 tcdC 앰플리콘의 크기는 86bp이다. Δ117 SNP를 포함하지 않는 야생형(wild type) tcdC에 비하여 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트에 의해 1 카피(copy) 이상의 Δ117 SNP을 포함하는 tcdC를 특이적으로 검출할 수 있었다. 따라서, 고도 독성이 있는 클로스트리디움 디피실리 균주를 빠른 시간 내에 민감도가 우수하게 검출할 수 있다.
클로스트리디움 디피실리를 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 실시
하나 이상의 프라이머 세트를 조합하여 하나 이상의 표적 핵산 서열을 검출하는 멀티플렉스(multiplex) PCR을 하기 표의 조합으로 실시하였다.
Figure 112012045859840-pat00001
<110> samsung electronics <120> Compositions and kits for detection and analysis of strains of Clostridium difficile, and methods using the same <130> PN096412 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 gctgcattag aaaactctat aac 23 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cagcctctgg agtagttg 18 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (7) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (10) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (12) <223> LNA <400> 3 ccattagcag ctcacaa 17 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 gctgaatcta taaaagctaa attag 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 cctctttcag caaatactt 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 tagttggtcc attagcagcc tcaca 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 gcggagtata tttagatgtt g 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 acggtctagt ccaataga 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 atgcttccag gtattcact 19 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 ttgtatggat aggtggagaa gtcagt 26 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 aatattatat tctgcattaa tatcagccca t 31 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1) <223> FAM <220> <221> modified_base <222> (22) <223> NFQ-MGB <400> 12 atattgctct tgaatacata aa 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1) <223> FAM <220> <221> modified_base <222> (23) <223> NFQ-MGB <400> 13 tattgttctt gaatacataa aac 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 ggtggtatgt atttagatgt tga 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 tccactgtta ctgaactagg 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 ccaggaatac aaccagact 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 gaaacaggat ggacaccagg tt 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 aagaggatgg acgccaggtt 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 acggtctaac agttttgtgc ca 22 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 ctgcccttca taatgatctc ttatacg 27 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1) <223> FAM <220> <221> modified_base <222> (17) <223> NFQ-MGB <400> 21 aagaagctta gaaaatg 17 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 gcatctgttg taagtagtct tg 22 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 aggtgttaat ttattactcc aatcatta 28 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 aatttgcttt accccaagag tcccc 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 aatttgcttt accccaagag tcccc 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 ggtgccatta attttaaatc ttta 24 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 agtgctcatc tgtgaaataa tatccca 27 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 gcacaaagga tattgctcta 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 cctcatggtc ttcagaac 18 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 tggcatttat tttggtgtgt tttttg 26

Claims (28)

  1. 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머: 및
    서열번호 4의 프라이머와 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 14의 프라이머와 서열번호 15의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 서열번호 28의 프라이머와 서열번호 29의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머;
    서열번호 22의 프라이머와 서열번호 23의 프라이머; 및
    서열번호 25의 프라이머와 서열번호 26의 프라이머를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 서열번호 3 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  7. 청구항 3에 있어서, 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  8. 청구항 4에 있어서, 서열번호 9, 24 및 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  9. 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머: 및
    서열번호 4의 프라이머와 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출용 키트.
  10. 청구항 9에 있어서, 서열번호 14의 프라이머와 서열번호 15의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  11. 청구항 9에 있어서, 서열번호 28의 프라이머와 서열번호 29의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  12. 청구항 9에 있어서,
    서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머;
    서열번호 22의 프라이머와 서열번호 23의 프라이머; 및
    서열번호 25의 프라이머와 서열번호 26의 프라이머를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  13. 청구항 9에 있어서, 서열번호 3 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  14. 청구항 10에 있어서, 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  15. 청구항 11에 있어서, 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  16. 청구항 12에 있어서, 서열번호 9, 24 및 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  17. 시료로부터 얻어진 핵산 시료를,
    서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머: 및
    서열번호 4의 프라이머와 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계;
    표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 시료로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 14의 프라이머와 서열번호 15의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 시료로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 28의 프라이머와 서열번호 29의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 시료로부터 얻어진 핵산 시료를
    서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머;
    서열번호 22의 프라이머와 서열번호 23의 프라이머; 및
    서열번호 25의 프라이머와 서열번호 26의 프라이머를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 3 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 18에 있어서, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 증폭된 핵산 서열을 서열번호 9, 24 및 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  25. 청구항 17에 있어서, 시료로부터 얻어진 핵산 시료는 분변, 솜막대로 채취한 시료, 체액 또는 조직 절편으로부터 얻어진 게놈 DNA 또는 정제된 게놈 DNA인 것인 방법.
  26. 청구항 17에 있어서, 증폭은 멀티플렉스 PCR인 것인 방법.
  27. 청구항 17에 있어서, 프라이머 세트에 의한 증폭 표적 핵산 서열의 크기는 40bp 내지 100bp인 것인 방법.
  28. 청구항 17에 있어서, 검출은 실시간(real time) 검출인 것인 방법.
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