CN114269944A - 使用探针、探针分子以及包含探针的阵列组合检测基因组序列用于对生物体特异性检测 - Google Patents

使用探针、探针分子以及包含探针的阵列组合检测基因组序列用于对生物体特异性检测 Download PDF

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Abstract

利用与来自不同生物体的基因组序列不同地结合的探针组合来鉴定可能存在于样品中的同源基因组序列的方法、用于区分同源基因组序列的阵列、用于区分同源基因组序列的系统以及可用于方法、阵列和系统中的细菌结合探针分子。

Description

使用探针、探针分子以及包含探针的阵列组合检测基因组序 列用于对生物体特异性检测
相关申请的交叉引用
本申请主张2019年7月17日提交的美国临时申请第62/876,413号和2020年4月3日提交的第63/004,664号的优先权，这些申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且其全文以引用的方式并入本文中。将2020年7月14日产生的该ASCII副本命名为SGB-006WO_ST25并且大小是1,581字节。
背景
传染性病原的识别在确定个体的恰当诊断和治疗过程中往往是至关重要的。传染原的错误识别可导致治疗的不恰当或无效的过程。对测序技术的改良有助于确定多种致病细菌的基因组的部分或完整序列。密切相关的细菌物种通常包含具有极高程度序列同一性的基因组序列。密切相关的物种之间的区分需要检测两个或更多个同源基因组序列之间的差异的灵敏和精确的方法。在一些情况下，使用单一寡核苷酸探针分子区分同源基因组序列可是不切实际的(如果非不可能)。
因此，需要用于区分密切相关的微生物物种的新方法。
发明概述
本公开内容提供识别可存在于样品中的基因组序列和/或区分同源基因组序列的方法。方法利用探针分子的组合，探针分子独自不能但共同地能区分来自密切相关的微生物物种的同源基因组序列，并且还可识别可能存在于样品中的基因组序列。为方便起见，探针分子的这样的组合在本文中称为“虚拟探针”。
虚拟探针可包含多种(例如两种、三种或更多种)个体探针分子。在不测序的情况下，基因组DNA(或从基因组DNA扩增的PCR产物)与个体探针分子的杂交可能不足以区别基因组DNA与可能存在于相同样品中的遗传相关的物种的同源基因组DNA，尤其是在使用靶向相关物种中的保守序列的通用引物来扩增基因组DNA时。然而，在基因组DNA或对应PCR扩增子用包含两种或更多种探针分子的虚拟探针探测时，与虚拟探针的杂交图案的差异可区别来自两个相关物种的基因组DNA或从其扩增的同源扩增子。
因此，借助于包含多种探针分子(例如具有可区分信号的探针分子)，本公开内容的虚拟探针可组合区分基因组序列与同源基因组序列(或从其制备的扩增子)并且识别存在于生物样品中的微生物物种。举例而言，根据本公开内容的方法，两种或三种寡核苷酸探针分子的组合可组合形成虚拟探针，虚拟探针区分来自相关物种(例如缓症链球菌(S.mitis)和肺炎链球菌(S.pneumoniae))的扩增子。因此，在样品用作模板DNA的来源(例如在PCR反应中)时，任何所得PCR产物与虚拟探针的杂交可确定两个物种中的哪个存在于样品中。
在认识到使用来自细菌16S rRNA基因的序列设计的物种特异性寡核苷酸探针分子在不同物种中显示交叉反应性之后，开发了使用本文所公开的虚拟探针识别同源基因组序列的方法。由于基因组的此区域的序列之间的低变异性，无法设计物种特异性探针分子。然而，发现不同物种仍可通过分析来自与虚拟探针的杂交的信号来区分，虚拟探针组合多种寡核苷酸探针分子，寡核苷酸探针分子本身独自不能区分不同物种。
在一个方面，本公开内容提供确定第一生物体(或对应第一基因组)和/或第二生物体(或对应第二基因组)是否存在于样品中的方法。
这样的方法可包含用针对第一生物体和第二生物体的虚拟探针探测样品，以确定对应于第一基因组或第二基因组的一种或多种目标核酸的存在或不存在。目标核酸可以是(例如)基因组片段或在DNA扩增反应(例如PCR)中产生的扩增子。虚拟探针包含两种或更多种探针分子，其各自能够与对应于第一基因组的目标核酸的一种或多种目标核酸和/或对应于第二基因组的一种或多种同源目标核酸特异性杂交。由于探针分子与对应于第一和第二基因组的目标核酸的杂交不同，因此虚拟探针可区分对应于第一基因组的目标核酸与对应于第二基因组的目标核酸。
示例性方法包括以下步骤：
(a)使用一对或多对能够与第一和第二基因组(如果存在于样品中)杂交并且从其起始PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增反应。各组引物产生优选对样品中可能存在的各生物体而言独特的扩增子组。因此，扩增在第一基因组存在于样品中的情况下产生第一扩增子组并且在第二基因组存在于样品中的情况下产生不同的第二扩增子组。如果仅使用单对PCR引物，则各扩增子组仅含有单一扩增子，并且当使用多个PCR引物对时，扩增子组可含有两种或更多种扩增子(例如多个单一扩增子)。
(b)在步骤(a)之后，用虚拟探针探测任何所得PCR扩增产物以确定第一扩增子组和第二扩增子组的存在或不存在。由于虚拟探针包含两种或更多种能够以不同方式与第一扩增子组和第二扩增子组特异性杂交的探针分子(例如两种或更多种寡核苷酸探针分子)，因此虚拟探针可区分第一扩增子组与第二扩增子组。各虚拟探针内的探针分子可借助于具有不同标记(例如荧光标记，例如用不同荧光标记来标记的分子信标)或置于阵列上的分离的位置处来区分。
因此，PCR反应的PCR扩增产物与虚拟探针的杂交可区分第一与第二基因组，由此识别样品中第一和/或第二生物体的存在。如本文所用，对于样品中的生物体的存在的提及并不意指样品具有活生物体，仅仅意指来自生物体的足够的基因组DNA存在于待检测或充当用于扩增反应(例如PCR反应)的模板的样品中。同样，对于样品中基因组的存在的提及并不意指样品具有完整的基因组，仅仅意指来自基因组的足够的DNA存在于待检测或充当用于扩增反应(例如PCR反应)的模板的样品中。
举例而言，在单一组引物用于PCR扩增反应中时，第一扩增子组和第二扩增子组可各自包含一种扩增子(分别称为“第一扩增子”和“第二扩增子”)。可替代地，例如当多于一组引物用于PCR扩增反应中时，第一扩增子组和/或第二扩增子组可包含多于一种扩增子(第一扩增子组中的各扩增子称为“第一扩增子”并且第二扩增子组中的各扩增子称为“第二扩增子”)。用于区分来自同源基因组序列的同源扩增子的其他示例性方法描述于章节6.2和编号实施方案1至86、130至132和135(见下文)中。
本公开内容进一步提供用于区分同源基因组序列的阵列、用于区分同源基因组序列的系统、以及可用于(例如)本公开内容的方法、阵列、和系统中的寡核苷酸探针分子。
在一个方面，本公开内容提供用于区分来自第一基因组的第一基因组序列与来自第二基因组的第二同源基因组序列的可寻址阵列。举例而言，可在本文所描述的方法中使用本公开内容的可寻址阵列。本公开内容的可寻址阵列可包含一群位置可寻址的寡核苷酸探针分子，寡核苷酸探针分子各自位于阵列上的分离的位置处，其中群的寡核苷酸探针分子中的各探针分子包含与第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列。可寻址阵列可进一步任选地包含一种或多种对照探针分子。
本公开内容的示例性可寻址阵列描述于章节6.3和编号实施方案87至129和153至155(见下文)中。
在另一个方面，本公开内容提供用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列(如果存在于样品中)的系统。示例性系统可包含：
(a)光学读取器，其用于产生本公开内容的阵列的各探针分子位置的信号数据；以及
(b)至少一个处理器，其：
(i)经配置以从光学读取器接收信号数据；
(ii)经配置以分析一种或多种虚拟探针(例如具有如本文中所描述的特征的虚拟探针)的信号数据；和
(iii)具有接口至储存或显示装置或网络用于输出分析结果。
示例性系统描述于章节6.4和编号实施方案133至134(见下文)中。
在另一个方面，本公开内容提供用于虚拟探针的示例性寡核苷酸探针分子和包含两种或更多种这样的寡核苷酸探针分子的试剂盒。本公开内容的寡核苷酸探针分子可包括于本公开内容的可寻址阵列上和/或用于本公开内容的方法中。示例性寡核苷酸探针分子和虚拟探针描述于章节6.2.4和编号实施方案136至152(见下文)中。示例性试剂盒描述于章节6.5和编号实施方案156至167(见下文)中。
附图说明
图1A-1B是根据从GenBank获得的几个葡萄球菌属(Staphylococcus)物种的16SrRNA基因制备的系统树图(在图1A与图1B间拆分)。该树图使用CLC序列查看器软件以从举分析(bootstrap analysis)构建以显示数据的置信度。葡萄球菌属群的各物种用两个由Gen Bank登录号显示的序列表示。树的各结点处的从举值(整数)定义跨越重复的数据的置信度的百分比。数据的从举值越高，其对于各自分类群的支持性越高。各自物种的水平线被称为分枝并且表示该物种的基因改变量。分枝长度的单位以改变或取代的数目除以序列的长度显示。
图2A-2B表示由16S rRNA和16s-23S rRNA基因组序列的多重比对产生的来自草绿色链球菌(Streptococcus viridians)群的物种的系统树图(在图2A与图2B间拆分)。I-牛链球菌(Streptococcus bovis)群、II-咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)群、III-唾液链球菌(Streptococcus salivarius)群、IV-缓症链球菌(Streptococcus mitis)群以及V-变形链球菌(Streptococcus mutans)群。数字表示指示数据组的置信度的百分比的从举值。取决于比对模式和它们的病原性重要性，将物种称为三个群-I、II和III。
图3是16S rRNA和16S-23S rRNA ITS基因组序列以及16S正向(16S Fw)、16S反向(16S Rv)、ITS正向(ITS Fw)和ITS反向(ITS Rv)引物的图。
图4举例说明可用于章节6.2.3.4中所描述的不对称PCR方法的引物对，该引物对包含未延伸引物(其可为用于对称PCR方法中的传统引物)以及由与目标核酸互补的“A”区、包括“A”区的至少一部分的直接重复或反向重复的“B”区、和可包括间隔序列和/或限制性核酸内切酶识别位点的部分或全部的可选的“C”区构成的延伸引物。
图5A-5C.图5A举例说明在“B”区含有“A”区的至少一部分的反向重复时发生的延伸引物的分子间杂交。图5B举例说明在“B”区含有“A”区的至少一部分的直接重复时发生的延伸引物的分子间杂交。图5C举例说明在“B”区含有“A”区的至少一部分的反向重复时发生的延伸引物的分子内杂交。优选地，“A”区与“B”区之间的互补区位于或接近于“A”区的5'端。
图6举例说明章节6.2.3.4中所描述的不对称PCR反应中的变性步骤。在变性步骤中，将PCR反应混合物(其典型地包含含有目标核酸或处于含有目标核酸的风险下的生物样品、不对称引物对、热稳定DNA聚合酶和PCR试剂)加热至高于目标核酸的解链温度，使得目标核酸(如果存在)和不对称引物对中的延伸引物变性，以形成单链。
图7举例说明章节6.2.3.4中所描述的不对称PCR反应的指数阶段的退火步骤，其在低于未延伸引物的解链温度发生。不对称引物对中的未延伸引物和延伸引物两者与它们各自的互补链杂交。图7显示与目标DNA的退火(也称为杂交或结合)，如发生于PCR的初始循环中，但在后续循环中，退火可能发生于引物与PCR产物中的互补序列之间。由于延伸引物中的“B”区和可选的“C”区，PCR产物将具有那些序列或它们的互补物，如图8B和图9中所描绘。
图8A-8B：图8A和图8B举例说明章节6.2.3.4中所描述的不对称PCR反应的指数阶段的延伸步骤，在此期间热稳定DNA聚合酶使用互补DNA作为模板延伸引物DNA。延伸的区域以虚线描绘。图8A中的模板是目标DNA的链，并且图8B中的模板是使用不对称引物对和目标DNA产生的PCR产物的链。
图9举例说明章节6.2.3.4中所描述的不对称PCR反应的线性阶段的同时退火和延伸步骤，其在高于未延伸引物的解链温度并且低于延伸引物的解链温度发生，使用PCR产物链2作为模板。此使得PCR产物链2不对称扩增，导致PCR反应结束时，相对于PCR产物链1分子产生过量PCR产物链2分子。
图10A-B举例说明可如何将两种(图10A)或三种(图10B)探针分子用于针对凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的虚拟探针中。来自PCR扩增产物与该两种或三种探针分子的杂交的信号可使用布尔运算子组合以确定CNS是否存在于样品中。
图11A-B显示在与来自缓症链球菌(图11A)和肺炎链球菌(图11B)的16S rRNA扩增子结合时，各种寡核苷酸探针分子的信号。
图12显示在与来自肺炎链球菌、缓症链球菌和口腔链球菌(Streptococcusoralis)的PCR扩增子结合时，各种寡核苷酸探针分子的信号强度。
图13显示在与来自肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和大肠杆菌(Escherichiacoli)的PCR扩增子结合时，各种寡核苷酸探针分子的信号强度。
图14显示在与来自克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的PCR扩增子结合时，各种寡核苷酸探针分子的信号强度。
图15显示在与来自阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)的PCR扩增子结合时，各种寡核苷酸探针分子的信号强度。
发明详述
6.1.定义
扩增子：扩增子是由PCR扩增反应产生的核酸分子。
不对称引物对：由延伸引物和未延伸引物组成的引物对。
对应：关于具有序列同一性或互补的不同长度的两个核酸链，术语“对应”是指于两条链中都存在的序列重叠或互补的区域，如上下文规定。
直接重复：在延伸引物的“B”区的上下文中，“直接重复”意指与“A”区的一部分直接互补的核苷酸序列(即，具有相同5'至3'方向的互补序列)。
延伸引物：含有以下的PCR引物：(a)位于其3'端处的与目标链1中的对应区具有至少75％序列同一性或与目标链2中的对应区具有至少75％序列互补性的“A”区；(b)位于其5'端处的包含与“A”区的至少一部分互补的序列的“B”区；以及(c)位于“A”区与“B”区之间的可选的“C”区。
同源基因组序列：同源基因组序列是在具有共用祖先但核苷酸序列不完全一致的不同物种或菌株中找到的基因组序列。示例性同源基因组序列包括16S rRNA基因、23SrRNA基因和16S-23S内部转录间隔区(ITS)序列。
反向重复：在延伸引物的“B”区的上下文中，“反向重复”意指与“A”区的一部分反向互补的核苷酸序列(即，具有相反5'至3'方向的互补序列)。
解链温度(Tm)：DNA双螺旋中的一半将解离以变成单链的温度。由脱氧核糖核苷酸(DNA)构成的线性引物的Tm通常通过以下计算：“百分比GC”法(PCR PROTOCOLS,a Guide toMethods and Applications,Innis等人eds.,Academic Press(San Diego,Calif.(USA)1990)或“2(A+T)加4(G+C)”法(Wallace等人,1979,Nucleic Acids Res.6(11)：3543-3557)或“最近邻”法(Santa Lucia,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1460-1465；Allawi andSanta Lucia,1997,Biochem.36：10581-10594)。出于权利要求书的目的，根据“最近邻”法计算DNA的Tm以及非天然存在的碱基(例如2-脱氧肌苷)视为腺嘌呤。
PCR产物链1：PCR产物链1是指由目标核酸与不对称引物对产生并且与不对称引物对的未延伸引物互补的双链PCR产物中的链。
PCR产物链2：PCR产物链1是指由目标核酸与不对称引物对产生并且与不对称引物对的延伸引物互补的双链PCR产物中的链。
PCR试剂：除非上下文另外规定，否则术语“PCR试剂”是指除模板核酸、热稳定聚合酶和引物以外的PCR反应的组分。PCR试剂典型地包括dNTP(并且除未经标记的dNTP以外，也可包括经标记(例如经荧光标记)的dNTP)、缓冲剂和含有二价阳离子的盐(例如MgCl2)。
引物：在其3'末端具有自由羟基的具有至少12个核苷酸的DNA寡核苷酸。引物可包括天然存在和非天然存在的核苷酸(例如含有通用碱基的核苷酸，例如3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或2-脱氧肌苷，2-脱氧肌苷是优选的)。除非上下文另外规定，否则术语“引物”也指在将混合碱基包括于引物设计和构建中以使得它们与目标核酸分子中的变体序列杂交时产生的引物分子的混合物。目标序列变体可是物种间或物种内变体。混合碱基的标准命名显示于表1中：
Figure BDA0003515808190000091
优选地，各引物在与目标核酸互补的区域中含有不多于三个混合碱基。在一些实施方案中，引物在与目标核酸互补的区域中含有零个、一个、两个或三个混合碱基。
引物对：能够与少于5000个碱基对的区域内的相同核酸分子的不同链杂交并且从其起始DNA聚合反应的正向和反向引物对(其各自可以是具有序列变异以考虑目标序列中的可能变异的引物的混合物)。在某些实施方案中，引物对能够与少于2500个碱基对或少于1500个碱基对的区域内的相同核酸分子的不同链杂交并且从其起始DNA聚合反应。
样品：如本文所用，术语“样品”是指含有或怀疑含有所关注的核酸(例如基因组、基因组片段、对应于基因组的区域的扩增子或另一目标核酸)的任何样品。样品可经受一种或多种处理并且仍被视为“样品”。举例而言，经受PCR扩增反应的样品在PCR扩增反应之后仍为“样品”。
单一扩增子：如本文所用，术语“单一扩增子”是指通过PCR扩增反应使用单一引物对从单一生物体产生的核酸分子或核酸分子的群。典型地，“单一扩增子”是指具有独特序列的PCR产物，但也可指具有一群(例如一对)独特序列的PCR产物，例如当生物体对于所扩增的序列是杂合子时。
特异性：如本文所用，关于探针分子与扩增子的结合的术语“特异性”意指探针分子对其目标扩增子具有相较于对其他非同源扩增子更大的亲和力，典型地具有大得多的亲和力，但并不要求探针分子对其目标具有绝对特异性。因此，探针分子可(例如)能够与包含第一基因组序列的扩增子和包含第二同源基因组序列的扩增子杂交，第二同源基因组序列与第一基因组序列在一个或多个核苷酸上不同。
目标链1：目标链1是指不对称引物对中的未延伸引物与之互补的双链目标核酸中的链。
目标链2：目标链2是指不对称引物对中的延伸引物中的“A”区与之互补的双链目标核酸中的链。
未延伸引物：基本上由与目标链2中的对应区具有至少75％序列同一性或与目标链1中的对应区具有至少75％序列互补性的核苷酸序列组成的PCR引物。提及未延伸引物的术语“基本上由…组成”意指核苷酸序列在与目标序列(至少75％)互补的区域的5'处可含有不多于3个额外核苷酸。
6.2.使用虚拟探针区分同源基因组序列的方法
本公开内容提供区分来自第一生物体的第一基因组序列与来自第二生物体的第二同源基因组序列的方法。方法允许使用虚拟探针识别样品中所存在的生物体。用于基因组序列的虚拟探针通常包含两种或更多种探针分子，探针分子可(例如)借助于它们在可寻址阵列上的分离的位置或通过差异性标记(例如以不同荧光部分)来区分。为方便起见，来自虚拟探针内的个体探针分子的读出在本文中有时被称为“信号”。为了清楚起见，探针分子无需经标记以产生“信号”。举例而言，与经荧光标记的扩增子的杂交的不存在可构成“信号”。
用于基因组序列的各虚拟探针含有能够与对应于基因组序列的目标核酸(例如扩增子)特异性杂交的(构成虚拟探针的多个探针分子中的)至少一种探针分子。在一些情况下，虚拟探针中的两种或更多种探针分子能够与对应于基因组序列的目标核酸(例如扩增子)杂交。虚拟探针中的探针分子与来自相关基因组序列的不同目标核酸(例如扩增子)的杂交模式充分不同，以便区分来自相关基因组序列的目标核酸，例如区分来自第一基因组的第一扩增子组与来自具有同源基因组序列的第二基因组的第二扩增子组。方法可用于(例如)确定细菌的特定物种或菌株存在于经探测的扩增子直接从其扩增(例如其中样品被直接用于PCR中)或间接从其扩增(例如经由中间纯化或富集步骤，例如章节6.2.1中所描述的珠磨方法)的样品中。本文所揭示的各种实施方案描述用虚拟探针探测DNA扩增反应(例如PCR反应)的产物；然而，应理解，探测可使用能够检测非扩增基因组DNA的方法替代地进行。用于检测非扩增基因组DNA的示例性方法描述于Detection of Non-AmplifiedGenomic DNA,2012,Spoto and Corradini(eds)doi.org/10.1007/978-94-007-1226-3中，其内容以全文引用的方式并入。这样的方法包括光学检测方法(参见例如Li and Fan,2012,“Optical Detection of Non-amplified Genomic DNA,”pp.153-183in Detectionof Non-Amplified Genomic DNA)、电化学检测方法(参见例如Marin和
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2012,“Electrochemical Detection of DNA Using Nanomaterials Based Sensors,”pp.185-201in Detection of Non-Amplified Genomic DNA)、压电感测方法(参见例如Minunni,2012,“Piezoelectric Sensing for Sensitive Detection of DNA,”pp.203-233 inDetection of Non-Amplified Genomic DNA)、基于表面等离子体共振的方法(参见例如D’Agata和Spoto,2012,“Surface Plasmon Resonance-Based Methods,”pp.235-261inDetection of Non-Amplified Genomic DNA)以及平行光学和电化学方法(参见例如Knoll等人,2012,“Parallel Optical and Electrochemical DNA Detection,”pp.263-278 inDetection of Non-Amplified Genomic DNA)。因此，在一些实施方案中，在不存在DNA扩增步骤下(例如其中样品含有或疑似含有作为基因组片段的目标核酸)进行样品探测。
确定来自第一生物体的第一基因组或来自第二生物体的第二基因组的存在(如果任一存在于样品中)的方法可包含使用能够与第一基因组和第二基因组杂交并且从其起始PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增反应(例如如章节6.2.3中所描述)的步骤。从第一基因组(如果存在于样品中)的扩增产生第一扩增子组。从第二基因组(如果存在于样品中)的扩增产生第二扩增子组。PCR扩增的产物可用虚拟探针探测以确定第一扩增子组和第二扩增子组的存在或不存在。探测可在PCR扩增反应期间(例如当使用实时PCR时，例如如章节6.2.3.5中所描述)或在PCR扩增反应之后(例如通过使用包含寡核苷酸探针分子的阵列，例如如章节6.3中所描述)进行。当在PCR反应之后进行探测(例如在阵列上)时，可用于在PCR的混合物中包括经荧光标记的核苷酸以标记所得的PCR扩增子。可寻址阵列上的荧光标记的一个或多个位置和在一些情况下其强度可构成用于构成虚拟探针的探针分子的信号。
如果确定第一扩增子组存在，则可得出以下结论：样品含有第一基因组。同样，如果确定第二扩增子组存在，则可得出以下结论：样品含有第二基因组。虚拟探针可用于区分由相关微生物制备的第一扩增子组与第二扩增子组，相关微生物例如是凝固酶阴性和凝固酶阳性葡萄球菌属物种(例如如章节6.2.5.1中所描述)、格氏链球菌(S.gordonii)和咽峡炎链球菌(S.anginosus)(例如如章节6.2.5.2中所描述)或缓症链球菌(S.mitis)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)(例如如章节6.2.5.3中所描述)。
样品可以是(例如)生物样品、环境样品、或食品。在一些实施方案中，样品被一种或多种微生物感染或处于被一种或多种微生物感染的风险下。示例性样品描述于章节6.2.1中。
涵盖本公开内容的方法用于区分任何同源基因组序列(和对应于同源基因组序列的扩增子)的用途。在确定样品中是否可能存在细菌物种或相关细菌物种时，可使用能够区分对应于编码rRNA(例如16S rRNA或23S rRNA)的基因组序列或rRNA基因之间的基因间间隔区(例如16S rRNA-23S rRNA基因间间隔区)的目标核酸(例如扩增子)的虚拟探针。可通过本公开内容的方法区分的示例性同源基因组序列的特征描述于章节6.2.2中。
用于根据本公开内容的方法使用虚拟探针探测的扩增子可通过使用能够与第一生物体的基因组和第二生物体的基因组杂交并且从其起始PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增反应来产生，样品含有或疑似含有第一生物体和/或第二生物体或处于含有第一生物体和/或第二生物体的风险下。PCR扩增反应可用单一引物组进行(在第一生物体和第二生物体存在于样品中时，其应分别产生第一扩增子和第二扩增子)。可替代地，在第一和第二生物体分别存在于样品中时，PCR扩增反应可用多于一组引物进行，以产生对应于第一基因组的多种扩增子和对应于第二基因组的多种扩增子。可用于本公开内容的方法中的示例性PCR扩增反应描述于章节6.2.3中。除PCR以外的核酸扩增技术(例如等温扩增技术)(例如环介导的等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和滚环式扩增(RCA)也可用于制备扩增子(参见例如Fakruddin等人,2013,J Pharm Bioallied Sci.5(4)：245–252。因此，应理解，本文中描述为可用于PCR扩增产物的实施方案同样可用于使用替代性扩增方法产生的扩增产物。
可用于虚拟探针中的探针分子的示例性特征和虚拟探针的示例性特征分别描述于章节6.2.4和6.2.5中。
在一些实施方案中，PCR扩增产物的探测包含以下步骤：使PCR扩增产物与阵列(例如如章节6.3中所描述)接触、从阵列洗涤未结合的核酸分子以及测量阵列上各探针分子位置处的标记(例如荧光标记)的信号强度。
在其他实施方案中，PCR扩增产物的探测包含测量来自用于实时PCR反应中的寡核苷酸探针分子的信号。
可用于执行本公开内容的方法的系统描述于章节6.4中。
可用于本公开内容的方法中的试剂盒描述于章节6.5中。
6.2.1.样品
用于本公开内容的方法中的样品可以是含有基因组DNA的任何类型或形式的样品，基因组DNA处于适用于PCR扩增的状况下或可制备成处于适用于PCR扩增的状况下。在某些实施方案中，样品处于被一种或多种微生物(例如一种或多种物种的微生物)感染的风险下。在其他实施方案中，样品疑似具有一种或多种微生物(例如一种或多种物种的微生物)的感染。样品可以是(例如)生物样品、环境样品或食品。
样品的实例包括各种流体样品。在一些情况下，样品可以是来自受试者的体液样品。样品可包括从个体收集的组织。样品可包括受试者的体液、分泌物和/或组织。样品可以是生物样品。生物样品可以是体液、分泌物和/或组织样品。生物样品的实例包括(但不限于)血液、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、泪液、粪便、精液、阴道液、来源于肿瘤组织的间隙液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺体分泌物、呼出气体、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗涤液、脊髓液、脑脊髓液、组织、咽喉拭子、伤口拭子、活检、胎盘液、羊水、脐带血、增强液、腔液、痰、脓或其他伤口渗出液、通过伤口清创术或切除取样的感染组织、脑脊髓液、灌洗物、白细胞生成样品、腹膜透析液、乳汁和/或其他排泄物。
受试者可提供样品，和/或样品可从受试者收集。受试者可以是人类或非人类动物。样品可从活的或死的个体收集。动物可以是哺乳动物，例如家畜(例如牛、猪、绵羊)、运动动物(例如马)、或宠物(例如狗或猫)。受试者可以是患者、临床受试者或临床前受试者。受试者可经受诊断、治疗和/或疾病管理或生活方式或预防性护理。受试者可在或可不在健康护理专业人员的护理下。
在一些实施方案中，样品可以是环境样品。环境样品的实例包括空气样品、水样品(例如地下水、地表水或废水)、土壤样品和植物样品。
其他样品包括食品、饮料、制造材料、纺织物、化学品和治疗剂。
在一些实施方案中，样品是含有或疑似含有例如以下中的一种或多种的病原体的样品：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、禽副结核分枝杆菌亚种(Mycobacterium avium subsp paratuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(包括甲氧西林敏感和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、嗜麦芽葡萄球菌(Staphylococcus maltophilia)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfuluezae,)、黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、克雷伯氏肺炎杆菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、百日咳博德氏杆菌(Bordetella pertussis)、奈瑟氏脑膜炎菌(Neisseria meningitidis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、诺卡菌属物种(Nocardia sp.)、放线菌属物种(Actinomycessp.)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、军团菌属物种(Legionella species)、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jiroveci)、A型流感病毒(influenza A virus)、巨细胞病毒、鼻病毒、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、粪肠球菌CI 4413(Enterococcus faecalis CI4413)、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、马链球菌(Streptococcusequi)、白色念珠菌(Candida albicans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、嗜麦芽寡养单胞菌(黄杆菌)(Stenotrophomonas(Xanthomonas)maltophilia)以及沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)。在一些实施方案中，样品是含有或疑似含有肠杆菌科群细菌(例如产气肠杆菌、阿氏肠杆菌或霍氏肠杆菌)的样品。
样品可在进行PCR扩增之前进行预处理。因此，在本公开内容的方法中经受PCR扩增的样品可以是(例如)从此章节中或在本公开内容中其他地方所描述的任何类型的样品处理、提取或分离的样品(例如从尿液、痰、伤口拭子、血液或腹膜透析液处理、提取或分离的样品)。
可使用的预处理步骤的实例包括如本文所描述或否则如本领域中已知的过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰性组分的失活、试剂的添加和类似的。
从生物样品移除不想要的细胞类型和粒状物质以在PCR之前最大化从所关注细胞类型的基因组DNA回收可以是尤其有利的。
如果意欲检测生物样品中的细菌，则可以期望的是经由过滤器预处理生物样品以使得粒子和非细菌细胞被保留在过滤器上，而细菌细胞(如果期望，包括其孢子)穿过。如本文所用的“过滤器”是允许基于大小的粒子和分子差异性通过的膜或装置。典型地，此通过在过滤器中具有特定公称尺寸的孔来完成。举例而言，特别可用于细菌检测应用的过滤器具有足够大以允许细菌通过但足够小以防止存在于所关注的样品中的真核细胞通过的孔。一般而言，细菌细胞的直径在0.2μm至2μm(微米(micrometer/micron))的范围内，大多数真菌细胞的直径在1μm至10μm的范围内，血小板的直径是约3μm并且大部分有核哺乳动物细胞的直径典型地是10μm至200μm。因此，如果意欲检测细菌，小于2μm或小于1μm的过滤器孔径尤其可用于从生物样品移除非细菌细胞。
除过滤步骤以外或作为过滤步骤的替代，生物样品可经受离心以从样品移除细胞和碎屑。使真核细胞沉淀但不使细菌细胞沉淀的离心参数是本领域中已知的。如果期望，随后可过滤上清液。
可使用本领域中已知的用于制备包含基因组DNA的样品用于PCR的各种方法中的任一种制备样品以用于PCR扩增(例如按照在上文所描述的预处理步骤中的一种或多种)。在一些实施方案中，可使用市售的DNA提取试剂、试剂盒和/或仪器，例如QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen)、MagMAXTM DNA多样品试剂盒(ThermoFisher Scientific)、
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RSC仪器(Promega)等。
在一些实施方案中，通过包含珠磨的方法(例如如美国专利第10,036,054号中所描述，该专利的内容以全文引用的方式并入本文中)制备样品用于PCR。血液可在收集于市售血液收集管中之后直接进行珠磨，例如通过将珠磨珠添加至收集管中并且对收集管进行搅拌。可用于收集血液样品的市售收集管的实例包括含有EDTA的淡紫色盖子管、含有柠檬酸钠的浅蓝色盖子管、含有草酸钾的灰色盖子管或含有肝素的绿色盖子管。
6.2.2.同源基因组序列
本公开内容的方法可用于识别和/或区分第一和第二同源基因组序列(和目标核酸，例如对应于第一和第二同源基因组序列的扩增子)。同源基因组序列是在具有共用祖先但核苷酸序列不完全一致的物种或菌株中找到的基因组序列。因此，举例而言，同源基因组序列在密切相关的物种或菌株中找到。
第一基因组序列和第二基因组序列通常是来自第一微生物和第二微生物(例如细菌、病毒或真菌)的基因组序列。第一和/或第二微生物可以是(例如)人类病原体和/或动物病原体。微生物可来自相同目、相同科、相同属、相同群(group)或甚至相同种。在优选实施方案中，第一和第二微生物是细菌。
测序技术的进展已导致多个公共数据库储存库(例如National Center forBiotechnology Information(NCBI),European Molecular Biology Laboratory(EMBL)和DNA Databank of Japan(DDBJ))中可得的完整细菌基因组序列的数目大量增加，并且此类数据库可用于识别同源基因组序列。
密切相关的微生物中的同源基因组序列往往在编码rRNA的基因和编码rRNA的基因之间的基因间间隔区中发现。使用16S核糖体RNA(16S rRNA)的基因进行细菌物种的序列比较已有很长的历史。16S核糖体RNA基因编码细菌核糖体(负责蛋白产生的蛋白质/RNA复合物)的30S小亚基的16S RNA组分。此基因包含高度保守序列区域，其间穿插九个高度变异区(V1-V9)。这些高度变异区中的序列变异考虑到了密切相关的物种之间的大多数可观察差异。由于这些基因中所观察到的序列演化的慢速率，16S rRNA序列已用于构建多个细菌物种的系统发生树。由从GenBank获得的几个葡萄球菌属物种的16S rRNA基因制备的示例性系统发生树显示于图1中。
细菌基因组含有第二核糖体rRNA基因，23S rRNA基因。16S rRNA和23S rRNA基因通过被称为16S-23S内部转录间隔区(ITS)或16S-23S基因间间隔区的间隔区彼此隔开。16S-23S rRNA ITS区包含高度变异区，这些高度变异区包含可用于区分和识别特定细菌物种的物种和物种间特异性序列(K.Okamura等人，2012)。由16S rRNA和16s-23s rRNA基因组序列的多重比对产生的草绿色链球菌群的示例性系统发生树显示于图2中。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含编码rRNA的基因的核苷酸序列。在其他实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含在rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
在微生物是细菌的实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列可各自包含(例如)16S rRNA基因或23S rRNA基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含16S rRNA基因的核苷酸序列。在其他实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含23S rRNA基因的核苷酸序列。在其他实施方案中，基因组序列包含在16S-23S基因间间隔区中找到的核苷酸序列。
在某些特定实施方案中，第一基因组序列和/或第二同源基因组序列是来自病原体(例如细菌、病毒或真菌)的基因组序列，病原体可在人类血液、尿液或腹膜液中找到。此类病原体的实例包括(但不限于)结核分枝杆菌、禽副结核分枝杆菌亚种、金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林敏感和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌、路邓葡萄球菌、嗜麦芽葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、黏膜炎莫拉氏菌、克雷伯氏肺炎杆菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、不动杆菌属物种、百日咳博德氏杆菌、奈瑟氏脑膜炎菌、炭疽芽孢杆菌、诺卡菌属物种、放线菌属物种、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌属物种、杰氏肺囊虫、A型流感病毒、巨细胞病毒、鼻病毒、粪肠球菌、鲍氏不动杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌CI 4413、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、马链球菌、白色念珠菌、奇异变形杆菌、藤黄微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌(黄杆菌)以及沙门氏菌属物种。
6.2.3.PCR扩增
在本公开内容的方法的一些实施方案中，使用能够与可存在于样品中的基因组杂交并且从其起始PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增。PCR扩增的反应可以是“对称”PCR反应，即，反应通过利用正向引物和反向引物制备模板DNA的双链副本，正向引物和反向引物经设计以具有彼此相等或彼此在数℃内的“解链温度”或“Tm”。用于引物设计的常用电脑软件程序警告用户避免高Tm差异，并且具有自动Tm匹配特征。还可使用可制备单链DNA扩增子的“不对称”PCR反应。也可使用实时PCR反应。在PCR扩增反应的上下文中，通过反应扩增的基因组序列可称为“目标”核酸、“模板”核酸或类似的。
PCR扩增反应可使用单一引物组或多个引物组(例如当PCR扩增是多重PCR时)。多重PCR可用于(例如)产生对应于第一基因组序列(例如16S rRNA基因)的扩增子和/或对应于第二基因组序列(例如23S rRNA基因)的不同扩增子。作为多重PCR的替代方案，可汇合通过用不同引物组进行的分离的PCR扩增反应产生的扩增子以用于后续分析。有利地，可使用单一引物组以制备对应于在多个菌株或物种(例如2、3、4或多于4个物种，它们可以是(例如)相同属的成员)的基因组中找到的同源基因组序列的扩增子。
可选择PCR扩增条件(无论对称或不对称、单重或多重)，例如使得DNA扩增产物的长度是100至1000个核苷酸。在一些实施方案中，选择PCR反应以使得DNA扩增产物的长度是300至800个核苷酸。在其他实施方案中，选择PCR条件以使得DNA扩增产物的长度是400至600个核苷酸。
在一些实施方案中，用于本公开内容的方法中的PCR扩增反应将产生可测量信号的标记并入至通过反应产生的任何扩增子。标记可以是(例如)荧光标记、电化学标记或化学发光标记。荧光标记可通过在PCR期间并入经荧光标记的核苷酸和/或通过使用经标记的用于PCR的引物来达成。电化学标记可通过在PCR期间并入经氧化还原活性标记的核苷酸和/或通过使用经氧化还原活性标记的用于PCR的引物来达成(参见例如Hocek和Fojta,2011,Chem.Soc.Rev.,40：5802-5814；Fojta,2016,Redox Labeling of Nucleic Acidsfor Electrochemical Analysis of Nucleotide Sequences and DNA Damage.In：Nikolelis D.,Nikoleli GP.(eds)Biosensors for Security and BioterrorismApplications.Advanced Sciences and Technologies for SecurityApplications.Springer,Cham)。化学发光标记可例如通过使用经生物素标记的用于PCR的引物，结合链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物，随后与化学发光1,2-二氧环丁烷底物一起孵育来达成。
适合的荧光部分的实例包括FITC,EDANS,德克萨斯红,6-joe,TMR,Alexa 488,Alexa 532,BODIPY FL/C3,BODIPY R6G,BODIPY FL,Alexa 532,BODIPY FL/C6,BODIPYTMR,5-FAM,BODIPY 493/503,BODIPY 564,BODIPY 581,Cy3,Cy5,R110,TAMRA,德克萨斯红和x-玫瑰红。
荧光部分可附接至dNTP,特别是含有胞嘧啶作为碱基的那些(胞苷酸、胞嘧啶核苷5'-磷酸、胞嘧啶核苷5'-二磷酸、胞嘧啶核苷5'-三磷酸或其聚合物或含有胞苷酸的聚合物)。
dNTP标记的位置可位于碱基(胺基)、磷酸基(OH基团)或脱氧核糖部分(2'-OH基团或3'-OH基团)处。优选的位置是在碱基处。
类似于其他核苷酸，经荧光标记的dNTP可在随机位置(典型是dC位置)处并入PCR扩增子的两条链中并且通过DNA聚合酶延伸。
荧光dNTP可以以高度浓缩形式商购获得并且可在不调整各未经标记的dNTP的浓度下添加至PCR反应混合物中。对于大多数PCR扩增，dNTP与荧光dNTP的典型比率在100：1与1000：1之间。因此，经荧光标记的dNTP可以以未经标记的dNTP的(摩尔)量的0.1％至1％包括在PCR试剂中。
经荧光标记的PCR产物的检测可经由与探针分子(例如与微阵列结合的探针分子)杂交来达成。适合的微阵列系统利用三维交联聚合物网络，如美国专利第9,738,926号中所描述，该专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
6.2.3.1.引物
用于PCR反应中的引物经设计以识别一个或多个给定核酸模板的序列(例如一个或多个目标基因组序列)并与之杂交。引物和目标核酸模板的序列中的错配可导致PCR反应的效率降低和/或期望序列以外的序列的扩增。成功引物设计的参数是本领域中所熟知的(参见例如Dieffenbach等人，1993)并且包括引物长度、解链温度、GC含量和类似的。PCR引物不需要与给定目标核酸模板共有100％序列同一性，并且与目标序列具有至少75％，例如80％、例如85％、例如90％、例如95％、例如96％、例如97％、例如98％、例如99％或99.5％同一性的PCR引物可用于与目标序列杂交和使得目标序列扩增。
本公开内容提供适合于制备具有高特异性和良好扩增效率的独特引物系统的其他参数。引物长度典型地是18至24个碱基，但引物可以是更长，例如长度是25至50个碱基、例如长度是25至45个碱基、例如长度是30至45个碱基、例如长度是35至45个碱基、例如长度是40至45个碱基长度或例如长度是40至50个碱基。用于PCR扩增的引物通常成对设计，其中一个引物称为“正向”引物并且一个引物称为“反向”引物。本公开内容的正向引物可设计成在3'端具有G和/或C残基以便提供“GC-夹”。G与C核苷酸对展现比A-T核苷酸对更强的氢键；因而，引物的3'端处的GC-夹可有助于增加序列特异性、增加杂交可能性并且增加PCR反应的总效率。
可设计一组引物以扩增两个基因组区域，例如一组引物可包括对16S rRNA基因具有特异性的一种引物对和对16S-23S rRNA ITS区具有特异性的第二引物对(参见图3)。这样的引物组可用于(例如)在单一PCR反应中产生多种扩增子。
PCR引物对可经设计以扩增跨越多个物种保守的序列(例如)以扩增多种细菌物种的16S rRNA基因。因此，有可能使用单一PCR引物对产生对应于同源基因组序列的扩增子，其在对含有或疑似含有多种可能生物体中的一种的样品进行PCR时是有利的。用于经设计以扩增保守序列的引物的参数可包括识别跨越各种物种的保守区，任选地证实为校正保守区的任何序列差异(例如如果所公布的序列是否正确不确定)，和选择跨越这些序列至少75％，例如80％、例如85％、例如90％、例如95％、例如96％、例如97％、例如98％、例如99％或甚至100％保守的序列。展现小于100％序列同一性的引物可仅含有一个或多个不同于给定模板的单一核苷酸碱基，即制剂中的所有引物含有彼此相同的序列。可替代地，引物可经制备以在序列中的特定位置处含有替代核苷酸残基。举例而言，用于扩增几个物种的16S区的反向引物可包含寡核苷酸池，其某百分比(例如50％)在引物中的某位置处含有第一核苷酸并且其某百分比(例如50％)在该位置处含有第二核苷酸。
在一些实施方案中，用于本公开内容的方法中的引物用可检测的标记(例如荧光标记)来标记。举例而言，在一些实施方案中，至少一种引物经5'荧光标记。在其他实施方案中，多于一种引物经5'荧光标记。可用于标记引物的荧光标记是本领域中已知的，并且包括Cy5、FAM、JOE、ROX和TAMRA。
6.2.3.2.对称PCR扩增
可用于本公开内容的方法中的典型三步骤PCR实验方法(参见PCR PROTOCOLS,aGuide to Methods and Applications,Innis等人eds.,Academic Press(San Diego,Calif.(USA)1990,Chapter 1)可包括93℃-95℃持续多于5秒的变性或链解链、55℃-65℃持续10-60秒的引物退火和在聚合酶有高活性的温度下持续15-120秒的引物延伸，例如对于TaqDNA聚合酶是72℃。典型两步骤PCR实验方法的不同之处可在于对于引物退火与对于引物延伸具有相同的温度，例如60℃或72℃。对于三步骤PCR或两步骤PCR，扩增涉及使反应混合物循环通过前述系列的步骤多次，典型地25-40次。在反应过程期间，反应中的个体步骤的时间和温度可在循环间保持不变，或其可在反应过程中的一个或多个点处改变以提高效率或增强选择性。
除了引物对和目标核酸以外，PCR反应混合物典型地含有四种脱氧核糖核苷酸5'三磷酸(dNTP)中的每种(典型地处于等摩尔浓度下)、热稳定聚合酶、二价阳离子(典型地是Mg2+)和缓冲剂。这样的反应的体积典型地是20-100μl。可在相同反应中扩增多个目标序列。特定PCR扩增的循环次数取决于包含以下的几个因素：a)起始物质的量；b)反应效率；和c)产物检测或后续分析的方法和灵敏度。用于典型循环扩增反应的循环条件、试剂浓度、引物设计和合适装置是本领域中所熟知的(参见例如Ausubel,F.Current Protocols inMolecular Biology(1988)Chapter 15：“The Polymerase Chain Reaction,”J.Wiley(NewYork,N.Y.(USA))。
6.2.3.3.不对称PCR扩增
示例性不对称PCR方法描述于Gyllensten和Erlich,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：7652-7656(1988)以及Gyllensten and Erlich,1991，美国专利第5,066,584号中。传统的不对称PCR不同于对称PCR在于引物中的一种以限制量添加，典型地是另一引物的浓度的1/100至1/5。双链扩增子在早期温度循环期间累积，如在对称PCR中一样，但一个引物耗尽，典型地在15-25个PCR循环之后，取决于起始模板数目。在后续循环期间利用未耗尽引物发生一条链的线性扩增。用于文献中所报告的不对称PCR反应中的引物通常是与已知用于对称PCR相同的引物。Poddar(Poddar,2000,Mol.Cell Probes 14：25-32)通过包括40个热循环的端点测定比较了用于扩增腺病毒底物的对称和不对称PCR。其报告50：1的引物比率是最佳的并且不对称PCR分析具有更好的灵敏度，然而对于可能含有较低数目的目标分子的稀释底物溶液而言灵敏度显著下降。
6.2.3.4经改良的不对称PCR扩增
经改良的不对称PCR方法描述于美国专利第10,513,730号中，其内容以全文引用的方式并入本文中。经改良的不对称PCR方法包括指数阶段和线性阶段两者。在指数阶段期间，目标核酸的两条链均扩增。在线性阶段期间，仅扩增链中的一条，导致目标核酸的单链过量。
该经改良的不对称PCR方法经由使用不同长度和解链温度的引物对实现单链的过量，其中较长引物称为“延伸引物”并且较短引物称为“未延伸引物”。延伸引物的解链温度高于未延伸引物，并且可用于使用PCR循环选择性扩增目标核酸的单链，这些PCR循环中退火步骤在大于未延伸引物的解链温度但低于延伸引物的解链温度的温度下进行。选择性扩增产生富含目标链的PCR产物混合物，其可在后续检测分析中探测。
除与目标核酸互补的序列以外，延伸引物含有5'延伸，其含有与相同引物的目标结合部分互补的序列。无意受限于理论，据信使用5'延伸允许延伸引物分子的分子内或分子间杂交并且防止这些较长引物与存在于PCR反应中的DNA分子在PCR反应起始时的任意或非特异性结合。此进而防止非特异性DNA扩增并且防止PCR产物中的“噪音”，其在扩增生物样品中少量存在的目标时可能成问题。
初始PCR反应混合物包括
·核酸样品；
·不对称引物对；
·热稳定DNA聚合酶；以及
·PCR试剂。
PCR反应中的延伸引物和未延伸引物的初始浓度可各自在200nM至8μM的范围内。延伸引物和未延伸引物可以以等摩尔量包括在初始PCR反应中，例如各自在约200nM与1μM之间的浓度的范围内，例如各自在500nM的浓度下。可替代地，延伸引物和未延伸引物可以以非等摩尔量包括在初始PCR反应中。在某些实施方案中，延伸引物的初始浓度优选地多于未延伸引物的浓度，例如多于约2倍至30倍摩尔浓度。因此，在某些方面，延伸引物的浓度在约1μM与8μM范围内，并且未延伸引物的浓度在约50nM与200nM的范围内。
不对称引物对可经设计以扩增来自任何来源的核酸，并且对于诊断应用而言，不对称引物对可经设计以扩增来自病原体(例如在章节6.2.1中所识别的那些)的DNA。
不对称引物对可经设计以便能够同时扩增许多物种中所存在的同源核酸序列，例如细菌中的高度保守16S核糖体序列。
热稳定DNA聚合酶：可用于本公开内容的不对称PCR反应中的热稳定聚合酶包括(但不限于)：Vent(Tli/嗜热高温球菌(Thermoccus Literalis)),Vent exo-,Deep Vent,Deep Vent exo-,Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus)),Hot Start Taq,Hot Start ExTaq,Hot Start LA Taq,DreamTaqTM,TopTaq,RedTaq,Taqurate,NovaTaqTM,SuperTaqTM,Stoffel Fragment,DiscoveraseTM dHPLC,9Nm,
Figure BDA0003515808190000251
LongAmp Taq,LongAmp HotStart Taq,OneTaq,
Figure BDA0003515808190000252
Hot Start Flex,Crimson Taq,Hemo KlenTaq,KlenTaq,Phire Hot Start II,DyNAzyme I,DyNAzyme II,M-MulV Reverse Transcript,
Figure BDA0003515808190000253
Tth(嗜热栖热菌(Thermos termophilus)HB-8),Tfl,AmlithermTM,芽孢杆菌DNA,DisplaceAceTM,Pfu(激烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)),Pfu Turbot,Pfunds,ReproFast,PyroBestTM,VeraSeq,Mako,Manta,Pwo(pyrococcus,woesei),ExactRun,KOD(thermococcus kodakkaraensis),Pfx,ReproHot,Sac(酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius),Sso(硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)),Tru(Thermusruber,Pfx50TM(Thermococcus zilligi),AccuPrimeTM GC-Rich(Pyrolobus fumarius),火球菌属物种GB-D,Tfi(丝状栖热菌(Thermus filiformis)),Tfi exo-,ThermalAceTM,Tac(嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)),(Mth(嗜热甲烷杆菌(M.thermoautotrophicum)),Pab(Pyrococcus abyssi),Pho(Pyrococcus horikosihi),B103(小短尾噬菌体科(Picovirinae Bacteriophage)B103),Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)),Bst Large Fragment,Bst 2.0,Bst 2.0WarmStart,Bsu,TherminatorTM,TherminatorTM II,TherminatorTM III,以及TherminatorTM T。在一个优选实施方案中，DNA聚合酶是Taq聚合酶，例如Taq,Hot Start Taq,Hot Start Ex Taq,Hot Start LA Taq,DreamTaqTM,TopTaq,RedTaq,Taqurate,NovaTaqTM或SuperTaqTM
用于经改良的不对称方法中的不对称循环的举例说明性组显示于表2中。
表2
Figure BDA0003515808190000261
Figure BDA0003515808190000271
表2中所显示的循环数目的范围可用于任何不对称引物对，并且最佳循环数目将取决于初始PCR混合物中的目标DNA的副本数：初始副本数越大，在指数阶段中需要越少循环数目以产生足够量的PCR产物来充当线性阶段的模板。循环数目的最佳化对于本领域技术人员而言是常规的。
表2中所显示的温度尤其可用于其中延伸引物的Tm大于72℃(例如75℃-80℃)并且未延伸引物的Tm大于58℃但小于72℃(例如60℃-62℃)并且当热稳定DNA聚合酶在72℃下具有活性时。
循环时间，特别是延伸时间可根据引物的解链温度和PCR产物的长度而变化，其中较长PCR产物需要较长延伸时间。经验法则是延伸步骤应是每1,000个扩增子的碱基至少60秒。延伸步骤可在线性阶段延伸以提供额外退火时间。
6.2.3.4.1.延伸引物
延伸引物的“A”区与目标链1中的对应区具有至少75％序列同一性。在某些实施方案中，引物的“A”区与目标链1中的对应区具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。在其他实施方案中，引物的“A”区与目标链1的对应区具有100％序列同一性。
另一方面，在各种实施方案中，延伸引物的“A”区与目标链2中的对应区的互补序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或100％序列同一性。典型地，引物序列与目标序列之间的任何错配的位置越朝向5'其在PCR反应期间越可能被容忍。本领域技术人员可容易地设计与目标链具有小于100％序列同一性但仍可有效扩增目标DNA的引物序列。
与“A”区的至少一部分互补的“B”区中的序列可以是直接重复或反向重复。在“B”区含有“A”区的一部分的直接重复的情况下，不同延伸引物分子可彼此分子间杂交，如图5B中所示。在“B”区含有“A”区的一部分的反向重复的情况下，延伸引物分子可在分子内杂交，如图5C中所示，或彼此分子间杂交，如图5A中所示。
“B”区中的序列与其互补的“A”区的一部分优选位于或接近于(例如距离1、2或3个核苷酸内)“A”区的5'端，即位于或接近于“A”区邻接“B”区(或在存在“C”区时的“C”区)处。
延伸引物的“B”区的长度优选是6至12个核苷酸，即长度优选是6、7、8、9、10、11或12个核苷酸。在特定实施方案中，延伸引物的“B”区的长度是8至10个核苷酸，即长度是8、9或10个核苷酸。
在“C”区存在于延伸引物中时，“C”区的长度优选是1至6个核苷酸，即长度优选是1、2、3、4、5或6个核苷酸。
延伸引物的Tm优选(但非必须)在约68℃与约80℃之间。在特定实施方案中，未延伸引物的Tm在约72℃与约78℃之间，例如约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃或约78℃。
位于区域“A”与“B”之间的可选的区域“C”可充当“A”区与“B”区之间的间隔子，以使得延伸引物形成发夹环和/或将限制性核酸内切酶序列(优选是6-剪切序列)引入PCR产物中。限制性核酸内切酶序列可全部在“C”区内，或可由“C”区的全部或一部分连同分别来自“B”区和“A”区的侧翼5'和/或3'序列形成。为了最小化与目标核酸杂交的干扰，“C”区优选不与目标链1或目标链2互补。
延伸引物的Tm优选比未延伸引物的Tm大至少约6℃。优选地，延伸引物具有比未延伸引物的Tm大约15℃至30℃的Tm。
延伸引物的“A”区的Tm优选比与目标(排除任何5'延伸)(至少75％)互补的未延伸引物的部分的Tm高或低不多于约3℃，即与目标杂交的正向引物中的区域的Tm优选比与目标杂交的反向引物中的区域的Tm高或低不多于约3℃，并且反之亦然。
延伸引物的“A”区的长度优选是至少12个核苷酸，并且优选在12至30个核苷酸的范围内并且更优选在14至25个核苷酸的范围内。在某些实施方案中，延伸引物的“A”区的长度是14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
6.2.3.4.2.未延伸引物
未延伸引物的核苷酸序列与目标链2中的对应区具有至少75％序列同一性。在某些实施方案中，未延伸引物的核苷酸序列与目标链2中的对应区具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。在其他实施方案中，未延伸引物的核苷酸序列与目标链2的相应区具有100％序列同一性。
另一方面，在各种实施方案中，未延伸引物的核苷酸序列与目标链2中的对应1区的互补序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或100％序列同一性。典型地，引物序列与目标序列之间的任何错配的位置越朝向5'，其在PCR反应期间越可能被容忍。本领域技术人员可容易地设计与目标链具有小于100％序列同一性但仍可有效扩增目标DNA的引物序列。
未延伸引物可进一步具有1、2或3个核苷酸的5'尾。
未延伸引物的Tm优选(但非必须)在约50℃与约62℃之间。在特定实施方案中，未延伸引物的Tm在约59℃与约62℃之间，例如约59℃、约60℃、约61℃或约62℃。
未延伸引物的Tm优选比延伸引物的Tm低至少约6℃。优选地，未延伸引物具有比延伸引物的Tm低约15℃至30℃的Tm。
与目标(排除任何5'延伸)(至少75％)互补的未延伸引物的区域的Tm优选比延伸引物的“A”区的Tm高或低不多于约3℃，即与目标杂交的正向引物中的区域的Tm优选比与目标杂交的反向引物中的区域的Tm高或低不多于约3℃，并且反之亦然。
未延伸引物的长度优选是至少12个核苷酸，并且优选在12至30个核苷酸的范围内并且更优选在14-25个核苷酸的范围内。在某些实施方案中，未延伸引物的长度是14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
6.2.3.4.3.通用引物
在一些不对称PCR方法中，例如如美国专利第8,735,067B2号中所描述，除正向和反向引物对以外，还使用第三“通用”引物，其具有与添加至引物之一的5’寡核苷酸尾类似的序列。意欲使通用引物参与初始PCR循环之后的扩增反应以“平衡”多重扩增反应中的不同目标的扩增效率。
无意受限于理论，据信如美国专利第8,735,067号中所描述地包括通用引物(其在经改良的不对称PCR方法的情形中会具有基本上由延伸引物的“B”区的序列组成的序列(这样的通用引物在本文中称为“通用引物”))会降低使用本文中所描述的不对称引物对的扩增效率。因此，本文中所描述的经改良的不对称DNA扩增方法优选在缺乏通用引物的情况下进行。
在相关实施方案中，本文中所描述的经改良的不对称DNA扩增方法每目标区域可利用单一不对称引物对，即不包括任何其他引物，认识到个体引物可以是引物分子与由在引物中的某些位置处包括混合碱基而产生的密切相关的序列的混合物。为清楚并且避免疑问起见，此实施方案并不排除在多重扩增反应中使用多个不对称引物对，其限制条件是单一不对称引物对用于各扩增子。
6.2.3.5.实时PCR扩增
用于本公开内容的方法中的PCR扩增反应可以是实时PCR扩增反应。
实时PCR是指一组不断成长的技术，其中可随着反应进展测量经扩增的DNA产物的累积，典型地每个PCR循环测量一次。监测产物随时间推移的累积允许确定反应的效率以及估算DNA模板分子的初始浓度。关于实时PCR的一般细节参见Real-Time PCR：An EssentialGuide,K.Edwards等人,eds.,Horizon Bioscience,Norwich,U.K.(2004)。
现存在数种不同的指示经扩增的DNA的存在的实时检测化学。它们大多数取决于由于PCR过程而改变特性的荧光指示物。这些检测化学中之一是DNA结合染料(例如
Figure BDA0003515808190000311
Green)，其一旦与双链DNA结合则增加荧光效率。其他实时检测化学利用荧光共振能量转移(FRET)(一种现象，其中染料的荧光效率强烈依赖于与另一光吸收部分或淬灭剂的接近程度)。这些染料和淬灭剂典型地接附至DNA序列特异性探针或引物。基于FRET的检测化学之一是水解探针和构形探针。水解探针(例如
Figure BDA0003515808190000312
探针)使用聚合酶以从附接至寡核苷酸探针的淬灭染料分子切割报告染料分子。构形探针(例如分子信标)利用附接至寡核苷酸的染料，其荧光发射在与目标DNA杂交的寡核苷酸的构形改变时改变(参见例如Tyagi S等人,1996,Molecular beacons：probes that fluoresce uponhybridization.Nat Biotechnol 14,303-308)。
实时PCR可以是对称或不对称的，例如在章节6.2.3.3或6.2.3.4中所描述的对称或不对称PCR扩增反应的反应混合物中用水解探针分子进行。
存在可用于进行实时PCR的多种商业仪器。可用仪器的实例包括AppliedBiosystems PRISM 7500,the Bio-Rad iCylcer,和Roche Diagnostics LightCycler2.0。
6.2.4.探针分子
本公开内容提供适于在PCR反应中产生的扩增子的序列特异性检测的探针分子，例如寡核苷酸探针分子。
成功寡核苷酸探针分子设计的参数是本领域中所熟知的并且包括(但不限于)探针分子长度、交叉杂交效率、解链温度、GC-含量、自退火和形成二级结构的能力。本公开内容提供寡核苷酸探针分子在微阵列(例如可寻址阵列)中的用途，其中探针分子被锚定至基底(例如膜，例如玻璃基底、例如塑料基底、例如聚合物-基质基底)并且在允许寡核苷酸探针分子与具有类似至相同的序列(例如这些序列共有至少75％，例如80％、例如85％、例如90％、例如95％、例如96％、例如97％、例如98％、例如99％或甚至100％类似性或同一性)的扩增子杂交的条件下暴露至核酸。
在一些实施方案中，用于本公开内容的方法中的寡核苷酸探针分子包含核苷酸序列，该核苷酸序列与第一基因组序列和/或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补(例如90％至95％或95％至100％)。
示例性寡核苷酸探针分子描述于实施例中，并且包括包含SEQ ID NO：1-7的核苷酸序列的探针分子。
在一些实施方案中，寡核苷酸探针分子存在于阵列上。各探针分子可位于阵列上的分离的位置处并且可通过其在阵列上的位置区分，以使得寡核苷酸探针分子是存在于阵列上的位置可寻址的探针分子。
在一些实施方案中，寡核苷酸探针分子包含聚胸苷尾，例如包含至多10个核苷酸的聚胸苷尾或例如包含至多15个核苷酸的聚胸苷尾或例如包含至多20个核苷酸的聚胸苷尾。在一个实施方案中，聚胸苷尾包含10至20个核苷酸，例如15个核苷酸。在探针分子附接至阵列时，聚胸苷尾可以是有用的，聚胸苷尾充当阵列基底和与一个或多个目标序列部分或完全互补的探针分子区域之间的间隔子。
寡核苷酸探针分子可经标记或未经标记。在一些实施方案中，寡核苷酸探针分子经标记。在其他实施方案中，寡核苷酸探针分子未经标记。寡核苷酸探针分子可例如用荧光报告子标记，荧光报告子可以是荧光染料，例如章节6.2.3或6.2.3.1中所描述的。经标记的寡核苷酸探针分子可用于(例如)实时PCR反应中。用于实时PCR的经标记的寡核苷酸探针分子可在探针分子的一端包含荧光报告子并且在探针分子的另一端包含淬灭报告子的荧光的淬灭部分。在PCR期间，探针分子可在退火阶段期间与其目标序列杂交，并且一旦聚合酶在延伸阶段期间到达探针分子，则其5'-3'-核酸外切酶降解探针，使荧光报告子与淬灭剂物理分离，引起可测量的荧光增加。
探针分子上的荧光标记和淬灭部分的位置可以是使得FRET可发生在此两个部分之间。举例而言，荧光标记可位于或接近于探针分子的5'端，并且淬灭部分位于或接近于探针的3'端。在一些实施方案中，荧光标记与淬灭剂之间的分离距离是约14至约22个核苷酸，但可使用其他距离，例如约6、约8、约10或约12个核苷酸。可使用的其他距离包括约14、约16、约18、约20或约22个核苷酸。
可用于实时PCR的寡核苷酸探针分子中的示例性荧光标记是FAM或6-FAM,并且代表性淬灭部分是MGB。报告子部分的其他非限制性实例包括荧光素、HEX、TET、TAM、ROX、Cy3、Alexa和德克萨斯红，而淬灭剂或受体荧光部分的非限制性实例包括TAMRA、BHQ(黑洞淬灭剂)、LC RED 640和例如CY5的花青染料。如本领域技术人员将理解的，可使用报告子和淬灭剂/受体部分的任何配对，只要它们相容而使得传送可从供体向淬灭剂/受体发生即可。此外，适合的供体与淬灭剂/受体的配对在本领域中是已知的并且提供于本文中。可通过本领域中已知的任何手段来进行对选择。定制实时PCR探针分子可从例如ThermoFisherScientific、Sigma-Aldrich和其他商购获得。
6.2.5.虚拟探针
为方便起见，此章节(和本公开内容的其他章节)提及可用虚拟探针探测的扩增子和扩增子组。然而，应理解，虚拟探针可同样用于探测含有或疑似含有非扩增目标核酸(例如基因组片段)的样品。
第一扩增子组(含有对应于第一基因组中的区域的单一种第一扩增子或对应于第一基因组中的不同区域的多个第一扩增子)与第二扩增子组(含有对应于第二基因组中的区域的单一种第二扩增子或对应于第二基因组中的不同区域的多个第二扩增子)之间的核苷酸错配的数目可相对较小，并且个体寡核苷酸探针分子可能独自不能区分第一扩增子组与第二扩增子组。本公开内容的发明人已出乎意料地发现，但是有可能通过使用虚拟探针在这样的情境下区分第一扩增子组与第二扩增子组。虚拟探针的探针分子独自不能但共同地能借助于在第一和第二扩增子组用虚拟探针的探针分子探测时观察到的不同杂交模式区分两个扩增子组。
第一扩增子和第二扩增子的核苷酸序列在能够被用于虚拟探针中的探针分子结合的扩增子的区域中应具有至少1个(例如1个，至少2个，2个，至少3个或3个)核苷酸错配，以使得在探针分子与第一扩增子组杂交时和在探针分子与第二扩增子组杂交时(例如在阵列上或实时PCR反应期间)，存在对于构成虚拟探针的两种或更多种探针分子的信号模式的差异。信号模式的差异可用于识别和/或区分第一和第二扩增子组。在通过使用虚拟探针确定第一扩增子组存在时，可得出以下结论：从其产生第一扩增子组的样品含有对应于第一扩增子组的基因组(和可延伸至其基因组含于样品中的生物体)。同样，在通过使用虚拟探针确定第二扩增子组存在时，可得出以下结论：从其产生第二扩增子组的样品含有对应于第二扩增子组的基因组(和可延伸至其基因组含于样品中的生物体)。
在与PCR扩增产物杂交时，虚拟探针的个体探针分子的信号(例如可通过其于阵列上的位置区分或对应于不同荧光标记的信号)可例如通过一个或多个布尔运算子、通过一个或多个关系运算子或通过以一个或多个布尔运算子与一个或多个关系运算子的任何组合形式来组合以区分第一扩增子与第二扩增子组。在一些实施方案中，信号通过一个或多个布尔运算子组合。在其他实施方案中，信号通过一个或多个关系运算子组合。在其他实施方案中，信号通过一个或多个布尔运算子和一个或多个关系运算子来组合。
在一些情况下，布尔运算子“与(AND)”或“(OR)”和“非(NOT)”可用于组合来自虚拟探针的个体探针分子的信号区以分第一扩增子组与第二扩增子组。作为一实例，用于两种同源扩增子(在此实例中为“扩增子A”和“扩增子B”)的虚拟探针由两种探针分子(在此实例中为“探针1”和“探针2”)组成。探针1和探针2两者均能够与扩增子A特异性杂交，而探针1但非探针2能够与扩增子B特异性杂交。在PCR扩增产物用虚拟探针探测并且来自探针1与PCR扩增产物的杂交的信号和来自探针2与PCR扩增产物的杂交的信号均是阳性(其可使用布尔运算子“与”表示是“探针1与探针2”)时，可确定扩增子A存在于PCR扩增产物中。在PCR扩增产物用虚拟探针探测并且来自探针1与PCR扩增产物的杂交的信号是阳性而来自探针2与PCR产物的杂交的信号不是阳性(其可使用布尔运算子“非”表示为“探针1非探针2”)时，可确定扩增子B存在于PCR扩增产物中。举例而言，如果杂交信号高于背景水平，则杂交信号可视为阳性。举例而言，在未观察到信号或所观察到的信号不高于背景水平时，杂交信号可视为不是阳性。
在一些情况下，关系运算子“大于”(“＞”)和“小于”(“＜”)可用于组合来自虚拟探针的个体探针分子的信号以区分第一扩增子组与第二扩增子组。作为一实例，用于两个同源扩增子(在此实例中是“扩增子C”和“扩增子D”)的虚拟探针由两种探针分子(在此实例中为“探针3”和“探针4”)组成。探针3和探针4两者均能够与扩增子C和扩增子D特异性杂交。在探针3和探针4与扩增子C杂交时，探针3的信号大于探针4的信号(其可使用“大于”关系运算子表示为“探针3>探针4”。另一方面，在探针3和探针4与扩增子D杂交时，探针3的信号小于探针4的信号(其可使用“小于”关系运算子表示为“探针3<探针4”)。因此，在PCR扩增产物用虚拟探针探测并且探针3的信号大于探针4的信号时，可确定扩增子C存在于PCR扩增产物中，并且当探针3的信号小于探针4的信号时，可确定扩增子D存在于PCR扩增产物中。
在组合杂交信号时，信号可以是(例如)绝对信号、标准化信号或分数信号(例如用于虚拟探针中的探针分子的信号的值可使用预定函数缩放，例如如实施例3中所描述)。举例而言，在探针分子的信号高于预定截止值时，其可视为阳性。举例而言，截止值可设定为或高于对于给定探针分子所观察到的背景信号(例如归因于非特异性杂交的背景信号)。因此，举例而言，如果观察到探针分子的信号但信号不高于背景水平时，则信号可视为不是阳性。
在一个实施方案中，虚拟探针包含两种或更多种寡核苷酸探针分子(例如2种寡核苷酸探针分子)。在另一个实施方案中，虚拟探针包含三种或更多种寡核苷酸探针分子(例如3种寡核苷酸探针分子或4种寡核苷酸探针分子)。
在一些实施方案中，用于第一生物体和第二生物体的虚拟探针由两种探针分子组成。在一个实施方案中，两种探针分子包含能够特异性杂交第一扩增子组(对应于第一生物体)中的第一扩增子和第二扩增子组(对应于第二生物体)中的第二扩增子的第一探针分子以及能够与第二扩增子组中的扩增子但不能与第一扩增子组中的扩增子特异性杂交的第二探针分子。在这样的实施方案中，在探测由样品制备的PCR扩增产物时，如果第一探针分子的信号是阳性并且第二探针分子的信号不是阳性，则可确定第一生物体存在于样品中。另一方面，在探测PCR扩增产物时，如果第一探针分子的信号是阳性并且第二探针分子的信号是阳性，则可确定第二生物体存在于样品中。
在一些实施方案中，用于第一生物体和第二生物体的虚拟探针由三种探针分子组成。在一个实施方案中，三种探针分子包含能够特异性杂交第一扩增子组(对应于第一生物体)中的第一扩增子和第二扩增子组(对应于第二生物体)中的第二扩增子的第一探针分子、能够与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子特异性杂交的第二探针分子(第二探针分子不同于第一探针)以及能够与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子特异性杂交的第三探针分子(第三探针分子不同于第一和第二探针分子)。在此类实施方案中，在探测PCR扩增产物时，观察到的三种探针分子的相对信号可用于确定用于制备所述PCR扩增产物的样品是否含有第一生物体或第二生物体。
由于虚拟探针可用于区分同源基因组序列，因此虚拟探针可用于区分密切相关的生物体，例如密切相关的微生物。举例而言，虚拟探针可用于区分来自相同目、相同科、相同属、相同群或甚至相同种(例如相同种的不同菌株)的微生物。举例而言，虚拟探针可用于区分乳酸杆菌属(Lactobacillus)与李斯特菌属(Listeria)物种、区分棒状杆菌属(Corynebacterium)与丙酸杆菌属(Propionibactium)物种、区分微球菌属(Micrococcus)与库克菌属(Kocuria)物种、区分巴斯德氏菌属(Pasturella)与嗜血杆菌属(Haemophillus)物种、区分凝固酶阴性葡萄球菌属物种与凝固酶阳性葡萄球菌属物种、区分链球菌属物种(例如咽峡炎链球菌、格氏链球菌、缓症链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌(S.agalactiae)、生脓链球菌(S.pyogenes)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、新生儿链球菌(S.infantarius)、前庭链球菌(S.vestibularis)、唾液链球菌(S.salivarius)、猪肠链球菌(S.hyointestinalis)、星座链球菌(S.constellatus)、中间链球菌(S.intermedius)、口腔链球菌(S.oralis)、血链球菌(S.sanguinis)、副血链球菌(S.parasanguinis))、区分葡萄球菌属物种(例如路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis))、区分肠球菌属物种(例如粪肠球菌(E.fecalis)、屎肠球菌(E.faecium))、区分梭菌属物种(例如产气荚膜梭菌(C.perfringens)、梭状梭菌(C.clostridiiforme)、无害梭菌(C.innocuum))、区分芽孢杆菌属物种(例如蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans))、区分假单胞菌属物种((例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、门多萨假单胞菌(P.mendocina))和区分不动杆菌属物种(例如鲍氏不动杆菌(A.baumannii)、鲁氏不动杆菌(A.lwoffii)、阿氏不动杆菌(A.ursingii)、溶血不动杆菌(A.haemolyticus)、琼氏不动杆菌(A.junii))。
章节6.2.5.1至6.2.5.3和章节7中的实施例1-5描述用于识别和/或区分不同类型的密切相关的细菌的示例性虚拟探针。
6.2.5.1.用于凝固酶阴性葡萄球菌属物种的虚拟探针
本公开内容提供虚拟探针，其可用于确定凝固酶阴性葡萄球菌属物种是否存在于样品中，并且可用于区分包含凝固酶阴性葡萄球菌属物种的样品与包含凝固酶阳性葡萄球菌属物种的样品。可用于凝固酶阴性葡萄球菌属物种的虚拟探针中的第一示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO：1)。可用于凝固酶阴性葡萄球菌属物种的虚拟探针中的第二示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO：2)。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列经设计以探测16S RNA扩增子。因此，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的探针分子可用于探测由使用经设计以扩增凝固酶阴性葡萄球菌属物种16S rRNA基因组序列的引物进行的PCR扩增反应产生的扩增子。探针分子可(例如)包括在阵列上或用于实时PCR反应中。
如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，第一寡核苷酸探针(“探针1”)的信号是阳性并且第二寡核苷酸探针(“探针2”)的信号不是阳性(其可使用“非”运算子表示为“探针1非探针2”)时，则可确定样品含有凝固酶阴性葡萄球菌属物种。用于凝固酶阴性葡萄球菌属物种的示例性虚拟探针进一步描述于实施例1中。
6.2.5.2.用于格氏链球菌和咽峡炎链球菌的虚拟探针
本公开内容提供虚拟探针，其可用于确定格氏链球菌或咽峡炎链球菌是否存在于样品中，并且可用于区分包含格氏链球菌的样品与包含咽峡炎链球菌的样品。可用于格氏链球菌和咽峡炎链球菌的虚拟探针中的第一示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO：3)。可用于格氏链球菌和咽峡炎链球菌的虚拟探针中的第二示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列经设计以探测16S RNA扩增子。因此，具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸探针分子可用于探测由使用经设计以扩增来自格氏链球菌和咽峡炎链球菌的16S rRNA基因组序列的引物进行的PCR扩增反应产生的扩增子。探针分子可(例如)包括在阵列上或用于实时PCR反应中。
如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，第一探针(“探针1”)的信号是阳性并且第二探针(“探针2”)的信号不是阳性(其可使用“非”运算子表示为“探针1非探针2”)时，则可确定样品含有格氏链球菌。如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，探针1的信号是阳性并且探针2的信号也是阳性(其可使用“与”运算子表示为“探针1与探针2”)时，则可确定样品含有咽峡炎链球菌。用于格氏链球菌和咽峡炎链球菌的示例性虚拟探针进一步描述于实施例2中。
6.2.5.3.用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针
本公开内容提供虚拟探针，其可用于确定缓症链球菌或肺炎链球菌是否存在于样品中，并且可用于区分包含缓症链球菌的样品与包含肺炎链球菌的样品。可用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针中的第一示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO：5)。可用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针中的第二示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO：6)。可用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针中的第三示例性探针分子包含以下核苷酸序列或由其组成：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO：7)。SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列经设计以探测16S RNA扩增子。因此，具有SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的核苷酸序列的探针分子可用于探测由使用经设计以扩增缓症链球菌和肺炎链球菌的16S rRNA基因组序列的引物进行的PCR扩增反应产生的扩增子。探针分子可(例如)包括在阵列上或用于实时PCR反应中。
如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，第二探针(“探针2”)和/或第三探针(“探针3”)小于第一探针(“探针1”)的按比例缩放的信号时，则可确定样品含有缓症链球菌。用于确定样品是否含有缓症链球菌的信号之间的关系可使用布林和关系运算子表示为“(探针2或探针3)<(探针1)/n”，其中n是用于缩放探针1信号的预定值。如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，探针2和/或探针3的信号大于探针1的按比例缩放的信号时，则可确定样品含有肺炎链球菌。用于确定样品是否含有肺炎链球菌的信号之间的关系可使用布林和关系运算子表示为“(探针2或探针3)>(探针1)/n”。可(例如)通过探测由已知含有缓症链球菌的样品产生的PCR产物和探测由已知含有肺炎链球菌的样品的PCR产物来确定“n”的适合值。
可替代地，如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，探针3的信号除以探针1的信号小于预定值“n”时，则可确定样品含有缓症链球菌。如果在探测由样品制备的PCR扩增产物，探针3的信号除以探针1的信号大于“n”时，则可确定样品含有肺炎链球菌。可(例如)通过探测由已知含有缓症链球菌的样品产生的PCR产物和探测来自已知含有肺炎链球菌的样品的PCR产物来确定“n”的适合值。
用于缓症链球菌和肺炎链球菌的示例性虚拟探针进一步描述于实施例3中。
6.3.阵列
本公开内容提供可寻址阵列，其包含一种或多种各自可用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列的虚拟探针。
本公开内容的可寻址阵列可用于本文所描述的方法中。本公开内容的可寻址阵列可包含一群位置可寻址的寡核苷酸探针分子，寡核苷酸探针分子各自位于阵列上的分离的位置处。在一些实施方案中，构成虚拟探针的寡核苷酸探针分子的群中的各探针分子(典型地是两种或三种不同探针分子)包含与虚拟探针意欲区分的第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸(例如15至20、15至30、20至40、20至30或30至40个连续核苷酸)90％至100％(例如90％至95％或95％至100％)互补的核苷酸序列。
可寻址阵列可进一步任选地包含一种或多种对照探针分子(例如用于评估DNA提取和扩增步骤的效率的提取和扩增对照和/或用于评估DNA与阵列杂交的效率的杂交对照)。
在一些实施方案中，阵列的探针分子包含聚胸苷尾，例如包含至多10个核苷酸的聚胸苷尾或例如包含至多15个核苷酸的聚胸苷尾或例如包含至多20个核苷酸的聚胸苷尾。在一些实施方案中，聚胸苷尾是10聚体至20聚体，例如15聚体。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含12或更多种探针分子，例如12至100种探针分子或例如12至50种探针分子或例如25至75种探针分子或例如50至100种探针分子。在一些实施方案中，可寻址阵列包含12种探针分子。在其他实施方案中，可寻址阵列包含14种探针分子。在其他实施方案中，可寻址阵列包含84种探针分子。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含用于至少2种虚拟探针(例如至少3种虚拟探针或例如至少5种虚拟探针或例如至少10种虚拟探针)的寡核苷酸探针，或例如可定址阵列包含用于至多10种或至多15种虚拟探针的寡核苷酸探针。
虚拟探针可重叠，使得探针分子可以是两种或更多种虚拟探针的组分。虚拟探针也可以是不重叠的。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含能够区分至少5种不同类型的微生物(例如细菌)的虚拟探针。在其他实施方案中，可寻址阵列包含能够区分至少10种不同类型(例如至少20种不同类型、例如至少30种不同类型、例如至少40种不同类型或例如至多50种不同类型)的微生物(例如细菌)的虚拟探针。
在一些实施方案中，可寻址阵列含有至少5种虚拟探针，例如至少10种虚拟探针、例如至少15种虚拟探针或例如至少20种虚拟探针，其各自能够识别样品中可能存在的不同类型的微生物，例如细菌，例如不同菌株或细菌物种。
在一些实施方案中，本公开内容的可寻址阵列包含一种或多种用于区别来自真细菌物种的基因组序列与非真细菌物种的微生物的基因组序列的虚拟探针。在一些实施方案中，可寻址阵列包含一种或多种可用于区别来自革兰氏阳性细菌的基因组序列与来自革兰氏阴性细菌的基因组序列的虚拟探针。在一些实施方案中，可寻址阵列包含一种或多种可用于区别来自不同目的微生物的基因组序列的虚拟探针。在一些实施方案中，虚拟探针可用于区别来自不同科的微生物的基因组序列。在一些实施方案中，虚拟探针可用于区别来自不同属、不同群和/或不同种的微生物的基因组序列。
可用于制备本公开内容的阵列的适合的微阵列系统描述于美国专利第9,738,926号和美国专利申请公开第2018/0362719A1号中，它们的内容以全文引用的方式并入本文中。美国专利第9,738,926号和美国专利申请公开第2018/0362719A1号中所描述的微阵列系统利用三维交联聚合物网络。因此，在一些实施方案中，本公开内容的阵列包含如美国专利第9,738,926号中所描述的阵列，其中阵列的探针分子包含一群如本文所描述的寡核苷酸探针分子。在其他实施方案中，本公开内容的阵列包含如美国专利申请公开第2018/0362719A1号中所描述的阵列，其中阵列的探针分子包含一群如本文所描述的寡核苷酸探针分子。
在本公开内容的一个方面，本公开内容提供使用本公开内容的阵列确定第一生物体或第二生物体是否存在于样品中的方法。示例性方法包括以下步骤：
使用能够与第一生物体的基因组(“第一基因组”)和第二生物体的基因组(“第二基因组”)杂交并且从其起始PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增反应，在第一基因组和第二基因组存在于样品中时，分别产生第一扩增子组和第二扩增子组，并且其中PCR扩增反应并入在任何由反应产生的PCR扩增产物中产生可测量信号的标记；
使PCR扩增产物与本公开内容的阵列接触，该阵列具有一种或多种包含两种或更多种寡核苷酸探针分子的虚拟探针，寡核苷酸探针分子中的每一种能够与第一扩增子组和/或第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中两种或更多种寡核苷酸探针分子与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子的杂交不同，使得探针分子与第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交可区分第一扩增子组与第二扩增子组；
从阵列洗涤未结合的核酸分子；和
测量阵列上的各探针分子位置处的标记的信号；以及
如果信号指示与探针分子杂交的PCR扩增产物由PCR扩增反应产生，则如本文所描述地分析信号以确定第一扩增子组或第二扩增子组是否由PCR扩增反应产生；或如果信号指示PCR扩增反应未产生与探针分子群杂交的PCR扩增产物，则确定样品不含有第一生物体或第二生物体，
因此确定第一生物体或第二生物体是否存在于样品中。
6.4.系统
本公开内容提供用于确定生物体是否存在于样品中的系统。系统可包含(例如)：(i)光学读取器，其用于产生具有寡核苷酸探针分子的阵列(例如本公开内容的阵列)的各探针分子位置的信号数据；以及(ii)至少一个处理器，其经配置以从光学读取器接收信号数据并且经配置以使用虚拟探针(例如具有如本文中所描述的特征的虚拟探针)分析信号数据，并且处理器具有接口至储存或显示装置或网络用于输出分析结果。
可用于本公开内容的系统中的光学读取器包括市售微盘读取器(例如
Figure BDA0003515808190000432
Discover(Promega),ArrayPixTM(Arrayit),VarioskanTM LUX(ThermoScientific),
Figure BDA0003515808190000431
200PRO(Tecan))。
系统可包括非暂时储存介质(例如硬盘、闪存盘、CD或DVD),其包括用于实施信号数据的分析的处理器可执行指令。
系统可包括通用或专用运算系统环境或配置。可与本公开内容的系统一起使用的熟知运算系统、环境和/或配置的实例包括(但不限于)个人电脑、服务器电脑、智能电话、平板电脑、手持式或膝上型电脑装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、网络PC、小型电脑、大型电脑、包括以上系统或装置中的任一的分散式运算环境和类似的。
本公开内容的系统可执行电脑可执行指令例如程序模块。一般而言，程序模块包括执行特定任务或实施特定抽象数据类型的惯例(routine)、程序、对象(object)、组件、数据结构等。一些实施方案也可在分散式计算环境中实践，其中通过远端处理装置执行任务，远端处理装置经由通信网络连接。这些分散式系统可以被称为企业运算系统，或在一些实施方案中，可以是“云端”运算系统。在分散式运算环境中，程序模块可位于本地和/或远端电脑储存介质(包括记忆储存装置)中。
运算环境可包括一个或多个输入/输出装置。一些此类输入/输出装置可提供用户界面。用户可经由输入装置(例如键盘和指向装置(例如鼠标))将命令和信息输入至电脑中。然而，可使用其他形式的指向装置，包括轨迹球、触控板或触控屏幕。
本公开内容的系统可包括一个或多个输出装置，包括可形成用户界面的一部分的输出装置，例如监视器。
本公开内容的系统可使用与一个或多个远端电脑的逻辑连接来在网络化环境中操作。远端电脑可以是个人电脑、服务器、路由器、网络PC、对等装置或其他常见网络结点。逻辑连接包括局域网络(LAN)和广域网络(WAN)，但也可包括其他网络。此类网络连接环境在办公室、企业范围的电脑网络、内部网络和互联网中是常见的。可替代地或另外地，WAN可包括蜂窝网络。
当用于LAN网络连接环境中时，本公开内容的系统可经由网络界面或适配器连接至LAN。在用于WAN网络连接环境中时，系统可包括调制解调器或用于经由WAN(例如互联网)建立通信的其他构件。
在网络化环境中，用于使用虚拟探针分析信号数据的程序模块可储存于远端记忆储存装置(例如硬盘驱动器或闪存驱动器)中。
本公开内容的系统可进一步包含能够将PCR扩增反应的产物添加至阵列并且能够从阵列洗涤未结合的核酸分子的平板操作机器人。多种平板操作机器人是可商购获得的并且这样的机器人可用于本公开内容的系统中(例如Tecan MSP 9000,MSP 9250或MSP 9500,Tecan
Figure BDA0003515808190000441
Omni Flex,Tricontinent TriTon(XYZ),或Aurora VersaTM)。
6.5.试剂盒
本公开内容提供可用于本公开内容的方法中的试剂盒。
试剂盒可包含(例如)适用于如本文所描述的实时PCR反应的一组两种或更多种经标记的探针分子(例如2至20种探针分子、2至10种探针分子、2至5种探针分子、5至10种探针分子或10至20种探针分子)。举例而言，试剂盒可包含(1)其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2的探针分子；(2)其核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的探针分子；或(3)其核苷酸序列包含SEQID NO：5的探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的探针分子和其核苷酸序列包含SEQID NO：7的探针分子。在一些实施方案中，试剂盒包含(1)和(2)的探针分子的组合。在其他实施方案中，试剂盒包含(1)和(3)的探针分子的组合。在其他实施方案中，试剂盒包含(2)和(3)的探针分子的组合。在其他实施方案中，试剂盒包含(1)、(2)和(3)的探针分子的组合。
在其他实施方案中，试剂盒可包含(例如)适用于如本文所描述的阵列中的一组两种或更多种探针分子(例如2至20种探针分子、2至10种探针分子、2至5种探针分子、5至10种探针分子或10至20种探针分子)(例如未标记的探针分子)。举例而言，试剂盒可包含(1)其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2的探针分子；(2)其核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的探针分子；或(3)其核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：7的探针分子。在一些实施方案中，试剂盒包含(1)和(2)的探针分子的组合。在其他实施方案中，试剂盒包含(1)和(3)的探针分子的组合。在其他实施方案中，试剂盒包含(2)和(3)的探针分子的组合。在其他实施方案中，试剂盒包含(1)、(2)和(3)的探针分子的组合。
在其他实施方案中，试剂盒可包含如本文所描述的阵列。
如本文所描述的试剂盒可进一步包含一种或多种用于进行PCR反应的试剂(例如一种或多种(例如两种)用于扩增同源基因组序列的引物)和/或一种或多种用于进行杂交反应的试剂(例如洗涤缓冲剂)。
如本文所描述的试剂盒可进一步包含一种或多种用于制备用于PCR扩增反应的样品的试剂和/或一种或多种用于制备用于PCR扩增反应的样品的装置，例如裂解缓冲剂或珠磨系统。
如本文所描述的试剂盒可进一步包含一个或多个容器和/或关于使用试剂盒的组件执行如本文所描述的方法中的一些或全部步骤的的说明书。
7.实施例
7.1.实施例1：用于凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的虚拟探针
金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性物种并且是身体的微生物群的正常成员。然而，金黄色葡萄球菌可变成机会性病原体，引起皮肤感染、呼吸道感染和食物中毒。因此，存在对可在临床样品中区分金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌属物种的测试的临床需求。存在少量其他凝固酶阳性葡萄球菌，但它们通常在疾病中不扮演主要角色，并且因此对于大部分的分析目的而言可忽略。
制备寡核苷酸探针“AllStaph-146abp”(具有核苷酸序列CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)),其可用于非特异性地识别葡萄球菌属物种。换言之，AllStaph-146abp是属探针分子并且本身无法区分样品中的金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性物种。实施例中所使用的探针分子名称中所存在的数字是指用于产生可用探针分子探测的扩增子的正向PCR引物与该探针的起始点之间的按核苷酸数目计的距离。第二寡核苷酸探针“Sau-71p”(具有核苷酸序列GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2))是16SrRNA探针分子，其为来自金黄色葡萄球菌的扩增子提供阳性信号，但不为来自凝固酶阴性葡萄球菌的扩增子提供阳性信号。因此，在唯一临床上相关的凝固酶阳性葡萄球菌属物种为金黄色葡萄球菌的情况下，用于凝固酶阴性葡萄球菌属物种的示例性虚拟探针可由AllStaph-146abp和Sau-71p组成。在以虚拟探针探测PCR扩增产物和AllStaph-146abp的信号是阳性并且Sau-71p的信号不是阳性(其可表示为“AllStaph-146-abp非Sau-71p”)时，可确定从其制备PCR扩增产物的样品含有凝固酶阴性葡萄球菌属物种(参见图10A)。在较多物种相关的情形下，虚拟探针可包括另外的探针分子。举例而言，在可引起牛、马和猪中的皮肤疾病的猪葡萄球菌(S.hyicus)相关时，在对猪葡萄球菌具有特异性的探针也不是阳性(其可表示为“AllStaph-146abp非Sau71P非猪葡萄球菌”)时，样品可确定含有凝固酶阴性葡萄球菌属物种(参见图10B)。
7.2.实施例2：用于区别咽峡炎链球菌和格氏链球菌的虚拟探针
格氏链球菌是通常在人类口中找到的细菌。格氏链球菌在口中通常是无害的，但可在进入血流后引起急性细菌性心内膜炎。咽峡炎链球菌也是人类微生物群的成员，并且已知在免疫功能不全个体中引起感染。
已制备两种寡核苷酸探针分子，它们可用于虚拟探针中以用于区分样品中的咽峡炎链球菌和格氏链球菌。具有核苷酸序列CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的寡核苷酸探针分子“Stango 85p”是16S rRNA探针分子，其可在咽峡炎链球菌和格氏链球菌中的任一种存在于样品中时产生阳性信号。另一方面，具有核苷酸序列TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的寡核苷酸探针分子“Sang 156p”为来自咽峡炎链球菌的扩增子提供阳性信号并且不为来自格氏链球菌的扩增子提供阳性信号。用于格氏链球菌和咽峡炎链球菌的示例性虚拟探针由Stango85p和Sang156p构成。在用虚拟探针探测PCR扩增产物并且Stango85p的信号是阳性并且San156p的信号不是阳性(其可表示为“Stango85p非Sang156p”)时，可确定用于制备PCR扩增产物的样品含有格氏链球菌，而如果Stango85p的信号是阳性并且San156p的信号是阳性(其可表示为“Stango85p与Sang156p”)，则可确定样品含有咽峡炎链球菌。
7.3.实施例3：用于区别缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针
缓症链球菌和肺炎链球菌(两者均可以是病原性的)在它们的16S rRNA上几乎完全一致，由此使得难以使用对于16S rRNA的单一寡核苷酸探针分子区分两个物种。
已制备三种寡核苷酸探针分子，它们可用于虚拟探针中以用于区分缓症链球菌和肺炎链球菌。具有核苷酸序列AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的第一探针“AllStrep-261p”是不能区分不同链球菌属物种的属探针分子。具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的第二探针“Spneu-229p”虽然包含来自肺炎链球菌的基因组序列，但是其自身不能用于区分缓症链球菌和肺炎链球菌。具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的第三探针“Spneu-229bp”与Spneu-229p在一个核苷酸上不同(考虑肺炎链球菌中的SNP)。
在来自缓症链球菌和肺炎链球菌的16S rRNA扩增子与包含该三种探针分子的阵列结合时，观察到该三种探针分子中的每一种的阳性信号(图11A-11B)。因此，该三种探针分子独自不能用于区分缓症链球菌与肺炎链球菌。然而，可通过在用该三种探针探测来自缓症链球菌和肺炎链球菌的16S rRNA扩增子时评估信号模式来区分来自缓症链球菌和肺炎链球菌的扩增子。具体地，探测由含有缓症链球菌的样品产生的PCR扩增产物产生可表示为“(Spneu-229p或Spneu-229bp)<(AllStrep-261p)/3”的信号模式，而探测由含有肺炎链球菌的样品产生的PCR扩增产物产生可表示为“(Spneu-229p与Spneu-229bp)>(AllStrep-261p)/3”的信号模式。
基于从来自含有缓症链球菌和肺炎链球菌的样品的杂交数据的进一步分析，确定对于Spneu-229bp和AllStrep-261p探针的“(Spneu-229bp/AllStrep-261p)≤0.39”的信号模式指示缓症链球菌的存在，而对于Spneu-229bp和AllStrep-261p探针的“(Spneu-229bp/AllStrep-261p)>0.39”的信号模式指示肺炎链球菌的存在。
因此，此实施例验证虚拟探针概念。
7.4.实施例4：用于检测草绿色链球菌群的虚拟探针
草绿色链球菌群(VGS)是临床上相关的革兰氏阳性细菌的主要群中的一种，其具有被安排在以下五个子群中的多于24个物种：牛链球菌群、咽峡炎链球菌群、唾液链球菌群、缓症链球菌群和变形链球菌群。VGS群细菌可在免疫功能不全患者中引起肺炎和败血症。
作为群的VGS物种呈现遗传异质性，表明可使用单一探针检测不同物种。多种探针经设计用于不同VGS群细菌，但一些物种显示与用于其他VGS子群的探针的交叉反应性(参见图12，其显示肺炎链球菌与缓症链球菌探针Smit-79p的交叉反应性，并且显示缓症链球菌和口腔链球菌与肺炎链球菌探针Spneu-229p和Spneu-229bp的交叉反应性)。鉴于此交叉反应，设计了可区分肺炎链球菌与缓症链球菌/口腔链球菌的缓症链球菌群细菌的虚拟探针：
缓症链球菌子群＝(Spar-205p与AllStrep-261p)或(Smit-79p与AllStrep-261p与非Shyo-193p)或(Ssang-193p与AllStrep-261p与非Stmu-86p)或(Stango-85p与非Sang-156p与AllStrep-261p>0.01)并且如果Smit-79p,则(Spneu-229bp/AllStrep-261p)/AllStrep-261p≤3。
7.5.实施例5：用于检测来自肠杆菌科群的物种的虚拟探针
肠杆菌科是包括病原性和非病原性物种的革兰氏阴性细菌的一大科。病原性科成员包括克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、埃希氏菌属(Escherichia)物种、柠檬酸杆菌属物种、沙雷菌属物种和沙门氏菌属物种。
该科的成员的16S rRNA区域在物种间具有极小基因序列变异，使得难以设计能够区分物种的16S探针。然而，考虑到16S序列的类似性，设计通用探针“Entb-132p”，其可将大部分科成员识别为肠杆菌科，除可被探针“Entb-299p”识别的泛菌属(Pantoea)物种以外。
遵循来自肠杆菌科物种的物种在16S rRNA基因组区域中的聚集模式设计两组探针。来自肠杆菌属和克雷伯氏菌属的物种可通过探针“Enklspss-95p”识别，并且来自柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属和埃希氏菌属的物种可通过探针“SaEsCi-91p”识别。由于在设计能够区分肠杆菌科物种的单一探针方面的困难，设计16S rRNA与ITS探针的组合(参见图13和图14)以用于肠杆菌科物种的分层识别和区别。
使用16s-23s ITS区使得有可能区别阴沟肠杆菌复合体的物种，该阴沟肠杆菌复合体包括阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌和霍氏肠杆菌。组合使用的三个探针：“Encl-1871p”、“Encl-1659p”和“ECC3-1729p”允许不同阴沟肠杆菌复合体物种的特异性识别(参见图15)。
阴沟肠杆菌＝Encl-1659p非(Encl-1871p或ECC3-1729p)
阿氏肠杆菌＝Encl01871p非(Encl-1659p或ECC3-1729p)
霍氏肠杆菌＝(Encl-1871p与ECC3-1729p)非Encl-1659p
8.特定实施方案
本公开内容通过以下特定实施方案例示。
1.一种确定具有第一基因组的第一生物体或具有第二基因组的第二生物体是否存在于测试样品或测试样品从其制备的初始样品中的方法，方法包括：
(a)用虚拟探针探测测试样品，虚拟探针包含两种或更多种探针分子，其中各探针分子能够与对应于第一基因组的一种或多种目标核酸和/或对应于第二基因组的一种或多种同源目标核酸特异性杂交，并且其中探针分子与对应于第一和第二基因组的目标核酸的杂交不同，使得探针分子与对应于第一基因组的一种或多种目标核酸和对应于第二基因组的一种或多种目标核酸的杂交能够区分对应于第一基因组的目标核酸与对应于第二基因组的目标核酸；以及
(b)检测和/或定量来自虚拟探针中的探针分子与测试样品中如果存在的核酸的杂交的信号，
由此确定第一生物体或第二生物体是否存在于测试样品或初始样本中。
2.实施方案1的方法，其中对应于第一基因组的一种或多种目标核酸是第一扩增子组并且对应于第二基因组的一种或多种目标核酸是第二扩增子组，并且其中虚拟探针中的各探针分子能够与第一扩增子组和/或第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中探针分子与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子的杂交不同，使得探针分子与第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交可区分第一扩增子组与第二扩增子组。
3.实施方案2的方法，其进一步包含通过使用PCR引物对初始样品进行PCR扩增反应来制备测试样品，该PCR引物能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并且从其起始PCR扩增以在第一基因组和第二基因组存在于初始样品中时分别产生第一扩增子组和第二扩增子组。
4.实施方案3的方法，其中PCR引物包含多于一种引物对并且其中第一扩增子组包含多个第一扩增子和/或第二扩增子组包含多个第二扩增子。
5.实施方案2的方法，其进一步包含通过以下制备测试样品：(a)使用能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并且从其起始PCR扩增的第一组PCR引物对初始样品进行第一PCR扩增反应；(b)使用不同于第一组PCR引物并且能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并且从其起始PCR扩增的第二组PCR引物对初始样品进行第二PCR扩增反应；以及(c)组合第一和第二PCR反应中产生的扩增子以在第一基因组和第二基因组存在于初始样品中时分别产生包含多个第一扩增子的第一扩增子组和包含多个第二扩增子的第二扩增子组。
6.实施方案4或实施方案5的方法，其中多个第一扩增子对应于第一基因组中的不同区域和/或多个第二扩增子对应于第二基因组中的不同区域。
7.实施方案3的方法，其中PCR引物包含单一引物对，并且第一扩增子组由单一种第一扩增子组成并且第二扩增子组由单一种第二扩增子组成。
8.实施方案7的方法，其中第一扩增子的核苷酸序列与第二扩增子的核苷酸序列在能够与虚拟探针中的至少一种探针分子杂交的扩增子的区域中具有至少1个核苷酸错配。
9.实施方案7的方法，其中第一扩增子的核苷酸序列与第二扩增子的核苷酸序列在能够与虚拟探针中的至少一种探针分子杂交的扩增子的区域中具有至少2个核苷酸错配。
10.实施方案7的方法，其中第一扩增子的核苷酸序列与第二扩增子的核苷酸序列在能够与虚拟探针中的至少一种探针分子杂交的扩增子的区域中具有至少3个核苷酸错配。
11.实施方案3至10中任一项的方法，其中PCR扩增反应将产生可测量信号的标记并入由反应产生的任何扩增子中。
12.实施方案3至11中任一项的方法，其中引物经标记。
13.实施方案12的方法，其中至少一种引物经5'荧光标记。
14.实施方案12的方法，其中多于一种引物经5'荧光标记。
15.实施方案3至14中任一项的方法，其中PCR反应包括经荧光标记的脱氧核苷酸。
16.实施方案1至15中任一项的方法，其中各探针分子包含与第一基因组和/或第二基因组中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列。
17.实施方案1至16中任一项的方法，其中虚拟探针包含两种相对于彼此具有1个或更多个核苷酸错配的探针分子。
18.实施方案17的方法，其中虚拟探针包含两种相对于彼此具有1个核苷酸错配的探针分子。
19.实施方案17的方法，其中虚拟探针包含相对于彼此具有2个核苷酸错配的探针分子。
20.实施方案1至19中任一项的方法，其中虚拟探针的探针分子是存在于阵列上的位置可寻址的探针分子，探针分子各自位于阵列上的分离的位置处。
21.实施方案20的方法，其中检测和/或定量来自虚拟探针中的探针分子与PCR扩增产物的杂交的信号包含检测和/或定量位于虚拟探针中的探针分子的位置处的标记。
22.实施方案20或实施方案21的方法，其中步骤(b)包含：
(i)使PCR扩增产物与阵列接触；
(ii)从阵列洗涤未结合的核酸分子；以及
(iii)测量位于阵列上的各探针分子位置处的标记的信号强度。
23.实施方案20至22中任一项的方法，其中阵列包含一种或多种对照探针分子。
24.实施方案20至23中任一项的方法，其中探针分子是寡核苷酸探针分子。
25.实施方案24的方法，其中探针分子中的一种或多种具有聚胸苷尾。
26.实施方案24的方法，其中聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
27.实施方案26的方法，其中聚胸苷尾是15聚体。
28.实施方案3至19中任一项的方法，PCR扩增反应是实时PCR扩增反应。
29.实施方案28的方法，其中：
(a)各探针分子包含可区分的标记和淬灭部分，淬灭部分在标记和淬灭部分均附接至探针时抑制标记的检测；
(b)标记在实时PCR扩增反应期间在探针分子被切割后产生可测量的信号；以及
(c)各标记可与其他标记彼此区分。
30.实施方案29的方法，其中标记是荧光标记。
31.实施方案2至30中任一项的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于编码rRNA的基因的核苷酸序列。
32.实施方案2至31中任一项的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
33.实施方案1至32中任一项的方法，其中第一生物体和第二生物体是微生物。
34.实施方案33的方法，其中微生物是相同目的成员。
35.实施方案33的方法，其中微生物是相同科的成员。
36.实施方案35的方法，其中微生物是相同属的成员。
37.实施方案36的方法，其中微生物是相同群的成员。
38.实施方案33至37中任一项的方法，其中微生物中的一种或多种是人类病原体或动物病原体。
39.实施方案33至38中任一项的方法，其中微生物是细菌、病毒或真菌。
40.实施方案33至39中任一项的方法，其中微生物是细菌。
41.实施方案40的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于16SrRNA基因的核苷酸序列和/或对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
42.实施方案41的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于16SrRNA基因的核苷酸序列。
43.实施方案41或实施方案42的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
44.实施方案40至43中任一项的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于16S-23S基因间间隔区的核苷酸序列。
45.实施方案1至44中任一项的方法，其中来自探针分子与目标核酸的杂交的信号通过(i)一个或多个布尔运算子、(ii)一个或多个关系运算子或(iii)一个或多个布尔运算子和一个或多个关系运算子组合以区分第一基因组与第二基因组。
46.实施方案45的方法，其进一步包含通过(i)一个或多个布尔运算子、(ii)一个或多个关系运算子或(iii)一个或多个布尔运算子和一个或多个关系运算子组合来自虚拟探针中的探针分子与目标核酸的杂交的信号以区分第一基因组和第二基因组。
47.实施方案45或实施方案46的方法，其中每个布尔运算子独立地选自“与”、“或”和“非”。
48.实施方案45至47中任一项的方法，其中每个关系运算子独立地选自“大于”(“＞”)和“小于”(“<”)。
49.实施方案45至47中任一项的方法，其中信号通过一个或多个布尔运算子组合。
50.实施方案45至48中任一项的方法，其中信号通过一个或多个关系运算子组合。
51.实施方案45至48中任一项的方法，其中信号通过一个或多个布尔运算子和一个或多个关系运算子组合。
52.实施方案1至51中任一项的方法，其中虚拟探针包含两种探针分子或由两种探针分子组成。
53.实施方案52的方法，其中虚拟探针包含(i)能够与第一目标核酸(例如当目标核酸是PCR产物时，第一扩增子组中的第一扩增子)和第二目标核酸(例如当目标核酸是PCR产物时，第二扩增子组中的第二扩增子)特异性杂交的第一探针分子以及(ii)能够与第二目标核酸特异性杂交但不与第一目标核酸特异性杂交的第二探针分子。
54.实施方案53的方法，其包含如果第一探针分子的信号是阳性并且第二探针分子的信号不是阳性则确定第一生物体存在于测试样品或初始样品中。
55.实施方案53或实施方案54的方法，其包含如果第一探针分子的信号是阳性并且第二探针分子的信号是阳性则确定第二生物体存在于测试样品或初始样品中。
56.实施方案53至55中任一项的方法，其中第一微生物是凝固酶阴性葡萄球菌属物种并且第二微生物是凝固酶阳性葡萄球菌属物种。
57.实施方案56的方法，其中第二微生物为金黄色葡萄球菌。
58.实施方案56或实施方案57中任一项的方法，其中第一探针分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列。
59.实施方案56至实施方案58中任一项的方法，其中第二探针分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列。
60.实施方案53至55中任一项的方法，其中第一微生物是格氏链球菌，并且第二微生物是咽峡炎链球菌。
61.实施方案60的方法，其中第一探针分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列。
62.实施方案60或实施方案61的方法，其中第二探针分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列。
63.实施方案53至55中任一项的方法，其中第一微生物和第二微生物是肠杆菌科细菌。
64.实施方案63的方法，其中第一微生物和第二微生物选自产气肠杆菌、阿氏肠杆菌和霍氏肠杆菌。
65.实施方案52的方法，其中虚拟探针包含(i)能够与第一目标核酸(例如当目标核酸是PCR产物时，第一扩增子组中的第一扩增子)和第二目标核酸(例如当目标核酸是PCR产物时，第二扩增子组中的第二扩增子)特异性杂交的第一探针分子和(ii)能够与第一目标核酸和第二目标核酸特异性杂交的第二探针分子。
66.实施方案65的方法，其包含如果第一探针分子的信号除以第二探针分子的信号小于预定截止值则确定第一生物体存在于测试样品或初始样品中。
67.实施方案65或实施方案66的方法，其包含如果第一探针分子的信号除以第二探针分子的信号大于预定截止值则确定第二生物体存在于测试样品或初始样品中。
68.实施方案65至67中任一项的方法，其中第一微生物是缓症链球菌，并且第二微生物是肺炎链球菌。
69.实施方案65至68中任一项的方法，其中第一探针分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列。
70.实施方案65至69中任一项的方法，其中第二探针分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列。
71.实施方案1至51中任一项的方法，其中虚拟探针包含三种探针分子或由三种探针分子组成。
72.实施方案71的方法，其中虚拟探针包含(i)能够与第一目标核酸(例如当目标核酸是PCR产物时，第一扩增子组中的第一扩增子)和第二目标核酸(例如当目标核酸是PCR产物时，第二扩增子组中的第二扩增子)特异性杂交的第一探针分子；(ii)不同于第一探针分子并且能够与第一和第二目标核酸特异性杂交的第二探针分子；以及(iii)不同于第一和第二探针分子并且能够与第一和第二目标核酸特异性杂交的第三探针分子。
73.实施方案72的方法，其包含如果出现以下情况则确定第一生物体存在于测试样品或初始样品中：
(a)第一探针分子的信号是阳性或第二探针分子的信号是阳性，以及
(b)第一探针分子的信号或第二探针分子的信号小于第三探针分子的信号或是第三探针分子的信号的实分数。
74.实施方案72或实施方案73的方法，其包含如果出现以下情况则确定第二生物体存在于测试样品或初始样品中：
(a)第一探针分子的信号和第二探针分子的信号是阳性，以及
(b)第一探针分子的信号和第二探针分子的信号大于第三探针分子的信号或是第三探针分子的信号的实分数。
75.实施方案65至74中任一项的方法，其中第一微生物是缓症链球菌，并且第二微生物是肺炎链球菌。
76.实施方案75的方法，其中第一探针分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列。
77.实施方案75或实施方案76的方法，其中第二探针分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列。
78.实施方案75至77中任一项的方法，其中第三探针分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列。
79.实施方案3至78中任一项的方法，其中选择PCR的条件以使得PCR扩增产物的长度是300至800个核苷酸。
80.实施方案79的方法，其中选择PCR条件以使得PCR扩增产物的长度是400至600个核苷酸。
81.实施方案33至80中任一项的方法，其中初始样品或测试样品处于被微生物中的一种或多种感染的风险下。
82.实施方案33至81中任一项的方法，其中初始样品或测试样品疑似被微生物中的一种或多种感染。
83.实施方案1至82中任一项的方法，其中初始样品或测试样品是生物样品、环境样品或食品。
84.实施方案83的方法，其中初始样品或测试样品是选自以下的生物样品：血液、血清、唾液、尿液、胃液、消化液、泪液、粪便、精液、阴道液、间质液、源于肿瘤组织的流体、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺体分泌物、呼出气体、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、从鼻拭子获得的流体、从鼻咽洗涤液获得的流体、脑脊髓液、组织样品、从咽喉拭子获得的流体或组织、从伤口拭子获得的流体或组织、活检组织、胎盘液、羊水、腹膜透析液、脐带血、淋巴液、腔液、痰、脓、微生物群、胎粪、乳汁或从前述中任一项处理、提取或分离的样品。
85.实施方案84的方法，其中生物样品是：
(a)尿液、痰或从尿液处理、提取或分离的样品；
(b)痰或从痰处理、提取或分离的样品；
(c)伤口拭子或从伤口拭子处理、提取或分离的样品；
(d)血液或从血液处理、提取或分离的样品；或
(e)腹膜透析液或从腹膜透析液处理、提取或分离的样品。
86.实施方案83的方法，其中初始样品或测试样品是选自以下的环境样品：土壤、地下水、地表水、废水或从前述中任一项处理、提取或分离的样品。
87.一种可寻址阵列，其包含：
(a)一种或多种用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列的虚拟探针，各虚拟探针包含一群位置可寻址的寡核苷酸探针分子，寡核苷酸探针分子各自位于阵列上的分离的位置处，其中一种或多种虚拟探针中的各探针分子包含与第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列；以及
(b)任选地，一种或多种对照探针分子。
88.实施方案87的可寻址阵列，其包含至少两种虚拟探针。
89.实施方案87的可寻址阵列，其包含至少三种虚拟探针。
90.实施方案87的可寻址阵列，其包含至少四种虚拟探针。
91.实施方案87的可寻址阵列，其包含至少五种虚拟探针。
92.实施方案87的可寻址阵列，其包含至少十种虚拟探针。
93.实施方案87至91中任一项的可寻址阵列，其包含至多十种虚拟探针。
94.实施方案87至92中任一项的可寻址阵列，其包含至多十五种虚拟探针。
95.实施方案87至94中任一项的可寻址阵列，其中各虚拟探针包含2-4种寡核苷酸探针分子。
96.实施方案95的可寻址阵列，其中各虚拟探针包含2-3种寡核苷酸探针分子。
97.实施方案87至96中任一项的可寻址阵列，其包含12种或更多种探针分子。
98.实施方案97的可寻址阵列，其包含12至100种探针分子。
99.实施方案97的可寻址阵列，其包含12至50种探针分子。
100.实施方案97的可寻址阵列，其包含25至75种探针分子。
101.实施方案97的可寻址阵列，其包含50至100种探针分子。
102.实施方案97的可寻址阵列，其包含12种探针分子。
103.实施方案97的可寻址阵列，其包含14种探针分子。
104.实施方案97的可寻址阵列，其包含84种探针分子。
105.实施方案87至104中任一项的可寻址阵列，其中第一基因组序列和第二基因组序列分别是来自第一微生物和第二微生物的基因组序列。
106.实施方案105的可寻址阵列，其中微生物是相同目的成员。
107.实施方案105的可寻址阵列，其中微生物是相同科的成员。
108.实施方案107的可寻址阵列，其中微生物是相同属的成员。
109.实施方案108的可寻址阵列，其中微生物是相同群的成员。
110.实施方案87至109中任一项的可寻址阵列，其中探针分子中的一种或多种包含聚胸苷尾。
111.实施方案110的可寻址阵列，其中聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
112.实施方案111的可寻址阵列，其中聚胸苷尾是15聚体。
113.实施方案87至112中任一项的可寻址阵列，其中第一基因组序列和第二基因组序列各自包含对应于编码rRNA的基因的核苷酸序列。
114.实施方案113的可寻址阵列，其中编码rRNA的基因为16S rRNA基因或23SrRNA基因。
115.实施方案87至112中任一项的可寻址阵列，其中第一基因组序列和第二基因组序列各自包含对应于rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
116.实施方案87至115中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自真细菌物种的基因组序列与非真细菌物种的微生物的基因组序列的探针分子。
117.实施方案87至116中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自革兰氏阳性细菌的基因组序列与来自革兰氏阴性细菌的基因组序列的探针分子。
118.实施方案87至117中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自不同目的微生物的基因组序列的探针分子。
119.实施方案87至118中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自不同科的微生物的基因组序列的探针分子。
120.实施方案87至119中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自不同属的微生物的基因组序列的探针分子。
121.实施方案87至120中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自不同群的微生物的基因组序列的探针分子。
122.实施方案87至121中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区别来自不同物种的微生物的基因组序列的探针分子。
123.实施方案87至122中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的探针分子。
124.实施方案87至123中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的探针分子。
125.实施方案87至124中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的探针分子。
126.实施方案87至125中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的探针分子。
127.实施方案87至126中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的探针分子。
128.实施方案87至127中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的探针分子。
129.实施方案87至128中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的探针分子。
130.一种确定具有第一基因组的第一生物体或具有第二基因组的第二生物体是否存在于测试样品或测试样品从其衍生的初始样品中的方法，方法包括：
(a)用包含含有两种或更多种探针分子的虚拟探针的实施方案87或129中任一项的阵列探测测试样品，其中各探针分子能够与对应于第一基因组的一种或多种目标核酸和/或对应于第二基因组的一种或多种同源目标核酸特异性杂交，并且其中探针分子与对应于第一和第二基因组的目标核酸的杂交不同，使得探针分子与对应于第一基因组的一种或多种目标核酸和对应于第二基因组的一种或多种目标核酸的杂交可区分对应于第一基因组的目标核酸与对应于第二基因组的目标核酸；和
(b)从阵列洗涤未结合的核酸分子；
(c)检测和/或定量位于阵列上的各探针分子位置处的信号；以及
(d)如果信号指示：
(i)与阵列的探针分子杂交的目标核酸存在于测试样品中，则分析信号以确定对应于第一基因组的目标核酸或对应于第二基因组的目标核酸是否存在于样品中，由此确定第一生物体或第二生物体是否存在于初始样品或测试样品中；或
(ii)在步骤(a)中并未产生与虚拟探针的探针分子杂交的目标产物，则确定初始样品或测试样品不含有第一生物体或第二生物体，
由此确定第一生物体或第二生物体是否存在于初始样品或测试样品中。
131.实施方案130的方法，其中对应于第一基因组的一种或多种目标核酸是第一扩增子组并且对应于第二基因组的一种或多种目标核酸是第二扩增子组，并且其中虚拟探针中的各探针分子能够与第一扩增子组和/或第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中探针分子与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子的杂交不同，使得探针分子与第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交可区分第一扩增子组与第二扩增子组。
132.实施方案131的方法，其进一步包含通过使用PCR引物对初始样品进行PCR扩增反应来制备测试样品，该PCR引物能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并且从其起始PCR扩增以在第一基因组和第二基因组存在于样品中时分别产生第一扩增子组和第二扩增子组。
133.一种系统，其用于确定生物体是否存在于样品中，系统包含：
(a)光学读取器，其用于产生实施方案87至129中任一项的阵列的各探针分子位置的信号数据；以及
(b)至少一个处理器，其：
(i)经配置以从光学读取器接收信号数据；
(ii)经配置以分析一个或多个虚拟探针的信号数据；和
(iii)具有接口至储存或显示装置或网络用于输出分析结果。
134.实施方案133的系统，其进一步包含能够将PCR扩增反应的产物添加至阵列并且能够从阵列洗涤未结合的核酸分子的平板操作机器人。
135.实施方案1至86或130至132中任一项的方法，其使用实施方案133或134的系统来执行。
136.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)。
137.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ IDNO:2)。
138.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)。
139.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQID NO:4)。
140.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQID NO:5)。
141.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQID NO:6)。
142.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQID NO:7)。
143.实施方案136至142中任一项的寡核苷酸探针分子，其包含聚胸苷尾。
144.实施方案143的寡核苷酸探针分子，其中聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
145.实施方案144的寡核苷酸探针分子，其中聚胸苷尾是15聚体。
146.实施方案136至145中任一项的寡核苷酸探针分子，其包含标记。
147.一种包含多个寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列并且虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列。
148.一种包含多个寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列并且虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列。
149.一种包含多个寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列、虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列并且虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ IDNO:7)的核苷酸序列。
150.实施方案147至149中任一项的虚拟探针，其中各寡核苷酸探针分子包含聚胸苷尾。
151.实施方案150的虚拟探针，其中聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
152.实施方案151的虚拟探针，其中聚胸苷尾是15聚体。
153.一种可寻址阵列，其包含：
(a)一群位置可寻址的探针分子，探针分子各自位于阵列上的分离的位置处，其中探针分子群包含实施方案136至146中任一项的寡核苷酸探针分子。
(b)任选地，一种或多种对照探针分子。
154.一种可寻址阵列，其包含实施方案147至152中任一项的虚拟探针，其中虚拟探针中的各探针分子位于阵列上的分离的位置处。
155.实施方案154的可寻址阵列，其进一步包含一种或多种对照探针分子。
156.一种试剂盒，其包含两种或更多种探针分子，探针分子选自其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的探针分子。
157.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸探针分子。
158.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸探针分子。
159.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQID NO：7的寡核苷酸探针分子。
160.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQID NO：3的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸探针分子。
161.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQID NO：5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：7的寡核苷酸探针分子。
162.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQID NO：5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：7的寡核苷酸探针分子。
163.实施方案156的试剂盒，试剂盒包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQID NO：3的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸探针分子，和其核苷酸序列包含SEQ ID NO：7的寡核苷酸探针分子。
164.实施方案156至163中任一项的试剂盒，其中探针分子经标记。
165.实施方案164的试剂盒，其中探针分子经荧光标记标记。
166.实施方案156至163中任一项的试剂盒，其中探针分子未经标记。
167.实施方案156至166中任一项的试剂盒，其进一步包含一种或多种能够扩增第一基因组序列和第二同源基因组序列的PCR引物对。
9.文献的引用
本申请中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献均出于所有目的以全文引用的方式并入，引用的程度就如同单独地指示将各个出版物、专利、专利申请和其他文献以引用的方式并入以用于所有目的一样。在并入本文中的一个或多个文献的教导内容与本公开内容不一致的情况下，以本说明书的教导内容为准。
序列表
<110> Safeguard Biosystems Holdings Ltd.
<120> 使用探针、探针分子以及包含探针的阵列组合检测基因组序列用于对生物体特异性检测
<130> SGB-006WO
<150> 62/876,413
<151> 2019-07-17
<150> 63/004,664
<151> 2020-04-03
<160> 7
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AllStaph-146abp
<400> 1
ccagtcttat aggtaggtta yccacg 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sau-71p
<400> 2
gcttctcgtc cgttcgctcg 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Stango 85p
<400> 3
cagtctatgg tgtagcaagc tacggtat 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sang 156p
<400> 4
tatccccctc taataggcag gtta 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AllStrep-261p
<400> 5
agctaataca acgcaggtcc atct 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Spneu-229p
<400> 6
gatgcaagtg caccttttaa gcaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Spneu-229bp
<400> 7
gatgcaagtg caccttttaa gtaa 24

Claims (25)

1.一种确定具有第一基因组的第一生物体或具有第二基因组的第二生物体是否存在于测试样品或所述测试样品从其制备的初始样品中的方法，所述方法包括：
(a)用虚拟探针探测所述测试样品，所述虚拟探针包含两种或更多种探针分子，其中各探针分子能够与对应于所述第一基因组的一种或多种目标核酸和/或对应于所述第二基因组的一种或多种同源目标核酸特异性杂交，并且其中所述探针分子与所述对应于第一和第二基因组的目标核酸的杂交不同，使得所述探针分子与所述对应于第一基因组的一种或多种目标核酸和所述对应于第二基因组的一种或多种目标核酸的杂交能够区分所述对应于第一基因组的目标核酸与所述对应于第二基因组的目标核酸；以及
(b)检测和/或定量来自所述虚拟探针中的探针分子与所述测试样品中如果存在的核酸的杂交的信号，
由此确定所述第一生物体或第二生物体是否存在于所述测试样品或初始样品中。
2.权利要求1的方法，其中所述对应于第一基因组的一种或多种目标核酸是第一扩增子组并且所述对应于第二基因组的一种或多种目标核酸是第二扩增子组，并且其中所述虚拟探针中的各探针分子能够与所述第一扩增子组和/或所述第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中所述探针分子与所述第一扩增子组中的扩增子和所述第二扩增子组中的扩增子的杂交不同，使得所述探针分子与所述第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交能够区分所述第一扩增子组与所述第二扩增子组。
3.权利要求2的方法，其进一步包含通过使用PCR引物对所述初始样品进行PCR扩增反应来制备所述测试样品，所述PCR引物能够与所述第一基因组和所述第二基因组两者杂交并且从其起始PCR扩增，从而在所述第一基因组和第二基因组存在于所述初始样品中时分别产生所述第一扩增子组和第二扩增子组。
4.权利要求3的方法，其中所述PCR引物包含多于一种引物对，并且其中所述第一扩增子组包含多种第一扩增子和/或所述第二扩增子组包含多种第二扩增子。
5.权利要求4的方法，其中所述多种第一扩增子对应于所述第一基因组中的不同区域和/或所述多种第二扩增子对应于所述第二基因组中的不同区域。
6.权利要求3的方法，其中所述PCR引物包含单一引物对，并且所述第一扩增子组由单一种第一扩增子组成并且所述第二扩增子组由单一种第二扩增子组成。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述虚拟探针的探针分子是存在于阵列上的位置可寻址的探针分子，所述探针分子各自位于所述阵列上的分离的位置处。
8.权利要求2至7中任一项的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于编码rRNA的基因的核苷酸序列。
9.权利要求2至7中任一项的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述第一生物体和所述第二生物体是微生物。
11.权利要求10的方法，其中所述微生物是相同目、科、属或群的成员。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述微生物是细菌。
13.权利要求2的方法，其中所述第一生物体和第二生物体是细菌，并且其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于16S rRNA基因的核苷酸序列和/或对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
14.权利要求13的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于16S rRNA基因的核苷酸序列。
15.权利要求13或权利要求14的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
16.权利要求13至15中任一项的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于16S-23S基因间间隔区的核苷酸序列。
17.权利要求12至16中任一项的方法，其中：
(a)所述第一微生物是凝固酶阴性葡萄球菌属物种并且所述第二微生物是凝固酶阳性葡萄球菌属物种；
(b)所述第一微生物是格氏链球菌并且所述第二微生物是咽峡炎链球菌；或
(c)所述第一微生物是缓症链球菌并且所述第二微生物是肺炎链球菌。
18.一种可寻址阵列，其包含：
(a)一种或多种用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列的虚拟探针，各虚拟探针包含一群位置可寻址的寡核苷酸探针分子，所述寡核苷酸探针分子各自位于所述阵列上的分离的位置处，其中所述一种或多种虚拟探针中的各探针分子包含与所述第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列；以及
(b)任选地，一种或多种对照探针分子。
19.权利要求18的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含以下的探针分子：CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO：1),GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ IDNO：2),CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO：3),TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQID NO：4),AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO：5),GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQID NO：6),或GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO：7)。
20.一种确定具有第一基因组的第一生物体或具有第二基因组的第二生物体是否存在于测试样品或所述测试样品从其衍生的初始样品中的方法，所述方法包括：
(a)用权利要求18或权利要求19的阵列探测所述测试样品，所述阵列包含虚拟探针，所述虚拟探针包含两种或更多种探针分子，其中各探针分子能够与对应于所述第一基因组的一种或多种目标核酸和/或对应于所述第二基因组的一种或多种同源目标核酸特异性杂交，并且其中所述探针分子与所述对应于第一和第二基因组的目标核酸的杂交不同，使得所述探针分子与所述对应于第一基因组的一种或多种目标核酸和所述对应于第二基因组的一种或多种目标核酸的杂交能够区分所述对应于第一基因组的目标核酸与所述对应于第二基因组的目标核酸；和
(b)从所述阵列洗涤未结合的核酸分子；
(c)检测和/或定量位于所述阵列上的各探针分子位置处的信号；以及
(d)如果所述信号指示：
(i)与所述阵列的探针分子杂交的目标核酸存在于所述测试样品中，则分析所述信号以确定对应于所述第一基因组的目标核酸或对应于所述第二基因组的目标核酸是否存在于所述样品中，由此确定所述第一生物体或第二生物体是否存在于所述初始样品或所述测试样品中；或
(ii)在步骤(a)中未产生与所述虚拟探针的探针分子杂交的目标产物，则确定所述初始样品或测试样品不含有所述第一生物体或所述第二生物体，
由此确定所述第一生物体或第二生物体是否存在于所述初始样品或所述测试样品中。
21.一种用于确定生物体是否存在于样品中的系统，所述系统包含：
(a)光学读取器，其用于产生权利要求18或权利要求19的阵列的各探针分子位置的信号数据；以及
(b)至少一个处理器，其：
(i)经配置以从所述光学读取器接收信号数据；
(ii)经配置以分析所述一种或多种虚拟探针的信号数据；和
(iii)具有接口至储存或显示装置或网络用于输出分析结果。
22.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ IDNO：1),GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO：2),CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ IDNO：3),TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO：4),AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ IDNO：5),GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO：6),或GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ IDNO：7)。
23.一种包含多种寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中：
(a)所述虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列，并且所述虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列；
(b)所述虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列，并且所述虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列；或
(c)所述虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列、所述虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列并且所述虚拟探针中的另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列。
24.一种包含一群位置可寻址的探针分子的可寻址阵列，所述探针分子各自位于所述阵列上的分离的位置处，其中探针分子群包含权利要求22的寡核苷酸探针分子。
25.一种包含权利要求23的虚拟探针的可寻址阵列，其中所述虚拟探针中的各探针分子位于所述阵列上的分离的位置处。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2022169969A1 (en) * 2021-02-04 2022-08-11 Quantum Digital Solutions Corporation Cyphergenics-based ecosystem security platforms
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US6638719B1 (en) * 1999-07-14 2003-10-28 Affymetrix, Inc. Genotyping biallelic markers
US20030134293A1 (en) * 1999-11-16 2003-07-17 Zhiping Liu Method for rapid and accurate identification of microorganisms
US7205104B2 (en) * 2000-03-24 2007-04-17 Eppendorf Array Technologies Sa (Eat) Identification of biological (micro) organisms by detection of their homologous nucleotide sequences on arrays
CN1280422C (zh) 2004-08-26 2006-10-18 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种不对称pcr扩增方法及其应用
US20110151453A1 (en) * 2007-07-11 2011-06-23 Bergeron Michel G Nucleic acid sequences and combination thereof for sensitive amplification and detection of bacterial and fungal sepsis pathogens
EP3181700A1 (en) 2015-12-18 2017-06-21 Safeguard Biosystems Holdings Ltd. Three-dimensional polymer networks with channels situated therein
US10036054B2 (en) 2016-01-30 2018-07-31 Safeguard Biosystems Holdings Ltd. Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms
EP3418741A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 Safeguard Biosystems Holdings Ltd. Three-dimensional polymer networks and their use
US10513730B2 (en) 2017-11-22 2019-12-24 Safeguard Biosystems Holdings Ltd. Asymmetric PCR methods, primers and kits

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