JP2023511909A - 細菌定量化方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料中の細菌の量または濃度を決定するための方法および薬剤に関する。本方法は、（ａ）試料から得た遺伝物質から細菌の標的核酸を増幅して増幅生成物を形成する工程であって、標的核酸は細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分を含む工程；（ｂ）増幅生成物の量または濃度を測定する工程；（ｃ）増幅生成物の量または濃度をその参照レベルと比較することによって試料中の標的核酸の量または濃度を計算する工程；および（ｄ）試料中の標的核酸の量または濃度から試料中の細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を決定する工程であって、コピー数は試料中の細菌の量の関数であるかまたはそれと相関する工程を含むことができる。他の実施形態では、本発明は、対象における細菌による感染症の予後を決定する方法、感染症を処置するかまたは細菌による感染症の処置有効性を評価する方法、ならびにキットおよびアッセイに関する。

Description

本発明は、特に対象からの生体試料中の細菌を定量化するための方法および薬剤に一般的に関する。本発明は本発明の定量化方法に基づく細菌感染症の予後診断および処置のための方法も特徴とする。

試料中の、およびより詳細には生体試料中の細菌の迅速で正確な定量化が非常に望ましい。

第１に、および最も重要なこととして、例えば敗血症患者からとられる生体試料中の細菌の迅速で正確な定量化は、予後診断的価値があり、臨床医の治療的意思決定を支援することができる。

迅速で正確な定量化は、さもなければ生物体の幸福または溶液、材料もしくは食品の生産の品質に脅威をもたらすことがある、汚染された溶液、材料または食品中の細菌を管理、制御、根絶および／または排除するための有効な制御措置の実行において支援することもできる。

定量化は、各試料中の細菌の実数を数える能力である。細菌は非常に小さいので、従来個々の細胞を数えることはほとんど不可能だった。この問題を克服するために、科学者および臨床医は試料中の病原体の所与の数の定量化を助けるための２つの一般的方法を開発した。１番目に、目的の試料（増殖培地、血液、尿、血清等）はプレートアッセイに連続希釈された。希釈が十分に高かったとき、これらのプレートの上で増殖する個々のコロニーの数を数えることは可能であった。第２に高度な顕微鏡なしに各個々の細胞を数えることは非現実的であったので、各個々のコロニーはコロニー形成単位（ＣＦＵ）と呼ばれた。これ以後、細胞の数を単位ＣＦＵで規定することが微生物学で標準になった。

敗血症患者からとられる試料中の細菌を定量化するためのゴールドスタンダードは、特化された血液培養系で病原体を増殖させることを含む。血液（８～１０ｍｌ）は敗血症が疑われる患者からとられ、それは、病原体を検出可能なレベルまで増殖させるために特別な増殖培地に入れられる。機械が増殖を記録すると、培地は同定のための様々な増殖培養培地に平板培養される。このプロセスのために必要とされる２つの増殖相は、病原体を同定するためにどれくらいの時間を要するかについて重大な影響を及ぼす：細菌を決定するために１２±１０時間が存在する。時間がかかることは別にしてこのアプローチの問題は、患者の初期の病原体レベルを定量化する機会がないことである。初期の増殖相の後、血液１ｍｌあたりの細菌細胞の量を正確に計算することはほぼ不可能である。最終的に、ＣＦＵを決定するためにコロニーの数がプレート上で数えられるが、これは非常に不正確である。

さらに、敗血症患者からとられる試料中の細菌を検出するための様々な分子学的方法（例えば、Ｔ２ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ＡｕｓＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されているもの）は、高レベルの増幅の後に病原体の存在を記録するだけであり、検出される病原体の特異的定量化が一般的に含まれないので、初期のＣＦＵに関するいかなる仮定も非常に不正確になる。

したがって、試料中の細菌の正確な定量化のための迅速で信頼できる技術の必要性が認識されている。

様々な態様では、本発明は細菌を含む原核生物の間での１６Ｓ（スベドベリ単位）リボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子の高い保存、ならびに試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の細菌のコピー数に基づく試料中の細菌の同定および定量化で役立つことができるその中の複数の一塩基多型（ＳＮＰ）に一部基づく。

一般的に言って、細菌を含む原核生物は１６Ｓ ｒＲＮＡを含有し、それは原核生物リボソームの３０Ｓ小サブユニットの構成成分である。１６Ｓ ｒＲＮＡは長さが概ね１，５００ヌクレオチドであり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡとも呼ばれる）によってコードされ、それは、一般的に２３Ｓおよび５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子も含有する共転写されたオペロンの一部である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子のＲＮＡ配列）は原核生物の間で高度に保存されているが、変異領域がある（Weisberg W.G., et al., 1991）。本発明に関連して、１ゲノムあたりの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数は一般的に種または株特異的であり、その中で一貫しているが、細菌種および株の間でこの遺伝子のコピー数は１から１５またはそれ以上まで異なることがある（Klappenbach JA, et al., 2001）。例示的な細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、配列番号１～１５および３８～４７に示す。

本発明の第１の態様により、試料中の細菌の量または濃度を決定する方法であって、
（ａ）試料から得た遺伝物質から細菌の標的核酸を増幅して増幅生成物を形成する工程であって、標的核酸は細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分を含む工程；
（ｂ）増幅生成物の量または濃度を測定する工程；
（ｃ）増幅生成物の量または濃度をその参照レベルと比較することによって試料中の標的核酸の量または濃度を計算する工程；および
（ｄ）試料中の標的核酸の量または濃度から細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を決定することによって細菌を定量化する工程であって、コピー数は試料中の細菌の量の関数であるかまたはそれと相関する工程
を含む方法が提供される。

好適には、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１～１５および３８～４７に示すもの、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性または同一性を有するその変異ヌクレオチド配列から選択される。

好適には、標的核酸は、細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）の１つまたは複数を含む。特定の一実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する。

別の実施形態では、本態様の方法は、例えば１つまたは複数の対照試料から標的核酸を増幅することによって、１つまたは複数の対照試料から参照レベルを生成する工程をさらに含み、ここで、対照試料は細菌から得たかまたはそれに由来するものなどの既知の量または濃度からの遺伝物質を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の対照試料から標的核酸を増幅することは、工程（ａ）と実質的に同時にかまたは並行して実行される。他の実施形態では、１つまたは複数の対照試料は、１つまたは複数のさらなる細菌からの遺伝物質をさらに含む。

一実施形態では、試料および／または１つまたは複数の対照試料の遺伝物質から標的核酸を増幅することは、配列番号１６～３７および４８～５１の少なくとも１つを含むプライマーの対で実行される。

特定の実施形態では、試料および／または１つまたは複数の対照試料の遺伝物質から標的核酸を増幅することは、定量的ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、サンガー配列決定、次世代配列決定またはその何れかの組合せの使用を含む。

ある特定の実施形態では、本態様の方法は、試料中の細菌が少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるように、例えば増幅生成物を少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無について分析することによって試料中の細菌を同定する工程をさらに含む。例として、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中にあることができるかまたはそれに対応する。他の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。好適には、細菌は少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて同定される。

特定の実施形態では、増幅生成物を少なくとも１つのＳＮＰの存在または不在について分析する工程は、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法、直接配列決定またはその何れかの組合せの使用を含む。

好適には、コピー数は、以下の式を使用して決定され：

式中、Ｘは増幅生成物の量であり、Ｎは標的核酸のヌクレオチドの長さである。

一実施形態では、試料は、対象からとられる生体試料である。好適には、対象は敗血症などの細菌による感染症を有する。

本発明の第２の態様により、対象における細菌による感染症の予後を決定する方法であって、対象からの生体試料中の細菌を第１の態様の方法により定量化し、それによって対象における感染症の予後を評価する工程を含む方法が提供される。

生体試料中の細菌の濃度または量が生体試料中で変更、モジュレートされるか、または比較的高いかもしくは低いかによって、予後は負または正であってよい。この点に関して、生体試料中の細菌の比較的高い量もしくは濃度または量もしくは濃度の増加は、対象の負の予後を示すことができるが、生体試料中の細菌の比較的低い量もしくは濃度または量もしくは濃度の低下は、対象の正の予後を示すことができる。

一実施形態では、細菌の量または濃度は、抗生物質処置などの処置の前、その間および／またはその後に決定される。

一実施形態では、予後は、少なくとも一部分、対象が感染症の処置から恩恵を受けるかどうか決定するために使用される。

一実施形態では、予後は、少なくとも一部分、対象のための処置戦略を開発するために使用される。

一実施形態では、予後は、少なくとも一部分、対象において疾患の進行または再発を決定するために使用される。

本発明の第３の態様により、対象における細菌による感染症を処置する方法であって、
対象からの生体試料中の細菌を第１の態様の方法により定量化する工程、および
定量化に基づいて、感染症の処置を開始、継続、変更または中止する工程
を含む方法が提供される。

本発明の第４の態様により、対象における細菌による感染症の処置有効性を評価する方法であって、
対象からの生体試料中の細菌を第１の態様の方法により定量化する工程、および
対象の生体試料中の細菌の前記量が低減されるかまたは存在しないかによって処置が有効かどうか決定する工程
を含む方法が提供される。

前記の態様に関して、対象は敗血症を有することができる。

本発明の第５の態様により、試料中の細菌を定量化するためのキットまたはアッセイが提供され、前記キットまたはアッセイは、第１、第２、第３または第４の態様および使用説明書により方法を実行するための１つまたは複数の試薬を含む。

一実施形態では、キットまたはアッセイは、試料中の少なくとも１つの細菌の同定、部分的同定または分類が可能である少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含み、ここで、プローブ、ツールまたは試薬は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分における本明細書に記載されるものなどの少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）に結合、検出すること、またはその存在の有無を特定することが可能である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。

一実施形態では、少なくとも１つの前記単離されたプローブ、ツールまたは試薬は、少なくとも１つの細菌を含む試料と少なくとも１つの細菌を含まない試料を区別することが可能である。

特定の実施形態では、キットまたはアッセイは、試料中の細菌および適宜１つまたは複数のさらなる細菌を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイまたはマイクロアレイであるかまたはそれを含み、前記プローブは、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、キットまたはアッセイは試料中の細菌および適宜１つまたは複数のさらなる細菌を同定するための固体基質ならびに少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むバイオチップであるかまたはそれを含み、少なくとも１つの前記プローブは、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。

前記態様の特定の実施形態では、試料または生体試料は、喀痰、血液、脳脊髄液および／または尿であるかまたはそれを含む。

本発明の第１～５の態様の特徴は、該当する場合、下に記載されるものであってよい。

一実施形態では、標的核酸を含有する遺伝物質は、本発明の方法での分析の前に試料から抽出されるかまたは得られる。核酸は、当技術分野で公知である任意の方法または手段によって試料から抽出するかまたは得ることができると想定される。

当業者は、細菌の標的核酸を増幅する工程は、標的核酸を増幅する１つまたは複数のオリゴヌクレオチド／プライマーを使用する、定量的ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、サンガー配列決定、次世代配列決定またはその何れかの組合せを限定されずに含む当技術分野で公知の任意の方法によって実行することができることを理解する。

特異的標的核酸が上記の方法の１つによって増幅され、蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルを有する検出可能な量に到達するとき、シグナル強度の急増が観察される。この時点でのサイクル数は閾値サイクル（以下、Ｃｔ値と呼ぶ）と呼ぶ。ＰＣＲ方法では、ＤＮＡはサイクルごとに一般的に倍増し、ＤＮＡは指数関数的に増幅される。試料中に含有される標的核酸の増幅生成物の初期の量が増加するにつれて、より少ない数のサイクルで検出することができる、結合標識による蛍光などのシグナルの量に到達し、したがってＣｔ値は減少する。

大まかに言って、Ｃｔ値と初期の標的核酸量の常用対数の間に直線関係があり、較正曲線を規定する参照レベルをこれに基づいて作成することができる。言い換えると、そのような増幅方法による標的核酸の異なるＤＮＡ濃度を有する複数の対照試料のＣｔ値を測定し、かつ、例えばＣｔ値を縦軸におよびＰＣＲの開始前の初期のＤＮＡ量を水平軸にプロットすることによって１つまたは複数の参照レベルを作成することができる。この較正曲線は、試料中の標的核酸の量または濃度とＣｔ値の間の関係を表し、試料中に含有されるＤＮＡの量はこの関係から次に容易に決定することができる。

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数は、当技術分野で公知の任意の方法またはアルゴリズム、例えばhttps://cels.uri.edu/gsc/cndna.html.のｄｓＤＮＡコピー数計算機によって決定または定量化することができることが理解される。この点に関して、このコピー数計算機は以下のアルゴリズムを利用し：

式中、Ｘは増幅生成物の量であり、Ｎは標的核酸のヌクレオチドの長さである。この式は、塩基対の平均重量が６６０ダルトンであるという仮定に基づき、そのため、塩基対の１モルの重量が約６６０ｇであり、任意の二本鎖ＤＮＡ鋳型または増幅生成物の分子量は塩基対でのその長さと６６０の積から推定することができる。分子量の逆数は、１グラムの材料に存在する鋳型のモル数である。アボガドロ数６．０２２×１０^２３分子／モルを使用して、１グラムあたりの鋳型の分子数を次に計算することができる（モル／ｇ＊分子／モル＝分子／ｇ）。最後に、試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分子数またはコピー数は、１＊１０^９を掛けてナノグラムに変換し、次に鋳型の量（ナノグラム）を掛けることによって推定することができる。

好適には、細菌の定量化は、工程（ｄ）で決定される試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を細菌中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数によって割ることをさらに含む。例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはその中の任意の範囲の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数を、問題の細菌によって使用することができる。この目的のために、前記の方法で同定されるものなどの特定の細菌の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数を、リボソームＲＮＡオペロンコピー数データベース（rrndb：https://rrndb.umms.med.umich.edu/）に見出すことができる。他の実施形態では、利用される遺伝子コピー数は、細菌のいくつかの種、変異体および／または株にわたる遺伝子コピー数の平均または中央数であってよい。ある範囲の細菌種のための１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の例示的な遺伝子コピー数は、下の表１および１５で提供される。

好適には、前記態様の方法は、細菌を同定するさらなる工程を含むことができる。細菌は当技術分野で公知である任意の手段によって同定することができると想定される。そのような同定工程は、細菌を定量化する方法の前記工程の１つまたは複数の前、後または同時にさらに実行することができる。好ましくは、細菌を同定する工程は、増幅生成物を少なくとも１つのＳＮＰ、例えば本明細書に記載されるＳＮＰの存在の有無について分析することを含む。

一実施形態では、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分の中の１つまたは複数の前記ＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置のＳＮＰから選択される。一部の実施形態では、複数のＳＮＰを本発明の方法で使用することができる。例えば、少なくとも２つのＳＮＰ、少なくとも３つのＳＮＰ、少なくとも４つのＳＮＰ、少なくとも５つのＳＮＰ、少なくとも６つのＳＮＰまたはさらに少なくとも７つのＳＮＰを使用することができる。

別の実施形態では、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分の中の１つまたは複数の前記ＳＮＰは、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあってもまたはそれに対応してもよい。配列番号３８に示す細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分の中の１つまたは複数のＳＮＰは、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）の少なくとも１つに対応する位置にあってもよい。少なくとも１つの前記ＳＮＰ、少なくとも２つの前記ＳＮＰ、少なくとも３つの前記ＳＮＰまたは少なくとも４つの前記ＳＮＰを使用することができる。

したがって、一部の実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にある一塩基多型；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１および７８５に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む。

さらなる実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも４つに対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む。

一部の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、哺乳動物（例えば、ヒト）関連の細菌、土壌関連の細菌および水関連の細菌の中から選択される。特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、１つまたは複数の敗血症関連の細菌であってよい。

一実施形態では、細菌または複数の細菌は、グラム陰性細菌または複数のグラム陰性細菌であるかまたはそれから選択される。一実施形態では、細菌または複数の細菌は、グラム陽性細菌または複数のグラム陽性細菌であるかまたはそれから選択される。一実施形態では、細菌または複数の細菌は、firmicutes門からの細菌または複数の細菌であるかまたはそれから選択される。一実施形態では、細菌または複数の細菌は、actinobacteria門からの細菌または複数の細菌であるかまたはそれから選択される。一実施形態では、細菌または複数の細菌は、proteobacteria門からの細菌または複数の細菌であるかまたはそれから選択される。

一部の特定の実施形態では、細菌または複数の細菌は、以下の少なくとも１つであるかまたはその中から選択される：Acinetobacter属の種；Actinobaccillus属の種；Actinomadura属の種；Actinomyces属の種；Actinoplanes属の種；Aerococcus属の種；Aeromonas属の種；Agrobacterium属の種；Alistipes属の種；Anaerococcus属の種；Arthrobacter属の種；Bacillus属の種；Bacteroides属の種；Brucella属の種；Bulleidia属の種；Burkholderia属の種；Cardiobacterium属の種；Cedecea属の種；Citrobacter属の種；Clostridium属の種；Cornyebacterium属の種；Cronobacter属の種；Dermatophilus属の種；Dorea属の種；Enterobacter属の種；Enterococcus属の種；Erysipelothrix属の種；Escherichia属の種；Eubacterium属の種；Ewardsiella属の種；Faecalibacterium属の種；Filifactor属の種；Finegoldia属の種；Flavobacterium属の種；Francisella属の種；Gallicola属の種；Haemophilus属の種；Helococcus属の種；Holdemania属の種；Hyphomicrobium属の種；Klebsiella属の種；Lactobacillus属の種；Legionella属の種；Listeria属の種；Methylobacterium属の種；Micrococcus属の種；Micromonospora属の種；Mobiluncus属の種；Moraxella属の種；Morganella属の種；Mycobacterium属の種；Neisseria属の種；Nocardia属の種；Paenibacillus属の種；Parabacteroides属の種；Pasteurella属の種；Peptoniphilus属の種；Peptostreptococcus属の種；Planococcus属の種；Planomicrobium属の種；Plesiomonas属の種；Porphyromonas属の種；Prevotella属の種；Propionibacterium属の種；Proteus属の種；Providentia属の種；Pseudomonas属の種；Ralstonia属の種；Rhodococcus属の種；Roseburia属の種；Ruminococcus属の種；Salmonella属の種；Sedimentibacter属の種；Serratia属の種；Shigella属の種；Shewanella属の種；Solobacterium属の種；Sphingomonas属の種；Staphylococcus属の種；Stenotrophomonas属の種；Streptococcus属の種；Streptomyces属の種；Tissierella属の種；Vibrio属の種；およびYersinia属の種。

一部のより特定の実施形態では、細菌または複数の細菌は、以下の少なくとも１つであるかまたはその中から選択される：Acinetobacter baumannii；Acinetobacter calcoaceticus；Aerococcus viridans；Bacteroides fragilis；Bacteroides vulgatus；Cedecea lapagei；Citrobacter freundii；Cronobacter dublinensis；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus avium；Enterococcus cecorum；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Haemophilus influenzae；Klebsiella oxytoca；Klebsiella pneumoniae；Morganella morganii；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Shewanella putrefaciens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Staphylococcus hominis；Staphylococcus saprophyticus；Stenotrophomonas maltophilia；Streptococcus agalactiae；Streptococcus anginosus；Streptococcus constellatus；Streptococcus intermedius；Streptococcus milleri；Streptococcus mitis；Streptococcus mutans；Streptococcus oralis；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Streptococcus sanguinis；およびStreptococcus sobrinus。

特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；およびStreptococcus pyogenes。

特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Listeria monocytogenes；Clostridium perfringens；Corynebacterium jeikeium；Bacteroides fragilis；Neisseria meningitides；Haemophilus influenzae；Salmonella sp.；およびStaphylococcus epidermidis。別の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Listeria monocytogenes；Clostridium perfringens；Corynebacterium jeikeium；Bacteroides fragilis；Neisseria meningitides；Haemophilus influenzae；Salmonella sp.；Staphylococcus epidermidis；Bacillus anthracis、Clostridium botulinum、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomallei。

一実施形態では、１つまたは複数の細菌は、セキュリティセンシティブな生体作用物質（ＳＳＢＡ）である。ＳＳＢＡは、階層１作用物質または階層２作用物質であってよい。例示的な階層１作用物質には、以下の１つまたは複数が含まれる：Bacillus anthracis（炭疽）およびYesinia pestis（ペスト）。例示的な階層２作用物質には、以下の１つまたは複数が含まれる：Clostridium botulinum（ボツリヌス菌中毒、特に毒素産生株）；Francisella tularensis（野兎病）；Salmonella Typhi（腸チフス）およびVibrio cholerae（特にコレラ血清型Ｏ１またはＯ１３９）。一実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下からなる群の少なくとも１つの中から選択される：Bacillus anthracis、Clostridium botulinum、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomallei。

一実施形態では、細菌はヒト病原体である。

一部の実施形態では、本発明の方法は、全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）を有する対象からの血液を分析して、ＳＩＲＳの発生原因（例えば、細菌）を決定するために使用することができる。他の実施形態では、本発明の方法は、対象が微生物感染源を有する敗血症を有するかどうか決定するために使用することができる。両方の実施形態では、本発明の方法は、試料中に存在する細菌などの微生物の存在を判定し、それを区別しおよび／または同定するために使用することができる。

ＳＩＲＳは、感染性の病因または非感染性の病因（すなわち、感染陰性のＳＩＲＳまたはｉｎＳＩＲＳ）を有することができる圧倒的な全身反応である。敗血症は、感染の間に起こるＳＩＲＳである。この場合における敗血症は、臨床医によって（感染が疑われるとき）、または生物体の培養を通して診断される。ＳＩＲＳおよび敗血症は、心臓および呼吸速度、体温および白血球数における変化を含むいくつかの非特異的宿主応答パラメータによって規定される（Levy et al., 2003；Reinhart et al., 2012）。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰまたは少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬は、試料中の細菌をグラム陽性の１つまたは複数の細菌またはグラム陰性の１つまたは複数の細菌として分類するために使用することができる。

例えば、一部の実施形態では、細菌は、上記のＳＮＰのいずれか１つ、特に配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに基づいてグラム陽性細菌に分類することができる。そのような一実施形態では、細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３および６５３に対応する位置のＳＮＰに基づいて分類することができ、ここで、２７３位にＡがあり、６５３位にＴがあるとき、細菌はグラム陽性であると判定される。

例えば、別の実施形態では、細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４４０位に対応する位置の少なくとも１つのＳＮＰに基づいてグラム陽性に分類することができ、ここで、４４０位にＴがあるとき、細菌はグラム陽性であると判定される。逆に、４４０位にＴがないとき、細菌はグラム陰性であると判定される。

さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰまたは少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬は、試料中の微生物、特に細菌の群を分類するために使用することができる。

例えば、一部の実施形態では、細菌は、上記のＳＮＰから選択される少なくとも１つのＳＮＰに基づいて特定の属に属すると分類することができる。そのような一実施形態では、細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置４１２および６４７に対応する位置のＳＮＰから選択される少なくとも１つのＳＮＰに基づいて特定の属に属すると分類することができる。例えば、試料中の１つまたは複数の細菌は、４１２位にＴがあるとき、Staphylococcus属に属すると分類することができる。例えば、試料中の１つまたは複数の細菌は、６４７位にＧがあるとき、Enterococcus属に属すると分類することができる。

さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰまたは少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬は、上記の通り試料中の細菌を同定するために使用することができる。

例えば、細菌Enterobacter cloacaeは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の６５３位に対応する位置の少なくとも１つのＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、６５３位にＧがあるとき、細菌Enterobacter cloacaeが同定される。

例えば、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３７８および４８８に対応する位置のＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：３７８位にＡがあり、４８８位にＴがあるときはStreptococcus pneumoniaeであり；３７８位にＡがあり、４８８位にＡがあるときはStreptococcus agalactiaeであり；３７８位にＧがあり、４８８位にＡがあるときはStreptococcus pyogenesである。

例えば、一実施形態では、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの中から選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：２７３、４４０および６４７位にＡがあるときはAcinetobacter calcoaceticusであり；６５３位にＧがあるときはEnterobacter cloacaeであり；２７３位にＴがあり、６５３位にＴがあるときはEscherichia coliであり；２７３位にＴがあり、４８８および６４７位にＣがあり、６５３位にＡがあるときはKlebsiella pneumoniaeであり；４４０および４８８位にＣがあり、６４７位にＴがあるときはProteus mirabilisであり；４４０位にＡがあり、６４７位にＴがあるときはPseudomonas aeruginosaであり；３７８、４８８および６４７位にＡがあるときはStreptococcus agalactiaeであり；４８８および６４７位にＴがあるときはStreptococcus pneumoniaeであり；３７８位にＧがあり、４８８および６４７位にＡがあるときはStreptococcus pyogenesである。

例えば、別の実施形態では、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes の中から選択される細菌は、表２に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：

例えば、別の実施形態では、Escherichia coli、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes、Proteus mirabilis、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter calcoaceticus、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、Corynebacterium jeikeium、Bacteroides fragilis、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Serratia marcescens、Salmonella sp.およびStaphylococcus epidermidisの中から選択される細菌は、表３に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：

別の実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５に対応する位置のＳＮＰに基づいて、試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：７４６位にＴがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＧがあるときはBacillus anthracisであり；７４６位にＴがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＴがあるときはClostridium botulinumＡ型またはClostridium botulinumＢ型であり；７４６位にＴがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＴがあるときはClostridium botulinumＣ型であり；７４６位にＣがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＴがあるときはClostridium botulinumＤ型であり；７４６位にＴがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＧがあるときはClostridium botulinumＧ型であり；７４６位にＣがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＧがあるときはYersinia pestisであり；７４６位にＴがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＧがあり、７８５位にＧがあるときはFrancisella tularensisであり；７４６位にＣがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＧがあるときはVibrio choleraeであり；７４６位にＣがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＧがあるときはBurkholderia pseudomalleiである。

例えば、別の実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、表４に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：

上記の生物体を同定するために使用された４つのＳＮＰの累積差別指数は、１ＳＮＰでは０．６６７；２ＳＮＰでは０．８８９；３ＳＮＰでは０．９４４；および４ＳＮＰでは０．９７２である。

配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７４６位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７３７位に対応する。配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６４位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７５５位に対応する。配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７１位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６２位に対応する。配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７８５位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７６位に対応する。

したがって、別の実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６に対応する位置のＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：７３７位にＴがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＧがあるときはBacillus anthracisであり；７３７位にＴがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＴがあるときはClostridium botulinumＡ型またはClostridium botulinumＢ型であり；７３７位にＴがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＴがあるときはClostridium botulinumＣ型であり；７３７位にＣがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＴがあるときはClostridium botulinumＤ型であり；７３７位にＴがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＧがあるときはClostridium botulinumＧ型であり；７３７位にＣがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＧがあるときはYersinia pestisであり；７３７位にＴがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＧがあり、７７６位にＧがあるときはFrancisella tularensisであり；７３７位にＣがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＧがあるときはVibrio choleraeであり；７３７位にＣがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＧがあるときはBurkholderia pseudomalleiである。

細菌は、上記のＳＮＰの１つまたは複数に基づいて部分的に同定または分類することができる。

ＳＮＰは、以下を限定されずに含む、当技術分野で公知の任意の方法によって分析することができる：高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化（５’ヌクレアーゼ消化を含む）、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型；抗体検出方法；直接配列決定または任意のその組合せ。一実施形態では、方法における分析工程は、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法；直接配列決定または任意のその組合せを使用して少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無を判定することを含む。ＳＮＰは、以下を限定されずに含む当技術分野で公知の任意の方法によって検出することができる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；ハイブリダイゼーション分析；高分解能融解分析；５’ヌクレアーゼ消化を含むヌクレアーゼによる消化；分子ビーコン；オリゴヌクレオチドライゲーション；マイクロアレイ；制限断片長多型；抗体検出方法；直接配列決定；または任意のその組合せ。

例えば、一部の実施形態では、細菌を同定または分類することは、上で広く記載されるＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性、好ましくは本明細書に参照により組み込まれるＰＣＴ／ＡＵ２０１８／０５０４７１に記載されるような高分解能融解分析にさらに基づくことができる。

例えば、一部のそのような実施形態では、本発明の方法は、上で広く記載されるＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性をさらに分析するために、高分解能融解（ＨＲＭ）分析をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＨＲＭ分析は、ＳＮＰの少なくとも１つおよび少なくとも１つの挿入蛍光色素を含有するＤＮＡ増幅生成物（すなわち、アンプリコン）を形成すること、ならびにその融点（Ｔ_ｍ）を通してＤＮＡ増幅生成物を加熱することを含むことができる。ＤＮＡ増幅生成物に組み込まれている蛍光色素を使用して、ＨＲＭはリアルタイムでモニタリングされる。蛍光レベルは、二本鎖のＤＮＡの量が低減するに従って蛍光が低減するので温度上昇に伴いモニタリングされる。蛍光および温度における変化は、融解曲線として知られるグラフにプロットすることができる。

熟練した受取人が理解するように、２つのＤＮＡ鎖が分離するＤＮＡ増幅生成物のＴ_ｍは予測可能であり、ＤＮＡ増幅生成物を形成するヌクレオチド塩基の配列に依存する。したがって、融解曲線は異なって出現するので、多型（すなわち、１つまたは複数のＳＮＰ）を含有するＤＮＡ増幅生成物を含むＤＮＡ増幅生成物を区別することが可能である。実際、一部の実施形態では、周囲のＤＮＡ配列における差に基づいて、同じ多型を含有するＤＮＡ増幅生成物を区別することが可能である。

例えば、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの中から選択される細菌は、表５に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる：

例えば、Escherichia coli、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes、Proteus mirabilis、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter calcoaceticus、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、Corynebacterium jeikeium、Bacteroides fragilis、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Serratia marcescens、Salmonella sp.、Staphylococcus epidermidisの中から選択される細菌は、表３に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる。

一実施形態では、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。

例えば、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの中から選択される細菌は、上記のＳＮＰ位置および／またはＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。

一部の実施形態では、Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置４１２、４４０、４８８および６４７に対応する位置にあるＳＮＰに基づいて試料の中で個々に同定することができ、ここで：Staphylococcus aureusおよびStaphylococcus epidermidisは、４１２位にＴがあるとき同定することができ、次に、４１２位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいてお互いからさらに区別することができ；Enterococcus faecalisおよびEnterococcus faecium は、６４７位にＧがあるとき同定することができ、次に、６４７位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいてお互いからさらに区別することができ；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenesは、４４０および６４７位にＣがあり、４８８位にＴがあるとき同定することができ、次に、位置４４０、４８８および６４７のいずれか１つにあるＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいてお互いからさらに区別することができる。

他の実施形態では、Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３７８位に対応する位置の少なくとも１つのＳＮＰ、および３７８位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。

例えば、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、表６に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる：

上記のように、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７４６位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７３７位に対応する。配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６４位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７５５位に対応する。配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７１位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６２位に対応する。配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７８５位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７６位に対応する。

一実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiから選択される細菌は、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）に対応する位置にあるＳＮＰならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。

例えば、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、上記のＳＮＰ位置および／またはＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。

一部の実施形態では、本発明の方法は、例えば抗生物質または抗微生物剤などの治療剤を対象に投与することをさらに含むことができる。別の実施形態では、処置有効性を評価する方法（例えば本発明の第４の態様におけるように）は、少なくとも１つの細菌が治療剤に少なくとも一部分に感受性および／または耐性であるかどうか決定する工程をさらに含むことができる。

一実施形態では、本明細書に記載される方法は、試料または生体試料中の細菌の量または濃度に基づいて感染症のための処置を選択する工程をさらに含む。

感染症を処置する方法は、その処置を促進する１つまたは複数の治療剤の治療的有効量の投与を含むことができることが理解される。例としてだけであるが、これらは：抗生物質剤（小分子抗生物質、本来抗微生物性である分子、天然もしくは合成のペプチド抗微生物薬および／または抗微生物特性を有するタンパク質を含む）、抗炎症剤（例えば、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド）、免疫抑制剤、免疫調節剤、酸素、静脈内液および昇圧剤を含むことができる。

例示的な抗生物質剤には、フルオロキノロン（シプロフロキサシンを含む）、テトラサイクリン（ドキシサイクリンを含む）、マクロライド（エリスロマイシン、セスロマイシン、アジスロマイシンおよびクラリスロマイシンを含む）、３－ラクタム（ペニシリン、イミペネムおよびアンピシリンを含む）、アンサマイシン（リファンピンを含む）、フェニコール（クロラムフェニコールを含む）、ストレプトグラミン（キヌプリスチン－ダルフォプリスチンを含む）、アミノグリコシド（ゲンタマイシンを含む）、オキサゾリジノン（リネゾリドを含む）、テトラサイクリン、グリシルグリシン（チゲサイクリンを含む）、環状リポペプチド（ダプトマイシンを含む）およびリンコサミン（クリンダマイシンを含む）が含まれる。他の抗生物質剤の具体例には、フシジン酸、トリメトプリム、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、ペニシリン、モノバクタム、ペナム、ペネム、クラバム、クラベム、カルボペナム、カルボペネム、セファム、セフェム、オキサセファム、オキサセフェム、カルボセファム、カルボセフェム、セファロスポリン、テトラサイクリン、テトラサイクリン由来の抗菌剤、グリシルサイクリン、グリシルサイクリン由来の抗菌剤、ミノサイクリン、ミノサイクリン由来の抗菌剤、サンサイクリン、サンサイクリン由来の抗菌剤、メタサイクリン、メタサイクリン由来の抗菌剤、オキサゾリジノン抗菌剤、アミノグリコシド抗菌剤、キノロン抗菌剤、ダプトマイシン、ダプトマイシン由来の抗菌剤、リファマイシン、リファマイシン由来の抗菌剤、リファンピン、リファンピン由来の抗菌剤、リファラジル、リファラジル由来の抗菌剤、リファブチン、リファブチン由来の抗菌剤、リファペンチン、リファペンチン由来の抗菌剤、リファキシミンおよびリファキシミン由来の抗菌剤が含まれる。

理解されるように、生体試料中の細菌の量または濃度は疾患の進行につれて一般的に増加する。

この点に関して、処置を受ける対象の生体試料中の細菌の量または濃度の増加は、対象での疾患の進行を、および処置が無効であること（例えば、薬物耐性）を示す可能性があり、処置を受ける対象の生体試料中の細菌の量または濃度の低下は、対象における疾患の寛解または退行を、したがって処置が有効であることを一般的に示す。

一部の実施形態では、感染症を有する対象の処置の前、その間および／またはその後の複数の時点を選択し、これらの複数の時点で対象からとられる生体試料中の細菌の量または濃度を決定して、予後または処置有効性を決定することができる。例えば、細菌の量または濃度は、最初の時点で、次に再び１、２、３またはそれより多くの以降の時点で決定することができる。

好適には、生体試料をとる時点は処置サイクル全体から、または所望の期間から選択することができる。所望の期間では、例えば、時点は処置の前、処置の途中、および／または処置の完了後であってよい。好適には、第１から第２および／または第３の時点からの生体試料中の細菌の変更またはモジュレートされた量または濃度レベル、例えば低下または低減は、本発明の方法によって利用することができ、細菌感染症を有する対象の正の予後診断を提供することができる。あるいは、第１から第２および／または第３の時点からの本発明の方法によって利用される生体試料中の細菌の変更またはモジュレートされた量または濃度レベル、例えばその中の増加は、細菌感染症を有する対象の劣った予後診断を提供することができる。

当業者によって理解されるように、前記生体試料中の細菌の量または濃度は、感染症の重症度、ステージ、再発または進行および／または処置の有効性に関連している可能性もある。

一実施形態では、生体試料は、診断時に対象から、および次に処置の各サイクルの前に供給および／または収集することができる。好適には、対象ならびに感染症の性質および／またはステージによって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５および／または２０サイクルを限定されずに含む任意の数の処置サイクルがあってよい。処置サイクルは、接近していてもよく、一定期間に分散してもよく、および／または一定の期間にわたる規定の時点の集中サイクル、または上記の何れかの組合せであってよい。

さらなる実施形態では、試料は処置の間および／または処置の完了後の両方でとることができる。好適には、試料は処置の完了後の任意の時点で対象から供給することができ、その例としては、処置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５および／または３０日後、処置の１、２および／または３週後、および／または処置の１、３、６および／または９カ月後、および／または処置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０および／または３０年後が挙げられる。対象および感染症によって、対象が寛解期にあるかまたは少なくとも１つまたは複数の処置サイクルの後に処置を完了することができる。

一実施形態では、任意の好適な試料、例えば環境試料および生体試料を、本発明の方法で使用することができる。例示的な生体試料は、喀痰、唾液、血液、脳脊髄液または尿試料を含むことができる。本明細書で使用されるように、用語「血液」は、従来規定される通り全血または血液の任意の分画、例えば血清および血漿を包含する。

一部の実施形態により、増幅生成物を定量化するための内部または外部標準を使用することができる。

プローブ、ツールまたは試薬は、限定されずに、オリゴヌクレオチド、プライマー、核酸、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドまたはポリペプチドであってよい。これらは、例えば、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、天然に存在するか、単離されたか、精製されたか、化学改変されたか、組換えか、または合成されたかであってよい。

プローブ、ツールまたは試薬は、限定されずに、少なくとも１つのＳＮＰを含有する試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分に特異的に結合するか、それを検出するかまたは同定することが可能である、抗体または他のタイプの分子または化学実体であってよい。

プローブ、ツールまたは試薬は、上記のものの何れかの数または組合せであってよく、数および組合せは、達成すべき所望の結果－例えば、ゲノムレベル（遺伝子タイピング）またはＲＮＡ転写レベルでのＳＮＰの検出に依存する。

プローブ、ツールまたは試薬は、単離されたものであってよい。プローブ、ツールまたは試薬は、検出可能に標識化されてもよい。検出可能な標識は、増幅反応に含まれてもよい。適する標識には、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ；等が含まれる。標識は、高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特異的抗体等を有する、増幅されたＤＮＡがビオチン、ハプテン等にコンジュゲートされる２段階システムであってよく、ここで、結合パートナーは、検出可能な標識にコンジュゲートされる。標識は、プライマーの片方または両方にコンジュゲートされてもよい。あるいは、増幅において使用されるヌクレオチドのプールは、増幅生成物に標識を組み込むために標識化される。

特定の実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は、ゲノムレベルまたは転写レベルでの、好ましくは前者でのＳＮＰの特異的結合、検出または同定のためである。

好ましい実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は、本明細書に記載されるように少なくとも１つのＳＮＰを含有する試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分に特異的に結合、検出または同定するためのものである。

本方法のために、単一のプローブ（特にプライマー）を各試料および／または対照試料で使用することができるか、複数のプローブ（特にプライマー）を各試料および／または対照試料で（すなわち、１ポットの中で）使用することができる。そのようなプローブ（特にプライマー）は、増幅（ＰＣＲなど）から得た生の溶液に加えることができる。

一実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は２つのプライマーを含むことができ、その各々は、上記のＳＮＰを含有する、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または遺伝子生成物）の少なくとも一部分にハイブリダイズする。

一実施形態では、少なくとも１つの前記プローブ、ツールまたは試薬は、配列番号１６～３７の少なくとも１つに示す配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列相同性または同一性を有するヌクレオチド配列を有する（または含むもしくはそれからなる）オリゴヌクレオチドを含む。前記プローブ、ツールまたは試薬は、プライマーであってよい。前記プローブ、ツールまたは試薬は、配列番号１６～３７の少なくとも１つに示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。

配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中のＳＮＰの同定（特に、表４のＳＮＰの同定）のために適するプライマーは、下の表７に示す通りであってよい。

本明細書に記載される特徴のいずれも、本発明の範囲内の本明細書に記載される他の特徴のいずれか１つまたは複数との何れかの組合せで組み合わせることができる。

上記は、主に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の使用を議論する。しかし、上記は、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび他の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子生成物にも適用可能である。したがって、一部の実施形態では（該当する場合）、上下の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子への言及は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子生成物（または、１６Ｓ ｒＲＮＡ）で置き換えることができる。

この明細書におけるいかなる先行技術への言及も、その先行技術が普通の一般的な知識の一部をなすということの承認でもいかなる形の示唆でもなく、それととるべきでもない。

本発明の様々な実施形態が、以下の図面を参照して記載される。

図１は、アンプリコンＤＮＡ（ｎｇ）を試料容量（μＬ）と相関させる、対照試料から作成された標準曲線を示す。 図２は、既知の細菌濃度の一連の対照試料を作製するための対照血液のスパイキングおよびその系列希釈を図式的に示す。 図３は、E. coliおよびS. aureusのための比較フローサイトメトリーおよびプレート計数データの結果を提供する。 図４は、実施例２で試験したBacteroides fragilisのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図５は、実施例２で試験したHaemophilus influenzaeのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図６は、実施例２で試験したPseudomonas aeruginosaのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図７は、実施例２で試験したStreptococcus pneumoniaeのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図８は、実施例２で試験したKlebsiella pneumoniaeのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図９は、実施例２で試験したEscherichia coliのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図１０は、実施例２で試験したEnterobacter cloacaeのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図１１は、実施例２で試験したSerratia marcescensのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図１２は、実施例２で試験したProteus mirabilisのための混入された血液対照試料の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。 図１３は、以下の細菌種からの１６Ｓ ｒＲＮＡ分子をコードする代表的遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬＷ配列アラインメントを示す：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントによって判定される可変配列を取り出した。配列番号１に示すE. coliからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰは、整列させた配列の中の対応するヌクレオチドと一緒に強調されている。 図１４は、Ｃｔ対対数コピー数（図１４Ａ）の一般的な標準曲線の例であり、ＰＣＲの２０サイクルと４０サイクルの間の５つの標準の正規化シグナルの変化（コピー数で示される）を示す増幅プロットから得たＣ_ｔ値を例示する（図１４Ｂ）。

配列表への鍵
配列番号１：図１３におけるEscherichia coliの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿１０２８０４．１）；

配列番号２：図１３におけるStaphylococcus aureusの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７５０００．１）；

配列番号３：図１３におけるStaphylococcus epidermidisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７４９９５．１）；

配列番号４：図１３におけるStreptococcus pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７４５６４．１）；

配列番号５：図１３におけるStreptococcus agalactiaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０４０８２１．１）；

配列番号６：図１３におけるStreptococcus pyogenesの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７４０９１．１）；

配列番号７：図１３におけるEnterococcus faecalisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７４６３７．１）；

配列番号８：図１３におけるEnterococcus faeciumの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０４２０５４．１）；

配列番号９：図１３におけるProteus mirabilisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７４８９８．１）；

配列番号１０：図１３におけるSerratia marcescensの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０４１９８０．１）；

配列番号１１：図１３におけるEnterobacter aerogenesの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２４６４３．１）；

配列番号１２：図１３におけるEnterobacter cloacaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２８９１２．１）；

配列番号１３：図１３におけるKlebsiella pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０３６７９４．１）；

配列番号１４：図１３におけるPseudomonas aeruginosaの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＲ＿０７４８２８．１）；

配列番号１５：図１３におけるAcinetobacter calcoaceticusの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ３０２１３２．１）；

配列番号１６：フォワードプライマー(CCTCTTGCCATCGGATGTG);

配列番号１７：リバースプライマー(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT);

配列番号１８：フォワードプライマー(GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT);

配列番号１９：フォワードプライマー(CCTACGGGAGGCAGCAGTAG);

配列番号２０：リバースプライマー(CGATCCGAAAACCTTCTTCACT);

配列番号２１：フォワードプライマー(AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA);

配列番号２２：リバースプライマー(CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA);

配列番号２３：フォワードプライマー(TGCCGCGTGAATGAAGAA);

配列番号２４：フォワードプライマー(GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA);

配列番号２５：フォワードプライマー(TGATGAAGGTTTTCGGATCGT);

配列番号２６：リバースプライマー(TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT);

配列番号２７：リバースプライマー(AACGCTCGGATCTTCCGTATTA);

配列番号２８：リバースプライマー(CGCTCGCCACCTACGTATTAC);

配列番号２９：フォワードプライマー(GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT);

配列番号３０：リバースプライマー(CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG);

配列番号３１：フォワードプライマー(GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA);

配列番号３２：フォワードプライマー(GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA);

配列番号３３：フォワードプライマー(TCAACCTGGGAACTCATTCGA);

配列番号３４：リバースプライマー(GGAATTCTACCCCCCTCTACGA);

配列番号３５：リバースプライマー(GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG);

配列番号３６：フォワードプライマー(GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG)；

配列番号３７：リバースプライマー(TCGTTTACCGTGGACTACCAGGG)；

配列番号３８：Bacillus anthracis株２００００３１６６４の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１３８３８３．１）；

配列番号３９：Burkholderia pseudomalleiの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ１３１７９０．１）；

配列番号４０：Clostridium botulinumＡ型の１６Ｓ ＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６８１８５．１）；

配列番号４１：Clostridium botulinumＢ型の１６Ｓ ＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６８１８６．１）；

配列番号４２：Clostridium botulinumＣ型の１６Ｓ ｒＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６８３１５．１）；

配列番号４３：Clostridium botulinumＤ型の１６Ｓ ＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６８１８７．１）；

配列番号４４：Clostridium botulinumＧ型の１６Ｓ ｒＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６８３１７．１）；

配列番号４５：Francisella tularensis株Ｂ－３８の１６ＳリボソームＲＮＡ、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号／ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９３６２．１）；

配列番号４６：Vibrio cholerae株ＤＬ２の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＭＧ０６２８５８．１）；

配列番号４７：Yersinia pestisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、単離株：ＳＳ－Ｙｐ－１１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２３２２３８．１）；

配列番号４８：フォワードプライマー(TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG);

配列番号４９：リバースプライマー(CCGCTACACATGGAATTCCAC);

配列番号５０：フォワードプライマー(GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG);

配列番号５１：リバースプライマー(GGTATTAACTTACTGCCCTTCCTCCC);

１．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するかまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的上、以下の用語が下で定義される。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書でその冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。

「増幅生成物」または「アンプリコン」は、核酸増幅技術によって生成された核酸生成物を意味する。

本明細書で用いる用語「生体試料」は、患者または対象由来の、抽出されたか、未処置であるか、処置されたか、希釈されたか、または濃縮されたものであってよい試料を意味する。好適には、生体試料は、毛髪、皮膚、爪、組織または体液、例えば喀痰、唾液、脳脊髄液、尿および血液を限定されずに含む、患者または対象の体の何れかの部分から選択される。

本明細書およびクレーム（あるならば）では、単語「含んでいる（comprising）」ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprise）」を含むその派生語は、明記された整数の各々を含むが、１つまたは複数のさらなる整数の含有を排除しない。

本明細書で「コピー数」という用語は、試験試料中に存在する核酸配列、例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子またはその一部分のコピー数を意味する。

本明細書で用いるように、「対応する」核酸位置またはヌクレオチドは、２つ以上の核酸分子の整列した遺伝子座に存在する位置またはヌクレオチドを意味する。関連したかまたは変異体のポリヌクレオチドは、当業者に公知である任意の方法によって整列させることができる。そのような方法は一致を一般的に最大にし、手動アラインメントの使用、ならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）および当業者に公知である他のものの使用などの方法を含む。ポリヌクレオチドの配列を整列させることによって、当業者は、同一のヌクレオチドをガイドとして使用して、対応するヌクレオチドまたは位置を同定することができる。例えば、E. coliの１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号１に示す）をコードする遺伝子の配列を、別の種からの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子と整列させることによって、当業者は、保存されたヌクレオチドをガイドとして使用して対応する位置およびヌクレオチドを同定することができる。

「遺伝子」は、ゲノム上の特異的座位を占有し、転写および／もしくは翻訳の調節配列ならびに／またはコード領域ならびに／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる遺伝形質の単位を意味する。

「遺伝子生成物」は、遺伝子の生成物を意味する。例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子生成物は、１６Ｓ ｒＲＮＡを含む。遺伝子生成物は、例えば、ｒＲＮＡ配列に由来するｃＤＮＡ配列も含む。遺伝子生成物は、ｒＲＮＡ遺伝子の中のＳＮＰが生成物において対応する変化をもたらすだろうｒＲＮＡの生成物を含むこともできる。

本明細書で使用されるように、用語「遺伝子コピー数」は、細胞中の核酸分子のコピー数を意味する。遺伝子コピー数は、細胞のゲノム（染色体）ＤＮＡ中の遺伝子コピー数を含む。細菌では、正常な状態で、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子などの核酸のコピー数は、種の間で異なることができる。したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数は、問題の具体的な細菌によって１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５等であってよい。

「相同性」は、同一であるかまたは保存的置換を構成する核酸またはアミノ酸の百分率を意味する。相同性は、ＧＡＰ（Deveraux et al. 1984）などの配列比較プログラムを使用して判定することができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。この方法では、本明細書に引用されるものに類似のまたは実質的に異なる長さの配列はアラインメントへのギャップの挿入によって比較することができ、そのようなギャップは、例えばＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって判定される。

本明細書において、「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを生成するための相補性ヌクレオチド配列の対形成を表すために使用される。ＤＮＡでは、ＡはＴと対になり、ＣはＧと対になる。ＲＮＡでは、ＵはＡと対になり、ＣはＧと対になる。この点に関しては、本明細書で用いる用語「一致」および「ミスマッチ」は、相補性核酸鎖における対形成ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性を意味する。上で指摘した古典的Ａ－ＴおよびＧ－Ｃ塩基対などのマッチしているヌクレオチドは、効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組合せである。ヌクレオチド記号は、表８に示す：

「単離された」は、その天然の状態においてそれに通常付随する構成成分が実質的にまたは事実上含まれない材料を意味する。

本明細書で用いる用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合を通して連結される多数のヌクレオチド残基（デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその関連した構造変異体もしくは合成類似体）で構成されるポリマーを指す（または、その関連した構造変異体または合成類似体）。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」はヌクレオチド残基およびそれらの間の連結が天然に存在するヌクレオチドポリマーを一般的に意味するが、この用語が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボ核酸などを限定されずに含む様々な類似体もその範囲に含むことが理解される。分子の正確なサイズは、特定の適用によって異なることができる。オリゴヌクレオチドは長さが一般的に約１０から３０ヌクレオチド残基と一般的にかなり短いが、しかしこの用語は任意の長さの分子を指すことができるが、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は大きなオリゴヌクレオチドのために一般的に使用される。

用語「患者」および「対象」は互換的に使用され、ヒトまたは他の哺乳動物の患者および対象を指し、本発明の方法を使用して検査または治療される任意の個体を含む。しかし、「患者」は、症状が存在することを暗示していないことが理解される。本発明の範囲に含まれる適した哺乳動物には、限定されずに、霊長類、畜産動物（例えば、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、臨床試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例えば、ネコ、イヌ）および狩猟野生動物（例えば、コアラ、クマ、野生のネコ、野生のイヌ、オオカミ、ディンゴ、キツネなど）が含まれる。

本明細書で用いる用語「多型」は、別の個体の相同領域におけるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較したときの、所与の領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列における差、特に、同じ種の個体の間で異なっている所与の領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列における差を意味する。多型は、参照配列に対して一般的に規定される。多型は、単一ヌクレオチドの差、複数のヌクレオチドにおける差ならびに単一または複数のヌクレオチドの挿入、反転および欠失；ならびに単一アミノ酸の差、複数のアミノ酸の配列における差ならびに単一または複数のアミノ酸の挿入、反転および欠失を含む。「多型部位」は、変異が起こる遺伝子座である。多型が核酸配列に存在し、多型部位の特定の１つまたは複数の塩基の存在に言及する場合、本発明はその部位の相補鎖の上の１つまたは複数の相補的塩基を包含することを理解すべきである。

本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを意味する。本用語は、長さが３０ヌクレオチド残基より大きいオリゴヌクレオチドを一般的に意味する。

「プライマー」は、ＤＮＡの鎖と対にしたとき、適する重合剤の存在下でプライマー伸長生成物の合成を開始することが可能であるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは増幅の最高効率のために好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。プライマーは、重合剤の存在下で伸長生成物の合成をプライミングするのに十分に長くなければならない。プライマーの長さは、適用、用いる温度、鋳型反応条件、他の試薬およびプライマーの供給源を含む多くの因子に依存する。例えば、標的配列の複雑性によって、オリゴヌクレオチドプライマーは１５～３５またはより多くのヌクレオチド残基を一般的に含有するが、それはより少ないヌクレオチド残基を含有することができる。プライマーは、例えば約２００ヌクレオチドから数キロベースまたはより多くの大きなポリヌクレオチドであってもよい。プライマーは、それがハイブリダイズして合成開始のための部位の役割をするように設計される鋳型の上の配列に「実質的に相補的である」ように選択することができる。「実質的に相補的である」は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするためにプライマーが十分に相補的であることを意味する。一部の実施形態では、プライマーはそれがハイブリダイズするように設計されている鋳型とのミスマッチを含有しないが、これは必須でない。例えば、非相補的ヌクレオチド残基をプライマーの５’末端に付着させることができるが、プライマー配列の残りは鋳型に相補的である。あるいは、非相補的ヌクレオチド残基またはひと続きの非相補的ヌクレオチド残基をプライマーに散在させることができるが、ただし、プライマー配列が、それとハイブリダイズし、それによってプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために、鋳型の配列と十分な相補性を有する場合に限る。

「プローブ」は、特異的配列または部分配列または別の分子の他の部分に結合する分子を意味する。別途指示がない限り、用語「プローブ」は、相補的塩基対形成を通して、しばしば「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる別のポリヌクレオチドに結合するポリヌクレオチドプローブを一般的に意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブとの完全な配列相補性を欠いている標的ポリヌクレオチドに結合することができる。プローブは、直接または間接的に標識化することができる。

用語「予後」および「予後の」は、臨床結果（医学処置の有無にかかわらず）を予測すること、適当な治療クールを選択すること（または、処置が有効かどうか）、および／または現行の処置をモニタリングし、潜在的に処置を変更することを可能にする、予後診断を含むものとして本明細書で使用される。これは、細菌の同定と組み合わせることができる、本発明の方法によって細菌を定量化することに少なくとも部分的に基づくことができる。予後診断は、細菌感染症が首尾よく処置されたかさもなければ解消した後に対象が患う、感染症の任意の永続的または恒久的な身体的または精神的な影響の予測、予想または予期を含むこともできる。さらに、予後診断は、敗血症の可能性または発生、治療応答性の決定、適当な処置療法の実行、療法の後の感染症再発の確率、見込みまたは可能性の決定、および確立された療法（例えば、抗生物質）への抵抗性の発達の予測のうちの１つまたは複数を含むことができる。正の予後診断は、対象の細菌感染症の再発のない長期生存などの有益な臨床結果または展望を一般的に指し、負の予後診断は、細菌感染症の再発または進行などの負の臨床結果または展望を一般的に意味すると理解され得る。

本明細書で使用されるように、用語「定量化する」は、増幅生成物などの生成物、標的核酸、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数および／または細菌の量または濃度の、好ましくは定量的、半定量的または相対的な方法による測定、計算または推定を意味する。

本明細書で使用されるように「抵抗性」は、生物体、疾患、組織または細胞、例えば細菌の、処置、例えば化学物質または薬物（例えば、抗生物質）の意図された有効性への応答の減少または消失を意味する。処置への抵抗性は、診断時または処置の開始時に既に存在してもよいか（すなわち、内因性抵抗性）、または処置によりもしくはその後に発達することがある（すなわち、後天性抵抗性）。

本明細書において、用語「敗血症」は、臨床医学におけるその通常の意味に従って使用され、例えば、細菌感染症などの全身性および／または血液媒介性の感染症を含む。

用語「敗血症関連細菌」は、対象において敗血症を引き起こすことができると同定されたか、または敗血症の対象の血液において同定された細菌を意味する。したがって、「哺乳動物（例えば、ヒト）敗血症関連細菌」は、哺乳動物（例えば、ヒト）対象において敗血症を引き起こすことができると同定されたか、または敗血症の哺乳動物（例えば、ヒト）対象の血液において同定された細菌を意味する。哺乳動物（例えば、ヒト）敗血症関連細菌の例には、Acinetobacter baumannii、Actinobacillus hominis、Actinomyces massiliensis、Aeromonas hydrophila、Bacillus anthracis、Bacteroides fragilis、Brucella abortus、Burkholderia cepacia、Campylobacter coli、Campylobacter fetus、Campylobacter jejuni、Campylobacter lari、Cardiobacterium valvarum、Chlamydia trachomatis、Chlamydophila abortus、Chlamydophila pneumoniae、Citrobacter freundii、Clostridium difficile、Clostridium perfringens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium urealyticum、Dermatophilus congolensis、Edwardsiella tarda、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Erysipelothrix rhusiopathiae、Escherichia coli、Eubacterium desmolans、Flavobacterium ceti、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenzae、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter cinaedi、Helicobacter pylori、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumonia、Lactobacillus intestinalis、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Listeria monocytogenes、Micrococcus luteus、Mobiluncus curtisii、Moraxella catarrhalis、Morganella morganii、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nocardia asteroids、Nocardia brasiliensis、Pasteurella multocida、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas gingivalis、Prevotella buccae、Prevotella intermedia、Prevotella melaninogenica、Proteus mirabilis、Providencia alcalifaciens、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus equi、Salmonella enterica、Serratia marcescens、Shigella dysenteriae、Shigella sonnei、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus saprophyticus、Stenotrophomonas maltophila、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus bovis、Streptococcus constellatus、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus intermedins、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptomyces anulatus、Streptomyces somaliensis、Veillonella atypica、Veillonella denticariosi、Veillonella dispar、Veillonella parvula、Veillonella rogosae、Vibrio cholerae、Yersinia enterocoliticaおよびYersinia pestisが含まれる。

本明細書で用いるように、「敗血症」は、推定されたかまたは確認された感染過程を有するＳＩＲＳであると規定される。感染過程の確認は、感染因子の微生物学的な培養または単離を使用して判定することができる。免疫学的観点から、敗血症は微生物または全身感染への全身性応答であると見ることができる。

本明細書で用いるように、「全身炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）」は、以下の測定可能な臨床特性の２つ以上を有する非特異的傷害から生じる臨床応答を指す；３８度を超えるかもしくは３６度未満の体温、毎分９０を超える心拍数、毎分２０を超える呼吸数、１ｍｍ^３につき１２，０００を超えるかもしくは１ｍｍ^３につき４，０００未満の白血球数（全白血球）、または１０％を超えるバンド好中球百分率。免疫学的観点から、それは、傷害（例えば、大手術）または全身性炎症への全身性応答を表すものと見ることができる。したがって、本明細書で用いるように、「感染陰性ＳＩＲＳ（ｉｎＳＩＲＳ）」は、上記の、しかし識別可能な感染過程の不在下での臨床応答を含む。

本明細書で用いる用語「配列同一性」は、比較ウインドウにわたって配列がヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を意味する。したがって、「配列同一性百分率」は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を与え、マッチした位置の数を比較ウインドウの中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、結果を１００倍にして配列同一性百分率（％配列同一性）を与えることによって計算される。

本明細書で用いるように、用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、ゲノム配列の中の単一のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）が変更される（例えば、置換、付加または欠失を通して）ときに起こる、ヌクレオチド配列変異を意味する。ＳＮＰは、原核生物または真核生物の微生物のゲノムなどのゲノムのコード（遺伝子）および非コード領域の両方に存在することができる。

本明細書で用いるように、用語「治療」、「治療する」などは、所望の薬理学的および／または生理的効果を得ることを意味する。この効果は、感染、状態もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点から予防的であってもよく、ならびに／または、感染、状態および／またはその感染もしくは状態に起因する有害作用のための部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってもよい。本明細書で用いる「治療」は、哺乳動物（例えば、ヒト）における感染または状態のいかなる治療も包含し、（ａ）感染または状態を抑制すること、すなわちその発達を抑えること；および（ｂ）感染または状態を軽減すること、すなわち感染または状態の退行を引き起こすことを含む。

２．１６Ｓ ｒＲＮＡにおけるＳＮＰおよび遺伝子コピー数の変動を使用した細菌の定量化
本発明は、対象からの生体試料などの試料中の細菌を定量化する方法を提供する。この目的のために、本発明は、特定の細菌に特異的である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子の中の）ＳＮＰおよび遺伝子コピー数が、細菌の個々の種または株を定量化するために使用することができるとの決定に一部基づく。

最も詳細には、本発明は、以下の中から選択される細菌種などの微生物を定量化する方法を提供する：Aerococcus viridans；Acinetobacter calcoaceticus；Bacteroides fragilis；Cedecea lapagei；Citrobacter freundii；Cronobacter dublinensis；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus cecorum；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Haemophilus influenzae；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Shewanella putrefaciens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。一実施形態では、本発明は、以下の中から選択される細菌種などの微生物を定量化する方法を提供する：Acinetobacter calcoaceticus； Bacteroides fragilis；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Haemophilus influenzae；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus； Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。

例えば、試料中の上の段落に掲載される細菌の１つを定量化する方法は、試料から得た遺伝物質からの問題の微生物の細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子から標的核酸を増幅して増幅生成物を形成すること、増幅生成物の量または濃度を測定すること、および増幅生成物の量または濃度をその参照レベルと比較することによって試料中の標的核酸の量または濃度を計算することを含む。

好適には、標的核酸は、定量的ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲおよびエンドポイントＰＣＲなどのＰＣＲまたはリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）によって増幅される。

ＰＣＲの間、ＤＮＡ（例えば、標的核酸）の量は、理論的には増幅生成物を生成するようにサイクルごとに倍増する。各サイクルの後、増幅生成物中のＤＮＡの量は以前の概ね２倍である。

試料中の標的核の絶対量は、好ましくは１つまたは複数の対照試料または外部標準から生成される参照レベル、曲線または値を使用して決定される。対照試料は、対照試料の遺伝物質が標的核酸の配列中のそれらと同一であるべきであるプライマー結合部位を含有するように、通常試料に非常に類似している。このことは、１つまたは複数の対照試料および試料中の標的核酸が同等の効率で増幅されることを確実にし、それは定量化のために一般的に必要とされる。特定の実施形態では、対照試料は、既知の量または濃度の細菌から得られる遺伝物質を含む。これは、その既知の量または濃度の生細菌および／もしくは死細菌、ならびに／または既知の量または濃度の細菌から抽出される遺伝物質を含むことができる。代わりの実施形態では、対照試料は、標的核酸を含む既知の量または濃度の合成オリゴヌクレオチドを含み、例えば、前記標的核酸は、既知の量または濃度の細菌と実質的に同等であってよい。好ましくは、実験間（例えば、ランの間、機械間）の変動の問題を回避するために、１つまたは複数の対照試料から標的核酸を増幅することは、試料から標的核酸を増幅するのと実質的に同時にまたは並行して実行される。

１つまたは複数の対照試料は、上に記載されるものなどの１つまたは複数のさらなる細菌からの遺伝物質をさらに含むことができると想定される。この目的のために、本方法は、試料中の少なくとも２つの細菌、少なくとも３つの細菌、少なくとも４つの細菌、少なくとも５つの細菌、少なくとも６つの細菌、少なくとも７つの細菌、少なくとも８つの細菌、少なくとも９つの細菌、少なくとも１０の細菌等を定量化するために利用することができる。

さらに、試料中の細菌は未知であってよいが、一旦同定されると、増幅生成物は同定された細菌に由来する１つまたは複数の対照試料に対応する参照レベルと比較することができる。

定量的ＰＣＲなどのＰＣＲ技術を使用して、蛍光標識などの検出可能な標識をＰＣＲサーモサイクラーで検出、測定し、生成物の指数関数的増加に対応するその幾何学的増加を使用して、各反応で閾値サイクル（Ｃ_ｔ）を決定する。

好適には、試料および対照試料の各々からの細菌の標的核酸は、別々のチューブ内で増幅される。対照試料の異なる希釈を使用して、標準曲線（Ｃ_ｔ値／標準の量のｌｏｇに対する交差点のプロット）を次に作成することができる。未知試料のＣ_ｔ値は、適当な細菌綱、属または種の結果参照レベルまたは標準曲線と次に比較され、試料中の標的核酸の初期の量の計算を可能にする。標準曲線を作成するために、好適には標的核酸の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６つの異なる量を定量化すべきであり、試料中の標的核酸の量は標準曲線の範囲内に入るべきである。

本明細書に記載される定量化方法は、試料中の細菌を同定する工程をさらに含むことができる。当業者ならば理解するように、これは本方法の前、後またはそれと同時に実行することができる。さらに、および先に述べたように、細菌の同定は、同定される特定の細菌綱、属および／または種に対応する適当な参照レベルおよび遺伝子コピー数の選択を支援することができる。

一実施形態では、細菌を同定する工程は、増幅生成物を少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無について分析することを含む。本明細書に記載される通り、配列番号１に示すE. coli１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３のいずれか１つに対応する１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子自体）のヌクレオチド位置の多型は、特に哺乳動物（例えば、ヒト）病原体（血液培養によって単離される最も一般的に見出される細菌種を含む（Karlowsky et al.2004））を含む、試料中の細菌を同定するために使用することができる。

一実施形態では、同定される細菌は、以下からなる群から選択される：Aerococcus viridans；Acinetobacter calcoaceticus；Bacteroides fragilis；Cedecea lapagei；Citrobacter freundii；Cronobacter dublinensis；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus cecorum；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Haemophilus influenzae；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Shewanella putrefaciens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。一実施形態では、同定される細菌は、以下からなる群から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。

上記のＳＮＰを使用した試料中の上記細菌種を同定するための一般規則は、上に記載される。

試料中の１つまたは複数の細菌種を同定するために、１つまたは複数のＳＮＰを検出するための当技術分野で公知の任意の方法を本明細書に記載される方法で使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、別のものではなく１細菌種を絞り込むことか、または一部の場合には確認することを促進する。試料中の一塩基多型に対応する特定の位置でのヌクレオチドの存在を判定するために、多数の方法が当技術分野で公知である。多型の検出のための様々なツールには、限定されずに、ＤＮＡ配列決定、スキャン技術、ハイブリダイゼーションベースの技術、伸長ベースの分析、高分解能溶融分析、組込みベースの技術、制限酵素ベースの分析およびライゲーションベースの技術が含まれる。

核酸は、対象からの生体試料から、または環境試料、例えば空気、土もしくは水試料、濾液、食物または製造品、または表面から、例えば医療器具もしくは作業場所表面からのスワップからであってよい。対象は、ヒト対象または非ヒト対象、例えば哺乳動物対象、例えば霊長類、畜産動物（例えば、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、臨床試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例えば、ネコ、イヌ）および狩猟野生動物（例えば、コアラ、クマ、野生のネコ、野生のイヌ、オオカミ、ディンゴ、キツネなど）であってよい。対象からの生体試料は、体液、例えば血液、唾液、喀痰、尿、脳脊髄液、糞便、細胞、組織または生検を非限定的に含む、対象の体の任意の部分からであってよい。他の例では、核酸は、培養細胞から得られる。

本発明の方法によって分析される核酸は、試料の中にある間に分析することができるか、または、分析の前に先ず試料から抽出、例えば試料から単離してもよい。試料から核酸を単離するための任意の方法を本発明の方法において使用することができ、そのような方法は当業者に周知である。抽出された核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡを含む）を含むことができる。一部の例では、分析の前に逆転写のさらなる工程が方法に含まれてもよい。したがって、分析される核酸は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡのＤＮＡコピー、またはその何れかの組合せを含むことができる。核酸は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ、または１６Ｓ ｒＲＮＡのＤＮＡコピーの部分を含有することもでき、ＳＮＰについて分析される核酸位置を含有する部分を提供する。

そのような方法は、例えば１つまたは複数のＳＮＰを含有する標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする増幅プライマー対を含む、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用することができる。本発明の方法の実施において有益なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ＳＮＰの位置を含む標的ポリヌクレオチドの一部に相補的でありそれにまたがるオリゴヌクレオチドを含むことができ、多型部位（すなわち、ＳＮＰ）の特異的ヌクレオチドの存在は、プローブの選択的ハイブリダイゼーションの存在の有無によって検出される。そのような方法は、標的ポリヌクレオチドおよびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをエンドヌクレアーゼと接触させること、および多型部位のヌクレオチドの存在がプローブの対応するヌクレオチドに相補的であるかどうかによってプローブの切断生成物の存在の有無を検出することをさらに含むことができる。

プライマーは、任意の便利な合成方法を使用して製造することができる。そのような方法の例は、「Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties」、Methods in Molecular Biology Series, Volume 20, Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7, 1993に見出すことができる。検出を促進するために、プライマーを標識化することもできる。

ＳＮＰの検出のために有益な任意の方法を本発明において使用することができ、ＳＮＰ遺伝子タイピングのための多くの異なる方法が当技術分野で公知である（レビューについては、Syvanen, A. C. (2001)；Kim, S. and Misra, A., (2007)、を参照する）。そのような方法は、「反応」（例えば、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、伸長および切断）および続く「分離」（例えば、固相マイクロタイタープレート、微粒子またはアレイ、ゲル電気泳動、溶液相均一または半均一）を含む、連続した３工程の使用からなることができる。全ての適用のために理想的なＳＮＰ遺伝子タイピング方法は１つもなく、様々なパラメータ、例えば分析するＳＮＰの試料サイズおよび数を考慮して最も適当な方法を決定することは当業者の技術の範囲内である。

臨床使用に特に役立ち、少数のＳＮＰへの照会に依存する例示的技術は、迅速、高感度（試料中の核酸の増幅を通して）、一段階、リアルタイム測定出力、多重化および自動化可能、比較的安価、ならびに正確であり、例には、限定されずに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（５’ヌクレアーゼアッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、高分解能融解分析、ＬＵＸ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）などの分子ビーコンプローブ、および鋳型による（template directed）色素組込み（ＴＤＩ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）が含まれる。

例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション、均一溶液相および蛍光共鳴エネルギー転移の組合せを使用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、核酸を増幅するためのフォワードおよびリバースプライマーならびにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと共に、ＳＮＰ部位（複数可）にわたって結合するように設計された標識プローブを分解するためのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’－ヌクレアーゼ活性に依存する。反応、分離および検出は全て同時に実行し、反応の進行に従って結果をリアルタイムに読み取ることができる。そのようなアプローチは多数のＳＮＰを同時に分析することに役立たないが、それは、少数のＳＮＰを相応な費用で速やかに、高感度におよび正確に照会するのに特に適する。

一部の方法が他より適することがあるが、試料中の細菌および／または複数の細菌を分類および／または同定するために、１つまたは複数のＳＮＰを検出するための当技術分野で公知の任意の方法を本明細書に記載される方法において使用することができる。

しかし、好ましい一実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無を検出することは、高分解能融解（ＨＲＭ）分析の使用を含む。この目的のために、本方法での高分解能融解分析の利用は、細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の標的核酸の単一の増幅工程から細菌の定量化および同定の両方が達成されることを有利に可能にする。

ＨＲＭは、挿入蛍光色素によって染色されたＰＣＲ生成物（すなわち、アンプリコン）がその融点（Ｔ_ｍ）を通して加熱されるときの、蛍光変化の正確なモニタリングに基づく。伝統的な融解と対照的に、ＨＲＭ分析における情報は、計算されたＴ_ｍだけでなく融解曲線の形で含有されるので、ＨＲＭは分光法の形と考えることができる。ＨＲＭ分析は単一工程の閉鎖的なチューブ方法であり、増幅および融解はリアルタイムＰＣＲ機器の上で単一のプロトコールとして実行することができる。

本発明の実施形態では、この方法は、本明細書に記載されるＳＮＰの１つまたは複数を含有する標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする増幅プライマー対を利用する。増幅反応混合物は蛍光色素を含有し、それは結果として生じるアンプリコンに組み込まれる。

結果として生じるアンプリコンは、約５０℃から約９５℃の範囲内の温度の漸増（すなわち、０．０１～０．５℃）によるＨＲＭに次に付される。この過程の間のある時点で、アンプリコンの融点に到達し、ＤＮＡの２本の鎖は分離するかまたは別々に「融解」する。

アンプリコンに組み込まれる蛍光色素を使用して、ＨＲＭはリアルタイムでモニタリングされる。色素の蛍光レベルは温度が上昇する間中モニタリングされ、二本鎖ＤＮＡの量が低減するに従って蛍光は低減する。蛍光および温度における変化は、融解曲線として知られるグラフにプロットすることができる。

熟練した受取人が理解するように、２本のＤＮＡ鎖が分離するアンプリコンのＴ_ｍは予測可能であり、アンプリコンを形成するヌクレオチド塩基の配列に依存する。したがって、融解曲線は異なって出現するので、多型（すなわち、１つまたは複数のＳＮＰ）を含有するアンプリコンを含むアンプリコンを区別することが可能である。実際、一部の実施形態では、周囲のＤＮＡ配列における差に基づいて、同じ多型を含有するアンプリコンを区別することが可能である。

ＨＲＭ曲線は、多くの異なる戦略によってお互いから識別することができる。例えば、多くの場合、ＨＲＭ曲線は、曲線形状における明らかな差に基づいておよび／またはＴｍに基づいて識別することができ、０．２℃の差が有意であると考えられている。他の場合には、規定の曲線がベースラインとして使用され、他の正規化曲線がベースラインに対してプロットされる、差グラフ分析を使用することができる（Price, E.P. et al. 2007を参照する）。さらに他の場合には、全ての温度での蛍光のための平均±１．９６標準偏差から第３および第９７パーセンタイル値を導くことを含む、差グラフに基づく方法を使用することができる（Andersson, P. et al., 2009およびMerchant-Patel, S. et al. 2008を参照する）。

３．キット
本明細書は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の様々なＳＮＰおよび遺伝子コピー数を、試料中の細菌を定量化するための「ツール」としてどのように使用することができるかについて説明する。本発明のこれらの知見は、試料中の細菌を定量化するための遺伝子／対立遺伝子ベースのおよび遺伝子生成物ベースのプローブ、ツール、試薬、方法およびアッセイを発明者が開発することを可能にする。

この点に関して、キットは、参照レベル、値もしくは曲線の決定、および／または参照レベル、値もしくは曲線を得ることに関する情報のための、本明細書に記載されるものなどの１つまたは複数の対照試料を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるように、細菌を定量化するためのキットの使用に関する使用説明書をさらに含むことができる。

一実施形態では、キットまたはアッセイは、試料中の少なくとも１つの細菌の同定、部分的同定または分類が可能である少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含み、ここで、プローブ、ツールまたは試薬は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分における本明細書に記載されるものなどの少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）に結合、検出すること、またはその存在の有無を特定することが可能である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。

一実施形態では、少なくとも１つの前記単離されたプローブ、ツールまたは試薬は、少なくとも１つの細菌を含む試料と少なくとも１つの細菌を含まない試料を区別することが可能である。

特定の実施形態では、キットまたはアッセイは、試料中の細菌および適宜１つまたは複数のさらなる細菌を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイまたはマイクロアレイであるかまたはそれを含み、前記プローブは、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、キットまたはアッセイは、試料中の細菌および適宜１つまたは複数のさらなる細菌を同定するための固体基質ならびに少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むバイオチップであるかまたはそれを含み、少なくとも１つの前記プローブは、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。

試料および／または１つまたは複数の対照試料の中の標的核酸を増幅するために、ならびに／または本発明による１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の１つまたは複数のＳＮＰを検出するために必要とされる全ての必須の材料および試薬は、キットの中に一緒に集めることができる。キットは、標識の検出、陽性および陰性対照、蛍光色素、洗浄溶液、ブロッティングメンブラン、マイクロタイタープレート、希釈緩衝液などのために、適当な試薬を含んでもよい。例えば、多型の同定のための核酸ベースの検出キットは、以下の１つまたは複数を含むことができる：（ｉ）グラム陽性細胞および／またはグラム陰性細胞からの核酸（陽性対照として使用することができる）；および（ｉｉ）分析するＳＮＰ位置（複数可）を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブ、ならびに適宜、疑われるＳＮＰ部位の、またはその周囲の１つまたは複数の他のマーカー。増幅のために必要な反応混合物を提供するために、様々なポリメラーゼ（用いる核酸増幅技術によって、逆転写酵素、Ｔａｑ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）ＤＮＡリガーゼ等）を含む核酸増幅に適する酵素、デオキシヌクレオチドおよび緩衝液が含まれてもよい。そのようなキットは、適する手段の中に、各個々の試薬および酵素、ならびに各プライマーまたはプローブのための個別の容器も一般的に含む。キットは、本明細書に記載されるアッセイの１つを実行するための様々な装置および試薬；および／または本明細書に規定されるＳＮＰの存在を同定するためにキットを使用するための印刷された説明書を特徴として有することもできる。

一部の実施形態では、本明細書に一般的に記載される方法は、少なくとも一部、適切にプログラムされたコンピュータシステムなどの処理システムによって実行される。上記の方法の実行を可能にするマイクロプロセッサー実行アプリケーションソフトを備えた、独立型コンピュータを使用することができる。あるいは、本方法は、少なくとも一部、分散型アーキテクチャの一部として動作する１つまたは複数の処理システムによって実行することができる。例えば、増幅生成物の量または濃度を測定し、増幅生成物の量または濃度をその参照レベルと比較することによって試料中の標的核酸の量または濃度を計算するために、および／または試料中の標的核酸の量または濃度からゲノムコピー数を決定することによって細菌を定量化するために、処理系を使用することができる。処理系は、１つまたは複数のＳＮＰの検出に基づいて細菌を同定するために使用することもできる。一部の例では、ユーザーによって処理システムに入力されるコマンドは、これらの判定において処理システムを支援することができる。

一例では、処理システムは、少なくとも１つのマイクロプロセッサー、メモリ、入力／出力装置、例えばキーボードおよび／または表示装置、ならびにバスを通して相互接続される外部インターフェースを含む。外部インターフェースは、処理システムを周辺装置、例えば通信ネットワーク、データベースまたは記憶装置に接続するために利用することができる。マイクロプロセッサーは、ＳＮＰ検出および／または細菌定量化プロセスの実行を可能にするために、ならびにコンピュータシステムとの通信などの任意の他の要求される処理を実行するために、メモリに格納されるアプリケーションソフトの形の命令を実行することができる。アプリケーションソフトは１つまたは複数のソフトウェアモジュールを含むことができ、適する実行環境、例えばオペレーティングシステム環境などの中で実行することができる。

３．１ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のためのプライマー、プローブ、キットおよび処理システム
細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡの中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７および／または６５３に対応する位置のＳＮＰが分析される、本発明の方法のために有益であるプライマーおよびプローブの非限定的な例を下に示す。

例えば、２７３位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CCAGTGTGGCTGGTCATCCT（配列番号１７）、CGATCCGAAAACCTTCTTCACT（配列番号２０）、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。

３７８位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、およびGGTATTAACTTACTGCCCTTCCTCCC（配列番号４８）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CGATCCGAAAACCTTCTTCACT（配列番号２０）、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）、およびCCGCTACACATGGAATTCCAC（配列番号４９）が含まれる。

４０８位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーにはＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧ（配列番号５０）が含まれ、例示的なリバースプライマーにはＧＧＴＡＴＴＡＡＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣ（配列番号５１）が含まれる。

４１２位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、およびAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。

４４０位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）、TGCCGCGTGAATGAAGAA（配列番号２３）、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA（配列番号２４）、およびTGATGAAGGTTTTCGGATCGT（配列番号２５）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。

４８８位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）、TGCCGCGTGAATGAAGAA（配列番号２３）、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA（配列番号２４）、TGATGAAGGTTTTCGGATCGT（配列番号２５）、およびGTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT（配列番号２９）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。

６４７位および／または６５３位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）、TGCCGCGTGAATGAAGAA（配列番号２３）、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA（配列番号２４）、TGATGAAGGTTTTCGGATCGT（配列番号２５）、GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT（配列番号２９）、GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA（配列番号３１）、GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA（配列番号３２）、およびTCAACCTGGGAACTCATTCGA（配列番号３３）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。

同様に、細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１６Ｓ ｒＲＮＡの中の、配列番号３８に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）に対応する位置にあるＳＮＰが分析される本発明の方法のために有益であるプライマーおよびプローブの非限定的な例には、表７に記載されるものが含まれる。

４．本発明の方法の適用
本発明の方法は、試料、例えば対象からの試料、または環境試料、例えば土もしくは水の試料、または、装置もしくは機器（例えば、医療もしくは手術機器）もしくは作業台の表面からとられる試料の中の１つまたは複数の細菌を定量化するために有益である。そのような定量化は、例えば、細菌を取り除くか、根絶するか、またはその数を低減するための治療クールを決定するために次に使用することができる。本発明の方法の任意の２つ以上を組み合わせてもよい。例えば、細菌感染症を有する対象からの生体試料中の細菌は、その対象の予後、ならびにその感染症を処置する方法を決定するために定量化することができる。

クリニック、救急室、一般病棟および集中治療室の臨床医のところに、感染症または疑わしい感染症を有する対象がしばしば診察に訪れる。そのような患者は、異常な体温、増加した心拍数および呼吸数、ならびに異常な白血球数の非診断的臨床徴候をしばしば有する。臨床医は、患者が感染を有するかどうか、感染の重症度、患者を病院に入院させるかどうか（まだ入院していない場合）、感染源、抗生物質を使用するかどうか、もしそうならば抗生物質の種類、経路および用量を決めなければならない。患者における感染の存在は、最も一般的には、患者から試料をとって培養液の中で生物体を増殖させることによって調査されている。生物体が増殖すると、それをグラム染色して同定することができる。しかし、そのような方法は、対象における細菌感染症のレベルを正確に定量化せず、したがって患者の予後の展望を提供することができない。細菌を定量化しない場合、臨床医は、対象の治療法を決定するために彼または彼女の臨床判断に頼らなければならない。

したがって、本発明の方法は、感染症を引き起こす細菌の定量化および適宜同定に基づいて、予後、適当な治療クールおよび処置有効性を臨床医が決定するのを助けるのに特に有益である。特定の実施形態では、本発明の方法は、対象で抗生物質耐性を決定するために使用することができる。

本発明の方法は、効率的な時間で実行することも可能であり、そのため、数日内ではなく数時間以内にその結果が臨床医に利用可能である。そのような属性は、臨床医が対象で細菌のレベルを鋭敏に定量化して、処置に関する情報に基づいた決定を下すことを可能にする。これらの改善は、不必要に入院させられる患者数の低減、細菌、感染の重症度の高感度検出、広域抗生物質／医薬品の使用の低減、広域抗生物質の下の患者時間の低減、抗生物質／医薬品からの毒性の低減、および医薬品への耐性（特に抗生物質耐性）の発達の低減をもたらすことができる。

本発明の方法の結果に基づいて、必要な場合、対象を適切に管理し、療法を投与することができる。例えば、細菌感染症の管理は、例えば、治療的に有効な抗生物質のクールなどの治療剤の投与を含むことができる。

一般的に、治療剤は、薬学的に許容される担体と一緒に医薬（または、対象が非ヒト対象である場合は獣医学的）組成物の形で、およびそれらの意図された目的を達成するのに有効な量で投与される。対象に投与される活性化合物の用量は、感染の症状の低減もしくは軽減および／または対象からの細菌の低減もしくは排泄などの有益な応答を対象において経時的に達成するのに十分であるべきである。投与すべき薬学的に活性な化合物（複数可）の量は、治療される対象、例えば、その年齢、性別、体重および一般健康状態に依存してもよい。この点に関しては、投与のための活性化合物（複数可）の正確な量は、開業医の判断に依存する。細菌感染症の治療または予防において投与される活性化合物（複数可）の有効量の決定では、開業医は、感染の重症度、ならびに、炎症、血圧異常、頻脈、呼吸促迫、発熱、悪寒、嘔吐、下痢、皮膚発疹、頭痛、錯乱、筋痛および発作を含む、感染に伴う任意の症状の重症度を評価することができる。いかなる事象においても、当業者は、治療剤および適する治療レジメンの適する投薬量を不相応な実験なしで容易に決定することができる。

主要器官への酸素供給を増加させるため、主要器官への血流を増加させるためおよび／または炎症性応答を低減するために、治療剤は補助的（対症的）療法と協調して投与することができる。そのような補助的療法の例示的な例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、静脈内生理食塩水および酸素が含まれる。

この明細書全体で「一実施形態」または「実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書全体の様々な場所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、同じ実施形態を必ずしも全て指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の組合せの中で任意の適する方法で組み合わせることができる。

法規に従って、本発明は、構造的または方法論的特徴に多かれ少なかれ特異的な言葉で記載された。本明細書に記載される手段が本発明の実行の好ましい形態を含むので、本発明は、示されるかまたは記載される特異的特徴に限定されないことを理解すべきである。したがって、本発明は、当業者によって適切に解釈される添付の請求項（あるならば）の正しい範囲の中のその形態または改変形のいずれかの形で請求される。

本明細書で言及される全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、受託番号および科学文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

本発明が容易に理解され、実際に実行されるように、特定の好ましい実施形態が以下の非限定的な実施例を通して記載される。

実施例１
本方法（ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標））は、所与の患者試料中の病原体を正確に定量化し、同定するために、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および高分解能融解（ＨＲＭ）のコア原理を使用する。このプロセスは、患者から血液を直接とり、病原体ＤＮＡを抽出し、それを増幅し、ＨＲＭ曲線を測定して種を区別することを含む。他の分子同定系のように、ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）プロセスは、ＤＮＡを検出可能なレベルまで増幅する。しかし、重要な差は、既知量で存在する対照ＤＮＡの試料と一緒にＤＮＡが増幅されることである。これらの量は勾配を形成するので、ＤＮＡ（ｎｇ）を容量（μｌ）と相関させる最良適合の線を引くことができる。例を図１に示す。

ＨＲＭ曲線分析および種分化のためにそれが別々にされるのは、増幅の間にＤＮＡ量が測定される後だけである。ＤＮＡの量がナノグラム（ｎｇ）で測定されると、細菌細胞またはゲノムコピーの数はゲノムコピー数式を使用して計算することができる。

遺伝子コピー数は、所与の病原体の遺伝子型における遺伝子のコピー数である。ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）は１６Ｓ遺伝子の領域を同定して増幅し、細菌は１つの染色体を有するだけなので、試料中の１６Ｓ分子の数を測定することは細菌細胞の数と直接相関する。異なる病原体はそれらの染色体に異なる数の１６Ｓ遺伝子を有し、例えば、Staphylococcus aureusは１６Ｓの５遺伝子コピーを有し、Klebsiella pneumoniaeは８コピーを有する。この変動を考慮し、遺伝子コピーの総数をゲノム中の１６Ｓコピーの数で割り算することによって、例えば下のアルゴリズムによって既知の値を使用して全細菌数を計算することができる。

式中：
・Ｘ＝アンプリコンの量（ｎｇ）
・Ｎ＝ｄｓＲＮＡアンプリコンの長さ
・６６０ｇ／モル＝１ｂｐ ｄｓＲＮＡの平均質量

結果
ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）の感度の要約を、下の表９に示す。これらの細胞値はＲｏｔｏｒｇｅｎｅからのＤＮＡデータから定量化され、これは上のゲノムコピー数式で次に使用した。

ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）の主要な障害物は現行の命名法を破壊し、臨床医および病理学者が感受性ゲノムコピー数がどうであるか、ならびにこれがＣＦＵおよび全細胞にどのように関連するか理解するのを助けている。これを実行するために、本発明者は、所与の試料中の病原性細胞の数を定量化するために複数の実験を行った。目的のいくつかの種のコロニーを種によって１２～１６時間増殖させ、その後、既知の病原性細胞濃度の単一のコロニーを試料に混入した。一例として、１２時間にわたるE.coliの増殖は、１０^７～１０^８細胞のコロニーをもたらす。E.coliは最も成長の速い細菌であるので、第一に全ての他のコロニーはより少ない細胞を有するだろうし、そのことはＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）感度の強度をさらに示す。血液およびスパイキングは、図２に示すように系列希釈で１０倍に希釈した単一のコロニーで実行した。

ＩｎｆｅｃｔＩＤ系で実験を行うとき、感度および特異性を試験するためにＰＢＳおよび血液に目的の病原体を混入した。この間に、混入した成分の試料を従来の培養プレートアッセイの上に平板培養した。生じたＣＦＵ数を、下の表１０に例示されるようにＩｎｆｅｃｔＩＤの結果と比較した。

フローサイトメトリーは、サイズおよび蛍光に基づく個々の分子の直接的計数である。これに関連して、細菌細胞は蛍光色素で染色し、個々の細菌をそれらがレーザーを通して一度に１細胞を調べられるときに計数した。

定量化実験の結果は、図３に示す。より低い希釈で個々のコロニーを計数する限定的な能力のために、プレート計数のためにより高い希釈だけで結果を記録した。下に示す細胞の総数は、３５０μＬであるＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）で使用された試料の容量に関係する。表１１は図３に例示されるデータを示し、下で提供される。

実施例２
背景
本発明の方法は、毎年数百万の命を奪い、数１０億の費用がかかる世界的な公衆健康脅威である敗血症の影響を低減することを支援することができる。

敗血症は、感染症に対する潜在的に生命にかかわる反応である。感染症の起因である病原体およびその後の最も有効な治療クールを特定することは、多くの時間、数日さえもとる。一方、臨床医は、この動きが速くて頻繁に致命的な状態を抑えるのにどの抗生物質が必要かについて推測することができるだけである。その結果として、試験結果を待つ間、医師は広範囲抗生物質を一般的に投与するが、それはしばしば不適当であり、したがって効果がない。

ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）は、敗血症を引き起こす病原体を血液（培養は必要としない）から直接検出する。ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）は、目的の複数の病原体を分離して同定するために少数のＳＮＰを試験することに基づく。これを実行するために、ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）は、血液中の病原体の種を正確に直接示すために、リアルタイムＰＣＲと続く高分解能融解曲線分析（ＭＣＡ）を使用する。

敗血症患者の血液に見出される細菌の極めて低いレベル（１～１００細胞数／ｍＬ）は、迅速な診断の困難な課題を増加させる（Reimer et al., 1997）。２つのさらなる試験は、患者が敗血症の臨床症状を示し始めるとき、血液中に存在する細菌の濃度は非常に低い（成人では１～１００ＣＦＵ／ｍＬ（Yagupsky et al., 1990）および新生児では＜１０ＣＦＵ／ｍＬ（Reier-Nilsen et al., 2009）ことも示した。血流感染症および敗血症の診断のための現行のゴールドスタンダードは血液培養であり、ゴールドスタンダードの厳しい限界は、懸濁液中の細菌の濃度を検出することができるまでにそれらが一般的に１０８ＣＦＵ／ｍＬに上昇しなければならないことである（Smith et al., 2008）。

菌血症および敗血症ショックをもつ一連の２０人の成人では、Hall and Gold (1955)は、＞１００ＣＦＵ／ｍＬ血液を有する全ての６人の患者は死亡し、より少ない菌血症の患者のわずか４１％が死亡したことを見出した。血液中の微生物数は敗血症ショックの発生および重症度と中等度の相関を示したが、３００ＣＦＵ／ｍＬ血液の高い細菌数を有する一部の患者はショックを患わなかった。別の試験では、Weil and Spink (1958)は、グラム陰性敗血症患者における菌血症の重大さと致命的な結果の間の相関を見出した。５ＣＦＵを有する８人の患者の死亡率は、患者の血液から単離され、死亡率は８４％に増加した。

ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）は、血流感染症および敗血症と最も一般的に関連する上位２０種の細菌および５種の酵母病原体を同定する、非常に特異的で感度の高い血液から直接診断する検査であることが実証された。血流感染症および敗血症の重症度を決定するツールとしてのＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）の有用性は、患者の抗生物質処置に重要な影響を及ぼすかもしれない。

本実施例の狙いは、ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）を使用して混入されたＥＤＴＡ血液で敗血症を引き起こす細菌種を検出することの限界を決定することであった。
方法
１．合計で、最も多発する細菌種のうちの２０種をこの試験で検査した。
２．２０種のアメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ）細菌種を、３７℃で一晩、脳心臓浸出液寒天で培養した。
３．１ｍＬのＥＤＴＡ血液に混入するために各細菌種からの単一の細菌コロニーを使用し、それを１：９倍に次に連続希釈し、混入血液の希釈系列を作成した。
４．ＤＮＡは、Ｒｏｃｈｅ ＭａｇＮＡｐｕｒｅシステムを使用して混入血液試料から抽出した。
５．さらに、Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌに入院した患者から得たＥＤＴＡ血液の１ｍＬを、Ｒｏｃｈｅ Ｍａｇｎａｐｕｒｅシステムを使用したＤＮＡ抽出にもかけた。
６．ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）ＳＮＰプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、高度に差別的なＳＮＰを包含する領域を増幅するように設計された。ＰＣＲ生成物のサイズは、７９ｂｐ～９６ｂｐの範囲内だった。
７．混入血液ならびに患者血液中の２０細菌種の濃度を決定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用した。ｑＰＣＲプロセスは以下の通りであった：１マイクロリットルの抽出したＤＮＡ（１～３ｎｇ）を、２×Ｔｙｐｅ－ｉｔ－ＨＲＭ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の１０μｌおよび各プライマーの８ｐｍｏｌを含有する１９μｌの反応ｍａｓｔｅｒｍｉｘに加えた。これらの反応の温度サイクルは以下の通りだった：５０℃で２分間、９５℃で２分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間、５２℃で２０秒間および７２℃で３５秒間、７２℃で２分間の保持、５０℃で２０秒間の保持（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱ、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。
８．ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱ（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ソフトウェアは、ユーザーがＨＲＭデータを複数の方法で可視化することを可能にする。正規化された生の融解曲線は、減少する蛍光対増加する温度、および差曲線を表し、それはユーザー定義の曲線をベースライン（すなわちｘ軸）として示し、そのベースラインに対する他の正規化された曲線を表す。

結果
試験した様々な細菌種の検出限界は表１３に示し、このデータの融解曲線分析は図６に示す。

患者試料の試験および細菌定量化に関するデータは、表１４に例示する。

結論
この試験は、血流感染症および敗血症を引き起こすことが知られている上位２０の細菌種の非常に低いゲノムコピー数を検出するＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）の能力を実証する。これは、混入血液および患者血液試料の両方で実証された。

実施例３
Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＭａｃｋａｙ Ｂａｓｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌの入院した患者から得られた３８０個の患者全血試料を調査した。血液培養（ＢａｃＴＡｌｅｒｔ）結果は、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄから得られた。さらに、同じ試料をＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）にかけ、それは、試料中に存在する細菌を同定すること、および本発明の方法を使用して３５０μＬの血液中に存在する細菌細胞を定量化すること（これは同じ調査の中で同時に達成された）を含んだ。最後に、全ての患者臨床メタデータを評価し、臨床評価判定基準に基づいて患者を高、中、低リスクにランクするために分類した。結果を、下の表１７に提供する。

血液培養プロセス：
全身性血流感染症の存在のために検査するために、血液培養を使用する。別々の部位から（一般的に患者の腕の静脈から）２つ以上の血液試料を採血した。複数の試料の収集は、感染症を検出する可能性を増加させることができる。収集の後、血液はＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）培地などの血液培養ボトルに移される。これらのボトルはルーチンの診断検査室へ送られ、そこで、ボトルはＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）機械などのインキュベーションシステムに入れられる。細菌または酵母が患者血液中に存在するならば、これらの微生物は血液培養ボトルの中で成長し、ＣＯ_２が生成される。機械はＣＯ_２の量を定期的に測定し、閾値量が生成されると、血液培養ボトルは標識され、検査技術者は機械からボトルを取り出し、標準の微生物培養技術を使用して微生物の同定のために患者試料を処理する。

ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）プロセス
標準曲線方法を使用した絶対的定量化では、未知のものは既知の量に基づいて定量化される。第１に、既知の濃度の１０倍連続希釈参照ＤＮＡを用いて標準曲線を作成し、これはＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）試験のためのインプット試料として使用される。これらの反応は未知試料と一緒に実行され、次に未知のものは標準曲線と比較され、標準曲線から値が推定され、それはリアルタイムＰＣＲ増幅からのサイクル時間（Ｃ_ｔ）に基づく。

Ｃ_Ｔ対対数コピー数の一般的な標準曲線の例は、図１４Ａに例示する（Yun JJ, Heisler L, Hwang IIL, Wilkins O. 2006. Genomic DNA functions as a universal external standard in quantitative real-time PCR. Nucleic Acids Research, 34(12): e85）。線を含む点は、コピー数で標識される。図１４Ｂは、増幅プロットから得たＣ_Ｔ値を示し、それは、ＰＣＲの２０サイクルと４０サイクルの間の５つの標準の正規化シグナルの変化（コピー数で示される）を示す。Ｃ_ｔは、蛍光が閾値と交差するサイクルである。

ＩｎｆｅｃｔＩＤ（登録商標）プロセスは、実施例２のそれと同様に実行された。簡潔には：
１．既知濃度の参照試料（表１５を参照する）を１０倍に希釈して参照試料を提供した。上記の患者血液試料も使用した。
２．Ｒｏｃｈｅ ＭａｇＮＡｐｕｒｅシステムを使用して、参照試料および患者血液試料からＤＮＡを抽出した。
３．同じ条件の下の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、参照試料および患者血液試料で実行した。これは、細菌種が患者血液試料中に存在するかどうかを決定する。もしそうならば、存在する細菌の濃度を決定するためにｑＰＣＲデータを上で概説されるように分析した。ｑＰＣＲプロセスは以下の通りであった：１マイクロリットルの抽出したＤＮＡ（１～３ｎｇ）を、２×Ｔｙｐｅ－ｉｔ－ＨＲＭ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の１０μｌおよび各プライマーの８ｐｍｏｌを含有する１９μｌの反応ｍａｓｔｅｒｍｉｘに加えた（プライマーは、１６ＳｒＲＮＡの高度に差別的なＳＮＰを包含する領域（配列番号１６～３７および４８～５１を参照する）を増幅するように設計された）。これらの反応のための温度サイクルは、以下の通りだった：５０℃で２分間、９５℃で２分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間、５２℃で２０秒間および７２℃で３５秒間、７２℃で２分間の保持、５０℃で２０秒間の保持（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱ、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ＰＣＲ生成物のサイズは、７９ｂｐ～９６ｂｐの範囲内だった。
４．ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱ（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ソフトウェアは、ユーザーがＨＲＭデータを複数の方法で可視化することを可能にする。正規化された生の融解曲線は減少する蛍光対増加する温度、および差曲線を表し、それはユーザー定義の曲線をベースライン（すなわちｘ軸）として示し、そのベースラインに対する他の正規化された曲線を表す。
５．上記の式を使用して、存在する細菌の濃度を決定した。

臨床評価判定基準
臨床評価判定基準（表１６に提供される）に基づいて患者を高、中、低にランクするために、患者メタデータをＥｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ａｄｕｌｔ Ｓｅｐｓｉｓ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、により評価して分類した。

参照
1. Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP. Update on detection of bacteremia and fungemia. Clin Microbiol Rev. 1997; 10:444-65.
2. Yagupsky P., Nolte F. 1990. Quantitative aspects of septicemia. Clin. Microbiol. Rev. 3:269-279.
3. Reier-Nilsen T., Farstad T., Nakstad B., Lauvrak V., Steinbakk M. 2009. Comparison of broad range 16S rDNA PCR and conventional blood culture for diagnosis of sepsis in the newborn: a case control study. BMC Pediatr. 9:5.
4. Smith, J., Y. Serebrennikova, D. Huffman, G. Leparc, and L. Garcia Rubio. 2008. A new method for the detection of microorganisms in blood cultures: Part I. Theoretical analysis and simulation of blood culture processes. Can. J. Chem. Eng. 86:947-959.
5. Hall, W. H., and D. Gold. 1955. Shock associated with bacteremia. Arch. Intern. Med. 96:403-412.
6. Weil, M. H., and W. W. Spink. 1958. The shock syndrome associated with bacteremia due to gram-negative bacilli. Arch. Intern. Med. 101:184-193.
7. Yun JJ, Heisler L, Hwang IIL, Wilkins O. 2006. Genomic DNA functions as a universal external standard in quantitative real-time PCR. Nucleic Acids Research, 34(12): e85.

Claims (21)

1. 試料中の細菌の量または濃度を決定する方法であって、
   （ａ）前記試料から得た遺伝物質から前記細菌の標的核酸を増幅して増幅生成物を形成する工程であって、前記標的核酸は細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分を含む工程；
   （ｂ）前記増幅生成物の量または濃度を測定する工程；
   （ｃ）前記増幅生成物の量または濃度をその参照レベルと比較することによって前記試料中の前記標的核酸の量または濃度を計算する工程；および
   （ｄ）前記試料中の前記標的核酸の量または濃度から前記試料中の前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を決定する工程であって、前記コピー数は前記試料中の前記細菌の量の関数であるかまたはそれと相関する工程
   を含む方法。
2. 前記標的核酸が、前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）の１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
3. １つまたは複数のＳＮＰが、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する、請求項２に記載の方法。
4. １つまたは複数の対照試料から前記参照レベルを生成する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記参照レベルを生成する工程が前記１つまたは複数の対照試料から前記標的核酸を増幅することを含み、前記対照試料が既知の量または濃度の遺伝物質を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記１つまたは複数の対照試料から前記標的核酸を増幅することが、工程（ａ）と実質的に同時にまたは並行して実行される、請求項５に記載の方法。
7. 前記１つまたは複数の対照試料が、１つまたは複数のさらなる細菌からの遺伝物質をさらに含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記試料および／または前記１つまたは複数の対照試料の遺伝物質から前記標的核酸を増幅することが、配列番号１６から３７および４８から５１の少なくとも１つを含むプライマーの対で実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記試料および／または前記１つまたは複数の対照試料の遺伝物質から前記標的核酸を増幅することが、定量的ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、サンガー配列決定、次世代配列決定またはその何れかの組合せの使用を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記試料中の前記細菌を同定する工程をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記細菌を同定する工程が、前記増幅生成物を少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無について分析することを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４０８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、請求項１１に記載の方法。
13. 前記増幅生成物を前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無について分析する工程が、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法、直接配列決定またはその何れかの組合せの使用を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数が、以下の式を使用して決定され：
    

    

    式中、Ｘは前記増幅生成物の量であり、Ｎは前記標的核酸のヌクレオチドの長さである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記試料が、対象からとられる喀痰、血液、脳脊髄液または尿などの生体試料である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記対象が前記細菌による感染症を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 対象における細菌による感染症の予後を決定する方法であって、前記対象からの生体試料中の前記細菌を請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法により定量化し、それによって前記対象における前記感染症の予後を評価する工程を含む方法。
18. 対象における細菌による感染症を処置する方法であって、
    前記対象からの生体試料中の前記細菌を請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法により定量化し、前記定量化に基づいて、前記感染症の処置を開始、継続、変更または中止する工程を含む方法。
19. 対象における細菌による感染症の処置有効性を評価する方法であって、
    前記対象からの生体試料中の前記細菌を請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法により定量化すること；および
    前記対象の生体試料中の前記細菌の前記量が低減されるかまたは存在しないかによって処置が有効かどうか決定することを含む方法。
20. 前記対象が敗血症を有する、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 試料または生体試料中の細菌を定量化するためのキットまたはアッセイであって、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法を実行するための１つまたは複数の試薬および使用説明書を含むキットまたはアッセイ。

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