CN111684067A

CN111684067A - 被检样品中的细菌数的定量方法

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Publication number: CN111684067A
Application number: CN201880080998.7A
Authority: CN
Inventors: 仁井见英树; 北岛勋; 宫腰晃央; 东祥嗣
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc; University of Toyama NUC
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; University of Toyama NUC
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2020-09-18
Also published as: PH12020550963A1; EP3730611A4; KR102363462B1; SG11202005945QA; JPWO2019123692A1; EP3730611A1; KR102428043B1; JP7023465B2; AU2018390590A1; KR20210145834A; WO2019123692A1; KR20200083604A; AU2018390590B2; US20210102239A1

Abstract

本发明的课题在于提供能够使用PCR法迅速且精度良好地定量被检样品中的细菌菌数的方法。作为解决上述课题的方法，利用以下的工序进行被检样品中的细菌的鉴定及定量。(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用用于扩增细菌的16S rRNA基因的通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(2)第二PCR工序，使用用于扩增利用前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及(3)菌数定量工序，使用校准用的数据，从由前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。另外，也可以在上述的工序(1)～(3)的基础上追加以下的工序(4)及(5)。(4)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。(5)细菌数校正工序，以由前述菌数定量工序求出的细菌数作为暂定细菌数，基于前述对照细菌及由前述菌种鉴定工序鉴定出的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数来校正暂定细菌数，从而确定前述被检样品中的细菌数。

Description

被检样品中的细菌数的定量方法

技术领域

本发明涉及使用PCR法迅速且精度良好地进行被检样品、特别是血液被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌菌种的鉴定的方法。

背景技术

败血症的重症度判定中所使用的传统检查项目为血液培养、内毒素、降钙素原、白细胞数、CRP(C-reactive protein，C-反应蛋白)、血压、体温、呼吸数、脉搏数等，最近新增加了Presepsin(可溶性CD14亚型，sCD14-ST)。由于血液培养结果需要时间，因此难以反馈到早期治疗中。由于白细胞数、CRP是宿主侧的感染防御反应，因此检查值与重症度产生时间差，常常成为与实际的重症度背离的值。降钙素原在特异性、定量性方面存在困难，从而难以应用。Presepsin无法用于肾功能障碍的患者。这样一来，作为实时地反映感染症的重症度、治疗效果的指标，还不存在值得信赖的检查项目。如果可能，以患者被检样品中的菌数作为生物标记而用作感染症重症度的判定或监测治疗效果的指标是最直接的，也是合理的。

目前，被检样品中的菌数的标准定量分析通过培养所采集的患者被检样品来进行，但只是非常粗略的定量(仅分类为“1+”、“2+”、“3+”)。培养技术虽然被长年利用，但是检查耗费时间(通常为2～3天)，而且依赖于每个菌种不同的增殖能力，因此使用菌落形成单位(Colony-forming unit，CFU)的定量结果的可靠性低。因此，为了进行细菌数的正确测定，优选不依赖于培养的测定法。近年来，认为在除培养以外的方法中通用性最高的技术是定量PCR(实时PCR)法。

尝试利用实时PCR法对患者被检样品中的致病菌进行定量的情况下，在检查开始的时刻不鉴定致病菌，另外，混合感染也可能经常发生，因此需要使用细菌通用引物(bacterial universal引物)(其是检测几乎所有细菌的引物，以下有时简单记载为“通用引物”。)。但是，患者被检样品中的致病菌常常是少量的，因此有时在通常的实时PCR中不能达到足以正确定量的充分的灵敏度。另外，即使得到充分的灵敏度，在细菌通用PCR(bacterial universal PCR)(其为检测几乎所有细菌的PCR)中也会存在污染容易被检测的问题，在致病菌的判定中产生困难。其结果为：患者被检样品中的致病菌的定量检查尽管对于感染症治疗非常有用，但是因技术上未解决的问题而还未达到实用化。

关于利用PCR法的感染症病原菌的鉴定方法，在专利文献1中公开了下述感染症病原菌的迅速鉴定方法：使用来源于被检样品的核酸，使用多个特定引物组进行实时PCR，并使用所得的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对被检样品中的菌进行鉴定。

在专利文献2中公开了可实现检测灵敏度提高的真核生物生产的耐热性DNA聚合酶和基于使用了该耐热性DNA聚合酶的PCR法的细菌菌种的鉴定方法。

在专利文献3中公开了如下用途的多个引物对：使用来源于被检样品的核酸进行实时PCR，使用所得的扩增产物的熔解温度(Tm值)对被检样品中的菌进行鉴定。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2007/097323号

专利文献2：国际公开2010/082640号

专利文献3：国际公开2015/053293号

发明内容

发明要解决的课题

在用以往的PCR法分析败血症中的血液被检样品等被检样品中微量地含有的致病菌的菌数或其菌种的情况下，现状是还残存下述的课题。

在通常的实时PCR中，有时无法得到足以正确地定量患者被检样品中的致病菌数的充分的灵敏度。尤其在致病菌极微量的情况下，有时不能用实时PCR正确地定量。

本发明的目的在于提供能够使用PCR法迅速且精度良好地进行被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌菌种的鉴定的方法。

用于解决课题的手段

本发明涉及的对被检样品中的细菌数进行定量的第一定量方法的一个实施方式，其特征在于，具有以下的工序。

(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；

(2)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及

(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。

(A)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；

(B)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；

(C)第三PCR工序，使用与菌种已知的对照细菌的已知细菌数对应的核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；

(D)第四PCR工序，使用通过前述第三PCR工序得到的第三扩增产物，利用巢式PCR法得到第四扩增产物；

(E)由前述已知的菌数和前述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；以及

(F)菌数定量工序，使用前述校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。

本发明涉及的对被检样品中的细菌数进行定量的第二定量方法的一个实施方式，其特征在于，具有以下的工序。

(2)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；

(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的暂定细菌数；

(4)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及

(5)细菌数校正工序，基于前述对照细菌及通过前述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数对通过前述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定前述被检样品中的细菌数。

(E)由前述已知的菌数和前述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；

(F)菌数定量工序，使用前述校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的暂定细菌数；

(G)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及

(H)细菌数校正工序，基于前述对照细菌及通过前述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数对通过前述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定前述被检样品中的细菌数。

本发明涉及的判定有无污染的方法的特征在于，具有下述工序：

工序(a)，将血液被检样品进行离心分离，分离成红细胞级分、血沉棕黄层级分及血浆级分后，制作包含上清的血浆级分和血沉棕黄层的试样A、以及包含上清的血浆级分且不包含血沉棕黄层的试样B；

工序(b)，利用具有以下的工序(2-1)、(2-2)及(2-3)的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，对前述试样A和前述试样B的各自的细菌数进行定量；以及

工序(c)，通过比较前述试样A的细菌数和前述试样B的细菌数，从而判定前述血液试样中有无细菌的污染。

(2-1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；

(2-2)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及

(2-3)菌数定量工序，使用校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的暂定细菌数。

本发明涉及的判定有无污染的方法中的对细菌数进行定量的工序(b)还可以具有以下的工序(2-4)及(2-5)。

(2-4)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。

(2-5)细菌数校正工序，基于前述对照细菌及通过前述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数对通过前述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定前述被检样品中的细菌数。

发明效果

根据本发明，能够提供可使用PCR法迅速且精度良好地进行被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌菌种的鉴定的方法。

附图说明

图1示出了实施例1中的各步骤的关系和流程。

图2是表示将细菌的分散液进行100×g、5分钟的轻度离心后的上半部(upperhalf)和下半部(lower half)的菌数的图表。

图3是表示采用通常的实时PCR法(conventional PCR method)的定量性与采用本发明涉及的巢式PCR法(nested PCR method)的定量性的比较的图表。

图4是表示残存于耐热性DNA聚合酶(市售品和以真核生物作为宿主(host)而制作的耐热性DNA聚合酶)的来源于宿主细菌的DNA的检测结果的图。

图5是Tm mapping法用的引物在16S rRNA中的布局图。

图6是表示通过等量混合1个碱基不同的引物而能够进行两者的正确定量的实验结果的图。

图7是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

图8是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

图9是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

图10是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

图11是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

图12是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

图13是表示致病菌的定量结果与其他的生物标记在抗菌药治疗前后的动态的比较的一例的图。

具体实施方式

本发明的被检样品中的细菌数的第一定量方法具有以下的工序。

(i)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物。

(ii)第二PCR工序，使用用于对通过第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物。

(iii)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的菌数的关系的校准用的数据，由通过第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出被检样品中的细菌数。

本发明的被检样品中的细菌数的第二定量方法具有以下的工序。

(III)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的菌数的关系的校准用的数据，由通过第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出被检样品中的暂定细菌数。

(IV)菌种鉴定工序，对被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。

(V)细菌数校正工序，基于对照细菌及通过菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16SrRNA操纵子拷贝数对通过菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定被检样品中的细菌数。

以下，对本发明涉及的被检样品中的细菌数的定量方法的实施方式进行说明。

首先，对在本发明涉及的被检样品中的细菌数的第一定量方法及第二定量方法中共通的第一PCR工序、第二PCR工序及菌数定量工序进行说明。

(来源于被检样品的核酸试样的制备)

来源于被检样品的核酸试样的制备可以利用常规方法进行。

需要说明的是，来源于被检样品的核酸试样的制备优选如后述的实施例中使用的方法那样、使用不产生由细菌菌种引起的差异的集菌及核酸提取方法。

作为被检样品，不仅可列举血液，还可列举脑脊液(细菌性脑膜炎)、心包积液(心包炎)、胸膜积液(胸膜炎)、腹水(腹膜炎)、关节积液(骨科的术后感染症)、眼房水(眼内炎)、肺胞灌洗液(肺炎)、尿(尿路感染症)、术后的引流管排液(术后感染症)、CV导管前端(长期卧床患者的由导管前端生物被膜(Biofilm)所致的败血症)等能够期待被用作多种感染症的重症度或治疗效果的指标、感染症风险管理的指标的被检样品。

(第一PCR用的引物对)

第一PCR工序中使用的通用引物对只要是能够对可用于定量成为定量对象或者有可能成为定量对象的范围的细菌菌种的16S rRNA基因的区域进行扩增的通用引物对即可，可以利用已知的引物对、从细菌的16S rRNA基因的碱基序列信息选择的引物对等，没有特别限制。

当在不同的细菌菌种间引物所结合的16S rRNA基因的部位的序列存在有1个碱基不同的2种碱基序列的情况下，在使用一者的碱基序列的引物的情况下，若产生1个碱基错配，则有时定量精度下降。在这样的情况下，优选的是：同时使用与上述两者的碱基序列对应的引物，扩大能够进行精度良好的定量的细菌菌种的范围。

即，在第一PCR工序中使用的通用引物对中，正向引物、反向引物中的一者或两者优选等量混合有1个碱基不同的2种引物。

作为这样的引物对，可列举以下的引物对的组合。

模式1：

区域1正向引物1a：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1正向引物1b：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列号2)

区域7反向引物：5′-CCGGGAACGTATTCACC-3′(序列号3)

在该模式1的情况下，优选将区域1正向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。区域7反向引物优选直接使用1种。第一PCR工序优选对每个被检样品用1管进行。

模式2：

区域1’正向引物1a：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1’正向引物1b：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列号2)

区域7’反向引物1a：5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(序列号4)

区域7’反向引物1b：5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(序列号5)

在该模式2的情况下，优选将区域1’正向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。同样地优选将区域7’反向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。第一PCR工序优选对每个被检样品用1管进行。。

(第一PCR工序)

在第一PCR工序中，为了在提高定量的精度的基础上得到与作为模板使用的核酸的量对应的扩增产物量，优选在基因扩增达到平台期之前、例如在扩增曲线具有斜率的阶段结束扩增。扩增产物的扩增速度可以通过PCR用的试剂的浓度、PCR用的酶的活性、用于扩增的循环数等进行控制。优选的是：设定根据核酸试样中所含的核酸的量所预计的未达到平台期的循环数、或者根据预先通过实验求出的数据设定未达到平台期的循环数，控制扩增速度，在基因扩增达到平台期之前结束PCR。

第一PCR工序可以利用已知的方法及装置来进行。

第一PCR工序优选在除来源于被检样品的核酸以外极少混入来源于细菌的核酸、或不存在这样的混入的反应体系中进行。利用如专利文献2中所公开那样的已知的方法对PCR用的试剂、器具、酶进行处理，从而可以制备上述反应体系。另外，作为用于核酸扩增的酶，优选使用在专利文献2中所公开的使用真核生物作为宿主而通过遗传工程学制造的耐热性DNA聚合酶。通过进行不存在除来源于被检样品的核酸以外的细菌核酸污染的PCR，基于来源于污染细菌的核酸的扩增的本底为零或检测限以下，从而能够正确地定量至极微量的致病菌。

(第二PCR用的引物对)

使用通过第一PCR工序得到的扩增产物，利用巢式PCR法进行第二PCR工序。

作为第二PCR工序用的引物对，只要是能够对具有下述内部序列的核酸片段进行扩增的引物对，则可以没有特别限制地利用，所述内部序列为第一PCR工序中的扩增产物的碱基序列的内部序列，且能够用于对目标细菌数进行定量。可以利用已知的引物对、或从细菌的16S rRNA基因的碱基序列选择得到的引物对等。

作为第二PCR工序用的优选的引物对，可列举以下的引物对。

模式1：

区域1正向引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1反向引物：5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′(序列号6)

区域2正向引物：5′-GACTCCTACGGGAGGCA-3′(序列号7)

区域2反向引物：5′-TATTACCGCGGCTGCTG-3′(序列号8)

区域3正向引物：5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(序列号9)

区域3反向引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(序列号10)

区域4正向引物：5′-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3′(序列号11)

区域4反向引物：5′-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′(序列号12)

区域5正向引物：5′-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3′(序列号13)

区域5反向引物：5′-GAGCTGACGACAGCCAT-3′(序列号14)

区域6正向引物：5′-TTGGGTTAAGTCCCGC-3′(序列号15)

区域6反向引物：5′-CGTCATCCCCACCTTC-3′(序列号16)

区域7正向引物：5′-GGCTACACACGTGCTACAAT-3′(序列号17)

区域7反向引物：5′-CCGGGAACGTATTCACC-3′(序列号3)

模式2：

区域1’正向引物：5′-GCAGGCTTAACACATGCAAGTCG-3′(序列号18)

区域1’反向引物：5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′(序列号6)

区域2’正向引物：5′-GTCCAGACTCCTACGGGAG-3′(序列号19)

区域2’反向引物：5′-CCTACGTATTACCGCGG-3′(序列号20)

区域3’正向引物：5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(序列号21)

区域3’反向引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(序列号10)

区域4’正向引物：5′-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3′(序列号11)

区域4’反向引物：5′-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′(序列号12)

区域5’正向引物：5′-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3′(序列号13)

区域5’反向引物：5′-GAGCTGACGACAGCCAT-3′(序列号14)

区域6’正向引物：5′-GTTAAGTCCCGCAACGAG-3′(序列号22)

区域6’反向引物：5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′(序列号23)

区域7’正向引物：5′-GGCTACACACGTGCTACAATGG-3′(序列号24)

区域7’反向引物：5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(序列号4)

可以使用选自由模式1及2组成的组中的至少1个引物对来进行第二PCR工序。需要说明的是，在使用多个引物对的情况下，分别使用它们中的各个引物对来进行第二PCR工序。

(第二PCR工序)

第二PCR工序可以利用已知的方法及装置来进行。

需要说明的是，包含由第一PCR工序得到的扩增产物的反应液可以在得到第二PCR工序中能够用于定量的扩增产物量的基础上根据需要进行稀释。

就稀释率而言，根据第一PCR工序中所得到的反应液的扩增产物的浓度来预估，或者以第二PCR工序中能够得到成为在预先进行的实验中可确保定量性的范围的量的扩增产物的方式来设定。

第二PCR工序也优选在除来源于被检样品的核酸以外极少混入来源于细菌的核酸、或不存在这样的混入的反应体系中进行。利用如专利文献2中所公开那样的已知的方法对PCR用的试剂、器具、酶进行处理，从而可以制备上述反应体系。另外，作为用于核酸扩增的酶，优选使用在专利文献2中所公开的使用真核生物作为宿主通过遗传工程学制造的耐热性DNA聚合酶。通过进行不存在除来源于被检样品的核酸以外的细菌核酸污染的PCR，基于来源于污染细菌的核酸的扩增的本底为零或检测限以下，从而能够正确地定量至极微量的致病菌。

(校准用的数据的制作)

在菌数定量工序中，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，可以求出被检样品中的细菌数。

校准用的数据并无特别限定，可以根据来源于已知细菌的扩增产物的量(其是通过使用与菌种已知的对照细菌的已知细菌数对应的核酸试样进行PCR工序而得到的)与前述已知细菌数的关系来制作。校准用的数据可以单独使用对照细菌的已知细菌数、或分别使用对照细菌的已知的多个不同细菌数来制作。

使用校准曲线作为校准用的数据的情况也没有特别限定，可以根据来源于已知细菌的扩增产物的量(其是通过分别使用与菌种已知的对照细菌的不同的多个已知细菌数对应的多个核酸试样进行PCR工序而得到的)与前述已知的细菌数间的关系制作校准曲线。

可以预先准备校准用的数据，用于菌数定量工序。

为了使由PCR装置的操作状态、操作环境带来的误差最小而进一步提高细菌数的定量精度，优选通过与第一PCR工序及第二PCR工序的一系列操作来进行校准用的数据的制作工序。此时的校准用的数据的制作可以利用以下的工序来进行。

(D)第四PCR工序，使用通过第三PCR工序得到的第三扩增产物，利用巢式PCR法得到第四扩增产物；以及

(E)由对照细菌的已知的菌数和第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序。

需要说明的是，通过在同一PCR装置内同时进行前述第一PCR工序和前述第三PCR工序，并且在同一PCR装置内同时进行前述第二PCR工序和前述第四PCR工序，从而可以效率良好地进行校准用的数据的制作。

在使用校准曲线作为校准用的数据的情况下，可以通过以下的工序(C-1)及(E-1)来进行工序(C)及(E)。

(C-1)第三PCR工序，分别使用与菌种已知的对照细菌的不同的多个已知细菌数对应的多个核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；

(E-1)由前述已知的菌数和前述第四扩增产物的量制作校准曲线的工序。

作为用于制作校准曲线的用作第三PCR工序的模板的多种核酸试样，可以使用从各个以不同的已知菌数包含对照细菌的多个试样提取核酸而得到的试样。或者，也可以将从以已知菌数包含对照细菌的试样中提取核酸而得到的核酸试样稀释成规定浓度，制备与多个不同的已知菌数对应的多个核酸试样，将所得到的各核酸试样分别独立地用于第三PCR工序。

对照细菌只要是能够制作目标校准曲线的对照细菌，就没有特别限定。可以考虑操作性、与其他菌种的互换性等来选择对照细菌。从这样的观点考虑，可优选利用大肠杆菌作为对照细菌。

在校准曲线的制作中使用的引物组优选根据第一PCR工序、第二PCR工序、后述的被检样品中的细菌的细菌菌种的鉴定中使用PCR法时与引物组的关系进行选择。例如可以将第一PCR工序中使用的引物组用于工序(C)、将第二PCR工序中使用的引物组(在使用多个引物组的情况下，为其中的至少1者)用于工序(D)。在后述的被检样品中的细菌的细菌菌种的鉴定中利用第一PCR工序中的扩增产物的情况下，也同样可以将第二PCR工序中使用的引物组(在使用多个引物组的情况下，为其中的至少1者)用于工序(D)。

(细菌数的计算)

在细菌数定量工序中，可以使用校准曲线等校准用数据由第二PCR工序中所得到的扩增产物的量求出被检样品中的细菌数。可以利用该细菌数作为被检样品中的细菌数。

需要说明的是，在本发明涉及的第二定量方法中，利用细菌数定量工序中所得到的细菌数作为暂定求出的暂定细菌数。

以下，对本发明涉及的第二定量方法中的菌种鉴定工序及细菌数校正工序进行说明。需要说明的是，可以在本发明涉及的第一定量方法中追加菌种鉴定工序。在该情况下，可以利用第一定量方法中的第一PCR工序及第二PCR工序来进行被检样品中的细菌的鉴定。

(细菌菌种鉴定用引物)

在本发明涉及的第二定量方法中，使用通过第一PCR工序得到的扩增产物，进行被检样品中的细菌的细菌菌种的鉴定。

在细菌菌种的鉴定中，在后述的Tm mapping法中使用模式1的引物组的情况下，优选使用以下的引物组。

·第一PCR工序(与Tm mapping法的模式1的第一PCR工序的引物组相同)

将区域1正向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。区域7反向引物直接使用以下的1种。关于第一PCR的患者被检样品，对每1个被检样品用1管进行，就定量对照而言，至少1个浓度用1管进行，更优选对3个浓度用3管进行，阴性对照用1管进行。

区域1正向引物1a：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1正向引物1b：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列号2)

区域7反向引物：5′-CCGGGAACGTATTCACC-3′(序列号3)

·第二PCR工序(巢式PCR)：

使用以下的区域3正向引物和区域3反向引物。关于第二巢式PCR中的定量，对每1个被检样品用1管进行，就定量对照而言，至少1个浓度用1管进行，更优选对3个浓度用3管进行，阴性对照用1管进行。其中，在患者被检样品中，将Tm mapping法施行时的区域3正向&反向引物中的扩增结果直接用于定量测定(在定量用途中无需使用新的管进行PCR)。

区域3正向引物：5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(序列号9)

区域3反向引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(序列号10)

当在细菌菌种的鉴定中采用使用模式2的引物组的Tm mapping法的情况下，优选使用以下的引物组。

·第一PCR工序(与Tm mapping法的模式2的第一PCR工序的引物组相同)

将以下的区域1’正向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。同样地将区域7’反向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。对每1个第一PCR的被检样品用1管进行，就定量对照而言，至少1个浓度用1管进行，更优选对3个浓度用3管进行，阴性对照用1管进行。

区域1’正向引物1a：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1’正向引物1b：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列号2)

区域7’反向引物1a：5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(序列号4)

区域7’反向引物1b：5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(序列号5)

·第二PCR工序(巢式PCR)：

使用区域3’正向引物和区域3’反向引物。关于第二巢式PCR中的定量，对每1个被检样品用1管进行，就定量对照而言，至少1个浓度用1管进行，更优选对3个浓度用3管进行，阴性对照用1管进行。其中，在被检样品中，将Tm mapping法施行时的区域3’正向&反向引物中的扩增结果直接用于定量测定(在定量用途中无需使用新的管进行PCR)。

区域3’正向引物：5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(序列号9)

区域3’反向引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(序列号10)

需要说明的是，上述的各PCR工序中的定量对照的数量并无特别限定，可以为1个，也可以使用用于2个以上不同浓度的定量对照的多个管。

(被检样品中的细菌菌种的鉴定)

在细菌菌种的鉴定中，可以利用专利文献1～3中所公开的方法等已知的方法。

例如可以使用检测对于细菌菌种有无特异性的扩增产物来鉴定细菌菌种的方法。在对于该细菌菌种有无特异性的扩增产物的检测中，可以利用以下的方法。

·通过使用具有检测用的荧光标识的嵌入剂(intercalator)、探针的实时PCR来确认有无扩增产物的方法。

·通过使用具有检测用的荧光标识的嵌入剂、探针的实时PCR来测定扩增产物的Tm值的方法。

·利用在凝胶等上的电泳将扩增产物展开、可视化的扩增产物的分析方法。

·通过解读扩增产物的碱基序列进行的扩增产物的分析方法。

·用质谱仪测定扩增产物的分子量的分析方法。

进而，也可以使用多个引物对进行PCR、并使用所得到的多个扩增产物的Tm值来鉴定细菌菌种。

作为使用该多个引物对的方法，可优选采用在第二PCR工序中所列举的使用模式1及模式2的引物组的巢式PCR法。

优选的是：将区域1～7的正向及反向引物组、或者区域1’～7’的正向及反向引物组分别用1管(对每1个被检样品共计用7管)进行PCR，使用所得到的7个Tm值，用专利文献1中记载的Tm mapping法迅速鉴定致病菌。

基于Tm mapping法的细菌菌种的鉴定可以依照例如专利文献1、专利文献2的段落[0237]或专利文献3的段落[0111]～[0116]中公开的方法、或者适当改变它们中公开的方法来进行。在基于Tm mapping法的细菌菌种的鉴定中，与利用由菌种已知的细菌得到的多个特定的引物对所扩增的多个扩增产物的Tm值的组合、或多个Tm值间的差值的组合有关的鉴定用数据可以被使用。将由从被检样品收集的未知的菌体试样利用相同的多个引物对得到的扩增产物的Tm值的组合、或Tm值间的差值的组合与鉴定用数据库进行对照，判断其一致性，从而进行被检样品中的未知细菌的鉴定。

以下示出鉴定方法的具体例之一。

＜鉴定方法＞

为了对检测细菌进行鉴定，可以利用使用本发明涉及的引物组由检测细菌得到的DNA片段的Tm值。尤其是，可以使用认为可能在被检样品包含的多个或大量的细菌的16SrRNA或16S rDNA，利用与本法完全或部分相同的方法，预先取得DNA片段及其Tm值，将它们的Tm值或后述的“Tm值的相对值”作为比较数据或数据库，鉴定被检样品中的菌种不明的细菌。作为用于进行鉴定的算法(algorithm)，可附加以下工序：不仅利用上述的Tm值本身的组合，而且还利用各Tm值间的差值的组合而进行鉴定，由此，可使测定误差(例如仪器的每次试行而导致的测定误差)的影响成为最低限度。

作为校正上述的仪器的每次试行而导致的测定误差的方法，可算出“Tm值的组合的平均值”，利用由该平均值得到的各Tm值的“相对值的组合”。即，将Tm值的组合的布局作为“形”而进行鉴定的方法。以2维示出Tm值的组合的布局的“形”不受测定误差影响。例如，将对检测细菌具有特异性的Tm值的组合(n个(n为例如4以上且7以下的整数))记为T1db～Tndb(db为database)，将由其平均值得到的相对值分别记为d1db～dndb。同样地，将从被检样品得到的未知的检测对象生物的Tm值的组合(n个(n为例如4以上且7以下的整数))记为T1ref～Tnref(ref为reference)，将由其平均值得到的相对值分别记为d1ref～dnref。这样，与database进行比较，将“与相对值的组合近似＝Tm值的组合的布局的“形”接近”作为鉴定算法而进行利用。

作为具体的计算方法，可列举例如算出欧几里得空间上的2点间距离的方法(式1)，但不限于此。

[数学式1]

[式1]

在基于式1的计算方法的情况下，将通过该计算式得到的Dist.值最接近0(零)的菌种鉴定为所寻求的检测细菌菌种。但是，由于所使用的PCR仪器的测定误差，也受仪器的温度控制规范、引物的数量的影响，Dist.值的允许范围为0～0.37、优选为0～0.30。

以上的算法可在计算机上以数据库型鉴定软件的形式利用。

＜可鉴定的细菌菌种＞

对于可鉴定的微生物而言，只要是在分类上属于细菌的微生物，则理论上就可以进行检测及细菌菌种的鉴定。

引物对的数量、引物对的碱基序列可以根据细菌菌种的检测范围等进行选择。

需要说明的是，作为巢式PCR中使用的核酸试样，将第一PCR工序中得到的扩增产物根据需要稀释而使用。作为此时的引物组，优选使用作为第一PCR工序用而列举的模式1的引物组与在第二PCR工序中所列举的模式1的引物组的组合、以及作为第一PCR工序用途而列举的模式2的引物组与第二PCR工序中所列举的模式2的引物组的组合。

(暂定细菌数的校正)

在利用本发明涉及的第一定量方法对败血症的血液被检样品等被检样品中微量含有的致病菌的菌数进行分析的情况下，用细菌通用PCR对致病菌进行定量，结果是按定量对照的细菌菌种计的换算值，有时与致病菌本身的真正菌数不同。

在本发明涉及的第二定量方法中，根据被检样品中的细菌的鉴定结果，被检样品中的细菌与对照细菌为同种细菌的情况下，暂时将得到的暂定细菌数确定为定量结果。另一方面，根据被检样品中的细菌的鉴定结果，被检样品中的细菌与对照细菌为异种细菌的情况下，将利用所鉴定的细菌的16S核糖体RNA操纵子拷贝数与对照细菌的16S核糖体RNA操纵子拷贝数的比、对暂定菌数进行了校正而得的细菌数确定为定量结果。

(鉴定及定量用试剂盒)

可以使用上述的引物组的至少1个和Tm mapping法的鉴定中使用的数据库、未混入细菌DNA的耐热性DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照等，制作用于定量被检样品中的细菌的试剂盒、或者用于鉴定及定量被检样品中的细菌的试剂盒。

(有无污染的判定方法)

在进行血液被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌的鉴定这两者的情况下，若因被检样品的取样而在第一PCR工序或第二PCR工序的期间混入来源于被检样品以外的细菌，则有时目标细菌数的定量、或包含假阳性的结果的细菌的鉴定精度降低。为此，通过预先确认有无这样的来源于被检样品以外的细菌对PCR用的样品的污染，从而可以进一步提高目标细菌数的定量、细菌的鉴定结果的可靠性。

本发明涉及的有无污染的判定方法的特征在于，包括下述工序：

工序(1)，将血液被检样品进行离心分离，分离成红细胞级分、血沉棕黄层级分及血浆级分后，制作包含上清的血浆级分和血沉棕黄层的试样A、以及包含上清的血浆级分而不包含血沉棕黄层的试样B；

工序(2)，利用具有以下的工序(2-1)、(2-2)及(2-3)的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，对前述试样A和前述试样B的各自的细菌数进行定量；以及

工序(3)，通过比较前述试样A的细菌数和前述试样B的细菌数，从而判定前述血液试样中有无细菌污染。

工序(2-1)～(2-3)可以使用本发明涉及的第一定量方法来进行。

对细菌数进行定量的工序(b)还可以具有以下的工序(2-4)及(2-5)。

工序(2-1)～工序(2-5)可以使用本发明涉及的第二定量方法来进行。

利用血液样品的离心分离，根据血液中所含的成分的比重而能够从下层向上层依次分离成红细胞级分、血沉棕黄层(白细胞)级分、血浆级分。

通过对由只有血浆级分的样品(无血沉棕黄层)与包含血浆级分和血沉棕黄层的样品(有血沉棕黄层)利用本发明涉及的定量方法得到的细菌数进行比较，从而可以判定在血液样品中有无混入来源于被检样品以外的细菌。

有血沉棕黄层时，包含在患者体内吞噬了致病菌的白细胞，无血沉棕黄层时，仅为不包含吞噬后的白细胞的血浆。在患者中及患者被检样品中未实际发生感染而检测到来源于采血时的皮肤常在菌、作业环境、器具上的污染的细菌DNA的情况下，这些细菌未被白细胞吞噬而不存在由有无血沉棕黄层所致的菌数差。另一方面，如果成为检测菌的细菌是致病菌，则在患者血中被白细胞吞噬，菌数必然是有血沉棕黄层的一方明显多于比无血沉棕黄层的一方。即，能够进行下述判定。

首先，在血液被检样品中不存在细菌的情况下，在无血沉棕黄层和有血沉棕黄层中的任何样品中均不能测定细菌数。

在血液被检样品中不存在细菌的情况下，来源于被检样品以外的细菌混入到血液样品时，所混入的细菌未被白细胞吞噬，不存在由有无血沉棕黄层所致的菌数差。所谓不存在菌数差，成为发生了来源于被检样品以外的细菌的污染的指标，表示此时所鉴定的细菌是致病菌的可靠性低，并且其菌数反映了实际的血液中的菌数的可靠性也低。

在来源于感染发病后的患者的血液、在血液被检样品中存在细菌的情况下，来源于被检样品以外的细菌未混入于血液样品时，就从无血沉棕黄层和有血沉棕黄层得到的细菌数而言，有血沉棕黄层的一方变多。由于存在菌数差，从而表示所得到的细菌数的结果反映实际的血液中的菌数的可靠性高，并且此时所鉴定的细菌也是致病菌的可靠性高。

在来源于感染发病后的患者的血液、并且在血液被检样品中存在细菌的情况下，在来源于被检样品以外的细菌混入于血液样品时，因混入而使从无血沉棕黄层和有血沉棕黄层得到的表观细菌数增加。尤其是，仅在无血沉棕黄层的样品的处理中发生了来源于被检样品以外的细菌的混入的情况下，它们的差变小。血液中的来源于感染的菌量非常少的情况下、或所混入的细菌量非常多的情况下，从无血沉棕黄层和有血沉棕黄层得到的细菌数之差变小。另一方面，来源于感染的菌量非常多的情况下、或所混入的细菌量为极微量的情况下，从无血沉棕黄层和有血沉棕黄层得到的细菌数之差变大。如此，利用细菌数之差的大小，可以判定来源于被检样品以外的细菌混入到血液样品中的可能性，可以如下进行判定：得到充分的细菌数之差时，结果的可靠性高，菌数差小时，结果的可靠性低。

在判定有无污染的工序(c)中，考虑到因在原本不包含细菌的被检样品中发生了来源于使用器具、作业环境的污染的情况、实时PCR中的定量值的误差等，能够检测何种程度的菌数，即考虑到实际的测定作业中误差的范围，从而优选从无血沉棕黄层和有血沉棕黄层的菌数之差判定有无污染。作为该误差范围，优选的是：如后述的实施例3所示，在本领域技术人员的常识的范围内多次实施将实际的使用器具、在作业环境下无污染的灭菌水等视为被检样品的阴性对照试验，求出其范围。在完全不发生污染、也无实时PCR的误差的理想的环境下，误差范围为±0个菌/ml，实施例3记载的±100个菌/ml为一定的参考值。

需要说明的是，在判定有无污染的工序中，将在各试验区中的实时PCR的结果以基于由定量对照的结果得到的校准曲线而数值化的菌数进行比较，除此以外，还可以以在实时PCR中得到的Ct值(Threshold cycle)进行比较。

根据本发明涉及的方法，与以往的生物化学的性状检查法相比，能够高精度地定量被检样品中的细菌。

进而，与一般需要采血后2天左右时间的以往的生物化学性状检查法相比，还能够进行采血后3.5小时左右等的迅速定量。

在以往的生物化学性状检查法中，还存在根据细菌菌种的水平而无法鉴定的情况、为特殊的细菌菌种时无法培养的情况，根据本发明涉及的方法，只要是16S rRNA的基因序列已经被登记在数据库中的菌种、并且是16S rRNA操纵子拷贝数已知的细菌，就能够进行定量。

进而，关于阴性的判定时间，在以往的生物化学性状检查法中，一般也需要1周左右的时间，而在本发明涉及的方法中，还能够实现采血后3.5小时左右等的迅速确定。

进而，对于被检样品中的细菌数成为感染症重症度的新指标的情况、被检样品中的细菌数的经时性变化成为治疗效果的新指标的情况、菌数无限接近零而成为停止抗菌药时的指标的情况、败血症的定义变成以菌数作为指标的情况，利用本发明能够提供极有用的被检样品中的细菌的定量技术。

进而，即使在进行被检样品中的细菌数的定量的同时进行被检样品中的细菌菌种的鉴定的情况下，也能得到与上述同样的效果。

实施例

以下，利用实施例进一步地说明本发明。需要说明的是，在没有特别记载的情况下，使用已知的试剂、已知的器具、市售的PCR装置，利用各种常规方法进行PCR及各种处理。

(实施例1)

图1示出本实施例中的各步骤的关系和流程。

(步骤1：不产生由菌种带来的差异的集菌及DNA提取方法)

首先，在来自血液被检样品的集菌中，将全血进行100×g、5分钟的轻度离心，分离血细胞后，利用20,000×g、10分钟的强离心将所得到的上清(包含血沉棕黄层)颗粒化而进行集菌。在该工序中，血浆中的菌的分级分离未发生变化，未产生由菌种带来的集菌效率的差异。

为了对此进行确认，在生理盐水中分别溶解大肠杆菌(E.coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC29213)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae NBRC3512)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC27853)，进行100×g、5分钟的轻度离心后，分别将离心管中的包含菌体的液体的上半部(upper half)和下半部(lower half)接种到培养基中，测定了CFU。

需要说明的是，上述的大肠杆菌(E.coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S.aureusATCC29213)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC27853)可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture.Collection：10801University Boulevard,Manassas(VA),20110-2209USA)获得，另外，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae NBRC3512)可以从独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)生物资源中心(NBRC)(地址：〒292-0818、千叶县木更津市上总镶足2-5-8)获得。

将其结果示于图2。根据该结果，离心后的上半部和下半部的菌数未观察到变化。即，在上述的离心条件下不存在由这些菌种带来的集菌效率的差异。

另外，在DNA提取中，对经集菌的细菌利用蛋白酶处理和采用珠的物理破碎将细菌壁进行彻底地破碎，以便不会因菌种而出现DNA提取效率的差异。

(步骤2：使用无细菌DNA污染的耐热性DNA聚合酶、能够高灵敏度且正确定量的巢式PCR的施行)

将利用步骤1的方法从血液被检样品得到的致病菌DNA作为PCR的模板，在1stPCR：30个循环→100倍稀释→2nd PCR：30～35个循环的条件下施行巢式PCR。患者被检样品中的致病菌数广泛分布在极微量至大量的范围，难以用1次的PCR正确地定量，因此将巢式PCR法组合。其中，在用巢式PCR进行定量的情况下，优选以在1st PCR中基因扩增未达到平台期的条件进行巢式PCR，例如将1st PCR按照以下的条件进行30个循环来进行巢式PCR。

图3是表示采用通常的实时PCR法(conventional PCR method)的定量性(用□来表示)与采用本发明涉及的巢式PCR法(巢式PCR method)的定量性(用○来表示)的比较的图表。

作为参考，记载具体的实施条件。

在进行巢式PCR时，以下述所示的反应液组成1于95℃进行5分钟加热后，将94℃10秒、57℃或62℃10秒、72℃30秒、82℃2秒重复30次(1^st PCR)。

＜反应液组成1＞

模板2μL

10×Buffer for rTaq、或10×Thunder Taq buffer 2μL

25mM MgCl₂ 1.6～1.8μL

酵母生产Taq DNA聚合酶1Unit

2mM CleanAmp-dNTP 2μL

EvaGreen 1μL

10μM区域1正向引物1a、1b各按等量计，0.8～1.2μL

10μM区域7反向引物0.6～1.2μL(在模式2的情况下，区域7反向引物1a和1b各按等量计，1.2μL)

灭菌水适量

总计20μL

在PCR结束后回收反应液，用无DNA的超纯水稀释100倍。将该稀释后的溶液作为模板，以下述所示的反应液组成2进行反应(2^nd PCR)。关于PCR的方法，在于95℃进行5分钟的加热后，将94℃10秒、57℃10秒、72℃10秒、82℃10秒重复35次。需要说明的是，本工序中使用的正向引物、反向引物为之前记载的第二PCR工序用的模式1，区域1～7各自的正向引物、反向引物作为引物对而使用。

＜反应液组成2＞

模板10μL

10×Thunder Taq buffer 2μL

25mM MgCl₂ 2μL

酵母生产Taq DNA聚合酶1Unit

2mM CleanAmp-dNTP或通常的dNTP 2μL

EvaGreen 1μL

10μM正向引物0.6μL

10μM反向引物0.6μL

灭菌水适量

总计20μL

需要说明的是，作为通常的实时PCR法，不进行前述1^st PCR，在与前述2^nd PCR同样的条件下将重复次数延长至60次而进行反应。另外，将其中定量性高的区域3的引物对的结果作为比较示于图3中。

通常的实时PCR中，无法进行低浓度区域的定量，但是，通过以在1^st PCR中基因扩增未达到平台期的循环数进行巢式PCR，从而直至低浓度区域校准曲线也显示线性，能够进行高灵敏度且正确的致病菌的定量及鉴定。关于本法中的定量性，确认到在每个PCR管中以E.coli计可确保至1～40万个。

在图3的用□表示的大肠杆菌浓度与PCR循环数的阈值的关系中，在10个/ml以下的低浓度区域中，丧失了它们的关系的线性，由该结果可知，在以往的PCR法中无法确保低浓度区域中的定量性。

另外，使用按照专利文献2制备的真核生物生产耐热性DNA聚合酶(eukaryote-made Taq DNA polymerase)，实施无细菌DNA污染的细菌通用PCR。由此，基于细菌污染的本底变为零，能够正确地定量直至极微量的致病菌(在无菌的情况，可以说为零)。为了对此进行确认，使用细菌通用引物、在有无作为模板的大肠杆菌DNA的条件下进行PCR后，使PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳。其结果，在市售品的耐热性DNA合成酶中确认到细菌DNA的残留，但是在真核生物制的Taq DNA聚合酶(其是以酵母或植物细胞作为宿主而制作的)中完全未确认到细菌DNA(图4)。

(步骤3：利用Tm mapping法的致病菌迅速鉴定(与步骤4同时进行))

将步骤1中得到的DNA作为模板，在步骤2的PCR条件下利用Tm mapping法进行致病菌的鉴定。

以下示出该Tm mapping法中的各引物的布局图(图5)及本例中使用的引物序列。

本例中使用的引物序列

·1st PCR：

将以下的区域1’正向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。

同样地，将区域7’反向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。

关于1st PCR，对每1个被检样品，用1管进行。

区域1’正向引物1a：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1’正向引物1b：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列号2)

区域7’反向引物1a：5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(序列号4)

区域7’反向引物1b：5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(序列号5)

·2nd(巢式)PCR：

将以下的区域1’～7’的正向及反向引物组分别用1管(对每1个被检样品，共计为7管)进行PCR，得到7个Tm值。然后，用Tm mapping法迅速鉴定致病菌。

区域1’正向引物：5′-GCAGGCTTAACACATGCAAGTCG-3′(序列号18)

区域1’反向引物：5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′(序列号6)

区域2’正向引物：5′-GTCCAGACTCCTACGGGAG-3′(序列号19)

区域2’反向引物：5′-CCTACGTATTACCGCGG-3′(序列号20)区域3’正向引物：5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(序列号21)

区域3’反向引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(序列号10)

区域4’正向引物：5′-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3′(序列号11)

区域4’反向引物：5′-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′(序列号12)

区域5’正向引物：5′-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3′(序列号13)

区域5’反向引物：5′-GAGCTGACGACAGCCAT-3′(序列号14)

区域6’正向引物：5′-GTTAAGTCCCGCAACGAG-3′(序列号22)

区域6’反向引物：5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′(序列号23)

区域7’正向引物：5′-GGCTACACACGTGCTACAATGG-3′(序列号24)

区域7’反向引物：5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(序列号4)

(步骤4：不产生由菌种带来的差异的致病菌的定量方法(与步骤3同时进行))

出于绘制定量用的校准曲线的目的，使用从菌数已知的细菌中提取的DNA，制作3个不同DNA浓度的稀释系列，作为定量对照。以下示出定量对照的制作法。

(A)从预先已知菌数的菌制作DNA提取液

(1)将E.coli ATCC25922株散布于普通琼脂培养基后，用孵育器培养12小时。

(2)使用生理盐水，制作悬浮液(McFarland 0.5)。

(3)进一步稀释1000倍，使用BD细胞活力检测试剂盒、BD FACS Canto II，对菌数进行计数。

(4)共测定3次，将其平均值作为菌数(140605个/ml)。

(5)从上述的稀释液100μl(14061个)中提取DNA，最终制作AVE(QIAGEN公司DNA提取试剂盒的DNA提取液)100μl的DNA提取液(140个/μl)。

(B)大量地制作定量对照用的DNA提取液

(2)使用生理盐水，制作悬浮液(McFarland 0.5)。

(3)从上述悬浮液1ml中提取DNA，最终制作AVE 100μl的DNA提取液。

(C)使用来自预先已知菌数的菌的DNA提取液，对项目(B)的大量的DNA提取液的菌数进行校正

(1)将项目(B)中制作的DNA提取液用AVE进行稀释。对于稀释后的稀释液，用项目(A)的校准曲线对菌数进行计数。

(2)然后，最终大量地制作5000个/μl的DNA提取液。

(3)将DNA提取液15μl细分于1.5ml管，于-80℃进行保存。

(4)在定量检查中使用时，将所细分的DNA提取液用AVE稀释10倍、100倍、1000倍而使用。其结果，成为500个/μl(1000个/PCR管)、50个/μl(100个/PCR管)、5个/μl(10个/PCR管)的DNA提取液，用这3个浓度绘制校准曲线。

接着，将步骤1的致病菌DNA作为模板，在步骤2的PCR条件下与定量对照一起进行巢式PCR。定量的1st PCR、2nd PCR使用以下的细菌通用引物(检测几乎所有细菌的引物)。细菌通用引物的靶标区域是16S核糖体RNA基因的细菌保守区域(在几乎所有细菌中通用的碱基序列区域)。如果对特定的菌进行定量，则只要使用菌种特异的引物就能进行定量，但是，在败血症早期，不会预先判明致病菌，从而无法使用菌种特异的引物。因此，只有使用细菌通用引物，才能检测未鉴定的菌。

但是，在引物与靶标区域之间只要有1个碱基的错配，就会对定量结果产生影响(测定成偏少)。细菌保守区域并不一定在所有细菌中碱基序列完全一致，例如有时存在1个碱基不同的2个保守序列等。在该情况下，若使用与任一个序列完全一致的引物，则在有1个碱基错配的细菌中，定量结果测定成偏少。为了解决该问题，在本发明中，通过等量混合与1个碱基不同的序列分别完全一致的引物，从而能够正确地对两者进行定量。以下，示出通过等量混合与各自完全一致的2种引物而能够正确定量两者的实验结果(图6)。

·图6的实验的说明：

关于细菌的16S核糖体RNA基因的细菌保守区域，例如在Tm mapping法使用模式1的引物组的情况下，1st PCR正向引物的靶序列在全部菌种中主要分成有1个碱基不同的AGAGTTTGATCATGGCTCAG(序列号1)或者AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(序列号2)的2种。

为此，我们使用以下的3种1st PCR正向引物(反向引物为通用)，将E.coli(正向引物的靶序列：AGAGTTTGATCATGGCTCAG：序列号1)作为模板，制作稀释系列，从而制作标准曲线。

·E.coli无错配的1st PCR正向引物(AGAGTTTGATCATGGCTCAG：序列号1)

·E.coli一个错配的1st PCR正向引物(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG：序列号2)

·上述两种1^st PCR正向引物的混合物(无错配：一个错配＝1：1)

其结果为：在使用一个错配的1^st PCR正向引物的PCR中，与使用无错配的1st PCR正向引物的情况相比，定量结果减少至约75％左右。但是，在两种1st PCR正向引物的混合物(无错配：一个错配＝1：1)的情况下，定量结果与无错配的1^st PCR正向引物几乎未变化。

即，如果是两种1st PCR正向引物(无错配：一个错配＝1：1)的混合物，则在AGAGTTTGATCATGGCTCAG(序列号1)或者AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(序列号2)的任一序列的情况下，均显示两者能够同等、正确地定量。

以下示出本例中使用的定量用的PCR引物组。

·1st PCR；

将以下的区域1’正向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。

同样地，将区域7’反向引物1a和1b按1：1等量混合而使用。

区域1’正向引物1a：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(序列号1)

区域1’正向引物1b：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列号2)

区域7’反向引物1a：5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(序列号4)

区域7’反向引物1b：5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(序列号5)

·2nd(巢式)PCR；

使用以下的区域3’正向引物和区域3’反向引物。

区域3’正向引物：5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(序列号21)

区域3’反向引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(序列号10)

以上，使用菌数已知的3个浓度的E.coli DNA作为定量对照，用定量对照的3个浓度绘制校准曲线，对从患者被检样品中提取的细菌DNA的致病菌数进行定量。菌数以按照作为定量对照所使用的E.coli的菌数换算而得的值的形式得到，从而能够更简便、迅速且精度良好地对该被检样品中的细菌数进行定量。

以上的步骤1～步骤4是本发明涉及的第一定量方法的一个实施例。

(步骤5：基于使用了致病菌迅速鉴定结果的16S核糖体RNA操纵子拷贝数进行的菌数的校正)

以上，按步骤4中作为定量对照所使用的E.coli的菌数算出了定量结果。定量中的靶基因是16S核糖体RNA基因，如表1中所例示的细菌基因组中的16S核糖体RNA操纵子拷贝数的多样性，根据菌种不同而16S核糖体RNA基因的操纵子拷贝数也不同，因此，E.coli的换算值并不表示其他菌种的菌数。

[表1]

细菌菌种名	16S rRNA操纵子拷贝数
		蜡样芽胞杆菌	13
艰难梭状芽孢杆菌	12
		嗜水气单胞菌	10
产气荚膜梭菌	10
		产气肠杆菌	8
阴沟肠杆菌	8
		肺炎克氏杆菌	8
普通拟杆菌	7
		大肠杆菌	7
无乳链球菌	7
		脆弱拟杆菌	6
屎肠球菌	6
		吉氏拟杆菌	5
金黄色葡萄球菌	5
		表皮葡萄球菌	5
溶血葡萄球菌	5
		路邓葡萄球菌	5
停乳链球菌	5
		粪肠球菌	4
嗜酸乳杆菌	4
		卷曲乳杆菌	4
大消化链球菌	4
		普氏消化链球菌	4
铜绿假单胞菌	4
		缓症链球菌	4
迟缓真杆菌	3
		空肠弯曲菌	3
疮疱丙酸杆菌	3
		醋酸钙不动杆菌	2
阴道加德纳氏菌	2
		微小脲原体	2
解脲支原体	2
		人型支原体	2
生殖道支原体	1
		肺炎支原体	1

因此，更正确的菌的定量需要对每个菌种用操纵子拷贝数进行校正。由于步骤3及步骤4中同时进行致病菌的鉴定和定量，因此可以用所鉴定的致病菌的16S核糖体RNA操纵子拷贝数对菌数进行校正而算出正确的菌数。

例如，以大肠杆菌作为对照细菌制作校准曲线，在从被检样品中鉴定出的细菌为蜡样芽胞杆菌的情况下，根据所校正的细菌数＝暂定细菌数×(7/13)的计算式，对细菌数进行校正。

以上的步骤1～步骤5是本发明涉及的第二定量方法的一个实施例。

(实施例2)

利用实施例1的步骤1～步骤4，使用败血症患者被检样品(EDTA采血管2mL)进行了致病菌迅速定量检查。病例是在富山大学附属医院怀疑败血症、之后血液培养检查呈阳性的3个病例。采血在抗菌药治疗前(pretreatment)、抗菌药施予后24小时(after24hrs.)及抗菌药施予后72小时(after 72hrs.)进行，在这3个时间点进行致病菌迅速定量检查的同时，还测定了体温、白细胞数、CRP、Presepsin、IL-6。另外，用在抗菌药治疗前进行采血得到的被检样品进行了基于血液培养法的致病菌的鉴定和药物敏感性试验。各病例的概况如下。

病例1：

·76岁女性，伴随有尿路感染的败血症

·血液培养·尿培养：大肠杆菌

·抗生素：美罗培南(Meropenem)(有敏感性)

病例2：

·88岁女性，伴随有胰腺癌晚期并发的梗阻性胆管炎的败血症

·血液培养：产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)

·抗生素：头孢吡肟(Cefepime)(产酸克雷伯菌和流感嗜血杆菌具有敏感性。肺炎链球菌是中间型。)

病例3：

·94岁女性，伴随有尿路感染的败血症

·血液培养·尿培养：大肠杆菌

·抗生素：他唑巴坦/哌拉西林(具有敏感性)

将各病例的检查结果示于表2～4及图7～图9。需要说明的是，图7～9中的符号表示以下的各测定项目，将各图所示的“○”的位置的测定值示于各表中。

a：病原体：利用本发明涉及的方法测得的致病菌的菌数

b：WBC：白细胞数[×100/μL]

c：CRP：C-反应蛋白[mg/L]

d：BT：体温(body temp.)[℃]

e：Presepsin[ng/mL]

f：IL-6：白介素-6[pg/mL]

[表2]

表2(病例1)

[表3]

表3(病例2)

[表4]

表4(病例3)

(实施例3)

利用实施例1的步骤1～步骤5，使用败血症患者被检样品(EDTA采血管2mL)进行了致病菌迅速鉴定·定量检查。病例是在富山大学附属医院怀疑败血症、之后血液培养检查呈阳性的4个病例。采血在抗菌药治疗前(pretreatment)、抗菌药施予后24小时(after24hrs.)及抗菌药施予后72小时(after 72hrs.)进行，在这3个时间点进行致病菌迅速鉴定·定量检查的同时，还测定了体温、白细胞数、CRP、Presepsin、IL-6。另外，在抗菌药治疗前进行采血得到的被检样品进行了基于血液培养法的致病菌的鉴定和药物敏感性试验。各病例的概况如下。

病例4：

·76岁女性，伴随有尿路感染的败血症

·Tm mapping法：大肠杆菌(Dist.值＝0.29)

·血液培养·尿培养：大肠杆菌

·抗生素：美罗培南(有敏感性)

病例5：

·94岁女性，伴随有与尿路感染的败血症

·Tm mapping法：大肠杆菌(Dist.值＝0.19)

·血液培养·尿培养：大肠杆菌

·抗生素：他唑巴坦/哌拉西林(有敏感性)

病例6：

·84岁女性，伴随有腰椎前路固定术后创伤部感染的败血症

·Tm mapping法：停乳链球菌(Dist.值＝0.28)

·血液培养：停乳链球菌

·抗生素：他唑巴坦/哌拉西林(敏感性无判定基准)

病例7：

·81岁女性，伴随有与尿路感染的败血症

·Tm mapping法：产气肠杆菌(Dist.值＝0.48)

·血液培养·尿培养：产气肠杆菌(2种突变菌株)

·抗生素：他唑巴坦/哌拉西林(有敏感性)

将各病例的检查结果示于表5～8及图10～图13。需要说明的是，图7～10中的符号表示以下的各测定项目，将各图所示的“○”的位置的测定值示于各表。

a：病原体：利用本发明涉及的方法测得的致病菌的菌数

b：WBC：白细胞数[×100/μL]

c：CRP：C-反应蛋白[mg/L]

d：BT：体温(body temp.)[℃]

e：Presepsin[ng/mL]

f：IL-6：白介素-6[pg/mL]

[表5]

表5(病例4)

[表6]

表6(病例5)

[表7]

表7(病例6)

[表8]

表8(病例7)

(实施例4)

利用实施例1的步骤1～步骤4，使用怀疑患败血症的患者血液被检样品、2根EDTA采血管2mL进行了致病菌迅速鉴定·定量检查。其中，对于已采血的2根中的1根，对全血进行100×g、5分钟的离心，分离血细胞后，将所得到的上清连同血沉棕黄层进行回收，将其用涡旋混合器均匀混合，从其中回收500μL，通过20,000×g、10分钟的离心对回收液进行颗粒化，进行了集菌的操作。对于2根中的另1根，如上所述，分离血细胞后，将所得到的上清以不包含血沉棕黄层的方式回收500μL，将其通过20,000×g、10分钟的强离心而颗粒化，进行了集菌的操作。

有血沉棕黄层时，包含吞噬后的白细胞，无血沉棕黄层时，仅为不包含吞噬后的白细胞的血浆。实际上，在患者中及患者被检样品中未发生感染、而检测到来源于采血时的皮肤常在菌、作业环境、器具上的污染的细菌DNA的情况下，这些细菌未被白细胞吞噬，不存在由有无血沉棕黄层所致的菌数差。另一方面，如果成为检测菌的细菌是致病菌，则在患者血中被白细胞吞噬，菌数必然是有血沉棕黄层的一方明显多于比无血沉棕黄层的一方。

将从各被检样品得到的结果的一例示于表9～13。

[表9]

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

表9及10的被检样品中的结果为，有血沉棕黄层的细菌数多、并且大大多于无血沉棕黄层的细菌数。由此可以判定，利用Tm Mapping鉴定出的细菌以非常高的概率为致病菌。另外，对于这些被检样品，即使在与采用本方法的细菌鉴定·定量同时实施的血液培养中，也明显检测为相同的细菌或细菌菌种。

就表11的被检样品而言，有血沉棕黄层的细菌数多，预计已感染。但是，与表9及表10相比，有无血沉棕黄层的菌数差小，猜测在有血沉棕黄层的试验区中发生了偶然污染或产生了定量的误差。

为此，将灭菌水看作样品，向采血管的取样后经过实施例1的步骤1～步骤4的操作，实施了多次相当于阴性对照的样品内的菌数定量。其结果可知：有时在我们的试验环境下，以大肠杆菌换算计相当于100个菌/ml的数字并非来源于原来的被检样品，但却被检测到。

即，即使在患者被检样品内不存在病原菌，也可能从有血沉棕黄层或无血沉棕黄层的样品各自得到作为误差的100个菌/ml的定量值。另外，即使在有血沉棕黄层、无血沉棕黄层之间存在菌数差的情况下，只要是100个菌/ml以下的差，就有来自误差的可能性。

若鉴于该结果来解释表11的结果，则可以判定如下。

就被检样品编号84而言，虽然是超出作为有血沉棕黄层、无血沉棕黄层各自误差范围的100个菌/ml的数字，但是由于不存在两者间的差异，因此判断无白细胞的吞噬、且所检测的细菌不是致病菌。

就被检样品编号89而言，在有血沉棕黄层中算出为87.5个菌/ml，对于无血沉棕黄层而言，成为大的数字，但在误差范围以内，所检测的细菌、细菌数不能断定是病原菌，因此无法判定。

就被检样品编号16、54、56、66、78、98、133、137而言，在各被检样品的有血沉棕黄层中算出比误差范围大的菌数，并且与无血沉棕黄层的菌数差也是比误差范围大的数字，所检测的细菌是病原菌的可能性高。

与作为以往的细菌鉴定法的利用培养得到结果(几天后)相比，能够以4、5小时进行这样的判定，更加快速。

以上的结果可知，血液中的菌数在治疗后短时间内比其他任何生物标记都更剧烈地变动。由该结果暗示着菌数是败血症的新的优异的生物标记。而且，认为能够在世界上首次提供菌数的临床数据的本检查法在今后的感染症医疗中极为有用。

Claims

1.对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(2)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及

(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与所述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。

2.如权利要求1所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(B)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；

(D)第四PCR工序，使用通过所述第三PCR工序得到的第三扩增产物，利用巢式PCR法得到第四扩增产物；

(E)由所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；以及

(F)菌数定量工序，使用所述校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。

3.如权利要求2所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其中，通过以下的工序进行所述工序(C)、(E)及(F)：

(E-1)从所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准曲线的工序；以及

(F-1)菌数定量工序，使用所述校准曲线，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。

4.如权利要求1～3中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，以所述第一PCR工序中的基因扩增未到达平台期的循环数进行所述第一PCR工序。

5.如权利要求1～4中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有将包含所述第一扩增产物的反应液进行稀释而供于所述第二PCR工序的稀释工序。

6.如权利要求2～5中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，在同一PCR装置内同时进行所述第一PCR工序和所述第三PCR工序，并且在同一PCR装置内同时进行所述第二PCR工序和所述第四PCR工序。

7.如权利要求1～6中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，还具有下述工序：分别使用多个引物对进行第二PCR工序，基于经各引物对所扩增的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合或Tm值间的差值的组合，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。

8.如权利要求7所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，使用所述第二PCR工序用的多个引物对中的至少1者进行所述第四PCR工序(其中，在使用多个引物对的情况下，分别使用多个引物对进行第四PCR工序)。

9.如权利要求1～8中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，所述对照细菌为大肠杆菌。

10.如权利要求1～9中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，在所述第一PCR工序中使用的通用引物对中，正向引物、反向引物中的一者或两者为等量地混合有1个碱基不同的2种引物而成的。

11.对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(2)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；

(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与所述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的暂定细菌数；

(4)菌种鉴定工序，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及

(5)细菌数校正工序，基于所述对照细菌及通过所述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16SrRNA操纵子拷贝数对通过所述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定所述被检样品中的细菌数。

12.如权利要求11所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(E)由所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；

(F)菌数定量工序，使用所述校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的暂定细菌数；

(G)菌种鉴定工序，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及

(H)细菌数校正工序，基于所述对照细菌及通过所述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16SrRNA操纵子拷贝数对通过所述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定所述被检样品中的细菌数。

13.如权利要求12所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其中，通过以下的工序进行所述工序(C)、(E)及(F)：

(E-1)由所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准曲线的工序；以及

(F-1)菌数定量工序，使用所述校准曲线，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的暂定细菌数。

14.如权利要求11～13中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，以所述第一PCR工序中的基因扩增未到达平台期的循环数进行所述第一PCR工序。

15.如权利要求11～14中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有将包含所述第一扩增产物的反应液进行稀释而供于所述第二PCR工序的稀释工序。

16.如权利要求12～15中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，在同一PCR装置内同时进行所述第一PCR工序和所述第三PCR工序，并且在同一PCR装置内同时进行所述第二PCR工序和所述第四PCR工序。

17.如权利要求11～16中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，所述菌种鉴定工序具有下述工序：分别使用多个引物对进行第二PCR工序，基于经各引物对所扩增的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合或Tm值间的差值的组合，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。

18.如权利要求17所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，使用所述第二PCR工序用的多个引物对中的至少1者进行所述第四PCR工序(其中，在使用多个引物对的情况下，分别使用多个引物对进行第四PCR工序)。

19.如权利要求11～18中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，所述对照细菌为大肠杆菌。

20.如权利要求11～19中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，在所述第一PCR工序中使用的通用引物对中，正向引物、反向引物中的一者或两者是等量地混合有1个碱基不同的2种引物而成的。

21.判定有无污染的方法，其包括下述工序：

工序(a)，将血液被检样品进行离心分离，分离成红细胞级分、血沉棕黄层级分及血浆级分后，制作包含上清的血浆级分和血沉棕黄层的试样A、以及包含上清的血浆级分而不包含血沉棕黄层的试样B；

工序(b)，利用具有以下的工序(2-1)、(2-2)及(2-3)的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，对所述试样A和所述试样B的各自的细菌数进行定量；以及

工序(c)，通过比较所述试样A的细菌数和所述试样B的细菌数，从而判定所述血液试样中有无细菌的污染，

(2-2)第二PCR工序，使用用于对利用所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及

(2-3)菌数定量工序，使用校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的暂定细菌数。

22.如权利要求21所述的判定有无污染的方法，其中，所述对细菌数进行定量的工序(b)还包括工序(2-4)及(2-5)，

(2-4)菌种鉴定工序，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及

(2-5)细菌数校正工序，基于所述对照细菌及通过所述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数对通过所述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定所述被检样品中的细菌数。

23.如权利要求21或22所述的判定有无污染的方法，其中，在所述判定有无污染的工序(c)中，考虑所述试样A与所述试样B的菌数之差和误差范围来进行判定。