KR102428043B1

KR102428043B1 - 검체 중의 세균수 정량 방법

Info

Publication number: KR102428043B1
Application number: KR1020217037803A
Authority: KR
Inventors: 히데키 니이미; 이사오 키타지마; 아키오 미야코시; 요시츠구 히가시
Original assignee: 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤; 국립대학법인 도야마 다이가쿠
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2022-08-01
Also published as: JP7023465B2; CN111684067A; KR102363462B1; US20210102239A1; KR20200083604A; AU2018390590B2; AU2018390590A1; JPWO2019123692A1; EP3730611A4; KR20210145834A; SG11202005945QA; EP3730611A1; PH12020550963A1; WO2019123692A1

Abstract

본 발명의 과제는, PCR법을 이용한 신속하고 정밀한 검체 중의 세균 균수의 정량을 가능하게 하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하는 방법으로서, 이하의 공정에 의해 검체 중 세균의 동정 및 정량을 실시한다.
(1) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,
(2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정, 및
(3) 검량용 데이터를 이용하여, 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정. 　
또한, 상기의 공정 (1)~(3)에 더하여 이하의 공정 (4) 및 (5)를 추가해도 된다.
(4) 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정.
(5) 상기 균수 정량 공정에서 구한 세균수를 잠정 세균수로 하고, 상기 컨트롤 세균 및 상기 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 잠정 세균수를 보정해서 상기 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.

Description

검체 중의 세균수 정량 방법{METHOD FOR QUANTIFYING NUMBER OF CELLS OF BACTERIUM IN SAMPLE}

본 발명은, PCR법을 이용하여, 검체, 특히 혈액 검체 중의 세균수의 정량, 혹은 세균수의 정량 및 세균종의 동정(同定)을 신속하고 정밀하게 실시하는 방법에 관한 것이다.

패혈증의 중증도 판정에 이용되고 있는 종래의 검사 항목은, 혈액 배양, 엔도톡신, 프로칼시토닌, 백혈구수, CRP(C-reactive protein), 혈압, 체온, 호흡수, 맥박수 등이며, 최근 새롭게 프리셉신이 추가되었다. 혈액 배양 결과는 시간을 필요로 하기 때문에 조기 치료에 피드백하는 것은 어렵다. 백혈구 수나 CRP는 숙주측의 감염 방어 반응이기 때문에, 검사치와 중증도에 시간차가 발생하여, 실제 중증도와는 종종 괴리된 값이 된다. 프로칼시토닌은 특이성이나 정량성에 어려움이 있어, 사용하기 어렵다. 프리셉신은 신기능 장애 환자에서는 사용할 수 없다. 이와 같이, 감염증의 중증도나 치료 효과를 리얼타임으로 반영하는 지표로서, 아직 신뢰할 수 있는 검사 항목은 존재하지 않는다. 가능하면, 환자 검체 중의 균수를 바이오마커로 하여, 감염증 중증도의 판정이나 치료 효과를 모니터링하는 지표로서 사용하는 것이 가장 직접적이며, 이치에 맞는다.

현행에서는, 검체 중의 균수의 표준적 정량 해석은, 채취한 환자 검체의 배양에 의해 실시되지만, 매우 대략적인 정량일 수 밖에 없다("1+", "2+", "3+"라는 분류만). 배양 기술은 오랫동안 이용되고 있지만, 검사에 시간이 걸리는 데다(통상 2~3일), 균종마다 상이한 증식능에 의존하기 때문에, Colony-forming unit(CFU)를 사용한 정량 결과의 신뢰성은 낮다. 따라서, 세균수의 정확한 측정을 하기 위해서는, 배양에 의존하지 않는 측정법이 바람직하다. 최근, 배양 이외의 방법으로 가장 범용성이 높다고 생각되는 기술은, 정량 PCR(real-time PCR)법이다.

리얼타임 PCR법으로 환자 검체 중의 기염균(起炎菌)의 정량을 시도하는 경우, 검사 개시 시점에 있어서 기염균은 동정되지 않고, 또한, 혼합 감염도 종종 발생할 수 있기 때문에, bacterial universal primer(거의 모든 세균을 검출하는 프라이머이며, 이하 간단히 "유니버설 프라이머"라고 기재하는 경우가 있다.)를 사용할 필요가 있다. 그러나, 환자 검체 중의 기염균은 종종 소량이기 때문에, 통상의 리얼타임 PCR에서는 정확하게 정량할 만큼의 충분한 감도를 얻을 수 없는 경우가 있다. 또한, 충분한 감도를 얻을 수 있었다고 해도, bacterial universal PCR(거의 모든 세균을 검출하는 PCR)에 있어서는 컨태미네이션(contamination)이 검출되기 쉬운 문제가 있어, 기염균의 판정에 어려움이 발생한다. 그 결과, 환자 검체 중의 기염균의 정량 검사는 감염증 치료에 매우 유용함에도 불구하고, 기술적으로 미해결인 문제에 의해 아직 실용화에 이르지 못했다.

PCR법에 의한 감염증 기인균의 동정 방법에 관하여는, 특허문헌 1에는, 검체 유래의 핵산을 사용하고 복수의 특정 프라이머 세트를 사용하여 리얼타임 PCR을 실시하고, 얻어진 복수의 증폭 산물의 융해 온도(Tm값)의 조합을 이용하여 검체 중의 균을 동정하는 감염증 기인균의 신속 동정 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 2에는, 검출 감도의 향상을 달성할 수 있는 진핵 생물에서 생산된 내열성 DNA 폴리머라아제와 그것을 이용한 PCR법에 의한 세균종의 동정 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 3에는, 검체 유래의 핵산을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시하고, 얻어진 증폭 산물의 융해 온도(Tm값)를 이용하여 검체 중의 균을 동정하기 위한 다수의 프라이머 쌍이 개시되어 있다.

특허문헌 1 : 국제 공개 2007/097323호 특허문헌 2 : 국제 공개 2010/082640호 특허문헌 3 : 국제 공개 2015/053293호

패혈증에 있어서의 혈액 검체 등의 검체 중에 미량으로 포함되는 기염균의 균수나 그 균종을 종래의 PCR법으로 분석하는 경우에는, 이하와 같은 과제가 여전히 남아 있는 것이 현실정이다.

통상의 리얼타임 PCR에서는, 환자 검체 중의 기염균수를 정확하게 정량할 만큼의 충분한 감도를 얻을 수 없는 경우가 있다. 특히, 기염균이 극미량인 경우, 리얼타임 PCR에서의 정확한 정량은 할 수 없는 경우가 있다.

본 발명의 목적은, PCR법을 이용하여 신속하고 정밀하게, 검체 중의 세균수의 정량, 혹은 세균수의 정량 및 세균종의 동정을 가능하게 하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명에 관련되는 검체 중의 세균수를 정량하는 제1 정량 방법의 일 실시형태는 이하의 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

(1) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,

(2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용한 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정, 및

(3) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 세균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정.

(A) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,

(B) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용한 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정,

(C) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 이미 알려진 세균 수에 대응한 핵산 시료를 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,

(D) 상기 제3 PCR 공정에 의해 얻어진 제3 증폭 산물을 사용하여 nested PCR법에 의해 제4 증폭 산물을 얻는 제4 PCR 공정,

(E) 상기 이미 알려진 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량용 데이터를 작성하는 공정, 및

(F) 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검량용 데이터를 이용하여 상기 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정.

본 발명에 관련되는 검체 중의 세균수를 정량하는 제2 정량 방법의 일 실시형태는 이하의 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

(2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용한 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정,

(3) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 세균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정,

(4) 상기 검체 중의 세균의 균종을 동정하는 균종 동정 공정, 및

(5) 상기 균수 정량 공정에서 구한 잠정 세균수를, 상기 컨트롤 세균 및 상기 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 보정해서 상기 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.

(C) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 이미 알려진 세균수에 대응한 핵산 시료를 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,

(E) 상기 이미 알려진 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량용 데이터를 작성하는 공정,

(F) 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검량용 데이터를 이용하여 상기 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정,

(G) 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정, 및

(H) 상기 균수 정량 공정에서 구한 잠정 세균수를, 상기 컨트롤 세균 및 상기 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 보정해서 상기 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.

본 발명에 관련되는 컨태미네이션의 유무의 판정 방법은,

혈액 검체를 원심 분리하여, 적혈구 획분(

分), 버피코트 획분 및 혈장 획분으로 분리한 후, 상청(上淸)의 혈장 획분과 버피코트를 포함하는 시료 A와, 상청의 혈장 획분을 포함하고 버피코트를 포함하지 않는 시료 B를 제작하는 공정 (a),

이하의 공정 (2-1), (2-2) 및 (2-3)을 갖는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법에 의해, 상기 시료 A와 상기 시료 B 각각의 세균수를 정량하는 공정 (b),

및

상기 시료 A와 상기 시료 B의, 세균수를 비교함으로써 상기 혈액 시료 중 세균의 컨태미네이션의 유무를 판정하는 공정 (c)

를 갖는 것을 특징으로 한다.

(2-1) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,

(2-2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정, 및

(2-3) 검량용 데이터를 이용하여, 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정.

본 발명에 관련되는 컨태미네이션의 유무의 판정 방법에 있어서의 세균수를 정량하는 공정 (b)는, 이하의 공정 (2-4) 및 (2-5)를 더 가져도 된다.

(2-4) 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정.

(2-5) 상기 균수 정량 공정에서 구한 잠정 세균수를, 상기 컨트롤 세균 및 상기 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 보정해서 상기 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.

본 발명에 의하면, PCR법을 이용한 신속하고 정밀한 검체 중의 세균수의 정량, 혹은 세균수의 정량 및 세균종의 동정을 가능하게 하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은, 실시예 1에 있어서의 각 Step의 관계와 순서에 관하여 나타낸다.
도 2는, 세균의 분산액을 100×g, 5분간 경도 원심한 후의 upper half와 lower half의 균수를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 통상의 real-time PCR법(conventional PCR method)에 의한 정량성과 본 발명에 관련되는 nested PCR법(nested PCR method)에 의한 정량성의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 내열성 DNA 폴리머라아제(시판품과 진핵 생물을 호스트로서 제작한 내열성 DNA 폴리머라아제)에 잔존하는 호스트 세균 유래 DNA의 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는, Tm mapping법용 프라이머의 16S rRNA에 있어서의 배치도이다.
도 6은, 1염기 상이한 프라이머의 등량 혼합에 의해, 쌍방의 정확한 정량을 가능하게 하는 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.
도 8은, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.
도 9는, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.
도 10은, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.
도 11은, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.
도 12는, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.
도 13은, 기염균의 정량 결과와 그 밖의 바이오마커의 항균약 치료 전후의 동태 비교의 일례를 나타내는 도면이다.

본 발명의 검체 중 세균수의 제1 정량 방법은, 이하의 공정을 갖는다.

(i) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정.

(ii) 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정.

(iii) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정.

본 발명의 검체 중 세균수의 제2 정량 방법은, 이하의 공정을 갖는다.

(III) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정.

(IV) 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정.

(V) 균수 정량 공정에서 구한 잠정 세균수를, 컨트롤 세균 및 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 보정해서 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.

이하, 본 발명에 관련되는 검체 중 세균수의 정량 방법의 실시형태에 관하여 설명한다.

우선, 본 발명에 관련되는 검체 중 세균수의 제1 정량 방법 및 제2 정량 방법에 있어서 공통되는 제1 PCR 공정, 제2 PCR 공정 및 균수 정량 공정에 관하여 설명한다.

(검체 유래 핵산 시료의 조제)

검체 유래의 핵산 시료의 조제는 정법(定法)에 의해 실시할 수 있다.

또한, 검체 유래의 핵산 시료의 조제는, 후술하는 실시예에서 이용하고 있는 방법과 같이, 세균종에 따른 차가 발생하지 않는 집균(集菌) 및 핵산 추출 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

검체로서는, 혈액뿐만 아니라, 뇌척수액(세균성 수막염), 심낭수(심막염), 흉수(흉막염), 복수(복막염), 관절포액(정형외과의 수술 후 감염증), 안방수(안내염), 폐포 세정액(폐렴), 소변(요로 감염증), 수술 후의 드레인 배액(수술 후 감염증), CV 카테터 선단(Catheter tip)(장기 와상 환자의 카테터 선단 Bio film에 의한 패혈증) 등 다종의 감염증의 중증도나 치료 효과의 지표, 감염증 리스크 관리의 지표로서 이용되는 것을 기대할 수 있는 검체를 들 수 있다.

(제1 PCR용 프라이머 쌍)

제1 PCR 공정에 있어서 사용하는 유니버설 프라이머 쌍은, 정량 대상으로 하거나, 혹은 정량 대상으로 할 가능성이 있는 범위의 세균종의 16S rRNA 유전자의 정량에 이용 가능한 영역을 증폭 가능한 것이면, 공지된 프라이머 쌍이나 세균의 16S rRNA 유전자의 염기 서열 정보에서 선택한 프라이머 쌍 등, 특별히 제한없이 이용할 수 있다.

상이한 세균 종간에서 프라이머가 결합하는 16S rRNA 유전자 부위의 서열에 1염기가 상이한 2종의 염기 서열이 있는 경우에, 일방의 염기 서열의 프라이머를 사용한 경우에 1염기 미스매치(mismatch)가 발생하면 정량 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 이와 같은 경우에서, 이들 양방의 염기 서열에 대응하는 프라이머를 동시에 사용하여, 정밀도 좋은 정량을 가능하게 하는 세균종의 범위를 확대하는 것이 바람직하다.

즉, 제1 PCR 공정에 사용하는 유니버설 프라이머 쌍에 있어서, 포워드(forward) 프라이머, 리버스(reverse) 프라이머의 일방 또는 양방이, 1염기 상이한 2종의 프라이머가 등량 혼합된 것인 것이 바람직하다.

이와 같은 프라이머 쌍으로서, 이하의 프라이머 쌍의 조합을 들 수 있다.

패턴 1:

Region 1 forward primer 1a: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1)

Region 1 forward primer 1b: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(서열 번호 2)

Region 7 reverse primer: 5′-CCGGGAACGTATTCACC-3′(서열 번호 3)

이 패턴 1의 경우, Region 1 forward primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. Region 7 reverse primer는 1종류를 그대로 사용하는 것이 바람직하다. 제1 PCR 공정은 1검체당 1tube로 실시하는 것이 바람직하다.

패턴 2:

Region 1' forward primer 1a: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1)

Region 1' forward primer 1b: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(서열 번호 2)

Region 7' reverse primer 1a: 5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 4)

Region 7' reverse primer 1b: 5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 5)

이 패턴 2의 경우, Region 1' forward primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 동일하게 Region 7' reverse primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 제1 PCR 공정은 1검체당 1tube로 실시하는 것이 바람직하다.

(제1 PCR 공정)

제1 PCR 공정에서는, 정량의 정밀도를 향상시키는 데 있어서 주형으로서 사용한 핵산의 양에 대응하는 증폭 산물량을 얻기 위해서, 유전자 증폭이 플래토(plateau)가 되기 전, 예를 들어, 증폭 곡선에 경사가 있는 단계에서 증폭을 종료시키는 것이 바람직하다. 증폭 산물의 증폭 속도는, PCR용 시약의 농도, PCR용 효소의 활성, 증폭을 위한 사이클(cycle)수 등에 의해 제어할 수 있다. 핵산 시료 중에 포함되는 핵산의 양으로부터 예상되는 플래토에 도달하지 않는 사이클수, 혹은 미리 실험에서 구해 놓은 데이터로부터 플래토에 도달하지 않는 사이클수를 설정하고, 증폭 속도를 제어하여, 유전자 증폭이 플래토에 도달하기 전에 PCR을 종료하는 것이 바람직하다.

제1 PCR 공정은 공지된 방법 및 장치에 의해 실시할 수 있다.

제1 PCR 공정은, 검체 유래 핵산 이외의 세균 유래 핵산의 혼입이 매우 적거나, 혹은 이와 같은 혼입이 없는 반응계에서 실시하는 것이 바람직하다. PCR용의 시약, 실험기구, 효소를, 특허문헌 2에 개시된 바와 같은 공지된 방법으로 처리함으로써, 이러한 반응계를 조제할 수 있다. 또한, 핵산 증폭을 위한 효소로는, 특허문헌 2에 개시되어 있는 진핵 생물을 숙주로서 사용하여 유전자 공학적으로 제조한 내열성 DNA 폴리머라아제를 사용하는 것이 바람직하다. 검체 유래 핵산 이외의 세균 핵산 오염이 없는 PCR을 실시함으로써, 오염 세균에서 유래하는 핵산으로부터의 증폭에 의한 백그라운드(background)가 제로(zero) 혹은 검출 한계 이하가 되어, 극미량의 기염균까지 정확하게 정량하는 것이 가능하게 된다.

(제2 PCR용 프라이머 쌍)

제1 PCR 공정에 의해 얻어진 증폭 산물을 사용하여, nested PCR법에 의해 제2 PCR 공정을 실시한다.

제2 PCR 공정용 프라이머 쌍으로는, 제1 PCR 공정에서의 증폭 산물의 염기 서열의 내부 서열로서, 목적으로 하는 세균수의 정량에 이용할 수 있는 내부 서열을 갖는 핵산 단편을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한없이 이용할 수 있다. 공지된 프라이머 쌍, 혹은, 세균의 16S rRNA 유전자의 염기 서열에서 선택하여 얻어진 프라이머 쌍 등을 이용할 수 있다.

제2 PCR 공정용의 바람직한 프라이머 쌍으로서, 이하의 프라이머 쌍을 들 수 있다.

패턴 1:

Region 1 forward primer: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1)

Region 1 reverse primer: 5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′(서열 번호 6)

Region 2 forward primer: 5′-GACTCCTACGGGAGGCA-3′(서열 번호 7)

Region 2 reverse primer: 5′-TATTACCGCGGCTGCTG-3′(서열 번호 8）

Region 3 forward primer: 5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(서열 번호 9）

Region 3 reverse primer: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(서열 번호 10）

Region 4 forward primer: 5′-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3′(서열 번호 11）

Region 4 reverse primer: 5′-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′(서열 번호 12）

Region 5 forward primer: 5′-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3′(서열 번호 13)

Region 5 reverse primer: 5′-GAGCTGACGACAGCCAT-3′(서열 번호 14）

Region 6 forward primer: 5′-TTGGGTTAAGTCCCGC-3′(서열 번호 15）

Region 6 reverse primer: 5′-CGTCATCCCCACCTTC-3′(서열 번호 16）

Region 7 forward primer: 5′-GGCTACACACGTGCTACAAT-3′(서열 번호 17）

Region 7 reverse primer: 5′-CCGGGAACGTATTCACC-3′(서열 번호 3)

패턴 2:

Region 1' forward primer: 5′-GCAGGCTTAACACATGCAAGTCG-3′(서열 번호 18）

Region 1' reverse primer:5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′(서열 번호 6）

Region 2' forward primer: 5′-GTCCAGACTCCTACGGGAG-3′(서열 번호 19）

Region 2' reverse primer: 5′-CCTACGTATTACCGCGG-3′(서열 번호 20）

Region 3' forward primer: 5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(서열 번호 21）

Region 3' reverse primer: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(서열 번호 10）

Region 4' forward primer: 5′-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3′(서열 번호 11）

Region 4' reverse primer: 5′-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′(서열 번호 12）

Region 5' forward primer: 5′-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3′(서열 번호 13）

Region 5' reverse primer: 5′-GAGCTGACGACAGCCAT-3′(서열 번호 14）

Region 6' forward primer: 5′-GTTAAGTCCCGCAACGAG-3′(서열 번호 22）

Region 6' reverse primer: 5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′(서열 번호 23）

Region 7' forward primer: 5′-GGCTACACACGTGCTACAATGG-3′(서열 번호 24）

Region 7' reverse primer: 5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 4）

패턴 1 및 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 프라이머 쌍을 사용하여 제2 PCR 공정을 실시할 수 있다. 또한, 복수의 프라이머 쌍을 사용하는 경우는, 이들의 각각을 개별적으로 사용하여 제2 PCR 공정을 실시한다.

(제2 PCR 공정)

제2 PCR 공정은 공지된 방법 및 장치에 의해 실시할 수 있다.

또한, 제1 PCR 공정에서 얻어진 증폭 산물을 포함하는 반응액은, 제2 PCR 공정에 있어서 정량으로 이용할 수 있는 증폭 산물량을 얻는 데 있어서, 필요에 따라 희석해도 된다.

희석율은, 제1 PCR 공정에서 얻어진 반응액의 증폭 산물의 농도로부터 상정되거나, 혹은 미리 실시한 실험에 있어서 정량성이 담보되는 범위가 되는 양의 증폭 산물이 제2 PCR 공정에서 얻어지도록 설정한다.

제2 PCR 공정에 있어서도, 검체 유래 핵산 이외의 세균 유래 핵산의 혼입이 매우 적거나, 혹은 이와 같은 혼입이 없는 반응계에서 실시하는 것이 바람직하다. PCR용의 시약, 기구, 효소를, 특허문헌 2에 개시되는 바와 같은 공지된 방법으로 처리함으로써, 이러한 반응계를 조제할 수 있다. 또한, 핵산 증폭을 위한 효소로는, 특허문헌 2에 개시되어 있는 진핵 생물을 숙주로서 사용하여 유전자 공학적으로 제조한 내열성 DNA 폴리머라아제를 사용하는 것이 바람직하다. 검체 유래 핵산 이외의 세균 핵산 오염이 없는 PCR을 실시함으로써, 오염 세균에서 유래하는 핵산으로부터의 증폭에 의한 백그라운드가 제로 혹은 검출 한계 이하가 되어, 극미량의 기염균까지 정확하게 정량하는 것이 가능하게 된다.

(검량용 데이터의 작성)

균수 정량 공정에 있어서, 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 세균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 검체 중의 세균수를 구할 수 있다.

검량용 데이터는, 특별히 한정되지 않지만, 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 이미 알려진 세균수에 대응한 핵산 시료를 사용하여 PCR 공정을 실시함으로써 얻어지는 이미 알려진 세균 유래의 증폭 산물의 양과, 상기 이미 알려진 세균수의 관계로부터 작성할 수 있다. 검량용 데이터는, 컨트롤 세균의 이미 알려진 세균수 단독을 사용하거나, 혹은 컨트롤 세균의 이미 알려진 복수의 상이한 세균수의 각각을 개별적으로 사용하여 작성할 수 있다.

검량용 데이터로서 검량선(calibration curve)을 이용하는 경우도 특별히 한정되지 않지만, 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 상이한 복수의 이미 알려진 세균수에 대응한 복수의 핵산 시료를 각각 개별적으로 사용하여 PCR 공정을 실시함으로써 얻어지는 이미 알려진 세균 유래의 증폭 산물의 양과, 상기 이미 알려진 세균수의 관계로부터 검량선을 작성할 수 있다.

검량용 데이터를 미리 준비해 두고, 균수 정량 공정에 이용할 수 있다.

PCR 장치의 조작 상태나 조작 환경에 의한 오차를 최소로 하여 세균수의 정량 정밀도를 보다 향상시키기 위해서는, 검량용 데이터의 작성 공정을 제1 PCR 공정 및 제2 PCR 공정이라는 일련의 조작에 의해 실시하는 것이 바람직하다. 그 때의 검량용 데이터의 작성은 이하의 공정에 의해 실시할 수 있다.

(D) 제3 PCR 공정에 의해 얻어진 제3 증폭 산물을 사용하여 nested PCR법에 의해 제4 증폭 산물을 얻는 제4 PCR 공정, 및

(E) 컨트롤 세균의 이미 알려진 균수와 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량용 데이터를 작성하는 공정.

또한, 동일 PCR 장치 내에서, 상기 제1 PCR 공정과 상기 제3 PCR 공정을 병행하여 실시하고, 또한, 동일 PCR 장치 내에서, 상기 제2 PCR 공정과 상기 제4 PCR 공정을 병행하여 실시함으로써 효율적인 검량용 데이터의 작성을 실시할 수 있다.

검량용 데이터로서 검량선을 이용하는 경우에는, 공정 (C) 및 (E)를 이하의 공정 (C-1) 및 (E-1)에 의해 실시할 수 있다.

(C-1) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 상이한 복수의 이미 알려진 세균수에 대응한 복수의 핵산 시료를 각각 개별적으로 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,

(E-1) 상기 이미 알려져 있는 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량선을 작성하는 공정.

검량선 작성용으로서 제3 PCR 공정의 주형으로서 사용하는 복수의 핵산 시료로서는, 컨트롤 세균을 상이한 이미 알려진 균수로 포함하는 복수의 시료 각각으로부터 핵산을 추출하여 얻어지는 시료를 사용할 수 있다. 혹은, 컨트롤 세균을 이미 알려진 균수로 포함하는 시료로부터 핵산을 추출하여 얻어지는 핵산 시료를 소정 농도로 희석하여, 복수의 상이한 이미 알려진 균수에 대응하는 복수의 핵산 시료를 조제하여, 얻어진 각 핵산 시료를 각각 독립하여 제3 PCR 공정에 이용해도 된다.

컨트롤 세균은, 목적으로 하는 검량선의 작성을 가능하게 하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 취급성이나 타균종과의 호환성 등을 고려하여 컨트롤 세균을 선택할 수 있다. 이러한 관점에서는, 대장균(Escherichia coli)을 컨트롤 세균으로서 바람직하게 이용할 수 있다.

검량선의 작성에 있어서 사용하는 프라이머 세트는, 제1 PCR 공정, 제2 PCR 공정, 후술하는 검체 중 세균의 세균종의 동정에 PCR법을 이용하는 경우의 프라이머 세트와의 관계에서 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제1 PCR 공정에서 사용하는 프라이머 세트를 공정 (C)에서 사용하고, 제2 PCR 공정에서 사용하는 프라이머 세트(복수의 프라이머 세트를 사용하는 경우는, 그 중 적어도 1개)를 공정 (D)에서 사용할 수 있다. 후술하는 검체 중 세균의 세균종의 동정에 제1 PCR 공정에서의 증폭 산물을 이용하는 경우에도, 동일하게, 제2 PCR 공정에서 사용하는 프라이머 세트(복수의 프라이머 세트를 사용하는 경우는, 그 중 적어도 1개)를 공정 (D)에서 사용할 수 있다.

(세균수의 산출)

세균수 정량 공정에 있어서, 검량선 등의 검량용 데이터를 이용하여 제2 PCR 공정에서 얻어진 증폭 산물의 양으로부터, 검체 중의 세균수를 구할 수 있다. 이 세균수를 검체 중의 세균수로서 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련되는 제2 정량 방법에서는, 세균수 정량 공정에 있어서 얻어진 세균수를 잠정적으로 구한 잠정 세균수로서 이용한다.

이하에, 본 발명에 관련되는 제2 정량 방법에 있어서의 균종 동정 공정 및 세균수 보정 공정에 관하여 설명한다. 또한, 본 발명에 관련되는 제1 정량 방법에, 균종 동정 공정을 추가해도 된다. 그 경우, 제1 정량 방법에 있어서의 제1 PCR 공정 및 제2 PCR 공정을 이용하여, 검체 중 세균의 동정을 실시할 수 있다.

(세균종 동정용 프라이머)

본 발명에 관련되는 제2 정량 방법에서는, 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 증폭 산물을 사용하여, 검체 중 세균의 세균종의 동정을 실시한다.

세균종의 동정에 패턴 1의 프라이머 세트를, 후술하는 Tm mapping법에 있어서 사용하는 경우에는, 이하의 프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다.

·제1 PCR 공정(Tm mapping법 패턴 1의 제1 PCR 공정의 프라이머 세트와 동일)

Region 1 forward primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용한다. Region 7 reverse primer는 이하의 1종류를 그대로 사용한다. 1st PCR의 환자 검체는 1검체당 1tube, 정량 컨트롤을 적어도 1개의 농도를 1tube, 보다 바람직하게는 3개의 농도를 3tube, 네거티브 컨트롤은 1tube로 실시한다.

Region 1 forward primer 1a: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1)

Region 1 forward primer 1b: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(서열 번호 2)

Region 7 reverse primer: 5′-CCGGGAACGTATTCACC-3′(서열 번호 3)

·제2 PCR 공정(nested PCR):

이하의 Region 3 forward primer와 Region 3 reverse primer를 사용한다. 2nd nested PCR에서의 정량은 검체 1개당 1tube, 정량 컨트롤을 적어도 1개의 농도를 1tube, 보다 바람직하게는 3개의 농도를 3tube, 네거티브 컨트롤에 1tube로 실시한다. 다만, 환자 검체에 있어서는, Tm mapping법 시행 시의 Region 3 forward & reverse primer에서의 증폭 결과를 그대로 정량 측정에 이용한다(정량용으로 새로운 tube를 사용하여 PCR을 실시할 필요는 없다).

Region 3 forward primer: 5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(서열 번호 9)

Region 3 reverse primer: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(서열 번호 10)

세균종의 동정에 패턴 2의 프라이머 세트를 사용하는 Tm mapping법을 이용하는 경우에는, 이하의 프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다.

·제1 PCR 공정(Tm mapping법 패턴 2의 제1 PCR 공정의 프라이머 세트와 동일)

이하의 Region 1' forward primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용한다. 동일하게 Region 7' reverse primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용한다. 1st PCR의 검체 1개당 1tube, 정량 컨트롤을 적어도 1개의 농도를 1tube, 보다 바람직하게는 3개의 농도를 3tube, 네거티브 컨트롤은 1tube로 실시한다.

Region 1' forward primer 1a: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1）

Region 1' forward primer 1b: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(서열 번호 2）

Region 7' reverse primer 1a: 5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 4）

Region 7' reverse primer 1b: 5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 5）

·제2 PCR 공정(nested PCR):

Region 3' forward primer와 Region 3' reverse primer를 사용한다. 2nd nested PCR에서의 정량은 검체 1개당 1tube, 정량 컨트롤을 적어도 1개의 농도를 1tube, 보다 바람직하게는 3개의 농도를 3tube, 네거티브 컨트롤에 1tube로 실시한다. 다만, 검체에 있어서는, Tm mapping법 시행 시의 Region 3' forward & reverse primer에서의 증폭 결과를 그대로 정량 측정에 이용한다(정량용으로 새로운 tube를 사용하여 PCR을 실시할 필요는 없다).

Region 3' forward primer: 5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(서열 번호 9)

Region 3' reverse primer: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(서열 번호 10)

또한, 상술한 각 PCR 공정에 있어서의 정량 컨트롤의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개여도 되며, 2 이상의 상이한 농도의 정량 컨트롤용 복수의 tube를 사용해도 된다.

(검체 중의 세균종 동정)

세균종의 동정에는, 특허문헌 1~3에 개시되는 방법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다.

예를 들어, 세균종에 특이적인 증폭 산물의 유무를 검출하여 세균종을 동정하는 방법을 이용할 수 있다. 이 세균종에 특이적인 증폭 산물의 유무의 검출에는 이하의 방법을 이용할 수 있다.

·검출용 형광 표식을 갖는 인터칼레이터(intercalator)나 프로브(probe)를 사용한 리얼타임 PCR에 의해 증폭 산물의 유무를 확인하는 방법.

·검출용 형광 표식을 갖는 인터칼레이터나 프로브를 사용한 리얼타임 PCR에 의해 증폭 산물의 Tm값을 측정하는 방법.

·증폭 산물을 겔(gel) 상 등에서의 전기 영동에 의해 전개, 가시화하는 증폭 산물의 해석 방법.

·증폭 산물의 염기 서열을 해독하는 것에 의한 증폭 산물의 해석 방법.

·증폭 산물의 분자량을 질량 분석계로 측정하는 해석 방법.

또한, 복수의 프라이머 쌍을 사용한 PCR을 실시하여, 얻어진 복수의 증폭 산물의 Tm값을 사용하여 세균종을 동정할 수도 있다.

이 복수의 프라이머 쌍을 사용하는 방법으로서는, 제2 PCR 공정에 있어서 예시한 패턴 1 및 패턴 2의 프라이머 세트를 사용한 nested PCR법을 바람직하게 이용할 수 있다.

Region 1~7의 forward 및 reverse 프라이머 세트, 또는 Region 1'~7'의 forward 및 reverse 프라이머 세트를 각각 1tube(1검체당 합계 7tubes)로 PCR을 실시하고, 얻어진 7개의 Tm값을 사용하여 특허문헌 1에 기재된 Tm mapping법으로 기염균을 신속 동정하는 것이 바람직하다.

Tm mapping법에 의한 세균종의 동정은, 예를 들어 특허문헌 1, 특허문헌 2의 단락 [0237] 또는 특허문헌 3의 단락 [0111]~[0116]에 개시된 방법에 따라서, 혹은 그것에 개시된 방법을 적절히 개변하여 실시할 수 있다. Tm mapping법에 의한 세균종의 동정에서는, 균종이 이미 알려져 있는 세균으로부터 얻어지는 복수의 특정 프라이머 쌍에 의해 증폭된 복수의 증폭 산물의 Tm값의 조합, 혹은 복수의 Tm값 간의 차의 조합에 관한 동정용 데이터가 이용된다. 검체로부터 모은 미지의 균체 시료로부터 동일한 복수의 프라이머 쌍에 의해서 얻어지는 증폭 산물의 Tm값의 조합, 혹은 Tm값 간의 차의 조합을, 동정용 데이터베이스와 대조하고, 그 일치성을 판단하여, 검체 중 미지의 세균의 동정을 실시한다.

동정 방법의 구체예 중 하나를 이하에 나타낸다.

<동정 방법>

검출 세균을 동정하기 위해, 본 발명에 관련되는 프라이머 세트를 사용하여 검출 세균으로부터 얻어지는 DNA 단편의 Tm값을 이용할 수 있다. 특히 검체에 포함될 가능성을 생각할 수 있는 복수 또는 많은 세균의 16S rRNA 또는 16S rDNA를 사용하여 본 법과 전부 또는 일부 동일한 방법에 의해, DNA 단편과 그 Tm값을 미리 취득해 두고, 그 Tm값 내지는 후술하는 "Tm값의 상대값"을, 비교 데이터 내지는 데이터베이스로서, 검체 중 종이 불분명한 세균을 동정할 수 있다. 동정하기 위한 알고리즘으로서는, 상술한 Tm값 그 자체의 조합뿐 아니라, 각 Tm값 간의 차의 조합을 이용하여 동정함으로써, 예를 들어 기기의 시행회마다 측정 오차와 같은 측정 오차의 영향을 최소한으로 하는 공정을 부가할 수 있다.

상기의, 기기의 시행회마다의 측정 오차를 보정하는 방법으로서, "Tm값의 조합의 평균값"을 산출하고, 그 평균값으로부터의 각 Tm값의 "상대값의 조합"을 이용할 수 있다. 즉, Tm값의 조합의 배치를 "형태"로서 동정하는 방법이다. Tm값의 조합의 배치를 2차원으로 나타낸 "형태"는 측정 오차에 영향을 받지 않는다. 예를 들어, 검출 세균에 특이적인 Tm값의 조합(n개(n은 예를 들어 4이상, 7이하의 정수))을 T1db~Tndb로 하고(db는 database), 그 평균값으로부터의 상대값을 각각 d1db~dndb로 한다. 동일하게 검체로부터 얻어진 미지의 검출 대상 생물의 Tm값의 조합(n개(n은 예를 들어 4이상, 7이하의 정수))을 T1ref~Tnref로 하고(ref는 reference), 그 평균값으로부터의 상대값을 각각 d1ref~dnref로 한다. 그렇게 하여 database와 비교하고, "상대값의 조합이 근사한 것=Tm값의 조합의 배치의 "형태"가 가까운 것", 을 동정 알고리즘으로서 이용한다.

구체적인 계산 방법으로서는, 예를 들어, 유클리드 공간(Euclidean space) 상의 2점간 거리를 산출하는 방법(식 1)을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

[수학식 1]

[식 1]

Dist.=√[(d1_db-d1_ref)²+(d2_db-d2_ref)²+....(dn_db-dn_ref)²]

식 1에 의한 계산 방법이면, 이 계산식에 의해서 얻어지는 Dist.값이 0(제로)에 가장 가까운 것이 구하는 검출 세균종으로서 동정된다. 다만, 사용하는 PCR 기기의 측정 오차의 관계 상, 기기의 온도 제어 스펙이나 프라이머의 수에 따라 다르지만, Dist.값의 허용 범위로서는, 0~0.37, 바람직하게는 0~0.30이다.

이상의 알고리즘은, 컴퓨터 상에서 데이터베이스형 동정 소프트웨어로서 이용할 수 있다.

<동정 가능한 세균종>

동정 가능한 미생물은, 분류 상 세균에 해당하는 것이면, 기구 상 검출 및 세균종의 동정이 가능하다.

프라이머 쌍의 수나 프라이머 쌍의 염기 서열은, 세균종의 검출 범위 등에 따라 선택할 수 있다.

또한, nested PCR에 사용하는 핵산 시료로서는, 제1 PCR 공정에서 얻어진 증폭 산물을, 필요에 따라 희석하여 사용한다. 그 때의 프라이머 세트로서, 제1 PCR 공정용으로서 예시한 패턴 1의 프라이머 세트와 제2 PCR 공정에서 예시한 패턴 1의 프라이머 세트의 조합, 그리고, 제1 PCR 공정용으로서 예시한 패턴 2의 프라이머 세트와 제2 PCR 공정에서 예시한 패턴 2의 프라이머 세트의 조합을 사용하는 것이 바람직하다.

(잠정 세균수의 보정)

패혈증(sepsis)에 있어서의 혈액 검체 등의 검체 중에 미량으로 포함되는 기염균의 균수를 본 발명에 관련되는 제1 정량 방법으로 분석하는 경우에는, bacterial universal PCR로 기염균을 정량한 결과는, 정량 컨트롤의 세균종에서의 환산값이며, 기염균 그 자체의 실제 균수와는 상이한 경우가 있다.

본 발명에 관련되는 제2 정량 방법에서는, 검체 중 세균의 동정 결과에 따라, 검체 중 세균이 컨트롤 세균과 동종인 경우는, 먼저 얻은 잠정 세균수를 정량 결과로서 확정한다. 한편, 검체 중 세균의 동정 결과에 따라, 검체 중 세균이 컨트롤 세균과 이종인 경우는, 동정된 세균의 16S ribosomal RNA operon copy number와 컨트롤 세균의 16S ribosomal RNA operon copy number의 비에 의해 잠정 균수를 보정한 세균수를 정량 결과로서 확정한다.

(동정 및 정량용 키트)

상술한 프라이머 세트 중 적어도 1개와, Tm mapping법에 있어서의 동정에 이용하는 데이터베이스, 세균 DNA의 혼입이 없는 내열성 DNA 폴리머라아제, 포지티브 컨트롤, 네거티브 컨트롤 등을 이용하여, 검체 중 세균의 정량을 위한, 혹은 검체 중 세균의 동정 및 정량을 위한 키트를 제작할 수 있다.

(컨태미네이션(contamination) 유무의 판정 방법)

혈액 검체 중 세균수의 정량, 혹은 세균수의 정량 및 세균의 동정 양방을 실시하는 경우에는, 검체의 샘플링으로부터 제1 또는 제2 PCR 공정 사이에 검체 유래 이외의 세균이 혼입하면, 목적으로 하는 세균수의 정량이나, 위양성(僞陽性, false positive result)의 결과를 포함하여 세균 동정의 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 그래서, 이와 같은 검체 유래 이외의 세균의 PCR용 샘플에 대한 컨태미네이션의 유무를 확인해 둠으로써, 목적으로 하는 세균수의 정량이나 세균의 동정 결과의 신뢰성을 보다 향상시킬 수 있다.

본 발명에 관련되는 컨태미네이션의 유무의 판정 방법은,

혈액 검체를 원심 분리하여, 적혈구 획분(fraction), 버피코트(buffy coat) 획분 및 혈장 획분으로 분리한 후, 상청의 혈장 획분과 버피코트를 포함하는 시료 A와, 상청의 혈장 획분을 포함하고 버피코트를 포함하지 않는 시료 B를 제작하는 공정 (1);

이하의 공정 (2-1), (2-2) 및 (2-3)을 갖는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법에 의해, 상기 시료 A와 상기 시료 B 각각의 세균수를 정량하는 공정 (2); 및

상기 시료 A와 상기 시료 B의, 세균수를 비교함으로써 상기 혈액 시료 중 세균의 컨태미네이션 유무를 판정하는 공정 (3);

을 갖는 것을 특징으로 한다.

(2-1) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정;

(2-2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정; 및

공정 (2-1)~(2-3)은, 본 발명에 관련되는 제1 정량 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

세균수를 정량하는 공정 (b)는, 이하의 공정 (2-4) 및 (2-5)를 더 가져도 된다.

(2-4) 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정.

공정 (2-1)~공정 (2-5)는, 본 발명에 관련되는 제2 정량 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

혈액 샘플의 원심 분리에 의해, 혈액에 포함되는 성분의 비중에 따라, 하층에서 상층으로 향하여 적혈구 획분, 버피코트(백혈구) 획분, 혈장 획분을 이 순서로 분리할 수 있다.

혈장 획분만의 샘플(버피코트 없음)과, 혈장 획분과 버피코트를 포함하는 샘플(버피코트 있음)로부터 본 발명에 관련되는 정량 방법에 의해 얻어지는 세균수를 비교함으로써, 혈액 샘플에 대해 검체 유래 이외의 세균의 혼입 유무를 판정할 수 있다.

"버피코트 있음"은 환자 체내에서 기염균을 탐식한 백혈구를 포함하고, "버피코트 없음"은 탐식한 백혈구를 포함하지 않는 혈장만으로 된다. 실제로는 환자 중 및 환자 검체 중에서 감염은 일어나지 않고, 채혈 시의 피부 상재균이나 작업 환경, 기구 상 오염에서 유래하는 세균 DNA가 검출된 경우는, 이들 세균은 백혈구에 의해 탐식되지 않아, 버피코트의 유무에 의한 균수 차는 없게 된다. 한편, 검출균되는 세균이 기염균이면, 환자 혈중에서 백혈구에 탐식되게 되어, 균수는 반드시 "버피코트 있음"의 쪽이, "버피코트 없음"보다도 현격히 많아질 것이다. 즉 이하와 같은 판정이 가능하다.

먼저, 혈액 검체 중에 세균이 존재하지 않는 경우는, "버피코트 없음"과 "버피코트 있음" 중 어느 샘플에 있어서도 세균수가 측정되지 않는다.

혈액 검체 중에 세균이 존재하지 않는 경우로, 검체 유래 이외의 세균이 혈액 샘플에 혼입된 경우에는, 혼입된 세균은 백혈구에 의해 탐식되지 않아, 버피코트의 유무에 따른 균수차는 없게 된다. "균수에 차가 없다"는 것은 검체 유래 이외의 세균의 컨태미네이션이 발생한 것의 지표가 되며, 이 때 동정된 세균에 관하여는 기염균이라는 것의 신뢰성이 낮고, 또한 그 균수가 실제 혈액 중에서의 균수를 반영한 것이라는 신뢰성도 낮은 것을 나타낸다.

감염을 발증한 환자에서 유래하는 혈액이며, 혈액 검체 중에 세균이 존재하는 경우로, 검체 유래 이외의 세균의 혈액 샘플에 대한 혼입이 없는 경우에는, 버피코트 없음과, 버피코트 있음으로부터 얻어지는 세균수는, 버피코트 있음의 쪽이 많아진다. 균수에 차가 있는 점에서, 얻어진 세균수의 결과가 실제 혈액 중의 균수를 반영한 것이라는 신뢰성이 높음을 나타내고, 또한 이 때 동정된 세균에 관하여도 기염균이라는 신뢰성이 높아지게 된다.

감염을 발증한 환자에서 유래하는 혈액이며, 혈액 검체 중에 세균이 존재하는 경우로, 검체 유래 이외의 세균의 혈액 샘플에 대한 혼입이 있는 경우에는, 혼입에 의해 버피코트 없음과, 버피코트 있음으로부터 얻어지는 외관의 세균수를 증가시킨다. 특히, 버피코트 없음의 샘플의 처리 중에만 검체 유래 이외의 세균의 혼입이 발생한 경우에는, 이들의 차가 적어진다. 혈액 중의 감염에서 유래하는 균량이 매우 적은 경우나, 혼입하는 세균량이 매우 많은 경우에는, 버피코트 없음과, 버피코트 있음으로부터 얻어지는 세균수의 차는 작아진다. 한편, 감염에서 유래하는 균량이 매우 많은 경우나, 혼입하는 세균량이 극미량인 경우에는, 버피코트 없음과, 버피코트 있음으로부터 얻어지는 세균수의 차는 큰 것이 된다. 이와 같이 세균수 차의 대소에 따라, 검체 유래 이외의 세균의 혈액 샘플에 대한 혼입 가능성을 판정할 수 있으며, 충분한 세균수의 차가 얻어진 경우의 결과는 신뢰성이 높고, 균수차가 작은 경우의 결과는 신뢰성이 낮다고 판정할 수 있다.

컨태미네이션의 유무를 판정하는 공정 (c)에 있어서는, 본래 세균이 포함되지 않는 검체에 대해, 사용 기구나 작업 환경에서 유래하는 컨태미네이션이 발생한 경우나, 리얼타임 PCR에서의 정량값의 오차 등에 의해, 어느 정도의 균수가 검출될 수 있는지, 즉, 실제 측정 작업에 있어서의 오차 범위를 고려하여, 버피코트 없음과, 버피코트 있음의 균수의 차로부터 컨태미네이션의 유무를 판정하는 것이 바람직하다. 이 오차 범위로서는, 후술하는 실시예 3에 나타내는 바와 같이, 실제 사용기구, 작업 환경하에서, 컨태미네이션이 없는 멸균수 등을 검체로 간주한 네거티브 컨트롤 시험을 당업자의 상식의 범위 내에서 복수회 실시하여, 그 범위를 구하는 것이 바람직하다. 컨태미네이션이 전혀 발생하지 않고, 리얼타임 PCR의 오차도 없는 이상적인 환경하에서는 오차 범위는 ±0 균/ml가 되지만, 실시예 3에 기재된 ±100 균/ml는 일정한 참고값이 된다.

또한, 컨태미네이션의 유무를 판정하는 공정에 있어서는, 각 시험구에 있어서의 리얼타임 PCR의 결과를 정량 컨트롤의 결과로부터 얻어진 검량선에 기초하여 수치화한 균수로 비교하는 것 이외에도, 리얼타임 PCR에 있어서 얻어지는 Ct값(Threshold cycle)으로써 비교하는 것이어도 된다.

본 발명에 관련되는 방법에 의하면, 종래의 생화학적 성상 검사법에 비해 고정밀도로 검체 중 세균의 정량을 실시할 수 있다.

또한, 일반적으로 채혈 후 2일 정도의 시간을 필요로 하는 종래의 생화학적 성상 검사법에 비해, 채혈 후 3.5시간 정도 등의 신속한 정량도 가능해진다.

종래의 생화학적 성상 검사법에서는, 세균종의 레벨에서는 동정 불능한 경우나, 특수한 세균종의 경우에는 배양 불가능한 경우도 있지만, 본 발명에 관련되는 방법에 의하면, 16S rRNA의 유전자 서열이 데이터베이스에 등록된 균종이며, 또한 16S rRNA 오페론 카피수가 이미 알려져 있는 세균이면 정량이 가능하다.

또한, 음성의 판정 시간에 관하여도, 종래의 생화학적 성상 검사법에서는 일반적으로는 1주일 정도의 시간을 필요로 하지만, 본 발명에 관련되는 방법에서는, 채혈 후, 3.5시간 정도 등의 신속한 결정도 가능해진다.

또한, 검체 중 세균수가 감염증 중증도의 새로운 지표가 되는 경우, 검체 중 세균수의 경시적 변화가 치료 효과의 새로운 지표가 되는 경우, 균수가 한없이 제로에 가까워지는 것이 항균약의 중지 시의 지표가 되는 경우, 패혈증의 정의가 균수를 지표로 한 것으로 변경되는 경우에 대해, 본 발명에 의해 매우 유용한 검체 중 세균의 정량 기술을 제공할 수 있다.

또한, 검체 중 세균수의 정량과 함께 검체 중 세균종의 동정을 동시에 실시하는 경우에 있어서도, 상기와 동일한 효과를 얻을 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 설명한다. 또한, 특별히 기재가 없는 경우에는, 공지된 시약, 공지된 기구, 시판되는 PCR 장치를 이용하여, 각종 정법에 따라 PCR 및 각종 처리를 실시하였다.

(실시예 1)

도 1에 본 실시예에 있어서의 각 Step의 관계와 순서에 관하여 나타낸다.

(Step 1 : 균종에 따른 차가 발생하지 않는 집균 및 DNA 추출 방법)

우선, 혈액 검체로부터의 집균(集菌)에 있어서는, 전혈(全血)을 100×g, 5분간 경도 원심하여 혈구를 분리한 후, 얻어진 상청(버피코트를 포함한다)을 20,000×g, 10분의 강원심에 의해 펠릿(pellet)화하여 집균한다. 이 공정에서 혈장 중 균의 분획은 변화되지 않아, 균종에 따른 집균 효율의 차는 발생하지 않는다.

이를 확인하기 위해, 생리 식염수에 대장균(E. coli ATCC25922), 황색 포도구균(S. aureus ATCC29213), 폐렴간균(K. pneumoniae NBRC3512), 녹농균(P. aeruginosa ATCC27853)을 각각 용해하여, 100×g, 5분간 경도 원심한 후, 원심관 중의 균체를 포함하는 액체의 상반분(upper half)과 하반분(lower half)을 각각 배지에 살포하여 CFU를 측정하였다.

또한, 상기 대장균(E. coli ATCC25922), 황색 포도구균(S. aureus ATCC29213), 녹농균(P. aeruginosa ATCC27853)은 아메리칸·타입·컬처·컬렉션(American Type Culture. Collection: 10801 University Boulevard, Manassas(VA), 20110-2209 USA)에서 입수할 수 있으며, 또한, 폐렴간균(K. pneumoniae NBRC3512)은 독립행정법인 제품평가 기술기반기구(NITE) 바이오테크놀로지 센터(NBRC)(주소: 우편번호 292-0818, 치바현 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8)에서 입수할 수 있다.

그 결과를 도 2에 나타낸다. 이 결과로부터, 원심 후의 상반분과 하반분의 균수에 변화는 보이지 않았다. 즉, 상기 원심 조건에 있어서 이들 균종에 따른 집균 효율의 차는 없었다.

또한, DNA 추출에 있어서는, 집균된 세균을 프로테아제(protease) 처리와 비즈(beads)에 의한 물리적 파쇄로 철저하게 균벽을 파쇄함으로써, 균종에 따라 DNA 추출 효율에 차가 나오지 않도록 하였다.

(Step 2: 세균 DNA 오염이 없는 내열성 DNA 폴리머라아제를 사용하여, 고감도이면서 정확한 정량을 가능하게 하는 nested PCR 시행)

혈액 검체로부터 Step 1의 방법에 의해 얻어진 기염균 DNA를 PCR의 주형으로 하여, 1st PCR: 30사이클→100배 희석→2nd PCR: 30~35사이클의 조건으로 nested PCR을 시행한다. 환자 검체 중의 기염균수는 극미량에서 다량까지 폭이 넓어, 1회의 PCR로 정확하게 정량하는 것은 어렵기 때문에, nested PCR법을 조합한다. 다만, nested PCR로 정량하는 경우, 1st PCR로 유전자 증폭이 플래토가 되지 않는 조건, 예를 들어, 1st PCR을 30사이클 이하의 조건으로 nested PCR을 실시하는 것이 바람직하다.

도 3은, 통상의 real-time PCR법(conventional PCR method)에 의한 정량성(□로 표시)과 본 발명에 관련되는 nested PCR법(nested PCR method)에 의한 정량성(○로 표시)의 비교를 나타내는 그래프이다.

참고로 구체적인 실시 조건을 기재한다.

nested PCR을 실시함에 있어서, 하기에 나타낸 반응액 조성 1에서, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 57℃ 내지는 62℃ 10초, 72℃ 30초, 82℃ 2초를 30회 반복하였다(1^st PCR).

<반응액 조성 1>

주형 2 μL

10xBuffer for rTaq, 내지는 10x Thunder Taq buffer 2 μL

25 mM MgCl₂ 1.6~1.8 μL

효모생산 Taq DNA polymerase 1 Unit

2 mM CleanAmp-dNTP 2 μL

EvaGreen 1 μL

10 μM Region 1 forward primer 1a, 1b 등량씩 합계 0.8~1.2 μL

10 μM Region 7 reverse primer 0.6~1.2 μL(패턴 2의 경우는 Region 7 reverse primer 1a와 1b를 등량씩 합계 1.2 μL)

멸균수 적량

Total 20 μL

PCR 종료 후에 반응액을 회수하여, DNA가 없는 초순수(超純水)로 100배로 희석하였다. 이 희석한 용액을 주형으로 하여, 하기에 나타낸 반응액 조성 2로 반응을 실시하였다(2^nd PCR). PCR 방법에 관하여는, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 57℃ 10초, 72℃ 10초, 82℃ 10초를 35회 반복하였다. 또한, 본 공정에서 사용하는 forward primer, reverse primer는 앞서 기재한 제2 PCR 공정용 패턴 1, region 1~7 각각의 forward primer, reverse primer를 프라이머 쌍으로서 사용하였다.

<반응액 조성 2>

주형 10 μL

10xThunder Taq buffer 2 μL

25 mM MgCl₂ 2 μL

효모생산 Taq DNA polymerase 1 Unit

2 mM CleanAmp-dNTP 내지는 통상의 dNTP 2 μL

EvaGreen 1 μL

10 μM forward primer 0.6 μL

10 μM reverse primer 0.6 μL

멸균수 적량

Total 20 μL

또한,　통상의 real-time PCR법으로서, 상기 1^stPCR은 실시하지 않고, 상기 2^nd PCR과 동일한 조건으로 반복 회수를 60회까지 연장하여 반응을 실시하였다. 또한 그 중에서도 정량성이 높았던 region 3의 프라이머 쌍에서의 결과를 도 3에 비교로서 나타냈다.

통상의 real-time PCR에서는 저농도 영역의 정량은 할 수 없지만, 1^stPCR에서 유전자 증폭이 플래토가 되지 않는 사이클수로 nested PCR을 실시함으로써, 저농도 영역까지 검량선이 직선성을 나타내며, 고감도·정확한 기염균의 정량 및 동정이 가능해진다. 본 법에서의 정량성은 PCR tube당 E. coli에서 1~40만개까지 확보되는 것을 확인하였다.

도 3의 □로 나타내는 대장균 농도와 PCR 사이클수의 역치(

値)의 관계에서는, 10 개/ml 이하의 저농도 영역에서는, 이들 관계에 있어서의 직선성이 상실되어 있고, 이 결과로부터, 종래의 PCR법에서는 저농도 영역에서의 정량성이 유지되지 않는 것을 알 수 있다.

또한, 특허문헌 2에 따라 조제한 진핵생물 생산 내열성 DNA 폴리머라아제(eukaryote-made Taq DNA polymerase)를 사용하여, 세균 DNA 컨태미네이션이 없는 bacterial universal PCR을 시행한다. 이로써 세균 컨태미네이션에 의한 background가 제로가 되어, 극미량의 기염균까지 정확하게 정량할 수 있게(무균의 경우는 제로라고 할 수 있다) 된다. 이를 확인하기 위해, bacterial universal primer를 사용하여, 템플릿으로서 대장균 DNA의 유무로 PCR을 실시한 후, PCR 증폭 산물을 아가로오스겔에 전기 영동하였다. 그 결과, 시판품의 내열성 DNA 합성 효소에는 세균 DNA의 잔존이 확인되지만, eukaryote-made Taq DNA polymerase(효모 or 식물 세포를 호스트로서 제작)에는 세균 DNA가 전혀 확인되지 않았다(도 4).

(Step 3: Tm mapping법에 의한 기염균 신속 동정(Step 4와 동시 병행으로 실시한다)

Step 1에서 얻은 DNA를 주형으로 하여, Step 2의 PCR 조건으로 Tm mapping법에 의한 기염균의 동정을 실시한다.

이 Tm mapping법에 있어서의 각 프라이머의 배치도(도 5) 및 본 예에 사용한 프라이머 서열을 이하에 나타낸다.

본 예에 사용한 프라이머 서열

·1st PCR:

이하의 Region 1' forward primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용한다.

동일하게 Region 7' reverse primer 1a와 1b를 1:1의 등량으로 혼합하여 사용한다.

1st PCR은 1검체당 1tube로 실시한다.

Region 1' forward primer 1a: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1)

Region 1' forward primer 1b: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(서열 번호 2)

Region 7' reverse primer 1a: 5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 4)

Region 7' reverse primer 1b: 5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 5)

·2nd (nested) PCR:

이하의 Region 1'~7'의 forward 및 reverse 프라이머 세트를 각각 1tube(1검체당 합계 7tubes)로 PCR을 실시하여, 7개의 Tm값을 얻는다. 그리고, Tm mapping법으로 기염균을 신속 동정한다.

Region 1' forward primer: 5′-GCAGGCTTAACACATGCAAGTCG-3′(서열 번호 18)

Region 1' reverse primer: 5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′(서열 번호 6)

Region 2' forward primer: 5′-GTCCAGACTCCTACGGGAG-3′(서열 번호 19）

Region 2' reverse primer: 5′-CCTACGTATTACCGCGG-3′(서열 번호 20）

Region 3' forward primer: 5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(서열 번호 21）

Region 3' reverse primer: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(서열 번호 10）

Region 4' forward primer: 5′-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3′(서열 번호 11）

Region 4' reverse primer: 5′-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′(서열 번호 12）

Region 5' forward primer: 5′-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3′(서열 번호 13）

Region 5' reverse primer: 5′-GAGCTGACGACAGCCAT-3′(서열 번호 14）

Region 6' forward primer: 5′-GTTAAGTCCCGCAACGAG-3′(서열 번호 22）

Region 6' reverse primer: 5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′(서열 번호 23）

Region 7' forward primer: 5′-GGCTACACACGTGCTACAATGG-3′(서열 번호 24）

Region 7' reverse primer: 5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 4）

(Step 4: 균종에 따른 차가 발생하지 않는 기염균의 정량 방법(Step 3과 동시 병행으로 실시한다))

정량용 검량선을 그릴 목적으로, 균수가 이미 알려져 있는 세균에서 추출한 DNA를 사용하여, 3개의 상이한 DNA 농도의 희석 계열을 작성하여 정량 컨트롤로 한다. 정량 컨트롤의 작성법을 이하에 나타낸다.

(A) 균수를 미리 알고 있는 균으로부터 DNA 추출액을 제조

(1) E. coli ATCC25922주를 보통 한천 배지에 살포 후, 12시간 부란기로 배양하였다.

(2) 생리 식염수를 사용하여 현탁액(McFarland 0.5)을 제조하였다.

(3) 다시 1000배 희석하여, BD cell viability kit, BD FACS Canto II를 사용하여 균수를 카운트하였다.

(4) Total 3회 측정하여, 그 평균값을 균수로 하였다(140605 개/ml).

(5) 상기 희석액 100 μl(14061개)에서 DNA를 추출하고, 최종적으로 AVE(QIAGEN 사 DNA 추출 키트의 DNA 추출액) 100 μl의 DNA 추출액을 제조하였다(140 개/μl).

(B) 정량 컨트롤용 DNA 추출액을 대량으로 제조

(3) 상기 현탁액 1 ml에서 DNA를 추출하여, 최종적으로 AVE 100 μl의 DNA 추출액을 제조하였다.

(C) 균수를 미리 알고 있는 균으로부터의 DAN 추출액을 사용하여, 항목 (B)의 대량의 DNA 추출액의 균수를 보정

(1) 항목 (B)에서 제조한 DNA 추출액을 AVE로 희석하였다. 희석한 것을 항목 (A)의 검량선으로 균수를 카운트하였다.

(2) 그리고, 최종적으로 5000 개/μl의 DNA 추출액을 대량으로 제조하였다.

(3) DNA 추출액 15 μl를 1.5 ml 튜브에 소분하여, -80℃에 보존하였다.

(4) 정량 검사에서 사용할 때, 소분한 DNA 추출액을 AVE로 10배, 100배, 1000배 희석하여 사용하였다. 그 결과, 500 개/μl(1000 개/PCR tube), 50 개/μl(100 개/PCR tube), 5 개/μl(10 개/PCR tube)의 DNA 추출액이 되어, 그들 3농도로 검량선을 그었다.

다음으로, Step 1의 기염균 DNA를 주형으로 하여, Step 2의 PCR 조건에서 정량 컨트롤과 함께 nested PCR을 실시하였다. 정량의 1st PCR, 2nd PCR은 이하의 bacterial universal primer(거의 모든 세균을 검출하는 프라이머)를 사용하였다. bacterial universal primer의 target region은, 16S ribosomal RNA 유전자의 bacterial conserved region(거의 모든 세균에 공통되는 염기 서열 영역)이다. 특정 균을 정량하는 것이면, 균종 특이적 프라이머를 사용하면 정량 가능하지만, 패혈증 조기에 있어서 기염균은 판명되지 않아, 균종 특이적 프라이머는 사용할 수 없다. 따라서, bacterial universal primer를 사용하지 않는 한, 미동정 균을 검출하는 것은 불가능하다.

다만, primer와 target region 사이에 1염기의 미스매치라도 있으면 정량 결과에 영향을 미친다(적게 측정된다). bacterial conserved region은 반드시 모든 세균에 있어서 염기 서열이 완전히 일치하고 있는 것은 아니며, 예를 들어 1염기 상이한 2개의 보존 서열이 존재하는 경우 등이 있다. 그 경우, 어느 1개의 서열에 완전 일치하는 프라이머를 사용하면, 1염기 미스매치가 되는 세균에서는 정량 결과가 적게 측정되어 버린다. 이를 해결하기 위해, 본 발명에서는 1염기 상이한 서열 각각에 완전 일치한 프라이머를 등량 혼합함으로써, 쌍방의 정확한 정량을 가능하게 하였다. 이하, 각각에 완전 일치한 2종류의 프라이머의 등량 혼합에 의해, 쌍방의 정확한 정량이 가능하게 된 실험 결과를 나타낸다(도 6).

·도 6의 실험 설명:

세균의 16S ribosomal RNA 유전자의 bacterial conserved region에 관하여, 예를 들어 Tm mapping법이 패턴 1의 프라이머 세트를 사용하는 경우, 1st PCR forward primer의 표적 서열은, 전(全)균종에서 주로 AGAGTTTGATCATGGCTCAG(서열 번호 1) 혹은 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(서열 번호 2)의 1염기 상이한 2종류로 나누어진다.

그래서, 우리는 이하의 3종류의 1st PCR forward primer(reverse primer는 공통)를 사용하여, E. coli(forward primer의 표적 서열: AGAGTTTGATCATGGCTCAG: 서열 번호 1)를 주형으로 하여, 희석 계열을 만들어 standard curve를 작성하였다.

·1st PCR forward primer with no mismatch against E. coli(AGAGTTTGATCATGGCTCAG: 서열 번호 1)

·1st PCR forward primer with one mismatch against E. coli(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG: 서열 번호 2)

·a mix of both 1^st PCR forward primers(no mismatch:one mismatch=1:1)

그 결과, 1^st PCR forward primer with one mismatch를 사용한 PCR에서는, 1st PCR forward primer with no mismatch를 사용한 경우에 비교하여 약 75% 정도까지 정량 결과가 감소하였다. 그러나, a mix of both 1st PCR forward primers (no mismatch:one mismatch=1:1)의 경우, 정량 결과는 1^st PCR forward primer with no mismatch와 거의 변하지 않았다.

즉, 양방의 1st PCR forward primers(no mismatch:one mismatch=1:1)의 혼합물이면, AGAGTTTGATCATGGCTCAG(서열 번호 1) 혹은 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(서열 번호 2) 중 어느 서열의 경우여도, 쌍방을 다 같이 정확하게 정량할 수 있는 것을 나타냈다.

본 예에 사용한 정량용 PCR 프라이머 세트를 이하에 나타낸다.

·1st PCR;

Region 1' forward primer 1a: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(서열 번호 1)

Region 1' forward primer 1b: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(서열 번호 2)

Region 7' reverse primer 1a: 5′-AGACCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 4)

Region 7' reverse primer 1b: 5′-AGGCCCGGGAACGTATTC-3′(서열 번호 5)

·2nd (nested) PCR;

이하의 Region 3' forward primer와 Region 3' reverse primer를 사용한다.

Region 3' forward primer: 5′-AGCAGCCGCGGTAATA-3′(서열 번호 21）

Region 3' reverse primer: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3′(서열 번호 10）

이상, 균수가 이미 알려진 3가지 상이한 농도의 E. coli DNA를 정량 컨트롤로서 사용하여, 정량 컨트롤의 3가지 상이한 농도로 검량선을 그어, 환자 검체에서 추출한 bacterial DNA의 기염균수를 정량하였다. 균수를 정량 컨트롤로서 사용한 E. coli의 균수로서 환산된 값으로서 얻음으로써, 검체 중의 세균수를 보다 간편, 신속하면서 정밀하게 정량하는 것이 가능하게 된다.

이상의 Step 1~Step 4는 본 발명에 관련되는 제1 정량 방법의 일 실시예이다.

(Step 5: 기염균 신속 동정 결과를 이용한 16S ribosomal RNA operon copy number에 의한 균수의 보정)

이상 Step 4에서 정량 컨트롤로서 사용한 E. coli의 균수로서 정량 결과가 산출되었다. 정량에서의 표적 유전자는 16S ribosomal RNA 유전자이지만, 표 1에 세균 게놈에 있어서의 16S ribosomal RNA operon copy number의 다양성을 예시하는 바와 같이, 균종에 따라 16S ribosomal RNA 유전자의 operon copy number가 상이하기 때문에, E. coli의 환산값이 타균종의 균수를 나타내는 것은 아니다.

따라서, 보다 정확한 균의 정량에는 균종마다 operon copy number로의 보정이 필요하게 된다. Step 3 및 Step 4에서 기염균의 동정과 정량을 동시 병행으로 실시하기 때문에, 동정된 기염균의 16S ribosomal RNA operon copy number로 균수를 보정하여, 올바른 균수를 산출할 수 있다.

예를 들어, 대장균을 컨트롤 세균으로서 검량선을 작성하고, 검체로부터 동정된 세균이 Bacillus cereus인 경우, 보정된 세균수=잠정 세균수×(7/13)의 계산식에 의해, 세균수를 보정한다.

이상의 Step 1~ Step 5는 본 발명에 관련되는 제2 정량 방법의 일 실시예이다.

(실시예 2)

실시예 1의 Step 1~Step 4에 의해, 패혈증 환자 검체(EDTA 채혈관 2 mL)를 사용한 기염균 신속 정량 검사를 실시하였다. 증례는 도야마 대학 부속 병원에서 패혈증이 의심되고, 그 후에 혈액 배양 검사가 양성이 된 3가지 증례들이다. 채혈은 항균약 치료 전(pretreatment), 항균약 투여 후 24시간(after 24 hrs.), 및 72시간(after 72 hrs.)에서 실시하고, 그 3포인트들에서 기염균 신속 정량 검사와 함께, 체온, 백혈구수, CRP, 프리셉신(presepsin) 및 IL-6을 측정하였다. 또한, 항균약 치료 전에 채혈한 검체로 혈액 배양법에 의한 기염균의 동정과 약제 감수성 시험을 실시하였다. 각 증례의 개요는 이하와 같다.

증례 1:

·76세 여성, 요로 감염에 수반되는 패혈증

·혈액 배양·요 배양: Escherichia coli

·항생 물질: 메로페넴(meropenem, 감수성 있음)

　증례 2:

·88세 여성, 췌장암 말기에 합병된 폐색성 담관염에 수반되는 패혈증

·혈액 배양: Klebsiella oxytoca, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae

·항생 물질: 세페핌(cefepim, K. oxytoca와 H. influenzae는 감수성 있음. S. pneumoniae는 중간.)

증례 3:

·94세 여성, 요로 감염에 수반되는 패혈증

·혈액 배양·요 배양: Escherichia coli

·항생 물질: 타조박탐(tazobactam)/피페라실린(piperacillin)(감수성 있음)

각 증례에 있어서의 검사 결과를 표 2~4 및 도 7~도 9에 나타낸다. 또한, 도 7~9에 있어서의 부호는 이하의 각 측정 항목을 나타내고, 각 도면에 나타내는 "○"의 위치의 측정값을 각 표에 나타낸다.

a: Pathogen: 본 발명에 관련되는 방법으로 측정한 기염균의 균수

b: WBC: 백혈구수[×100/μL]

c: CRP: C-리액티브 프로테인[mg/L]

d: BT: 체온(body temp.) [℃]

e: Presepsin: 프리셉신[ng/mL]

f: IL-6: 인터류킨-6[pg/mL]

(실시예 3)

실시예 1의 Step 1~Step 5에 의해, 패혈증 환자 검체(EDTA 채혈관 2 mL)를 사용한 기염균 신속 동정·정량 검사를 실시하였다. 증례는 도야마 대학 부속 병원에서 패혈증이 의심되고, 그 후에 혈액 배양 검사가 양성이 된 4가지 증례들이다. 채혈은 항균약 치료 전(pretreatment), 항균약 투여 후 24시간(after 24 hrs.), 및 72시간(after 72 hrs.)에서 실시하고, 그 3포인트들에서 기염균 신속 동정·정량 검사와 함께, 체온, 백혈구수, CRP, 프리셉신, IL-6을 측정하였다. 또한, 항균약 치료 전에 채혈한 검체로 혈액 배양법에 의한 기염균의 동정과 약제 감수성 시험을 실시하였다. 각 증례의 개요는 이하와 같다.

증례 4:

·76세 여성, 요로 감염에 수반되는 패혈증

·Tm mapping법: Escherichia coli(Dist. 값=0.29)

·혈액 배양·요 배양: Escherichia coli

·항생 물질: 메로페넴(감수성 있음)

　증례 5:

·94세 여성, 요로 감염에 수반되는 패혈증

·Tm mapping법: Escherichia coli(Dist. 값=0.19)

·혈액 배양·요 배양: Escherichia coli

·항생 물질: 타조박탐/피페라실린(감수성 있음)

증례 6:

·84세 여성, 요추전방 고정술 후 창부(創部) 감염에 수반되는 패혈증

·Tm mapping법: Streptococcus dysgalactiae (Dist. 값=0.28)

·혈액 배양: Streptococcus dysgalactiae

·항생 물질: 타조박탐/피페라실린(감수성은 판정 기준 없음)

증례 7:

·81세 여성, 요로 감염에 수반되는 패혈증

·Tm mapping법: Enterobacter aerogenes(Dist. 값=0.48)

·혈액 배양·요 배양: Enterobacter aerogenes(mutant strains 2종류)

·항생 물질: 타조박탐/피페라실린(감수성 있음)

각 증례에 있어서의 검사 결과를 표 5~8 및 도 10~도 13에 나타낸다. 또한, 도 7~10에 있어서의 부호는 이하의 각 측정 항목을 나타내고, 각 도면에 나타내는 "○"의 위치의 측정값을 각 표에 나타낸다.

b: WBC: 백혈구수[×100/μL]

c: CRP: C-리액티브 프로테인(reactive protein)[mg/L]

d: BT: 체온(body temp.) [℃]

e: Presepsin: 프리셉신[ng/mL]

f: IL-6: 인터류킨-6[pg/mL]

(실시예 4)

실시예 1의 Step 1~Step 4에 의해, 패혈증이 의심되는 환자 혈액 검체, EDTA 채혈관 2 mL, 2개를 사용한 기염균 신속 동정·정량 검사를 실시하였다. 다만, 채혈한 2개 중 1개는, 전혈(全血)을 100×g, 5분간 원심하여 혈구를 분리한 후, 얻어진 상청을, 버피코트를 포함하여 회수하고, 이것을 보텍스 믹서로 균일하게 혼합하고, 그것으로부터 500 μL를 회수하고, 회수액에 대해, 20,000×g, 10분의 원심에 의해 펠릿화, 집균의 조작을 실시하였다. 2개 중 다른 1개는, 상술한 바와 같이 혈구를 분리한 후, 얻어진 상청을 버피코트를 포함하지 않도록 500 μL 회수하고, 이것을 20,000×g, 10분의 강원심에 의해 펠릿화, 집균의 조작을 실시하였다.

버피코트 있음은 탐식한 백혈구를 포함하고, 버피코트 없음은 탐식한 백혈구를 포함하지 않는 혈장만으로 된다. 실제로는 환자 중 및 환자 검체 중에서 감염은 일어나지 않고, 채혈 시의 피부 상재균이나 작업 환경, 기구 상 오염에서 유래하는 세균 DNA가 검출된 경우는, 이들 세균은 백혈구에 의해 탐식되지 않아, 버피코트의 유무에 따른 균수차는 없게 된다. 한편, 검출균되는 세균이 기염균이면, 환자 혈중에서 백혈구에 탐식되게 되어, 균수는 반드시 버피코트 있음의 쪽이, 버피코트 없음보다도 현격히 많아질 것이다.

각 검체로부터 얻어진 결과의 일례를 표 9~13에 나타낸다.

표 9 및 10의 검체에서의 결과는, 버피코트 있음에서의 세균수가 크고, 또한, 버피코트 없음의 세균수를 크게 상회하였다. 이러한 점에서 Tm Mapping에 의해 동정된 세균이, 매우 높은 확률로 기염균이라고 판정할 수 있다. 또한 이들 검체에 관하여는, 본 방법에 의한 세균 동정·정량과 동시에 실시한 혈액 배양에 있어서도, 동일한 세균 내지는 세균종이 현저하게 검출되었다.

표 11의 검체는, 버피코트 있음에서의 세균수가 커 감염이 예상되었다. 다만, 표 9 및 표 10에 비해 버피코트 유무에서의 균수차는 작고, 버피코트 있음의 시험구에 있어서, 우연히 컨태미네이션이 발생하거나, 정량의 오차가 발생한 것도 상정되었다.

그래서, 멸균수를 샘플로 간주하여, 채혈관에 대한 샘플링으로부터, 실시예 1의 Step 1~Step 4의 조작을 거쳐, 네거티브 컨트롤에 상당하는 샘플 내의 균수 정량을 복수회 실시하였다. 그 결과, 우리의 시험 환경하에서는, 대장균 환산으로 100 균/ml에 상당하는 숫자가, 원래의 검체에서 유래하지 않고, 검출되는 경우가 있는 것을 알 수 있었다.

즉, 가령 환자 검체 내에 기인균이 존재하지 않아도, 버피코트 있음, 내지는 없음의 샘플 각각으로부터, 오차로서 100 균/ml의 정량값을 얻을 수 있다. 또한, 버피코트 있음, 없음의 사이에서 균수차가 있던 경우여도, 100 균/ml 이하의 차이면 오차에서 유래할 가능성이 있다는 것이 된다.

이 결과에 입각하여, 표 11의 결과를 해석하면, 이하와 같이 판정할 수 있다.

검체 번호 84는 버피코트 있음, 없음 각각 오차 범위인 100 균/ml를 초과하는 숫자이지만, 양자에서의 차가 없는 점에서 백혈구에 의한 탐식은 없고, 검출된 세균은 기염균이 아니라고 판단된다.

검체 번호 89는 버피코트 있음에서 87.5 균/ml로 산출되어, 버피코트 없음에 대해, 큰 숫자로는 되어 있지만, 오차 범위 이하이며, 검출된 세균, 세균수는 기인균이라고는 단정할 수 없어 판정 불능.

검체 번호 16, 54, 56, 66, 78, 98, 133, 137은 각 검체의 버피코트 있음에서, 오차 범위보다 큰 균수가 산출되고, 또한 버피코트 없음과의 균수차도 오차 범위보다 큰 숫자이며, 검출된 세균은 기인균일 가능성이 높다.

종래의 세균 동정법인 배양에 의한 결과가 얻어지는(며칠 후) 것 보다도 빠르게 4, 5시간으로 이러한 판정을 하는 것이 가능하게 된다.

이상의 결과, 혈액 중의 균수는 치료 후 단시간에 다른 어떠한 바이오마커보다도 극적으로 변동되었다. 이 결과로부터, 균수는 패혈증의 새로운 우수한 바이오마커인 것이 시사되었다. 그리고, 균수의 임상 데이터를 세계에서 처음으로 제공할 수 있는 본 검사법은 향후의 감염증 의료에 있어서 매우 유용하다고 생각한다.

SEQUENCE LISTING <110> National University Corporation University Toyama and Mitsui chemicals, inc. <120> A quantification method of bacterial count in a sample <130> 18-0042-MC <150> JP 2017-246724 <151> 2017-12-22 <150> JP 2017-246333 <151> 2017-12-22 <160> 24 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 1 agagtttgat catggctcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 3 ccgggaacgt attcacc 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 4 agacccggga acgtattc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 5 aggcccggga acgtattc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 6 cgtaggagtc tggaccgt 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 7 gactcctacg ggaggca 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 8 tattaccgcg gctgctg 17 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 9 agcagccgcg gtaata 16 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 10 ggactaccag ggtatctaat cct 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 11 aacaggatta gataccctgg tag 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 12 aattaaacca catgctccac c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 13 tggtttaatt cgatgcaacg c 21 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 14 gagctgacga cagccat 17 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 15 ttgggttaag tcccgc 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 16 cgtcatcccc accttc 16 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 17 ggctacacac gtgctacaat 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 18 gcaggcttaa cacatgcaag tcg 23 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 19 gtccagactc ctacgggag 19 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 20 cctacgtatt accgcgg 17 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 21 agcagccgcg gtaata 16 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 22 gttaagtccc gcaacgag 18 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 23 ccattgtagc acgtgtgtag cc 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 24 ggctacacac gtgctacaat gg 22

Claims

이하의 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법:
(1) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,
(2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정, 및
(3) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 세균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정.
제 1 항에 있어서,
이하의 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법:
(A) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,
(B) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정,
(C) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 이미 알려진 세균 수에 대응한 핵산 시료를 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,
(D) 상기 제3 PCR 공정에 의해 얻어진 제3 증폭 산물을 사용하여 nested PCR법에 의해 제4 증폭 산물을 얻는 제4 PCR 공정,
(E) 상기 이미 알려진 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량용 데이터를 작성하는 공정, 및
(F) 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검량용 데이터를 이용하여 상기 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정.
제 2 항에 있어서,
상기 공정 (C), (E) 및 (F)를, 이하의 공정에 의해 실시하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
(C-1) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 상이한 복수의 이미 알려진 세균수에 대응한 복수의 핵산 시료를 각각 개별적으로 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,
(E-1) 상기 이미 알려진 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량선을 작성하는 공정, 및
(F-1) 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검량선을 이용하여 상기 검체 중의 세균수를 구하는 균수 정량 공정.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 PCR 공정에 있어서의 유전자 증폭이 플래토가 되지 않는 사이클수로 상기 제1 PCR 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 증폭 산물을 포함하는 반응액을 희석하여 상기 제2 PCR 공정에 제공하는 희석 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
동일 PCR 장치 내에서, 상기 제1 PCR 공정과 상기 제3 PCR 공정을 병행하여 실시하고, 또한, 동일 PCR 장치 내에서, 상기 제2 PCR 공정과 상기 제4 PCR 공정을 병행하여 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 PCR 공정을 복수의 프라이머 쌍을 각각 개별적으로 사용하여 실시하고, 각 프라이머 쌍에서 증폭된 복수의 증폭 산물의 융해 온도(Tm값)의 조합 또는 Tm값간의 차의 조합에 기초하여 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 공정을 더 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 제2 PCR 공정용 복수의 프라이머 쌍 중 적어도 1개를 사용하여 상기 제4 PCR 공정을 실시하고, 다만, 복수의 프라이머 쌍을 사용하는 경우는, 복수의 프라이머 쌍을 각각 개별적으로 사용하여 제4 PCR 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 컨트롤 세균이, 대장균인 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 PCR 공정에 사용하는 유니버설 프라이머 쌍에 있어서, 포워드 프라이머, 리버스 프라이머의 일방 또는 양방이, 1염기 상이한 2종의 프라이머가 등량 혼합된 것인, 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
이하의 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법:
(1) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,
(2) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정,
(3) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균 유래의 증폭 산물의 양과 상기 컨트롤 세균의 세균수의 관계를 나타내는 검량용 데이터를 이용하여, 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정,
(4) 상기 제1 PCR 공정 및 제2 PCR 공정을 이용하여 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정, 및
(5) 상기 균수 정량 공정에서 구한 잠정 세균수를, 상기 컨트롤 세균 및 상기 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 보정해서 상기 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.
제 11 항에 있어서,
이하의 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법:
(A) 검체 유래의 핵산을 주형으로 하여, 세균의 16S rRNA 유전자의 증폭용 유니버설 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 제1 증폭 산물을 얻는 제1 PCR 공정,
(B) 상기 제1 PCR 공정에 의해 얻어진 제1 증폭 산물이 갖는 서열의 내부 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 nested PCR법에 의해 제2 증폭 산물을 얻는 제2 PCR 공정,
(C) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 이미 알려진 세균수에 대응한 핵산 시료를 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,
(D) 상기 제3 PCR 공정에 의해 얻어진 제3 증폭 산물을 사용하여 nested PCR법에 의해 제4 증폭 산물을 얻는 제4 PCR 공정,
(E) 상기 이미 알려진 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량용 데이터를 작성하는 공정,
(F) 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검량용 데이터를 이용하여 상기 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정,
(G) 상기 제1 PCR 공정 및 제2 PCR 공정을 이용하여 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 균종 동정 공정, 및
(H) 상기 균수 정량 공정에서 구한 잠정 세균수를, 상기 컨트롤 세균 및 상기 균종 동정 공정에서 동정된 균종의 16S rRNA 오페론 카피수에 기초하여 보정해서 상기 검체 중의 세균수를 확정하는 세균수 보정 공정.
제 12 항에 있어서,
상기 공정 (C), (E) 및 (F)를, 이하의 공정에 의해 실시하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
(C-1) 균종이 이미 알려져 있는 컨트롤 세균의 상이한 복수의 이미 알려진 세균수에 대응한 복수의 핵산 시료를 각각 개별적으로 사용하여 PCR법에 의해 제3 증폭 산물을 얻는 제3 PCR 공정,
(E-1) 상기 이미 알려진 균수와 상기 제4 증폭 산물의 양으로부터 검량선을 작성하는 공정, 및
(F-1) 상기 제2 PCR 공정에서 얻어진 제2 증폭 산물의 양으로부터 상기 검량선을 이용하여 상기 검체 중의 잠정 세균수를 구하는 균수 정량 공정.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 PCR 공정에 있어서의 유전자 증폭이 플래토가 되지 않는 사이클수로 상기 제1 PCR 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 증폭 산물을 포함하는 반응액을 희석하여 상기 제2 PCR 공정에 제공하는 희석 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
동일 PCR 장치 내에서, 상기 제1 PCR 공정과 상기 제3 PCR 공정을 병행하여 실시하고, 또한, 동일 PCR 장치 내에서, 상기 제2 PCR 공정과 상기 제4 PCR 공정을 병행하여 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 균종 동정 공정이, 제2 PCR 공정을 복수의 프라이머 쌍을 각각 개별적으로 사용하여 실시하고, 각 프라이머 쌍에서 증폭된 복수의 증폭 산물의 융해 온도(Tm값)의 조합 또는 Tm값간의 차의 조합에 기초하여 상기 검체 중의 세균 균종을 동정하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 제2 PCR 공정용 복수의 프라이머 쌍 중 적어도 1개를 사용하여 상기 제4 PCR 공정을 실시하고, 다만, 복수의 프라이머 쌍을 사용하는 경우는, 복수의 프라이머 쌍을 각각 개별적으로 사용하여 제4 PCR 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 컨트롤 세균이, 대장균인 것을 특징으로 하는 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 PCR 공정에 사용하는 유니버설 프라이머 쌍에 있어서, 포워드 프라이머, 리버스 프라이머의 일방 또는 양방이, 1염기 상이한 2종의 프라이머가 등량 혼합된 것인, 검체 중의 세균수를 정량하는 방법.