TW202246525A - 基因體序列之改善之偵測及用於其之探針分子 - Google Patents

Abstract

本發明提供利用虛擬探針鑑別可存在於樣本中之同源基因體序列之方法、用於區分同源基因體序列之陣列、用於區分同源基因體序列之系統、以及可用於本發明之該等方法、陣列、及系統中之探針分子。

Description

基因體序列之改善之偵測及用於其之探針分子

相關申請之交叉引用

本申請案主張2021年1月20日申請之美國臨時申請案第63/139,643號之優先權，其內容以全文引用的方式併入本文中。 序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2022年1月18日創建，命名為SGB-009WO_ST25且大小為1,550位元組。

傳染病原之鑑別在確定個體之恰當診斷及治療過程中通常為至關重要的。傳染原之錯誤鑑別可導致治療過程之不當或無效。對定序技術之改善有助於部分或完全確定多種致病細菌之基因體之序列。密切相關之細菌物種通常包含具有極高程度序列一致性的基因體序列。密切相關之物種之間的區分需要偵測兩個或更多個同源基因體序列之間的差異之靈敏且準確的方法。在一些情況下，使用單一寡核苷酸探針分子區分同源基因體序列可能為不切實際的，甚至不可能的。

因此，需要用於準確區分密切相關之微生物物種的新方法。

本發明提供改善之鑑別可存在於樣本中之基因體序列及/或區分可存在於樣本中之同源基因體序列之方法。該等方法利用探針分子之組合，該等探針分子個別地無法區分但一起可區分來自密切相關物種之微生物之同源基因體序列，且亦可鑑別可能存在於樣本中之基因體序列。為方便起見，探針分子之此類組合在本文中稱為「虛擬探針（virtual probe）」。

虛擬探針可包含複數個（例如兩個、三個、或多於三個）個別探針分子。在無定序之情況下，基因體DNA（或自基因體DNA擴增之PCR產物）與個別探針分子之雜交可能不足以區別基因體DNA與可存在於同一樣本中之基因相關物種之同源基因體DNA，尤其當使用靶向相關物種中保守序列之通用引子來擴增基因體DNA時。然而，當基因體DNA或對應PCR擴增子用包含兩個或更多個探針分子之虛擬探針探測時，與虛擬探針的雜交模式之差異可區別來自兩個相關物種之基因體DNA或自其擴增之同源擴增子。

因此，藉助於包含複數個探針分子（例如具有可區分信號之探針分子），本發明之虛擬探針可組合區分基因體序列與同源基因體序列（或自其等製備之擴增子）且鑑別存在於生物樣本中之微生物物種。舉例而言，根據本發明之方法，兩個或三個寡核苷酸探針分子之組合可組合形成虛擬探針，其區分來自相關物種，諸如凝固酶陰性葡萄球菌屬物種（coagulase negative Staphylococcus sp.）（例如，人類葡萄球菌（ S. hominis））及凝固酶陽性葡萄球菌屬物種（coagulase positive Staphylococcus sp.）（例如，金黃色葡萄球菌（ S. aureus））之擴增子。因此，當樣本用作模板DNA之來源時，例如在PCR反應中，任何所得PCR產物與虛擬探針之雜交可確定兩個物種中之哪個存在於樣本中。

在認識到使用來自細菌16S rRNA基因之序列設計的物種特異性寡核苷酸探針分子在不同物種中展示交叉反應性之後，開發了使用本文所揭示之虛擬探針鑑別同源基因體序列之方法。由於基因體之此區域之序列之間的低變化性，無法設計物種特異性探針分子。然而，發現不同物種仍可藉由分析來自雜交至虛擬探針之信號來區分，該虛擬探針組合多個寡核苷酸探針分子，該等寡核苷酸探針分子本身不能單獨區分不同物種。

進一步發現，當使用虛擬探針時，微生物鑑別之準確性可藉由將探針包括於虛擬探針中來改善，該探針能夠與來自多種密切相關物種（例如凝固酶陰性葡萄球菌屬物種及凝固酶陽性葡萄球菌屬物種）之同源基因體序列雜交，使得來自探針之信號可提供樣本中同源基因體序列之相對量的度量。為方便起見，此類探針在本文中稱為「計量探針（meter probe）」。當計量探針之信號等於或高於臨限值時，例如，第一式可用於分析虛擬探針之探針的雜交信號，且當計量探針之信號低於臨限值時，可使用第二式。藉由使用考慮相對樣本濃度之用於微生物鑑別的不同式，而非針對所有樣本使用單個式，可提高微生物鑑別之準確性。

當使用具有在虛擬探針之一或多個其他探針分子之前達到飽和的探針分子之虛擬探針時，計量探針可尤其可用於提高微生物鑑別之準確性。當虛擬探針之一個探針分子在一或多個其他探針分子之前達到飽和時，在探測樣本時所獲得之信號模式可視樣本中之目標序列之濃度而變化。在瞭解測試樣本中之目標序列之相對量的情況下，可使用對目標序列之相對濃度具有特異性之式分析測試樣本所獲得之信號模式，例如若相對濃度較高（例如，其中計量探針之信號高於臨限值），則可使用第一式分析雜交模式，且若相對濃度較低（例如，其中計量探針之信號低於臨限值），則使用第二式分析雜交模式。實施例6例示計量探針的使用，以增加將樣本鑑別為含有凝固酶陰性葡萄球菌屬物種或凝固酶陽性金黃色葡萄球菌之準確性。由計量探針提供之微生物鑑別的提高準確性表示優於不利用計量探針之現有微生物偵測方法的顯著改善。

在一些態樣中，本發明提供偵測第一微生物（或相應第一基因體）及/或第二微生物（或相應第二基因體）是否存在於樣本中之方法。在特定實施方式中，樣本為血液樣本。藉由允許自血液樣本偵測，本發明之方法表示優於需要使用需要額外時間及費用來製備的臨床分離物之偵測方法的顯著改善。

本發明之方法可包含用針對第一生物體及第二生物體之虛擬探針探測樣本，以確定對應於第一基因體或第二基因體之一或多個目標核酸存在或不存在。目標核酸可為例如基因體片段或在DNA擴增反應（諸如PCR）中產生之擴增子。虛擬探針包含兩個或更多個探針分子，其中之每一者能夠與對應於第一基因體之一或多個目標核酸及/或對應於第二基因體之一或多個同源目標核酸特異性雜交。由於探針分子與對應於第一及第二基因體之目標核酸之雜交併不一致，因此虛擬探針可區分對應於第一基因體之目標核酸與對應於第二基因體之目標核酸。虛擬探針較佳包括計量探針。

例示性方法包含以下步驟： （a）    使用一或多對能夠與第一及第二基因體（若存在於樣本中）雜交且自該第一及第二基因體起始PCR擴增之PCR引子對樣本進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction；PCR）擴增反應。各引子集合產生較佳對樣本中可能存在之各生物體而言獨特的擴增子集合。因此，擴增在第一基因體存在之情況下產生第一擴增子集合且在第二基因體存在於樣本中之情況下產生第二不同擴增子集合。若僅使用單對PCR引子，則各擴增子集合僅含有單一擴增子，且當使用複數個PCR引子對時，擴增子集合可含有兩種或更多種擴增子（例如複數個單一擴增子）。 （b）    在步驟（a）之後，用虛擬探針探測任何所得PCR擴增產物以確定第一擴增子集合及第二擴增子集合存在或不存在。由於虛擬探針包含兩個或更多個能夠以獨特方式與第一擴增子集合及第二擴增子集合特異性雜交的探針分子（例如兩個或更多個寡核苷酸探針分子），因此虛擬探針可區分第一擴增子集合與第二擴增子集合。各虛擬探針內之探針分子可藉助於具有不同標記（例如，螢光標記，例如用不同螢光標記標記之分子信標）或安置於陣列上之不同的位置來區分。

因此，PCR反應之PCR擴增產物與虛擬探針之雜交可區分第一與第二基因體，由此鑑別樣本中第一及/或第二生物體之存在。如本文所用，對樣本中之生物體之存在的提及並不意謂樣本具有活生物體，僅僅意謂來自生物體之足夠基因體DNA存在於待偵測或充當用於擴增反應（諸如PCR反應）之模板的樣本中。同樣，對樣本中基因體之存在的提及並不意謂樣本具有完整基因體，僅僅意謂來自基因體之足夠DNA存在於待偵測或充當用於擴增反應（諸如PCR反應）之模板的樣本中。

舉例而言，當單一引子集合用於PCR擴增反應中時，第一擴增子集合及第二擴增子集合可各自包含一個擴增子（分別稱為「第一擴增子（first amplicon）」及「第二擴增子（second amplicon）」）。可替代地，例如當超過一個引子集合用於PCR擴增反應中時，第一擴增子集合及/或第二擴增子集合可包含超過一個擴增子（第一擴增子集合中之各擴增子稱為「第一擴增子」且第二擴增子集合中之各擴增子稱為「第二擴增子」）。用於區分同源擴增子與同源基因體序列之其他例示性方法描述於章節6.2及編號實施方式1至98、142至147及151中，見下文。

本發明進一步提供用於區分同源基因體序列之陣列、用於區分同源基因體序列之系統、以及可用於例如本發明之方法、陣列及系統中之寡核苷酸探針分子。

在一個態樣中，本發明提供用於區分來自第一基因體之第一基因體序列與來自第二基因體之第二同源基因體序列之可定址陣列。舉例而言，可在本文所描述之方法中使用本發明之可定址陣列。本發明之可定址陣列可包含位置上可定址之寡核苷酸探針分子之群，該等位置上可定址之寡核苷酸探針分子各自處於陣列上之不同的位置處，其中寡核苷酸探針分子之群中之各探針分子包含與第一基因體序列或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列。可定址陣列典型地包含一或多個計量探針且可進一步視需要包含一或多個對照探針分子。

本發明之例示性可定址陣列描述於章節6.3及編號實施方式99至141及173至175中，見下文。

在一些態樣中，電腦實施本發明之方法之一或多個步驟。例示性電腦實施方法描述於章節6.4及編號實施方式97、98、146及147中，見下文。

在另一態樣中，本發明提供用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列（若存在於樣本中）之系統。例示性系統可包含： （a）    光學讀取器，其用於產生本發明之陣列的各探針分子位置之信號數據；及 （b）    至少一個處理器，其： （i）     經配置以自該光學讀取器接收信號數據； （ii）    經配置以分析一或多個虛擬探針（例如，具有如本文中所描述之特徵的虛擬探針）之信號數據；及 （iii）   具有至用於輸出分析結果之儲存或顯示裝置或網路之介面。

例示性系統描述於章節6.5及編號實施方式148至150中，見下文。

在另一態樣中，本發明提供適用於虛擬探針之例示性寡核苷酸探針分子及包含此類寡核苷酸探針分子中之兩者或更多者的套組。本發明之寡核苷酸探針分子可包括於本發明之可定址陣列上及/或用於本發明之方法中。例示性寡核苷酸探針分子及虛擬探針描述於章節6.2.4及編號實施方式156至172中，見下文。例示性套組描述於章節6.6及編號實施方式176至187中，見下文。

6.1. 定義

擴增子：擴增子為由PCR擴增反應產生之核酸分子。

不對稱引子對：由延伸引子及未延伸引子組成之引子對。

對應：關於具有序列一致性或互補之不同長度之兩個核酸股，術語「對應（corresponding）」係指存在於兩個股中之序列重疊或互補的區域，如上下文指示。

直接重複序列：在延伸引子之「B」區之情形下，「直接重複序列（Direct Repeat）」意謂係「A」區之一部分的直接互補序列的核苷酸序列（亦即，具有相同5'至3'次序之互補序列）。

延伸引子：含有以下之PCR引子：（a）其3'端處之「A」區，該區與目標股1中之對應區具有至少75%序列一致性或與目標股2中之對應區至少75%序列互補；（b）其5'端處之「B」區，該區包含與「A」區之至少一部分互補之序列；以及（c）視需要存在之「C」區，其安置於「A」區與「B」區之間。

同源基因體序列：同源基因體序列為具有共同祖先但核苷酸序列不一致之不同物種或菌株中發現之基因體序列。例示性同源基因體序列包括16S rRNA基因、23S rRNA基因及16S-23S內轉錄間隔區（internal transcribed spacer；ITS）序列。

反向重複序列：在延伸引子之「B」區之情形下，「反向重複序列（Inverted Repeat）」意謂係「A」區之一部分的反向互補序列的核苷酸序列（亦即，具有相反5'至3'次序之互補序列）。

解鏈溫度 （ T _m ）：DNA雙螺旋中之一半將解離變為單股之溫度。由去氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide；DNA）構成之線性引子之T _m通常藉由以下計算：「百分比GC（percent GC）」法（《PCR方案，方法及應用指南（PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications）》, Innis等人編, 學術出版社（Academic Press）（加利福尼亞州聖地亞哥（美國）（San Diego, Calif. (USA)）1990）或「2（A+T）加4（G+C）」法（Wallace等人, 1979, Nucleic Acids Res. 6（11）:3543-3557）或「最近鄰（Nearest Neighbor）」法（Santa Lucia, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1460-1465：及Allawi及Santa Lucia, 1997, Biochem. 36:10581-10594）。出於申請專利範圍之目的，根據「最近鄰」法計算DNA之T _m，且非天然存在之鹼基（例如2-去氧肌苷）視為腺嘌呤。

PCR 產物股 1：PCR產物股1係指由目標核酸及不對稱引子對產生之雙股PCR產物中之股，其與不對稱引子對之未延伸引子互補。

PCR 產物股 2：PCR產物股1係指由目標核酸及不對稱引子對產生之雙股PCR產物中之股，其與不對稱引子對之延伸引子互補。

PCR 試劑：除非上下文另外規定，否則術語「PCR試劑（PCR Reagent）」係指除模板核酸、熱穩定聚合酶及引子以外的PCR反應之組分。PCR試劑典型地包括dNTP（且除未經標記之dNTP以外，亦可包括經標記（例如經螢光標記）之dNTP）、緩衝劑及含有二價陽離子之鹽（例如MgCl ₂）。

引子：具有至少12個核苷酸之DNA寡核苷酸，該寡核苷酸在其3'末端具有自由羥基。引子可包括天然存在及非天然存在之核苷酸（例如，含有通用鹼基之核苷酸，諸如3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或2-去氧肌苷，2-去氧肌苷為較佳的）。除非上下文另外規定，否則術語「引子（primer）」亦指引子分子之混合物，該混合物係在將混合鹼基包括於引子設計及構築中以使得其與目標核酸分子中之變異序列雜交時產生。目標序列變異體可為物種間或物種內變異體。混合鹼基之標準命名展示於表1中：

表 1 混合鹼基命名
R	A、G
Y	C、T
M	A、C
K	G、T
S	C、G
W	A、T
H	A、C、T
B	C、G、T
V	A、C、G
D	A、G、T
N	A、C、G、T

較佳地，各引子在與目標核酸之互補區中含有不超過三個混合鹼基。在一些實施方式中，引子在與目標核酸之互補區中含有零個、一個、兩個或三個混合鹼基。

引子對：正向及反向引子對（其中之每一者可為具有序列變異之引子之混合物，以考慮目標序列中之可能變異），其能夠與以下雜交且起始自以下之DNA聚合反應：少於5,000個鹼基對之區域內之同一核酸分子之不同股。在某些實施方式中，引子對能夠與以下雜交且起始自以下之DNA聚合反應：少於2,500個鹼基對或少於1,500個鹼基對之區域內之同一核酸分子之不同股。

樣本：如本文所用，術語「樣本（sample）」係指含有或懷疑含有所關注之核酸，例如基因體、基因體片段、對應於基因體區域之擴增子或另一目標核酸之任何樣本。樣本可經受一或多個過程且仍視為「樣本」。舉例而言，經受PCR擴增反應之樣本在PCR擴增反應之後仍為「樣本」。

單一擴增子：如本文所用，術語「單一擴增子（single amplicon）」係指藉由具有單一引子對之單一生物體的PCR擴增反應產生之核酸分子或核酸分子之群。典型地，「單一擴增子」係指具有獨特序列之PCR產物，但亦可指具有一組，例如一對獨特序列的PCR產物，例如當生物體對於所擴增之序列為異型接合時。

特異性：如本文所用，關於探針分子與擴增子之結合的術語「特異性（specific）」意謂探針分子對其目標擴增子之親和力比其他非同源擴增子更大，典型地具有大得多的親和力，但並不要求探針分子對其目標具有絕對特異性。因此，探針分子可例如能夠與包含第一基因體序列之擴增子及包含第二同源基因體序列之擴增子雜交，該第二同源基因體序列與第一基因體序列有一或多個核苷酸不同。

目標股 1：目標股1係指與不對稱引子對中之未延伸引子互補的雙股目標核酸中之股。

目標股 2：目標股2係指與不對稱引子對中之延伸引子中的「A」區互補的雙股目標核酸中之股。

未延伸引子：PCR引子，其基本上由與目標股2中之對應區具有至少75%序列一致性或與目標股1中之對應區具有至少75%序列互補性的核苷酸序列組成。關於未延伸引子之術語「基本上由……組成（consisting essentially of）」意謂核苷酸序列可含有與目標序列之互補區的5'處的不超過3個額外核苷酸（至少75%）。 6.2. 使用虛擬探針區分同源基因體序列之方法

本發明提供區分來自第一生物體之第一基因體序列與來自第二生物體之第二同源基因體序列之方法。該等方法允許使用虛擬探針鑑別樣本中所存在之生物體。用於基因體序列之虛擬探針通常包含兩個或更多個探針分子，該等探針分子可例如藉助於其在可定址陣列上之不同的位置或藉由例如不同螢光部分之差異標記來區分。為方便起見，來自虛擬探針內之個別探針分子之讀數在本文中有時稱為「信號（signal）」。為了清楚起見，探針分子無需標記以產生「信號」。舉例而言，不存在與經螢光標記之擴增子之雜交可構成「信號」。

用於基因體序列之各虛擬探針含有至少一個能夠與對應於基因體序列之目標核酸（例如擴增子）特異性雜交之探針分子（構成虛擬探針之複數個探針分子中之至少一個）。在一些情況下，虛擬探針中之兩個或更多個探針分子能夠與對應於基因體序列之目標核酸（例如擴增子）雜交。虛擬探針中之探針分子與來自相關基因體序列之不同目標核酸（例如擴增子）之雜交模式充分不同，以便區分來自相關基因體序列的目標核酸，例如區分來自第一基因體之第一擴增子集合與來自具有同源基因體序列之第二基因體之第二擴增子集合。該等方法可用於例如確定特定物種或細菌菌株是否存在於樣本中，探測之擴增子係直接（例如，其中樣本直接用於PCR中）或間接（例如，經由中間純化或富集步驟，諸如章節6.2.1中所描述之珠磨（bead beating）方法）自該樣本擴增。本文所揭示之各種實施方式描述用虛擬探針探測諸如PCR反應之DNA擴增反應之產物；然而，應理解，探測可使用能夠偵測非擴增基因體DNA之方法替代地進行。用於偵測非擴增基因體DNA之例示性方法描述於《非擴增基因體DNA之偵測（ Detection of Non-Amplified Genomic DNA）》2012, Spoto及Corradini（編）doi.org/10.1007/978-94-007-1226-3中，其內容以全文引用之方式併入。此類方法包括光學偵測方法（參見例如《非擴增基因體DNA之偵測》中之Li及Fan, 2012, 「非擴增基因體DNA之光學偵測（Optical Detection of Non-amplified Genomic DNA）」, 第153-183頁）、電化學偵測方法（參見例如《非擴增基因體DNA之偵測》中之Marin及Merkoçi, 2012, 「使用基於奈米材料之感測器之DNA電化學偵測（Electrochemical Detection of DNA Using Nanomaterials Based Sensors）」, 第185-201頁）、壓電感測方法（參見例如《非擴增基因體DNA之偵測》中之Minunni, 2012, 「用於DNA靈敏偵測之壓電感測（Piezoelectric Sensing for Sensitive Detection of DNA）」, 第203-233頁）、基於表面電漿子共振之方法（參見例如《非擴增基因體DNA之偵測》中之D'Agata及Spoto, 2012, 「基於表面電漿子共振之方法（Surface Plasmon Resonance-Based Methods）」, 第235-261頁），以及平行光學及電化學方法（參見例如《非擴增基因體DNA之偵測》中之Knoll等人, 2012, 「平行光學及電化學DNA偵測（Parallel Optical and Electrochemical DNA Detection）」, 第263-278頁）。因此，在一些實施方式中，在不存在DNA擴增步驟之情況下進行樣本探測（例如，其中樣本含有或疑似含有目標核酸，該目標核酸為基因體片段）。

確定來自第一生物體之第一基因體或來自第二生物體之第二基因體（若任一存在於樣本中）之存在的方法可包含使用能夠與第一基因體及第二基因體雜交且起始自第一基因體及第二基因體之PCR擴增的PCR引子對樣本進行PCR擴增反應（例如如章節6.2.3中所描述）之步驟。自第一基因體（若存在於樣本中）之擴增產生第一擴增子集合。自第二基因體（若存在於樣本中）之擴增產生第二擴增子集合。PCR擴增產物可用虛擬探針探測以確定第一擴增子集合及第二擴增子集合存在或不存在。探測可在PCR擴增反應期間（例如當使用即時PCR時，例如如章節6.2.3.5中所描述）或在PCR擴增反應之後（例如藉由使用包含寡核苷酸探針分子之陣列，例如如章節6.3中所描述）進行。當在PCR反應之後，例如在陣列上進行探測時，在PCR混合物中包括經螢光標記之核苷酸以標記所得PCR擴增子係有用的。可定址陣列上之螢光標記之位置及在一些情況下其強度可構成信號，該等信號係構成虛擬探針之探針分子的信號。

若確定第一擴增子集合存在，則可得出以下結論：樣本含有第一基因體。同樣，若確定第二擴增子集合存在，則可得出以下結論：樣本含有第二基因體。虛擬探針可用於區分由相關微生物製備之第一擴增子集合與第二擴增子集合，該等微生物例如凝固酶陰性及凝固酶陽性葡萄球菌物種（例如如章節6.2.5.1中所描述）、格氏鏈球菌（ S. gordonii）及咽峽炎鏈球菌（ S. anginosus）（例如如章節6.2.5.2中所描述）或和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌（例如如章節6.2.5.3中所描述）。

樣本可為例如生物樣本、環境樣本、或食品。在一些實施方式中，樣本感染了一或多種微生物或處於感染一或多種微生物之風險下。例示性樣本描述於章節6.2.1中。

考慮使用本發明之方法來區分任何同源基因體序列（及對應於同源基因體序列之擴增子）。當確定樣本中是否可能存在細菌物種或相關細菌物種時，可使用能夠區分對應於編碼rRNA（例如，16S rRNA或23S rRNA）之基因體序列，或rRNA基因之間的基因間間隔區（例如16S rRNA - 23S rRNA基因間間隔區）的目標核酸（例如擴增子）的虛擬探針。可藉由本發明方法區分之例示性同源基因體序列之特徵描述於章節6.2.2中。

根據本發明方法用虛擬探針進行探測之擴增子可藉由使用能夠與第一生物體之基因體及第二生物體之基因體雜交且起始自第一生物體之基因體及第二生物體之基因體的PCR擴增的PCR引子，對樣本進行PCR擴增反應來產生，該樣本含有或疑似含有或處於含有第一生物體及/或第二生物體之風險下。PCR擴增反應可用單一引子集合進行（當第一生物體及第二生物體存在於樣本中時，其應分別產生第一擴增子及第二擴增子）。可替代地，當第一及第二生物體分別存在於樣本中時，PCR擴增反應可用超過一個引子集合進行，以產生對應於第一基因體之多種擴增子及對應於第二基因體之多種擴增子。可用於本發明方法中之例示性PCR擴增反應描述於章節6.2.3中。除PCR以外之核酸擴增技術（例如，等溫擴增技術），諸如環介導之等溫擴增（loop mediated isothermal amplification）（LAMP）；基於核酸序列之擴增（nucleic acid sequence based amplification；NASBA）；股置換擴增（strand displacement amplification；SDA）及滾環擴增（rolling circle amplification；RCA）亦可用以製備擴增子（參見例如Fakruddin等人, 2013, J Pharm Bioallied Sci.5（4）: 245-252。因此，應理解，本文中描述為適用於PCR擴增產物之實施方式同樣適用於使用替代性擴增方法產生之擴增產物。

可用於虛擬探針中之探針分子之例示性特徵及虛擬探針之例示性特徵分別描述於章節6.2.4及6.2.5中。

在一些實施方式中，PCR擴增產物之探測包含以下步驟：使PCR擴增產物與陣列（例如如章節6.3中所描述）接觸；自陣列洗滌未結合之核酸分子；以及量測陣列上各探針分子位置處之標記（例如螢光標記）的信號強度。較佳地，陣列包含一或多個計量探針。

在其他實施方式中，PCR擴增產物之探測包含量測來自用於即時PCR反應中之寡核苷酸探針分子的信號。

可用以執行本發明之方法的系統描述於章節6.4中。

可用於本發明之方法中之套組描述於章節6.6中。 6.2.1. 樣本

用於本發明之方法中之樣本可為任何類型或形式之樣本，其含有處於適用於PCR擴增條件下或可製備成處於適用於PCR擴增之條件下的基因體DNA。在某些實施方式中，樣本處於感染一或多種微生物（例如一或多種微生物物種）之風險下。在其他實施方式中，樣本疑似具有一或多種微生物（例如一或多種微生物物種）之感染。樣本可為例如生物樣本、環境樣本、或食品。

樣本之實例包括各種流體樣本。在一些情況下，樣本可為來自個體之體液樣本。樣本可包括自個體收集之組織。樣本可包括個體之體液、分泌物及/或組織。樣本可為生物樣本。生物樣本可為體液、分泌物及/或組織樣本。生物樣本之實例包括（但不限於）：血液、血清、唾液、尿液、胃液及消化液、淚液、糞便、精液、陰道液、來源於腫瘤組織之間質液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺體分泌物、呼出氣體、脊髓液、毛髮、指甲、皮膚細胞、血漿、鼻拭子或鼻咽洗滌液、脊髓液、腦脊髓液、組織、咽喉拭子、傷口拭子、生檢體、胎盤液、羊水、臍帶血、增強液（emphatic fluid）、腔液、痰、膿或其他傷口分泌物、藉由傷口清創術或切除取樣之感染組織、腦脊髓液、灌洗物、白血球生成樣本、腹膜透析液、乳汁及/或其他排泄物。

個體可提供樣本，及/或樣本可自個體收集。個體可為人類或非人類動物。樣本可自活的或死的個體收集。動物可為哺乳動物，諸如家畜（例如，牛、豬、羊）、運動動物（例如，馬）或寵物（例如，狗或貓）。個體可為患者、臨床個體或臨床前個體。個體可在進行診斷、治療及/或疾病管理或生活方式或預防性照護。個體可在或可不在健康照護專業人員之照護下。

在一些實施方式中，樣本可為環境樣本。環境樣本之實例包括空氣樣本、水樣本（例如，地下水、地表水或廢水）、土壤樣本及植物樣本。

額外樣本包括食品、飲料、製造材料、紡織物、化學品及療法。

在一些實施方式中，樣本為含有或疑似含有諸如以下中之一或多者的病原體之樣本：結核分枝桿菌（ Mycobacterium tuberculosis）、副結核鳥分枝桿菌亞種（ Mycobacterium aviumsubsp paratuberculosis）、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）（包括二甲氧苯青黴素敏感性及二甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus；MRSA））、表皮葡萄球菌（ Staphylococcus epidermidis）、路鄧葡萄球菌（ Staphylococcus lugdunensis）、嗜麥芽葡萄球菌（ Staphylococcus maltophilia）、釀膿鏈球菌（ Streptococcus pyogenes）、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌（ Streptococcus agalactiae）、流感嗜血桿菌（ Haemophilus influenzae）、副流感嗜血桿菌（ Haemophilus parainfuluezae）、黏膜炎莫拉氏菌（ Moraxella catarrhalis）、肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌（ Pseudomonas aeruginosa）、不動桿菌種（ Acinetobactersp.）、百日咳博德氏桿菌（ Bordetella pertussis）、奈瑟氏腦膜炎菌（ Neisseria meningitidis）、炭疽芽孢桿菌（ Bacillus anthracis）、諾卡菌種（ Nocardiasp.）、放線菌種（ Actinomycessp.）、肺炎黴漿菌（ Mycoplasma pneumoniae）、肺炎衣原體（ Chlamydia pneumonia）、軍團菌物種（ Legionella species）、傑氏肺囊蟲（ Pneumocystis jiroveci）、A型流感病毒（influenza A virus）、巨細胞病毒、鼻病毒、屎腸球菌（ Enterococcus faecium）、鮑氏不動桿菌（ Acinetobacter baumannii）、無枝菌酸棒狀桿菌（ Corynebacterium amycolatum）、產氣腸桿菌（ Enterobacter aerogenes）、糞腸球菌CI 4413（ Enterococcus faecalisCI 4413）、陰溝腸桿菌、黏質沙雷菌（ Serratia marcescens）、馬鏈球菌（ Streptococcus equi）、白色念珠菌（ Candida albicans）、奇異變形桿菌（ Proteus mirabilis）、黃色微球菌（ Micrococcus luteus）、嗜麥芽寡養單胞菌（ Stenotrophomonas maltophilia）（黃桿菌（ Xanthomonas））以及沙門氏菌種（ Salmonellasp.）。在一些實施方式中，樣本為含有或疑似含有 腸桿菌科群細菌之樣本，該腸桿菌科群細菌 諸如產氣腸桿菌、阿氏腸桿菌或霍氏腸桿菌。

樣本可在進行PCR擴增之前經預加工。因此，在本發明方法中經受PCR擴增之樣本可為例如自此章節中或在本發明中其他地方所描述之任何類型的樣本加工、萃取、或分離的樣本（例如自尿液、痰、傷口拭子、血液或腹膜透析液加工、萃取、或分離之樣本）。

可使用之預加工步驟之實例包括如本文所論述或以其他方式如所屬技術領域中已知之過濾、蒸餾、萃取、濃縮、離心、干擾組分之不活化、添加試劑及其類似者。

在PCR之前自生物樣本移除非所要細胞類型及粒狀物質，從而使自所關注細胞類型之基因體DNA的回收率最大化可為尤其有利的。

若意欲偵測生物樣本中之細菌，則經由過濾器預加工生物樣本可為合乎需要的，其使得顆粒及非細菌細胞保留在過濾器上，而細菌細胞（視需要包括其孢子）穿過。如本文所用，「過濾器（filter）」為使得粒子及分子基於大小區別通過的膜或裝置。典型地，此藉由在過濾器中具有特定標稱大小之孔隙來實現。舉例而言，用於細菌偵測應用之尤其關注之過濾器孔隙足夠大以允許細菌通過但足夠小以防止存在於所關注之樣本中之真核細胞通過。一般而言，細菌細胞之直徑在0.2 µm至2 µm（微米（micrometer/micron））範圍內，大多數真菌細胞之直徑在1 µm至10 µm範圍內，血小板之直徑為大約3 µm且大部分成核哺乳動物細胞之直徑典型地為10 µm至200 µm。因此，在預期偵測細菌之情況下，小於2 µm或小於1 µm之過濾器孔徑尤其適用於自生物樣本移除非細菌細胞。

除過濾步驟以外或作為過濾步驟之替代，生物樣本可經受離心以自樣本移除細胞及碎屑。使真核細胞沈澱但不使細菌細胞沈澱之離心參數為所屬技術領域中已知的。視需要，隨後可過濾上清液。

可使用所屬技術領域中已知的用於製備用於PCR之包含基因體DNA之樣本的各種製程中之任一者製備樣本以用於PCR擴增（例如，在上文所描述之預加工步驟中之一或多者之後）。在一些實施方式中，可使用市售之DNA萃取試劑、套組及/或儀器，例如QIAamp DNA微型套組（Qiagen）、MagMAX™ DNA多樣本套組（ThermoFisher Scientific）、Maxwell® RSC儀器（Promega）等。

在一些實施方式中，藉由包含珠磨之製程製備用於PCR之樣本，例如如美國專利第10,036,054號中所描述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。血液可在收集於市售血液收集管中之後直接進行珠磨，例如藉由將珠磨珠添加至收集管中且對收集管進行攪拌。可用於收集血液樣本之市售收集管之實例包括含有EDTA之淡紫頂管、含有檸檬酸鈉之淺藍頂管、含有草酸鉀之灰頂管或含有肝素之綠頂管。 6.2.2. 同源基因體序列

本發明之方法可用於鑑別及/或區分第一及第二同源基因體序列（及目標核酸，諸如對應於第一及第二同源基因體序列之擴增子）。同源基因體序列為具有共同祖先但核苷酸序列不一致之物種或菌株中發現之基因體序列。因此，舉例而言，同源基因體序列發現於密切相關之物種或菌株中。

第一基因體序列及第二基因體序列通常為來自第一微生物及第二微生物（例如細菌、病毒或真菌）之基因體序列。第一及/或第二微生物可為例如人類病原體及/或動物病原體。微生物可來自相同目、相同科、相同屬、相同群或甚至相同物種。在較佳實施方式中，第一及第二微生物為細菌。

定序技術之進展已使得多個公共資料庫儲存庫（諸如國立生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information；NCBI）、歐洲分子生物學實驗室（European Molecular Biology Laboratory；EMBL）及日本DNA資料庫（DNA Databank of Japan；DDBJ））中可用之完整細菌基因體序列之數目實質上增加，且此類資料庫可用以鑑別同源基因體序列。

密切相關之微生物中之同源基因體序列通常發現於編碼rRNA之基因及編碼rRNA之基因之間的基因間間隔區中。長久以來使用16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA；16S rRNA）之基因進行細菌物種之序列比較。16S核糖體RNA基因編碼細菌核糖體（負責蛋白產生之蛋白質/RNA複合物）之30S較小子單元之16S RNA組分。基因包含穿插九個高變區（V1-V9）之高度保守序列區域。高變區中之序列變化允許密切相關之物種之間的大多數可觀測差異。由於此等基因中所觀測到序列演變的速率較慢，16S rRNA序列已用於構築多個細菌物種之系統發育樹（phylogenic tree）。由獲自GenBank之若干葡萄球菌物種之16S rRNA基因製備的例示性系統發育樹展示於圖1中。

細菌基因體含有第二核糖體rRNA基因，23S rRNA基因。16S rRNA及23S rRNA基因藉由稱為16S-23S內轉錄間隔區（ITS）或16S-23S基因間間隔區的間隔區彼此隔開。16S-23S rRNA ITS區包含高變區，該等高變區包含可用於區分及鑑別特定細菌物種之物種及物種間特異性序列（K. Okamura等人, 2012）。由16s rRNA及16s-23s rRNA基因體序列之多重排比產生之草綠色鏈球菌群的例示性系統發育樹展示於圖2中。

在本發明之方法之一些實施方式中，第一基因體序列及第二基因體序列各自包含編碼rRNA之基因的核苷酸序列。在其他實施方式中，第一基因體序列及第二基因體序列各自包含在rRNA基因之間的基因間間隔區之核苷酸序列。

在微生物為細菌之實施方式中，第一基因體序列及第二基因體序列可各自包含例如16S rRNA基因或23S rRNA基因之核苷酸序列。在一些實施方式中，第一基因體序列及第二基因體序列各自包含16S rRNA基因之核苷酸序列。在其他實施方式中，第一基因體序列及第二基因體序列各自包含23S rRNA基因之核苷酸序列。在其他實施方式中，基因體序列包含發現於16S-23S基因間間隔區中之核苷酸序列。

在某些特定實施方式中，第一基因體序列及/或第二同源基因體序列為來自病原體（例如細菌、病毒或真菌）之基因體序列，該等病原體可發現於人類血液、尿液或腹膜液中。此類病原體之實例包括（但不限於）：結核分枝桿菌、副結核鳥分枝桿菌亞種、金黃色葡萄球菌（包括二甲氧苯青黴素敏感性及二甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌（MRSA））、表皮葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、嗜麥芽葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、黏膜炎莫拉氏菌、肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、不動菌桿種、百日咳博德氏桿菌、奈瑟氏腦膜炎菌、炭疽芽孢桿菌、諾卡菌種、放線菌種、肺炎黴漿菌、肺炎衣原體、軍團菌物種、傑氏肺囊蟲、A型流感病毒、巨細胞病毒、鼻病毒、屎腸球菌、鮑氏不動桿菌、無枝菌酸棒狀桿菌、產氣腸桿菌、糞腸球菌CI 4413、陰溝腸桿菌、黏質沙雷菌、馬鏈球菌、白色念珠菌、奇異變形桿菌、黃色微球菌、嗜麥芽寡養單胞菌（黃桿菌）以及沙門氏菌種。 6.2.3. PCR 擴增

在本發明方法之一些實施方式中，使用能夠與可存在於樣本中之基因體雜交且起始自可存在於樣本中之基因體的PCR擴增之PCR引子對樣本進行PCR擴增。PCR擴增反應可為「對稱（symmetric）」PCR反應，亦即，反應藉由利用正向引子及反向引子製得模板DNA之雙股複本，該正向引子及反向引子經設計以具有彼此相等或在彼此數℃內之「解鏈溫度（melting temperature）」或「T _m」。用於引子設計之常用電腦軟體程式警告使用者避開高T _m差異，且具有自動T _m匹配功能。亦可使用可製得單股DNA擴增子之「不對稱（asymmetric）」PCR反應。亦可使用即時PCR反應。在PCR擴增反應之情形下，藉由反應擴增之基因體序列可稱為「目標（target）」核酸、「模板（template）」核酸或其類似者。

PCR擴增反應可使用單一引子集合或多個引子集合（例如，當PCR擴增為多重PCR時）。多重PCR可用於例如產生對應於第一基因體序列（例如，16S rRNA基因）之擴增子及/或對應於第二基因體序列（例如，23S rRNA基因）之不同擴增子。作為多重PCR之替代方案，可混合藉由用不同引子集合進行之各別PCR擴增反應產生之擴增子以用於後續分析。有利地，可使用單一引子集合以製備對應於多個菌株或物種，例如2、3、4或超過4個物種之基因體中所發現之同源基因體序列的擴增子，該等物種可為例如相同屬之成員。

可選擇PCR擴增條件（無論對稱或不對稱、單重或多重）例如以使得DNA擴增產物之長度為100至1000個核苷酸。在一些實施方式中，選擇PCR反應以使得DNA擴增產物之長度為300至800個核苷酸。在其他實施方式中，選擇PCR條件以使得DNA擴增產物之長度為400至600個核苷酸。

在一些實施方式中，用於本發明方法中之PCR擴增反應併入標記，該標記在藉由反應產生之任何擴增子中產生可量測信號。標記可為例如螢光標記、電化學標記或化學發光標記。螢光標記可藉由在PCR期間併入經螢光標記之核苷酸及/或藉由使用經標記之引子進行PCR來達成。電化學標記可藉由在PCR期間併入經氧化還原活性標記之核苷酸及/或藉由使用經氧化還原活性標記之引子進行PCR來達成（參見例如，Hocek及Fojta, 2011, Chem. Soc. Rev., 40:5802-5814；Fojta, 2016, 《核酸之氧化還原標記以用於核苷酸序列及DNA損壞之電化學分析（Redox Labeling of Nucleic Acids for Electrochemical Analysis of Nucleotide Sequences and DNA Damage）》。於：Nikolelis D., Nikoleli GP.（編）《用於安全性及生物恐怖主義應用之生物感測器，用於安全性應用之先進科學及技術（Biosensors for Security and Bioterrorism Applications. Advanced Sciences and Technologies for Security Applications）》，Springer, Cham中）。化學發光標記可例如藉由使用經生物素標記之引子進行PCR，結合鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶結合物，隨後與化學發光1,2-二氧雜環丁烷受質一起培育來達成。

適合之螢光部分之實例包括FITC、EDANS、德克薩斯紅（Texas red）、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、R110、TAMRA、德克薩斯紅及x-玫瑰紅。

螢光部分可附接至dNTP，尤其含有胞嘧啶作為鹼基者（胞苷酸、胞嘧啶核苷5'-磷酸酯、胞嘧啶核苷5'-二磷酸酯、胞嘧啶核苷5'-三磷酸酯或其聚合物或含有胞苷酸之聚合物）。

dNTP標記之位置可位於鹼基（胺基）、磷酸酯基（OH基團）或去氧核糖部分（2'-OH基團或3'-OH基團）處。較佳位置係於鹼基處。

類似於其他核苷酸，經螢光標記之dNTP可在隨機位點，典型地dC位點處併入PCR擴增子之兩股中，且藉由DNA聚合酶延伸。

螢光dNTP可以高度濃縮形式購得且可在不調整各未經標記之dNTP之濃度的情況下添加至PCR反應混合物中。對於大多數PCR擴增，dNTP相對於螢光dNTP之典型比率在100:1與1000:1之間。因此，經螢光標記之dNTP可以未經標記之dNTP之（莫耳）數量之0.1%至1%包括於PCR試劑中。

經螢光標記之PCR產物之偵測可經由與探針分子（例如與微陣列結合之探針分子）雜交來達成。適合的微陣列系統利用三維交聯聚合物網路，如美國專利第9,738,926號中所描述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。 6.2.3.1. 引子

用於PCR反應中之引子經設計以識別一或多個給定核酸模板之序列（例如一或多個目標基因體序列）及與其雜交。引子及目標核酸模板之序列中之錯配可導致PCR反應之效率降低及/或除所要序列以外之序列的擴增。成功引子設計之參數為所屬技術領域中所熟知的（參見例如Dieffenbach等人, 1993）且包括引子長度、解鏈溫度、GC含量及其類似者。PCR引子不需要與給定目標核酸模板共有100%序列一致性，且與目標序列具有至少75%，例如80%、例如85%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%、例如99%或99.5%一致性之PCR引子可用於與目標序列雜交及使得目標序列擴增。

本發明提供適合於製備具有高特異性及良好擴增效率之獨特引子系統之額外參數。引子長度典型地為18至24個鹼基，但引子可為更長，例如長度為25至50個鹼基、例如長度為25至45個鹼基、例如長度為30至45個鹼基、例如長度為35至45個鹼基、例如長度為40至45個鹼基長度或例如長度為40至50個鹼基。用於PCR擴增之引子通常成對設計，其中一個引子稱為「正向（forward）」引子且一個引子稱為「反向（reverse）」引子。本發明之正向引子可設計成在3'端具有G及/或C殘基以便提供「GC夾（GC-clamp）」。G與C核苷酸對展現比A-T核苷酸對更強的氫鍵結；因而，引子之3'端處之GC夾可有助於增加序列特異性、增加雜交可能性且增加PCR反應之總效率。

可設計引子集合以擴增兩個基因體區域，例如一引子集合可包括對16S rRNA基因具有特異性之一個引子對及對16S-23S rRNA ITS區具有特異性之第二引子對（參見圖3）。此類引子集合可用於例如在單一PCR反應中產生多種擴增子。

PCR引子對可經設計以擴增跨越多個物種之保守序列，例如擴增多種細菌物種之16S rRNA基因。因此，可有可能使用單一PCR引子對產生對應於同源基因體序列之擴增子，其在對含有或疑似含有多種可能生物體中之一者之樣本進行PCR時係有利的。經設計以擴增保守序列之引子的參數可包括鑑別跨越各種物種之保守區，視需要驗證以校正保守區之任何序列差異（例如若存在所公佈之序列是否正確的不確定性），及選擇跨越序列至少75%，例如80%、例如85%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%、例如99%或甚至100%保守的序列。展現小於100%序列一致性之引子可僅含有一或多個不同於給定模板之單一核苷酸鹼基，亦即，製備物中之所有引子含有彼此相同的序列。可替代地，引子可經製備以在序列中之特定位置處含有替代核苷酸殘基。舉例而言，用於擴增若干物種之16S區的反向引子可包含寡核苷酸池，其中一定百分比（例如50%）在引子中之位置處含有第一核苷酸且其中一定百分比（例如50%）在該位置處含有第二核苷酸。

在一些實施方式中，用於本發明方法中之引子用可偵測之標記（例如螢光標記）來標記。舉例而言，在一些實施方式中，至少一個引子經5'螢光標記。在其他實施方式中，超過一個引子經5'螢光標記。適用於標記引子之螢光標記為所屬技術領域中已知的，且包括Cy5、FAM、JOE、ROX及TAMRA。 6.2.3.2. 對稱 PCR 擴增

可用於本發明之方法中之典型三步驟PCR方案（參見《PCR方案，方法及應用指南》，Innis等人編, 學術出版社（加利福尼亞州聖地亞哥（美國）1990, 第1章）可包括93℃-95℃持續超過5秒之變性或股解鏈、55℃-65℃持續10-60秒之引子黏合及在聚合酶高活性之溫度下持續15-120秒之引子延伸，例如對於Taq DNA聚合酶為72℃。典型兩步驟PCR方案之不同之處可在於對於引子黏合，具有與對於引子延伸相同之溫度，例如60℃或72℃。對於三步驟PCR或兩步驟PCR，擴增涉及使反應混合物循環通過前述系列之步驟多次，典型地25-40次。在反應過程期間，反應中之個別步驟之時間及溫度可在循環至循環間保持不變，或其可在反應過程中之一或多點處改變以提高效率或增強選擇性。

除了引子對及目標核酸以外，PCR反應混合物典型地含有以下中之每一者：四個去氧核糖核苷酸5'三磷酸酯（dNTP），典型地具有等莫耳濃度；熱穩定聚合酶；二價陽離子（典型地為Mg ²⁺）及緩衝劑。此類反應之體積典型地為20-100 µl。多個目標序列可在同一反應中經擴增。特定PCR擴增之循環次數視若干因素而定，該等因素包括：a）起始材料之量；b）反應效率；及c）產物偵測或後續分析之方法及靈敏度。用於典型循環擴增反應之循環條件、試劑濃度、引子設計及適當設備為所屬技術領域中所熟知（參見例如Ausubel, F. 《分子生物學中之當前方案（Current Protocols in Molecular Biology）》（1988）第15章: 「聚合酶鏈反應（The Polymerase Chain Reaction）」, J. Wiley（紐約州紐約（美國））。 6.2.3.3. 不對稱 PCR 擴增

例示性不對稱PCR方法描述於Gyllensten及Erlich, 1988, Natl. Acad. Sci.（USA）85: 7652-7656（1988）；以及Gyllensten及Erlich, 1991, 美國專利第5,066,584號中。傳統的不對稱PCR不同於對稱PCR，因為引子中之一者以限制量添加，典型地為另一引子之濃度的1/100至1/5。如在對稱PCR中，雙股擴增子在早期溫度循環期間積聚，但視起始模板數目而定，典型地在15-25個PCR循環之後，一種引子耗盡。在後續循環期間利用未耗盡引子進行一股之線性擴增。用於文獻中所報告之不對稱PCR反應中之引子通常為已知用於對稱PCR之相同引子。Poddar（Poddar, 2000, Mol. Cell Probes 14: 25-32）藉由包括40個熱循環之端點分析比較了擴增腺病毒受質之對稱及不對稱PCR。Poddar報告，50:1之引子比率為最佳的且不對稱PCR分析具有更好的靈敏度，然而，對於推測含有較低數目之目標分子的稀受質溶液，靈敏度顯著下降。 6.2.3.4. 經改善之不對稱 PCR 擴增

經改善之不對稱PCR方法描述於美國專利第10,513,730號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。經改善之不對稱PCR方法包括指數階段及線性階段兩者。在指數階段期間，目標核酸之兩股均擴增。在線性階段期間，僅擴增股中之一者，產生過量的目標核酸之單股。

經改善之不對稱PCR方法經由使用長度及解鏈溫度不同之引子對實現單股之過量，其中較長引子稱為「延伸引子（Extended Primer）」且較短引子稱為「未延伸引子（Unextended Primer）」。延伸引子之解鏈溫度高於未延伸引子，且可用於使用PCR循環選擇性擴增目標核酸之單股，其中黏合步驟係在高於未延伸引子之解鏈溫度但低於延伸引子之解鏈溫度的溫度下進行。選擇性擴增產生富含目標股之PCR產物混合物，其可在後續偵測分析中探測。

除與目標核酸互補之序列以外，延伸引子含有5'延伸序列，該延伸序列含有與相同引子之目標結合部分互補之序列。在不受理論束縛之情況下，咸信使用5'延伸序列允許延伸引子分子之分子內或分子間雜交，且防止此等較長引子與存在於PCR反應中之DNA分子在PCR反應開始時之任意或非特異性結合。此轉而防止非特異性DNA擴增且防止PCR產物中之「雜訊（noise）」，其當擴增生物樣本中少量存在之目標時可成問題。

初始PCR反應混合物包括 ●    核酸樣本； ●    不對稱引子對； ●    熱穩定DNA聚合酶；及 ●    PCR試劑。

PCR反應中之延伸引子及未延伸引子之初始濃度可各自在200 nM至8 µM範圍內。延伸引子及未延伸引子可以等莫耳數量包括於初始PCR反應中，例如各自在約200 nM與1 µM之間的濃度範圍內，例如各自500 nM之濃度。可替代地，延伸引子及未延伸引子可以非等莫耳數量包括於初始PCR反應中。在某些實施方式中，延伸引子之初始濃度較佳地超過未延伸引子之濃度，例如超過約2倍至30倍莫耳濃度。因此，在某些態樣中，延伸引子之濃度在約1 µM與8 µM範圍內，且未延伸引子之濃度在約50 nM與200 nM範圍內。

不對稱引子對可經設計以擴增來自任何來源之核酸，且對於診斷應用，不對稱引子對可經設計以擴增來自病原體，諸如在章節6.2.1中所鑑別之彼等病原體的DNA。

不對稱引子對可經設計以便能夠同時擴增許多物種中所存在之同源核酸序列，例如細菌中之高度保守16S核糖體序列。 熱穩定 DNA 聚合酶 ：可用於本發明之不對稱PCR反應中之熱穩定聚合酶包括（但不限於）：Vent（Tli/嗜熱高溫球菌（ Thermoccus Literalis））、Vent胞外-、Deep Vent、Deep Vent胞外-、水生棲熱菌（ Thermus aquaticus；Taq）、熱起動（Hot Start）Taq、熱起動Ex Taq、熱起動LA Taq、DreamTaq™、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaq™、SuperTaq™、Stoffel片段、Discoverase™dHPLC、9° Nm、Phusion®、LongAmp Taq、LongAmp熱起動Taq、OneTaq、Phusion®熱起動Flex、Crimson Taq、Hemo KlenTaq、KlenTaq、Phire熱起動II、DyNAzyme I、DyNAzyme II、M-MulV逆轉錄物、PyroPhage®、Tth（嗜熱棲熱菌HB-8（Thermos termophilus HB-8））、Tfl、Amlitherm™、芽孢桿菌DNA、DisplaceAce™、激烈熱球菌（ Pyrococcus furiosus；Pfu）、Pfu Turbot、Pfunds、ReproFast、PyroBest™、VeraSeq、Mako、Manta、沃氏火球菌（ pyrococcus,woesei；Pwo）、ExactRun、KOD（於超熱球菌（ thermococcus kodakkaraensis））、Pfx、ReproHot、嗜酸熱硫化葉菌（ Sulfolobus acidocaldarius；Sac）、硫磺礦硫化葉菌（ Sulfolobus solfataricus；Sso）、紅棲熱菌（ Thermus ruber；Tru）、Pfx50™（速生熱球菌（ Thermococcus zilligi））、AccuPrime™富GC（馬呂斯火葉菌（ Pyrolobus fumarius））、火球菌物種GB-D、絲狀棲熱菌（ Thermus filiformis；Tfi）、Tfi胞外-、ThermalAce™、嗜酸熱原體（ Thermoplasma acidophilum；Tac）、（嗜熱甲烷桿菌（ M. thermoautotrophicum；Mth）、深海熱球菌（ Pyrococcus abyssi；Pab）、超嗜熱球菌（ Pyrococcus horikosihi；Pho）、B103（小短尾噬菌體亞科B103（ Picovirinae BacteriophageB103））、嗜熱脂肪芽孢桿菌（ Bacillus stearothermophilus；Bst）、Bst較大片段、Bst 2.0、Bst 2.0 WarmStart、Bsu、Therminator™、Therminator™II、Therminator™III以及Therminator™T。在一較佳實施方式中，DNA聚合酶為Taq聚合酶，諸如Taq、熱起動Taq、熱起動Ex Taq、熱起動LA Taq、DreamTaq™、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaq™或SuperTaq™。

用於經改善之不對稱方法中之不對稱循環之說明性集合展示於表2中。

表2
階段	步驟	溫度	時間	循環數目
初始變性	初始變性	90至100℃，較佳95℃	0至5分鐘，較佳2分鐘	0-1
指數階段	變性	90至100℃，較佳95℃	15至25秒，較佳20秒	20至40，較佳地30至37（例如，35）
黏合	58℃	12至18秒，較佳15秒
延伸	72℃	30至50秒，較佳40秒
線性階段	變性	90至100℃，較佳95℃	15至25秒，較佳20秒	15至25，較佳20
同時黏合及延伸	72℃	40至60秒，較佳50秒
延長之延伸	延長之延伸	72℃	0至5分鐘，較佳2分鐘	0-1

表2中所展示之循環數目之範圍可用於任何不對稱引子對，且最佳循環數目將視初始PCR混合物中之目標DNA之複本數而定：初始複本數越大，在指數階段中產生足夠數量之PCR產物來充當線性階段之模板需要之循環數目越少。循環數目之最佳化對於所屬技術領域中具有通常知識者而言係常規的。

表2中所展示之溫度尤其有用，其中延伸引子之T _m大於72℃（例如，75℃-80℃）且未延伸引子之T _m大於58℃但小於72℃（例如，60℃-62℃），並且熱穩定DNA聚合酶在72℃下具有活性。

循環時間，尤其延伸時間可根據引子之解鏈溫度及PCR產物之長度而變化，其中較長PCR產物需要較長延伸時間。經驗法則為延伸步驟應為至少60秒/1,000個擴增子鹼基。延伸步驟可在線性階段延長以提供額外黏合時間。 6.2.3.4.1. 延伸引子

延伸引子之「A」區與目標股1中之對應區具有至少75%序列一致性。在某些實施方式中，引子之「A」區與目標股1中之對應區具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性。在又其他實施方式中，引子之「A」區與目標股1之對應區具有100%序列一致性。

換言之，在各種實施方式中，延伸引子之「A」區與目標股2中之對應區之互補序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或100%序列一致性。典型地，引子序列與目標序列之間之任何錯配位置愈靠5'，其在PCR反應期間愈可能被容許。所屬技術領域中具有通常知識者可容易地設計與目標股具有小於100%序列一致性，但仍可有效擴增目標DNA之引子序列。

與「A」區之至少一部分互補的「B」區中之序列可為直接重複序列或反向重複序列。在「B」區含有「A」區之一部分之直接重複序列的情況下，不同延伸引子分子可彼此分子間雜交，如圖5B中所示。在「B」區含有「A」區之一部分之反向重複序列的情況下，延伸引子分子可分子內雜交，如圖5C中所示，或彼此分子間雜交，如圖5A中所示。

「B」區中之序列互補之「A」區之一部分較佳處於或接近於（例如離1、2或3個核苷酸內）「A」區之5'端，亦即處於或接近於「A」區鄰接「B」區（或當存在「C」區時「C」區）處。

延伸引子之「B」區之長度較佳為6至12個核苷酸，亦即長度較佳為6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在特定實施方式中，延伸引子之「B」區之長度為8至10個核苷酸，亦即長度為8、9或10個核苷酸。

當「C」區存在於延伸引子中時，該區之長度較佳為1至6個核苷酸，亦即長度較佳為1、2、3、4、5或6個核苷酸。

延伸引子之T _m較佳（但未必）在大約68℃與大約80℃之間。在特定實施方式中，未延伸引子之T _m在大約72℃與大約78℃之間，例如大約72℃、大約73℃、大約74℃、大約75℃、大約76℃、大約77℃或大約78℃。

安置於區域「A」與「B」之間的視需要存在之區域「C」可充當「A」區與「B」區之間的間隔子，以使得延伸引子形成髮夾環（hairpin loop）及/或將限制性核酸內切酶序列（較佳為6-剪切酶序列）引入PCR產物中。限制性核酸內切酶序列可全部在「C」區內，或可由「C」區之全部或一部分連同分別來自「B」區及「A」區之側接5'及/或3'序列形成。為了最小化對與目標核酸的雜交之干擾，「C」區較佳不與目標股1或目標股2互補。

延伸引子之T _m較佳比未延伸引子之T _m大至少約6℃。較佳地，延伸引子具有比未延伸引子之T _m大約15℃至30℃之T _m。

延伸引子之「A」區之T _m較佳比與目標（排除任何5'延伸序列）互補之未延伸引子部分（至少75%）之T _m高或低不超過大約3℃，亦即與目標雜交之正向引子中之區域之T _m較佳比與目標雜交之反向引子中之區域之T _m高或低不超過大約3℃，且反之亦然。

延伸引子之「A」區之長度較佳為至少12個核苷酸，且較佳在12至30個核苷酸範圍內且更佳在14至25個核苷酸範圍內。在某些實施方式中，延伸引子之「A」區之長度為14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。 6.2.3.4.2. 未延伸引子

未延伸引子之核苷酸序列與目標股2中之對應區具有至少75%序列一致性。在某些實施方式中，未延伸引子之核苷酸序列與目標股2中之對應區具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性。在又其他實施方式中，未延伸引子之核苷酸序列與目標股2之相應區具有100%序列一致性。

換言之，在各種實施方式中，未延伸引子之核苷酸序列與目標股2中之對應1區之互補序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或100%序列一致性。典型地，引子序列與目標序列之間之任何錯配位置愈靠5'，其在PCR反應期間愈可能被容許。所屬技術領域中具有通常知識者可容易地設計與目標股具有小於100%序列一致性，但仍可有效擴增目標DNA之引子序列。

未延伸引子可進一步具有1、2或3個核苷酸之5'尾。

未延伸引子之T _m較佳（但未必）在大約50℃與大約62℃之間。在特定實施方式中，未延伸引子之T _m在大約59℃與大約62℃之間，例如大約59℃、大約60℃、大約61℃或大約62℃。

未延伸引子之T _m較佳比延伸引子之T _m低至少約6℃。較佳地，未延伸引子具有比延伸引子之T _m低約15℃至30℃之T _m。

與目標（排除任何5'延伸序列）互補之未延伸引子區域（至少75%）之T _m較佳比延伸引子之「A」區之T _m高或低不超過大約3℃，亦即與目標雜交之正向引子中之區域之T _m較佳比與目標雜交之反向引子中之區域之T _m高或低不超過大約3℃，且反之亦然。

未延伸引子之長度較佳為至少12個核苷酸，且較佳在12至30個核苷酸範圍內且更佳在14-25個核苷酸範圍內。在某些實施方式中，未延伸引子之長度為14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。 6.2.3.4.3. 通用引子

在一些不對稱PCR方法中，例如，如美國專利第8,735,067 B2號中所描述，除正向及反向引子對以外，亦使用第三「通用（generic）」引子，其具有與添加至引子中之一者之5'寡核苷酸尾類似之序列。通用引子旨在參與初始PCR循環之後的擴增反應，以「平衡（balance）」多重擴增反應中之不同目標之擴增效率。

不受理論束縛，咸信包括如美國專利第8,735,067號中所描述之通用引子將降低使用本文中所描述之不對稱引子對的擴增效率，在經改善之不對稱PCR方法之情形中，該通用引子將具有基本上由延伸引子之「B」區之序列組成之序列（此類通用引子在本文中稱為「通用引子（Generic Primer）」）。因此，本文中所描述之經改善之不對稱DNA擴增方法較佳在缺乏通用引子之情況下進行。

在相關實施方式中，本文中所描述之經改善之不對稱DNA擴增方法可利用單一不對稱引子對/目標區域，亦即不包括任何額外引子，認識到個別引子可為具有由引子中之某些位置處包括混合鹼基產生之密切相關的序列的引子分子之混合物。為清楚且避免疑問起見，此實施方式並不排除在多重擴增反應中使用複數個不對稱引子對，其限制條件為對於各擴增子使用單一不對稱引子對。 6.2.3.5. 即時 PCR 擴增

用於本發明方法中之PCR擴增反應可為即時PCR擴增反應。

即時PCR係指一組不斷增加之技術，其中隨著反應進展，可量測經擴增之DNA產物之堆積，典型地每個PCR循環量測一次。監測產物隨時間推移之積聚允許確定反應之效率，以及估算DNA模板分子之初始濃度。關於即時PCR之一般細節參見《即時PCR：必需指南（ Real-Time PCR: An Essential Guide）》, K. Edwards等人編, Horizon Bioscience, Norwich, U.K.（2004）。

現存在若干不同即時偵測化學方法以指示經擴增之DNA之存在。其中大多數取決於由於PCR過程而改變特性之螢光指示物。在此等偵測化學方法中有DNA結合染料（諸如SYBR®綠），其與雙股DNA結合時增加螢光效率。其他即時偵測化學方法利用螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer；FRET），一種染料之螢光效率強烈依賴於其與另一光吸收部分或淬滅劑之接近度之現象。此等染料及淬滅劑典型地附接至DNA序列特異性探針或引子。在基於FRET之偵測化學方法中有水解探針及構形探針。水解探針（諸如TaqMan®探針）使用聚合酶以自附接至寡核苷酸探針之淬滅劑染料分子裂解報告子染料分子。構形探針（諸如分子信標）利用附接至寡核苷酸之染料，其螢光發射在與目標DNA雜交之寡核苷酸之構形改變時改變（參見例如Tyagi S等人, 1996, 《分子信標：在雜交時發螢光之探針（Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization）》. Nat Biotechnol 14, 303-308）。

即時PCR可為對稱或不對稱的，例如在章節6.2.3.3或6.2.3.4中所描述之對稱或不對稱PCR擴增反應之反應混合物中用水解探針分子進行。

存在可用於進行即時PCR之多種商業儀器。可購儀器之實例包括Applied Biosystems PRISM 7500、Bio-Rad iCylcer及Roche Diagnostics LightCycler 2.0。 6.2.4. 探針分子

本發明提供適用於在PCR反應中產生之擴增子之序列特異性偵測的探針分子，例如寡核苷酸探針分子。

成功寡核苷酸探針分子設計之參數為所屬技術領域中所熟知的且包括（但不限於）探針分子長度、交叉雜交效率、解鏈溫度、GC含量、自黏合及形成二級結構之能力。本發明提供寡核苷酸探針分子在微陣列，例如可定址陣列中的用途，其中探針分子錨定至基板，例如膜、例如玻璃基板、例如塑膠基板、例如聚合物-基質基板，且在允許寡核苷酸探針分子與具有類似於一致序列的擴增子雜交之條件下暴露於核酸，例如該等序列享有至少75%，例如80%、例如85%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%、例如99%或甚至100%類似性或一致性。

在一些實施方式中，用於本發明方法中之寡核苷酸探針分子包含之核苷酸序列與第一基因體序列及/或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補（例如，90%至95%或95%至100%）。

例示性寡核苷酸探針分子描述於實施例中，且包括包含SEQ ID NO: 1-7之核苷酸序列的探針分子。

在一些實施方式中，寡核苷酸探針分子存在於陣列上。各探針分子可離散處於陣列上之不同的位置處且可藉由其於陣列上之位置區分，以使得寡核苷酸探針分子為存在於陣列上之位置上可定址之探針分子。

在一些實施方式中，寡核苷酸探針分子包含聚胸苷尾，例如包含至多10個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多15個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多20個核苷酸之聚胸苷尾。在一個實施方式中，聚胸苷尾包含10至20個核苷酸，例如15個核苷酸。當探針分子附接至陣列時，聚胸苷尾可有用，其中聚胸苷尾充當陣列基板與探針分子區域之間的間隔子，該探針分子區域與一或多個目標序列部分或完全互補。

寡核苷酸探針分子可經標記或未經標記。在一些實施方式中，寡核苷酸探針分子經標記。在其他實施方式中，寡核苷酸探針分子未經標記。寡核苷酸探針分子可例如用螢光報告子標記，該等螢光報告子可為螢光染料，諸如章節6.2.3或6.2.3.1中所描述者。經標記之寡核苷酸探針分子可用於例如即時PCR反應中。用於即時PCR之經標記之寡核苷酸探針分子可在探針分子的一端包含螢光報告子且在探針分子的另一端包含淬滅劑部分，該淬滅劑部分淬滅報告子之螢光。在PCR期間，探針分子可在黏合階段期間與其目標序列雜交，且一旦聚合酶在延伸階段期間達至探針分子，則其5'-3'-核酸外切酶降解探針，使螢光報告子與淬滅劑物理分離，引起可量測之螢光的增加。

探針分子上之螢光標記及淬滅劑部分之位置可使得FRET可出現在兩個部分之間。舉例而言，螢光標記可處於或接近於探針分子之5'端，且淬滅劑部分處於或接近於探針之3'端。在一些實施方式中，螢光標記與淬滅劑之間的分離距離為約14至約22個核苷酸，但可使用其他距離，諸如約6、約8、約10或約12個核苷酸。可使用之額外距離包括約14、約16、約18、約20或約22個核苷酸。

可用於即時PCR之寡核苷酸探針分子中之例示性螢光標記為FAM或6-FAM，且代表性淬滅劑部分為MGB。報告子部分之其他非限制性實例包括螢光素、HEX、TET、TAM、ROX、Cy3、Alexa及德克薩斯紅，而淬滅劑或受體螢光部分之非限制性實例包括TAMRA、黑洞淬滅劑（black hole quencher；BHQ）、LC紅640及諸如CY5之花青染料。如所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解，可使用任何報告子及淬滅劑/受體部分之對，只要其為相容的即可，以使得可自供體至淬滅劑/受體傳輸。此外，適合供體與淬滅劑/受體對在所屬技術領域中為已知的且提供於本文中。可藉由所屬技術領域中已知之任何手段來進行對的選擇。定製即時PCR探針分子可購自例如ThermoFisher Scientific、Sigma-Aldrich及其他。 6.2.5. 虛擬探針

為方便起見，此章節（及本發明之其他章節）係指可用虛擬探針探測之擴增子及擴增子集合。然而，應理解，虛擬探針可同樣用於探測含有或疑似含有非擴增目標核酸（諸如基因體片段）之樣本。

第一擴增子集合（含有對應於第一基因體中之區域的單一第一擴增子或對應於第一基因體中之不同區域的複數個第一擴增子）與第二擴增子集合（含有對應於第二基因體中之區域的單一第二擴增子或對應於第二基因體中之不同區域的複數個第二擴增子）之間的核苷酸錯配之數目可相對較小，且個別寡核苷酸探針分子可能不能夠個別地區分第一擴增子集合與第二擴增子集合。本發明人已無法預期地發現，仍有可能藉由使用虛擬探針在此類情境下區分第一擴增子集合與第二擴增子集合。虛擬探針之探針分子無法個別地但可共同地藉助於在第一及第二擴增子集合用虛擬探針之探針分子探測時觀測到之不同雜交模式區分兩個擴增子集合。

本發明人已進一步發現虛擬探針中包括計量探針可有助於提高物種鑑別之準確性。可與第一擴增子集合中之擴增子及第二擴增子集合中之同源擴增子雜交的計量探針可用於提供樣本中之此類擴增子之相對濃度的度量。視來自計量探針之信號而定，可使用第一式或第二式分析所觀測到的虛擬探針之所有探針分子的雜交模式。舉例而言，當來自計量探針之信號等於或高於預定臨限水準（指示樣本中相對較高濃度之擴增子）時，第一式可用於分析雜交模式，而當來自計量探針之信號低於臨限水準（指示樣本中相對較低濃度之擴增子）時，第二式可用於分析雜交模式。臨限水準可憑經驗，例如自含有已知濃度之微生物的一系列樣本獲得之信號數據確定（參見例如實施例6）。在一些實施方式中，用於虛擬探針中之計量探針係屬探針，例如可用於將微生物鑑別為屬之成員，但其本身不能相對於該屬的另一物種鑑別出該屬的個別物種的探針。可用於葡萄球菌之虛擬探針的例示性計量探針包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。

第一擴增子及第二擴增子之核苷酸序列應具有至少1個（例如，1個，至少2個，2個，至少3個或3個）擴增子區域中之核苷酸錯配，該錯配能夠由用於虛擬探針中之探針分子結合，使得當探針分子與第一擴增子集合雜交時及當探針分子與第二擴增子集合雜交時（例如，在陣列上或即時PCR反應期間），構成虛擬探針的兩個或更多個探針分子之信號模式存在差異。信號模式之差異可用於鑑別及/或區分第一及第二擴增子集合。當藉由使用虛擬探針確定第一擴增子集合存在時，可得出以下結論：產生第一擴增子集合之樣本含有對應於第一擴增子集合之基因體（及引申開來，其基因體含於樣本中之生物體）。同樣，當藉由使用虛擬探針確定第二擴增子集合存在時，可得出以下結論：產生第二擴增子集合之樣本含有對應於第二擴增子集合之基因體（及引申開來，其基因體含於樣本中之生物體）。

當與PCR擴增產物雜交時，虛擬探針之個別探針分子之信號（例如可藉由其於陣列上之位置區分或對應於不同螢光標記之信號）可例如藉由一或多個布林運算子、藉由一或多個關係運算子、藉由一或多個信號比（例如第一探針之信號可除以第二探針之信號）或藉由呈任何組合之前述任一者來組合，以區分第一擴增子集合與第二擴增子集合。在一些實施方式中，信號藉由一或多個布林運算子組合。在其他實施方式中，信號藉由一或多個關係運算子組合。在又其他實施方式中，信號藉由一或多個布林運算子及一或多個關係運算子來組合。在又其他實施方式中，信號係藉由信號比組合。

在一些情況下，布林運算子「與（AND）」、「或（OR）」及「非（NOT）」可用於組合來自虛擬探針之個別探針分子之信號以區分第一擴增子集合與第二擴增子集合。作為一實例，用於兩個同源擴增子（在此實例中為「擴增子A（Amplicon A）」及「擴增子B（Amplicon B）」）之虛擬探針由兩個探針分子（在此實例中為「探針1（Probe 1）」及「探針2（Probe 2）」）組成。探針1及探針2兩者均能夠與擴增子A特異性雜交，而探針1，但並非探針2，能夠擴增子B特異性雜交。當PCR擴增產物用虛擬探針探測，且來自探針1與PCR擴增產物雜交之信號及來自探針2與PCR擴增產物雜交之信號均為正（其可使用布林運算子「與」表示為「探針1與探針2」）時，可確定擴增子A存在於PCR擴增產物中。當PCR擴增產物用虛擬探針探測，且來自探針1與PCR產物雜交之信號為正，而來自探針2與PCR產物雜交之信號不為正（其可使用布林運算子「非」表示為「探針1非探針2」）時，可確定擴增子B存在於PCR擴增產物中。舉例而言，若雜交信號高於背景水準，則雜交信號可視為呈正信號。舉例而言，當未觀測到信號或所觀測到之信號不高於背景水準時，雜交信號可視為非正。

在一些情況下，關係運算子「大於（greater than）」（「＞」）、「大於或等於（greater than or equal to）」（「≥」）、「小於（less than）」（「＜」）及「小於或等於（less than or equal to）」（「≤」）可用於組合來自虛擬探針之個別探針分子之信號以區分第一擴增子集合與第二擴增子集合。作為一實例，用於兩個同源擴增子（在此實例中為「擴增子C（Amplicon C）」及「擴增子D（Amplicon D）」）之虛擬探針由兩個探針分子（在此實例中為「探針3（Probe 3）」及「探針4（Probe 4）」）組成。探針3及探針4兩者均能夠與擴增子C及擴增子D特異性雜交。當探針3及探針4與擴增子C雜交時，探針3之信號大於探針4之信號（其可使用「大於」關係運算子表示為「探針3＞探針4」。另一方面，當探針3及探針4與擴增子D雜交時，探針3之信號小於探針4之信號（其可使用「小於」關係運算子表示為「探針3＜探針4」）。因此，當PCR擴增產物用虛擬探針探測且探針3之信號大於探針4之信號時，可確定擴增子C存在於PCR擴增產物中，且當探針3之信號小於探針4之信號時，可確定擴增子D存在於PCR擴增產物中。

在一些情況下，來自個別探針分子之信號可藉由信號比組合，例如探針1之信號除以探針2之信號，或反之亦然。在一些實施方式中，信號比可與預定截止值相比較以確定樣本或該測試樣本自其製備之初始樣本中微生物存在或不存在。

當組合雜交信號時，信號可為例如絕對信號、標準化信號或分率信號（例如，用於虛擬探針中之探針分子之信號的值可使用預定函數縮放，例如如實施例3中所描述）。舉例而言，當探針分子之信號高於預定截止值時，其可視為正信號。舉例而言，截止值可設定為或高於對於給定探針分子所觀測到之背景信號（例如由於非特異性雜交之背景信號）。因此，舉例而言，若觀測到探針分子之信號，但該信號不高於背景水準，則該信號可視為非正信號。

在一個實施方式中，虛擬探針包含兩個或更多個寡核苷酸探針分子（例如2個寡核苷酸探針分子）。在另一實施方式中，虛擬探針包含三個或更多個寡核苷酸探針分子（例如3個寡核苷酸探針分子或4個寡核苷酸探針分子）。

在一些實施方式中，第一生物體及第二生物體之虛擬探針由兩個探針分子組成。在一個實施方式中，兩個探針分子包含能夠特異性雜交第一擴增子集合（對應於第一生物體）中之第一擴增子及第二擴增子集合（對應於第二生物體）中之第二擴增子的第一探針分子，以及能夠與第二擴增子集合中之擴增子而非第一擴增子集合中之擴增子特異性雜交的第二探針分子。在此類實施方式中，當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，若第一探針分子之信號為正且第二探針分子之信號不為正，則可確定第一生物體存在於樣本中。另一方面，當探測PCR擴增產物時，若第一探針分子之信號為正且第二探針分子之信號為正，則可確定第二生物體存在於樣本中。

在一些實施方式中，第一生物體及第二生物體之虛擬探針由三個探針分子組成。在一個實施方式中，三個探針分子包含能夠特異性雜交第一擴增子集合（對應於第一生物體）中之第一擴增子及第二擴增子集合（對應於第二生物體）中之第二擴增子的第一探針分子；能夠與第一擴增子集合中之擴增子及第二擴增子集合中之擴增子特異性雜交之第二探針分子，且該第二探針分子不同於第一探針；以及能夠與第一擴增子集合中之擴增子及第二擴增子集合中之擴增子特異性雜交之第三探針分子，且該第三探針分子不同於第一及第二探針分子。在此類實施方式中，當探測PCR擴增產物時，觀測到之三種探針分子之相對信號可用於確定用於製備PCR擴增產物之樣本是否含有第一生物體或第二生物體。

由於虛擬探針可用於區分同源基因體序列，因此虛擬探針可用於區分密切相關之生物體，例如密切相關之微生物。舉例而言，虛擬探針可用於區分來自相同目、相同科、相同屬、相同群或甚至相同物種之微生物（例如，相同物種之不同菌株）。舉例而言，虛擬探針可用於區分乳酸桿菌屬（ Lactobacillus）與李氏菌屬（ Listeria）物種，區分棒狀桿菌屬（ Corynebacterium）與丙酸桿菌屬（ Propionibactium）物種，區分微球菌屬（ Micrococcus）與庫克菌屬（ Kocuria）物種，區分巴斯德氏菌屬（ Pasturella）與嗜血桿菌屬（ Haemophillus）物種，區分凝固酶陰性葡萄球菌物種與凝固酶陽性葡萄球菌物種，區分鏈球菌物種（例如，咽峽炎鏈球菌、格氏鏈球菌、和緩鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌（ S. agalactiae）、釀膿鏈球菌（ S. pyogenes）、解沒食子酸鏈球菌（ S. gallolyticus）、嬰兒鏈球菌（ S. infantarius）、前庭鏈球菌（ S. vestibularis）、唾液鏈球菌（ S. salivarius）、豬腸鏈球菌（ S. hyointestinalis）、星座鏈球菌（ S. constellatus）、中間鏈球菌（ S. intermedius）、口腔鏈球菌（ S. oralis）、血鏈球菌（ S. sanguinis）、副血鏈球菌（ S. parasanguinis）），區分葡萄球菌物種（例如，路鄧葡萄球菌（ S. lugdunensis）、表皮葡萄球菌（ S. epidermidis）），區分腸球菌物種（例如，糞腸球菌（ E. fecalis）、屎腸球菌（ E. faecium）），區分梭菌物種（例如，產氣莢膜梭菌（ C. perfringens）、梭狀梭菌（ C. clostridiiforme）、無害梭菌（ C. innocuum）），區分芽孢桿菌物種（例如，蠟樣芽孢桿菌（ B. cereus）、凝結芽孢桿菌（ B. coagulans）），區分假單胞菌物種（（例如，綠膿桿菌（ P. aeruginosa）、惡臭假單胞菌（ P. putida）、施氏假單胞菌（ P. stutzeri）、螢光假單胞菌（ P. fluorescens）、門多薩假單胞菌（ P. mendocina）），及區分不動桿菌物種（例如，鮑氏不動桿菌（ A. baumannii）、魯氏不動桿菌（ A. lwoffii）、阿氏不動桿菌（ A. ursingii）、溶血不動桿菌（ A. haemolyticus）、瓊氏不動桿菌（ A. junii））。

章節6.2.5.1至6.2.5.3及章節7中之實施例1-5描述用於鑑別及/或區分不同類型之密切相關的細菌的例示性虛擬探針。 6.2.5.1. 用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之虛擬探針

本發明提供虛擬探針，其可用以確定凝固酶陰性葡萄球菌屬物種是否存在於樣本中，且可用以區分包含凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之樣本與包含凝固酶陽性葡萄球菌屬物種之樣本。可用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之虛擬探針中之第一例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）。可用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之虛擬探針中之第二例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之核苷酸序列經設計以探測16S RNA擴增子。因此，具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之探針分子可用於探測由PCR擴增反應產生之擴增子，該PCR擴增反應使用經設計以擴增凝固酶陰性葡萄球菌屬物種16S rRNA基因體序列之引子進行。探針分子可例如包括於陣列上或用於即時PCR反應中。

若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，第一寡核苷酸探針（「探針1」）之信號為正且第二寡核苷酸探針（「探針2」）之信號不為正（其可使用「非」運算子表示為「探針1非探針2」），則可確定樣本含有凝固酶陰性葡萄球菌屬物種。

替代地，可使用探針1及探針2之信號比。舉例而言，當探針1之信號除以探針2之信號大於或等於預定截止值時，可判定樣本含有凝固酶陰性葡萄球菌屬物種。當來自計量探針之信號指示樣本中相對較高量或相對較低量之目標核酸時，可使用具有不同截止值之不同式。屬探針探針1可用作計量探針。因此，舉例而言，當來自計量探針之信號指示相對較高濃度之目標核酸時（例如當信號等於或高於預定臨限值時），可使用具有第一截止值之第一式，且當來自計量探針之信號指示相對較低濃度之目標核酸時（例如當計量探針之信號低於預定臨限值時），可使用具有第二截止值之第二式。舉例而言，如實施例6中所描述，使用第一及第二式可提高凝固酶陰性葡萄球菌屬物種及凝固酶陽性葡萄球菌屬物種鑑別之準確性。

用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之例示性虛擬探針進一步描述於實施例1及6中。 6.2.5.2. 用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之虛擬探針

本發明提供虛擬探針，其可用於確定格氏鏈球菌或咽峽炎鏈球菌是否存在於樣本中，且可用於區分包含格氏鏈球菌之樣本與包含咽峽炎鏈球菌之樣本。可用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之虛擬探針中之第一例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）。可用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之虛擬探針中之第二例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）。SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4之核苷酸序列經設計以探測16S RNA擴增子。因此，具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之核苷酸序列之寡核苷酸探針分子可用於探測由PCR擴增反應產生之擴增子，該PCR擴增反應使用經設計以擴增來自格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之16S rRNA基因體序列之引子進行。探針分子可例如包括於陣列上或用於即時PCR反應中。

若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，第一探針（「探針1」）之信號為正且第二探針（「探針2」）之信號不為正（其可使用「非」運算子表示為「探針1非探針2」），則可確定樣本含有格氏鏈球菌。若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，探針1之信號為正且探針2之信號亦為正（其可使用「與」運算子表示為「探針1與探針2」），則可確定樣本含有咽峽炎鏈球菌。用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之例示性虛擬探針進一步描述於實施例2中。 6.2.5.3. 用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針

本發明提供虛擬探針，其可用於確定和緩鏈球菌或肺炎鏈球菌是否存在於樣本中，且可用於區分包含和緩鏈球菌之樣本與包含肺炎鏈球菌之樣本。可用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針中之第一例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）。可用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針中之第二例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）。可用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針中之第三例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7之核苷酸序列經設計以探測16S RNA擴增子。因此，具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7之核苷酸序列之探針分子可用於探測由PCR擴增反應產生之擴增子，該PCR擴增反應使用經設計以擴增和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之16S rRNA基因體序列之引子進行。探針分子可例如包括於陣列上或用於即時PCR反應中。

若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，第二探針（「探針2」）及/或第三探針（「探針3」）之信號小於第一探針（「探針1」）之按比例縮放之信號，則可確定樣本含有和緩鏈球菌。用於確定樣本是否含有和緩鏈球菌之信號之間的關係可使用布林及關係運算子表示為「(探針2或探針3)＜(探針1)/n」，其中n為用於縮放探針1信號之預定值。若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，探針2及/或探針3之信號大於探針1之按比例縮放之信號，則可確定樣本含有肺炎鏈球菌。用於確定樣本是否含有肺炎鏈球菌之信號之間的關係可使用布林及關係運算子表示為「(探針2或探針3)＞(探針1)/n」。可例如藉由探測由已知含有和緩鏈球菌之樣本產生之PCR產物及探測來自已知含有肺炎鏈球菌之樣本的PCR產物來確定「n」之適合值。

可替代地，若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，探針3之信號除以探針1之信號小於預定值「n」，則可確定樣本含有和緩鏈球菌。若當探測由樣本製備之PCR擴增產物時，探針3之信號除以探針1之信號大於「n」，則可確定樣本含有肺炎鏈球菌。可例如藉由探測由已知含有和緩鏈球菌之樣本產生之PCR產物及探測來自已知含有肺炎鏈球菌之樣本的PCR產物來確定「n」之適合值。

用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之例示性虛擬探針進一步描述於實施例3中。 6.3. 陣列

本發明提供可定址陣列，其包含一或多個各自可用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列之虛擬探針。

本發明之可定址陣列可用於本文所描述之方法中。本發明之可定址陣列可包含一組位置上可定址之寡核苷酸探針分子，其等各自處於陣列上之不同的位置處。在一些實施方式中，一組構成虛擬探針之寡核苷酸探針分子（典型地為兩個或三個不同探針分子）中的各探針分子包含：與該虛擬探針旨在區分的第一基因體序列或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸（例如15至20、15至30、20至40、20至30或30至40個連續核苷酸）90%至100%（例如，90%至95%或95%至100%）互補的核苷酸序列。

可定址陣列可視需要進一步包含一或多個對照探針分子（例如，可用於評價DNA萃取及擴增步驟之效率的萃取及擴增對照及/或可用於評價與陣列DNA雜交之效率的雜交對照）。

在一些實施方式中，陣列之探針分子包含聚胸苷尾，例如包含至多10個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多15個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多20個核苷酸之聚胸苷尾。在一些實施方式中，聚胸苷尾為10聚體至20聚體，例如15聚體。

在一些實施方式中，可定址陣列包含12個或更多個探針分子，例如12至100個探針分子、或例如12至50個探針分子、或例如25至75個探針分子、或例如50至100個探針分子。在一些實施方式中，可定址陣列包含12個探針分子。在其他實施方式中，可定址陣列包含14個探針分子。在再其他實施方式中，可定址陣列包含84個探針分子。

在一些實施方式中，可定址陣列包含用於至少2個虛擬探針，例如至少3個虛擬探針、或例如至少5個虛擬探針、或例如至少10個虛擬探針之寡核苷酸探針，或例如可定址陣列包含用於至多10個或至多15個虛擬探針之寡核苷酸探針。

虛擬探針可重疊，使得探針分子可為兩個或更多個虛擬探針之組分。虛擬探針亦可為不重疊的。

在一些實施方式中，可定址陣列包含能夠區分至少5種不同類型之微生物（例如細菌）的虛擬探針。在其他實施方式中，可定址陣列包含能夠區分至少10種不同類型，例如至少20種不同類型、例如至少30種不同類型、例如至少40種不同類型、或例如至多50種不同類型之微生物（例如細菌）的虛擬探針。

在一些實施方式中，可定址陣列含有至少5個虛擬探針，例如至少10個虛擬探針、例如至少15個虛擬探針、或例如至少20個虛擬探針，其中之每一者能夠鑑別不同類型之微生物，例如細菌，例如樣本中可能存在之不同菌株或細菌物種。

在一些實施方式中，本發明之可定址陣列包含一或多個用於區別來自真細菌物種之基因體序列與並非真細菌物種之微生物之基因體序列的虛擬探針。在一些實施方式中，可定址陣列包含一或多個適用於區別來自革蘭氏陽性細菌之基因體序列與來自革蘭氏陰性細菌之基因體序列的虛擬探針。在一些實施方式中，可定址陣列包含一或多個適用於區別來自不同目之微生物之基因體序列的虛擬探針。在一些實施方式中，虛擬探針適用於區別來自不同科之微生物之基因體序列。在一些實施方式中，虛擬探針適用於區別來自不同屬、不同群及/或不同物種之微生物之基因體序列。

可用於製備本發明之陣列之適合的微陣列系統描述於美國專利第9,738,926號及美國專利申請公開案第2018/0362719 A1號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。美國專利第9,738,926號及美國專利申請公開案第2018/0362719 A1號中所描述之微陣列系統利用三維交聯聚合物網路。因此，在一些實施方式中，本發明之陣列包含如美國專利第9,738,926號中所描述之陣列，其中陣列之探針分子包含一組如本文所描述之寡核苷酸探針分子。在其他實施方式中，本發明之陣列包含如美國專利申請公開案第2018/0362719 A1號中所描述之陣列，其中陣列之探針分子包含一組如本文所描述之寡核苷酸探針分子。

在本發明之一個態樣中，本發明提供使用本發明之陣列確定第一生物體或第二生物體是否存在於樣本中之方法。例示性方法包含以下步驟： 使用能夠與第一生物體之基因體（「第一基因體（first genome）」）及第二生物體之基因體（「第二基因體（second genome）」）雜交且起始自該第一生物體之基因體及該第二生物體之基因體之PCR擴增的PCR引子對樣本進行PCR擴增反應，當第一基因體及第二基因體存在於樣本中時，分別產生第一擴增子集合及第二擴增子集合，且其中PCR擴增反應併入標記，該標記在任何由反應產生之PCR擴增產物中產生可量測信號； 使PCR擴增產物與本發明之陣列接觸，該陣列具有一或多個包含兩個或更多個寡核苷酸探針分子之虛擬探針，該等寡核苷酸探針分子中之每一者能夠與第一擴增子集合及/或第二擴增子集合中之一或多個擴增子特異性雜交，且其中兩個或更多個寡核苷酸探針分子與第一擴增子集合中之擴增子及第二擴增子集合中之擴增子之雜交併不一致，使得探針分子與第一擴增子集合及第二擴增子集合中之擴增子之雜交可區分第一擴增子集合與第二擴增子集合； 自該陣列洗滌未結合之核酸分子；及 量測陣列上之各探針分子位置處之標記之信號；及 若信號指示與探針分子雜交之PCR擴增產物由PCR擴增反應產生，則如本文所描述分析信號以確定第一擴增子集合或第二擴增子集合是否由PCR擴增反應產生；或若信號指示沒有與該組探針分子雜交之PCR擴增產物由PCR擴增反應產生，則確定樣本不含有第一生物體或第二生物體， 因此確定第一生物體或第二生物體是否存在於樣本中。 6.4. 電腦實施方式

本發明之方法之許多態樣可藉由電腦實施。

因此，本發明提供用於偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於測試樣本或該測試樣本自其製備之初始樣本中的電腦實施方法。

該等方法典型地包含在具有耦接至記憶體之一或多個處理器的電腦系統中執行一或多個電腦可讀指令，該記憶體儲存該一或多個電腦可讀指令以供該一或多個處理器執行，該一或多個電腦可讀指令包含用於以下者之指令：（a）接收來自探針分子與測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號數據，及（d）根據一或多個式分析信號數據，以確定具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之第二微生物是否存在於測試樣本或該測試樣本自其製備之初始樣本中。一或多個式可包含例如：第一式，其用以在來自計量探針之信號等於或高於預定臨限值的情況下分析信號數據；及第二式，其用以在來自計量探針之信號數據小於預定臨限值的情況下分析信號數據。

電腦實施方法可包括向使用者提供通知，例如關於樣本中微生物之身分及/或關於樣本中不存在所關注之微生物之通知。 6.5. 系統

本發明提供可用於例如判定生物體是否存在於樣本中之系統。該系統可包含例如：（i）光學讀取器，其用於產生具有寡核苷酸探針分子之陣列（例如，本發明之陣列）的各探針分子位置之信號數據；以及（ii）至少一個處理器，其經配置以自光學讀取器接收信號數據且經配置以使用虛擬探針（例如，具有如本文中所描述之特徵的虛擬探針）分析信號數據，且該處理器具有至用於輸出分析結果之儲存或顯示裝置或網路之介面。

可用於本發明之系統中之光學讀取器包括市售微量盤讀取器（例如，GloMax® Discover（Promega）、ArrayPix ^TM（Arrayit）、Varioskan ^TMLUX（Thermo Scientific）、Infinite® 200 PRO（Tecan））。

該等系統可進一步包括（作為光學讀取器之組件或作為單獨的組件）光源，該光源能夠在陣列上激發經螢光標記之分子（例如探針分子及/或與其雜交之擴增子）。

系統可包括非暫態儲存媒體（例如，硬碟、快閃驅動機、CD或DVD），其包括用於實施信號數據之分析的處理器可執行指令。

該系統可包括通用或專用計算系統環境或配置。可與本發明之系統一起使用的熟知計算系統、環境及/或配置之實例包括（但不限於）個人電腦、伺服器電腦、智慧型手機、平板電腦、手持式或膝上型裝置、多處理器系統、基於微處理器之系統、網路PC、小型電腦、大型電腦、包括以上系統或裝置中之任一者的分散式計算環境，及其類似者。

本發明之系統可執行電腦可執行指令，諸如程式模組。一般而言，程式模組包括執行特定任務或實施特定抽象資料類型之常式、程式、物件、組件、資料結構等。亦可在分散式計算環境中實踐一些實施方式，其中藉由遠端處理裝置執行任務，該等遠端處理裝置經由通信網路連接。此等分散式系統可為稱為企業計算系統之系統，或在一些實施方式中，可為「雲端（cloud）」計算系統。在分散式計算環境中，程式模組可位於本端及/或遠端電腦儲存媒體（包括記憶體儲存裝置）中。

計算環境可包括一或多個輸入/輸出裝置。一些此類輸入/輸出裝置可提供使用者介面。使用者可經由諸如鍵盤及指標裝置（諸如滑鼠）之輸入裝置將命令及資訊鍵入至電腦中。然而，可使用其他形式之指標裝置，包括軌跡球、觸控板或觸控式螢幕。

本發明之系統可包括一或多個輸出裝置，該一或多個輸出裝置包括可形成使用者介面之一部分的輸出裝置，例如監視器。

本發明之系統可在網路化環境中使用與一或多個遠端電腦之邏輯連接來操作。遠端電腦可為個人電腦、伺服器、路由器、網路PC、對等裝置或其他共同網路節點。邏輯連接包括區域網路（local area network；LAN）及廣域網路（wide area network；WAN），但亦可包括其他網路。此類網路連接環境在辦公室、企業範圍的電腦網路、內部網路及網際網路中為常見的。或者或另外，WAN可包括蜂巢式網路。

當用於LAN網路連接環境中時，本發明之系統可經由網路介面或適配器連接至LAN。當用於WAN網路連接環境中時，系統可包括數據機或用於經由WAN（諸如網際網路）建立通信之其他構件。

在網路化環境中，用於使用虛擬探針分析信號數據之程式模組可儲存於遠端記憶體儲存裝置（例如，硬碟機或快閃驅動機）中。

本發明之系統可進一步包含盤操作機器人，其能夠將PCR擴增反應之產物添加至陣列且能夠自該陣列洗滌未結合之核酸分子。多種盤操作機器人為可商購的且此類機器人可用於本發明之系統中（例如，Tecan MSP 9000、MSP 9250或MSP 9500、Tecan Cavro® Omni Flex、Tricontinent TriTon（XYZ）或Aurora Versa ^TM）。 6.6. 套組

本發明提供適用於本發明之方法中之套組。

套組可包含例如適用於如本文所描述之即時PCR反應之兩個或更多個經標記之探針分子（例如2至20個探針分子、2至10個探針分子、2至5個探針分子、5至10個探針分子或10至20個探針分子）的集合。舉例而言，套組可包含（1）核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之探針分子；（2）核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之探針分子；或（3）核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之探針分子。在一些實施方式中，套組包含（1）及（2）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（1）及（3）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（2）及（3）之探針分子之組合。在又其他實施方式中，套組包含（1）、（2）及（3）之探針分子之組合。

在其他實施方式中，套組可包含例如適用於如本文所描述之陣列上之兩個或更多個探針分子（例如2至20個探針分子、2至10個探針分子、2至5個探針分子、5至10個探針分子或10至20個探針分子）的集合（例如未標記之探針分子）。舉例而言，套組可包含（1）核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之探針分子；（2）核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之探針分子；或（3）核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之探針分子。在一些實施方式中，套組包含（1）及（2）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（1）及（3）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（2）及（3）之探針分子之組合。在又其他實施方式中，套組包含（1）、（2）及（3）之探針分子之組合。

在其他實施方式中，套組可包含如本文所描述之陣列。

如本文所描述之套組可進一步包含一或多種用於進行PCR反應之試劑，例如一或多種（例如兩種）用於擴增同源基因體序列之引子，及/或一或多種用於進行雜交反應之試劑，例如洗滌緩衝劑。

如本文所描述之套組可進一步包含用於製備用於PCR擴增反應之樣本的一或多種試劑及/或一或多種裝置，例如溶解緩衝劑或珠磨系統。

如本文所描述之套組可進一步包含一或多個容器及/或使用該套組之組分執行如本文所描述之方法中之一些或全部步驟之說明書。 7. 實施例 7.1. 實施例 1 ：用於凝固酶陰性葡萄球菌（ CNS ）之虛擬探針

金黃色葡萄球菌為凝固酶陽性物種且為人體之微生物群（microbiota）之正常成員。然而，金黃色葡萄球菌可變成機會性病原體，引起皮膚感染、呼吸道感染及食物中毒。因此，存在對可在臨床樣本中區分金黃色葡萄球菌及其他葡萄球菌物種之測試的臨床需求。存在幾種其他凝固酶陽性葡萄球菌，但其通常在疾病中不起主要作用，且因此對於大部分分析目的可忽略。

製得寡核苷酸探針「AllStaph-146abp」（具有核苷酸序列CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）），其可用於非特異性地鑑別葡萄球菌物種。換言之，AllStaph-146abp為屬探針分子且本身無法區分樣本中之金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性物種。實施例中所使用之探針分子名稱中所存在之數字係指用於製備可用探針分子探測之擴增子之正向PCR引子與探針起點之間的核苷酸數目之距離。第二寡核苷酸探針「Sau-71p」（具有核苷酸序列GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2））為16S rRNA探針分子，其提供來自金黃色葡萄球菌之擴增子之正信號，但不提供來自凝固酶陰性葡萄球菌之擴增子的正信號。因此，在唯一臨床上相關之凝固酶陽性葡萄球菌物種為金黃色葡萄球菌之情況下，用於凝固酶陰性葡萄球菌物種之例示性虛擬探針可由AllStaph-146abp及Sau-71p組成。當用虛擬探針探測PCR擴增產物且AllStaph-146abp之信號為正且Sau-71p之信號不為正（其可表示為「AllStaph-146-abp非Sau-71p」）時，可確定製備PCR擴增產物之樣本含有凝固酶陰性葡萄球菌物種（參見圖10A）。在有關更多物種之情形下，虛擬探針可包括額外探針分子。舉例而言，當有關可引起牛、馬及豬中之皮膚疾病之豬葡萄球菌（ S. hyicus）時，當對豬葡萄球菌具有特異性之探針亦不為正（其可表示為「AllStaph-146abp非Sau71P非豬葡萄球菌」時，可確定樣本含有凝固酶陰性葡萄球菌物種（參見圖10B）。 7.2. 實施例 2 ：用於區別咽峽炎鏈球菌及格氏鏈球菌之虛擬探針

格氏鏈球菌為通常發現於人類口腔中之細菌。格氏鏈球菌在口腔中通常為無害的，但在進入血流後可引起急性細菌性心內膜炎。咽峽炎鏈球菌亦為人類微生物群之成員，且已知會引起免疫功能不全個體的感染。

已製得兩個寡核苷酸探針分子，其可用於虛擬探針中以區分樣本中之咽峽炎鏈球菌與格氏鏈球菌。具有核苷酸序列CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之寡核苷酸探針分子「Stango 85p」為16S rRNA探針分子，其可在咽峽炎鏈球菌及格氏鏈球菌中之任一者存在於樣本中時產生正信號。另一方面，具有核苷酸序列TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之寡核苷酸探針分子「Sang 156p」為來自咽峽炎鏈球菌之擴增子提供正信號且不為來自格氏鏈球菌之擴增子提供正信號。用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之例示性虛擬探針由Stango85p及Sang156p組成。當用虛擬探針探測PCR擴增產物，且Stango85p之信號為正，並且San156p之信號非正（其可表示為「Stango85p非Sang156p」）時，可確定用於製備PCR擴增產物之樣本含有格氏鏈球菌，而若Stango85p之信號為正且San156p之信號為正（其可表示為「Stango85p與Sang156p」），則可確定樣本含有咽峽炎鏈球菌。 7.3. 實施例 3 ：用於區分和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針

和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌兩者均可為病原性的，在其16S rRNA方面幾乎一致，由此使得兩個物種難以使用針對16S rRNA之單一寡核苷酸探針分子來區分。

已製得三個寡核苷酸探針分子，其可用於虛擬探針中以區分和緩鏈球菌與肺炎鏈球菌。具有核苷酸序列AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之第一探針「AllStrep-261p」為不能區分不同鏈球菌物種之屬探針分子。具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6），但包含來自肺炎鏈球菌之基因體序列的第二探針「Spneu-229p」自身不能用於區分和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌。具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之第三探針「Spneu-229bp」藉由考慮肺炎鏈球菌中之SNP的單核苷酸而不同於Spneu-229p。

當來自和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之16S rRNA擴增子與包含三個探針分子之陣列結合時，觀測到三個探針分子中之每一者的正信號（圖11A-11B）。因此，三個探針分子無法個別地用於區分和緩鏈球菌與肺炎鏈球菌。然而，來自和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之擴增子可藉由評價用三個探針探測來自和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之16S rRNA擴增子時的信號模式來區分。特定言之，探測由含有和緩鏈球菌之樣本產生之PCR擴增產物產生可表示為「(Spneu-229p或Spneu-229bp)＜(AllStrep-261p)/3」之信號模式，而探測由含有肺炎鏈球菌之樣本產生之PCR擴增產物產生可表示為「(Spneu-229p與Spneu-229bp)＞(AllStrep-261p)/3」之信號模式。

自來自含有和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之樣本之雜交資料的進一步分析，確定對於Spneu-229bp及AllStrep-261p探針之「(Spneu-229bp/AllStrep-261p)≤0.39」之信號模式指示和緩鏈球菌之存在，而對於Spneu-229bp及AllStrep-261p探針之「(Spneu-229bp/AllStrep-261p)＞0.39」之信號模式指示肺炎鏈球菌之存在。

因此，此實施例驗證虛擬探針概念。 7.4. 實施例 4 ：用於偵測草綠色鏈球菌群之虛擬探針

草綠色鏈球菌群（viridians Streptococci group；VGS）為臨床上相關之革蘭氏陽性細菌之主要群之一，該等革蘭氏陽性細菌具有超過24個物種，安排於五個子群中：牛鏈球菌群、咽峽炎鏈球菌群、唾液鏈球菌群、和緩鏈球菌群及變形鏈球菌群。VGS群細菌可在免疫功能不全患者中引起肺炎及敗血症。

作為一個群，VGS物種基因上呈異質，表明可使用單一探針偵測不同物種。多個探針經設計用於不同VGS群細菌，但少數物種展示與用於其他VGS子群之探針的交叉反應性（參見圖12，其展示肺炎鏈球菌與和緩鏈球菌探針Smit-79p之交叉反應性，且展示和緩鏈球菌及口腔鏈球菌與肺炎鏈球菌探針Spneu-229p及Spneu-229bp之交叉反應性）。鑒於交叉反應性，設計可區分肺炎鏈球菌與和緩鏈球菌/口腔鏈球菌之和緩鏈球菌群細菌的虛擬探針：

和緩鏈球菌子群=(Spar-205p與AllStrep-261p)或(Smit-79p與AllStrep-261p與非Shyo-193p)或(Ssang-193p與AllStrep-261p與非Stmu-86p)或(Stango-85p與非Sang-156p與AllStrep-261p＞0.01)且若Smit-79p則(Spneu-229bp / AllStrep-261p)AllStrep-261p ≤ 3。 7.5. 實施例 5 ：用於偵測來自腸桿菌科群之物種的虛擬探針

腸桿菌科為包括病原性及非病原性物種之較大革蘭氏陰性細菌科。病原性的科成員包括克雷伯氏菌物種、腸桿菌物種、艾氏菌（ Escherichia）物種、檸檬酸桿菌物種、沙雷菌物種及沙門氏菌物種。

該科之成員之16s rRNA區域在物種當中基因序列變異極小，使得難以設計能夠區分物種之16S探針。然而，考慮到16S序列之類似性，設計公用探針「Entb-132p」，其可將大部分科成員鑑別為腸桿菌科，除探針「Entb-299p」可鑑別之泛菌屬物種以外。

根據來自腸桿菌科物種之物種16S rRNA基因體區域中的聚集模式設計兩種群探針。來自腸桿菌屬及克雷伯氏菌屬之物種可藉由探針「Enklspss-95p」鑑別，且來自檸檬酸桿菌屬、沙門氏菌屬及艾氏菌屬之物種可藉由探針「SaEsCi-91p」鑑別。由於設計能夠區分腸內菌科物種之單一探針之困難，設計16S rRNA與ITS探針之組合（參見圖13及圖14）以用於腸內菌科物種之分級鑑別及區別。

使用16s-23s ITS區使得有可能區分包括陰溝腸桿菌、阿氏腸桿菌及霍氏腸桿菌的陰溝腸桿菌複合物之物種。組合使用之三個探針：「Encl-1871p」、「Encl-1659p」及「ECC3-1729p」允許不同陰溝腸桿菌複合物物種之特異性鑑別（參見圖15）。 陰溝腸桿菌 = Encl-1659p非(Encl-1871p或ECC3-1729p) 阿氏腸桿菌 = Encl01871p非(Encl-1659p或ECC3-1729p) 霍氏腸桿菌 = (Encl-1871p與ECC3-1729p)非Encl-1659p 7.6. 實施例 6 ：藉由虛擬探針之改善的凝固酶陰性葡萄球菌（ CNS ）偵測

此實施例描述使用包含實施例1中所述之AllStaph-146abp及Sau-71p探針之虛擬探針區分及鑑別CNS及凝固酶陽性金黃色葡萄球菌的改善式。

可使用AllStaph-146abp/Sau-71p信號比區分含有CNS之樣本與含有金黃色葡萄球菌之樣本。舉例而言，發現2之信號比截止值可用於以良好準確性區分含有CNS之樣本與含有金黃色葡萄球菌之樣本（例如當AllStaph-146abp/Sau-71p信號比＞2時鑑別樣本含有CNS，且當AllStaph-146abp/Sau-71p信號比＜2時鑑別樣本含有金黃色葡萄球菌）（資料未示出）。

然而，發現對於含有高濃度CNS之樣本，截止值2有時可引起不正確的鑑別，此係因為在高濃度下AllStaph-146abp/Sau-71p信號比下降至約2。參見圖16A-16B。當探測含有高濃度目標核酸之樣本時，寡核苷酸探針可變得飽和，且發現AllStaph-146abp及Sau-71p探針在不同樣本濃度下達到飽和。舉例而言，圖16A-16B展示，隨著樣本中CNS（人類葡萄球菌）及金黃色葡萄球菌之濃度增加，含有人類葡萄球菌或金黃色葡萄球菌之樣本所觀測到的AllStaph-146abp/Sau-71p信號比不保持恆定，而是隨著樣本濃度增加而降低。此指示AllStaph-146abp探針（一種屬探針）在比Sau-71p更低的濃度下達到飽和。因此，可在低樣本濃度下準確地區分CNS與金黃色葡萄球菌的AllStaph-146abp/Sau-71p信號比截止值（例如2）可在高樣本濃度下引起不正確鑑別。

儘管觀測到AllStaph-146abp/Sau-71p信號比隨著樣本濃度增加而降低，但亦觀測到在所有研究濃度下，CNS之AllStaph-146abp/Sau-71p比率保持比金黃色葡萄球菌更高。因此，在瞭解樣本中之目標序列之相對濃度的情況下，即使在高樣本濃度下，亦可使用AllStaph-146abp/Sau-71p信號比之適當截止值來區分CNS及金黃色葡萄球菌。發現屬探針AllStaph-146abp可用作計量探針，以提供目標核酸濃度之相對度量。設計考慮到目標核酸濃度之此相對度量的鑑別CNS及金黃色葡萄球菌之式： 用於CNS判定之式： ((AllStaph-146abp≥0.2與AllStaph-146abp/Sau-71p≥1.5)) 或 ((AllStaph-146abp＜0.2與AllStaph-146abp/Sau-71p＞3))

在上式中，0.2之原始AllStaph-146abp信號係臨限值（其係自原始信號數據憑經驗確定）。當來自AllStaph-146abp之信號大於或等於0.2之臨限值時（指示目標核酸之相對較高濃度），當AllStaph-146abp/Sau-71p之原始信號之比率大於或等於1.5時，判定存在CNS；若該比率小於1.5，則判定存在金黃色葡萄球菌。當來自AllStaph-146abp之信號小於0.2時（指示目標核酸之相對較低濃度），當AllStaph-146abp/Sau-71p之原始信號之比率大於3時，判定樣本中存在CNS；若該比率小於或等於3，則判定存在金黃色葡萄球菌。

因此，上式表示第一式(AllStaph-146abp/Sau-71p≥1.5)及第二式(AllStaph-146abp/Sau-71p＞3)之組合，其中AllStaph-146abp之信號（特定言之，信號與臨限值比較起來如何）用於確定使用哪個式以鑑別樣本含有CNS或金黃色葡萄球菌。相比於僅基於單一AllStaph-146abp/Sau-71p信號比截止值的式，使用考慮樣本中目標核酸之相對濃度的式鑑別CNS及金黃色葡萄球菌之準確性可提高。 8. 特定實施方式

本發明藉由以下特定實施方式例示。 1.          一種偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於測試樣本或該測試樣本自其製備之初始樣本中之方法，其包含： （a）    用包含複數個探針分子之虛擬探針探測該測試樣本，其中： （i）     該虛擬探針包含至少兩個探針分子，其等各自能夠與對應於該第一基因體之一或多個目標核酸及/或對應於該第二基因體之一或多個同源目標核酸特異性雜交， （ii）    該等探針分子中之至少一者為能夠與對應於該第一基因體之目標核酸及對應於該第二基因體之同源目標核酸雜交的計量探針，使得該計量探針與此類目標核酸之雜交可提供該測試樣本中目標核酸之相對量的度量， （iii）   該虛擬探針之該等探針分子無法個別地區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸，及 （iv）   該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸之雜交併不一致，使得該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸的雜交可區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸； （b）    偵測及/或定量來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號；及 （c）    若偵測到該等探針分子與該測試樣本中之核酸之雜交，則： （i）     若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號大於或等於臨限值，則根據第一式分析在步驟（b）中偵測及/或定量之該等信號，及 （ii）    若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的該信號小於該臨限值，則根據第二式分析在步驟（b）中偵測及/或定量之該等信號。 2.          如實施方式1之方法，其中來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的該信號係原始信號。 3.          如實施方式1之方法，其中來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的該信號係標準化信號。 4.          如實施方式1至3中任一項之方法，其中該計量探針係屬探針。 5.          如實施方式1至4中任一項之方法，其中對應於該第一基因體之一或多個目標核酸為第一擴增子集合且對應於該第二基因體之一或多個目標核酸為第二擴增子集合，並且其中該虛擬探針中之各探針分子能夠與該第一擴增子集合及/或該第二擴增子集合中之一或多個擴增子特異性雜交，且其中該等探針分子與該第一擴增子集合中之擴增子及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交併不一致，使得該等探針分子與該第一擴增子集合及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交可區分該第一擴增子集合及該第二擴增子集合。 6.          如實施方式5之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對該初始樣本進行PCR擴增反應來製備該測試樣本：能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增以在該第一基因體及第二基因體存在於該初始樣本中時分別產生該第一擴增子集合及第二擴增子集合。 7.          如實施方式6之方法，其中該等PCR引子包含超過一個引子對且其中該第一擴增子集合包含複數個第一擴增子及/或該第二擴增子集合包含複數個第二擴增子。 8.          如實施方式5之方法，其進一步包含藉由以下製備該測試樣本：（a）使用能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增之PCR引子之第一集合對該初始樣本進行第一PCR擴增反應；（b）使用不同於PCR引子之第一集合，且能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交並且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增的PCR引子之第二集合對該初始樣本進行第二PCR擴增反應；以及（c）組合第一及第二PCR反應中產生之擴增子，當該第一基因體及第二基因體存在於該初始樣本中時，分別產生包含複數個第一擴增子之第一擴增子集合及包含複數個第二擴增子之第二擴增子集合。 9.          如實施方式7或實施方式8之方法，其中該複數個第一擴增子對應於該第一基因體中之不同區域及/或該複數個第二擴增子對應於該第二基因體中之不同區域。 10.        如實施方式6之方法，其中該等PCR引子包含單一引子對，且該第一擴增子集合由單一第一擴增子組成且該第二擴增子集合由單一第二擴增子組成。 11.        如實施方式10之方法，其中該第一擴增子之核苷酸序列與該第二擴增子之核苷酸序列在能夠與該虛擬探針中之至少一個探針分子雜交的擴增子區域中具有至少1個核苷酸錯配。 12.        如實施方式10之方法，其中該第一擴增子之核苷酸序列與該第二擴增子之核苷酸序列在能夠與該虛擬探針中之至少一個探針分子雜交的擴增子區域中具有至少2個核苷酸錯配。 13.        如實施方式10之方法，其中該第一擴增子之核苷酸序列與該第二擴增子之核苷酸序列在能夠與該虛擬探針中之至少一個探針分子雜交的擴增子區域中具有至少3個核苷酸錯配。 14.        如實施方式6至13中任一項之方法，其中PCR擴增反應併入標記，該標記在藉由反應產生之任何擴增子中產生可量測信號。 15.        如實施方式6至14中任一項之方法，其中引子經標記。 16.        如實施方式15之方法，其中至少一個引子經5'螢光標記。 17.        如實施方式15之方法，其中超過一個引子經5'螢光標記。 18.        如實施方式6至17中任一項之方法，其中PCR反應包括經螢光標記之去氧核苷酸。 19.        如實施方式1至18中任一項之方法，其中各探針分子包含與該第一基因體及/或第二基因體中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列。 20.        如實施方式1至19中任一項之方法，其中該虛擬探針包含兩個相對於彼此具有1個或更多個核苷酸錯配之探針分子。 21.        如實施方式20之方法，其中虛擬探針包含兩個相對於彼此具有1個核苷酸錯配的探針分子。 22.        如實施方式20之方法，其中虛擬探針包含相對於彼此具有2個核苷酸錯配的探針分子。 23.        如實施方式1至22中任一項之方法，其中該虛擬探針之該等探針分子為存在於陣列上之位置上可定址之探針分子，該等探針分子各自處於該陣列上之不同的位置處。 24.        如實施方式23之方法，其中偵測及/或定量來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號包含偵測及/或定量該虛擬探針中之該等探針分子之位置處的標記。 25.        如實施方式23或實施方式24之方法，其中步驟（b）包含： （i）     使PCR擴增產物與該陣列接觸； （ii）    自該陣列洗滌未結合之核酸分子；及 （iii）   量測該陣列上之各探針分子位置處之標記之信號強度。 26.        如實施方式23至25中任一項之方法，其中陣列包含一或多個對照探針分子。 27.        如實施方式23至26中任一項之方法，其中探針分子為寡核苷酸探針分子。 28.        如實施方式27之方法，其中該等探針分子中之一或多者具有聚胸苷尾。 29.        如實施方式27之方法，其中聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 30.        如實施方式29之方法，其中聚胸苷尾為15聚體。 31.        如實施方式6至22中任一項之方法，PCR擴增反應為即時PCR擴增反應。 32.        如實施方式31之方法，其中： （a）    各探針分子包含可區分之標記及淬滅劑部分，該淬滅劑部分在標記及淬滅劑部分均附接至該探針時抑制該標記之偵測； （b）    該標記在該即時PCR擴增反應期間在該探針分子裂解後產生可量測之信號；及 （c）    各標記為可彼此區分之標記。 33.        如實施方式32之方法，其中標記為螢光標記。 34.        如實施方式5至33中任一項之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於編碼rRNA之基因的核苷酸序列。 35.        如實施方式5至34中任一項之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於rRNA基因之間的基因間間隔區的核苷酸序列。 36.        如實施方式1至35中任一項之方法，其中該第一微生物及該第二微生物為相同群之成員。 37.        如實施方式1至36中任一項之方法，其中該等微生物中之一或多者為人類病原體或動物病原體。 38.        如實施方式36至37中任一項之方法，其中該等微生物為細菌、病毒或真菌。 39.        如實施方式36至38中任一項之方法，其中該等微生物為細菌。 40.        如實施方式39之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於16S rRNA基因的核苷酸序列及/或對應於23S rRNA基因的核苷酸序列。 41.        如實施方式40之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於16S rRNA基因的核苷酸序列。 42.        如實施方式40或實施方式41之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於23S rRNA基因的核苷酸序列。 43.        如實施方式39至42中任一項之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於16S-23S基因間間隔區的核苷酸序列。 44.        如實施方式1至43中任一項之方法，其中該第一式組合來自該等探針分子與目標核酸之雜交的信號，其係藉由（i）一或多個布林運算子；（ii）一或多個關係運算子；（iii）一或多個信號比；或（iv）（i）-（iii）之任何組合。 45.        如實施方式1至44中任一項之方法，其中該第二式組合來自該等探針分子與目標核酸之雜交的信號，其係藉由（i）一或多個布林運算子；（ii）一或多個關係運算子；（iii）一或多個信號比；或（iv）（i）-（iii）之任何組合。 46.        如實施方式44或實施方式45之方法，其中各布林運算子獨立地選自「與」、「或」及「非」。 47.        如實施方式44至46中任一項之方法，其中各關係運算子獨立地選自「大於」（「＞」）、「小於」（「＜」）、「大於或等於」（「≥」）及「小於或等於」（「≤」）。 48.        如實施方式44至46中任一項之方法，其中在第一式及/或第二式中，信號由一或多個布林運算子組合。 49.        如實施方式44至48中任一項之方法，其中在第一式及/或第二式中，信號由一或多個關係運算子組合。 50.        如實施方式44至49中任一項之方法，其中在第一式及/或第二式中，信號由一或多個信號比組合。 51.        如實施方式1至50中任一項之方法，其中該虛擬探針包含兩個探針分子或由兩個探針分子組成。 52.        如實施方式51之方法，其中該虛擬探針包含（i）能夠與第一目標核酸（例如當該等目標核酸為PCR產物時，該第一擴增子集合中之第一擴增子）及第二目標核酸（例如當該等目標核酸為PCR產物時，該第二擴增子集合中之第二擴增子）特異性雜交之第一探針分子，以及（ii）能夠與該第二目標核酸特異性雜交但不與該第一目標核酸特異性雜交之第二探針分子。 53.        如實施方式52之方法，其中第一探針為計量探針。 54.        如實施方式51之方法，其中該虛擬探針包含（i）能夠與第一目標核酸（例如當該等目標核酸為PCR產物時，該第一擴增子集合中之第一擴增子）及第二目標核酸（例如當該等目標核酸為PCR產物時，該第二擴增子集合中之第二擴增子）特異性雜交之第一探針分子；及（ii）能夠與該第一目標核酸及該第二目標核酸特異性雜交之第二探針分子。 55.        如實施方式54之方法，其中第一探針為計量探針。 56.        如實施方式1至55中任一項之方法，其中虛擬探針包含第一探針及第二探針，且其中第一式及第二式以信號比組合來自第一探針及第二探針的信號。 57.        如實施方式56之方法，其中該第一式及該第二式各自將該信號比與預定截止值進行比較，其中該第一式之截止值及該第二式之截止值不同。 58.        如實施方式1至57中任一項之方法，其中該第一微生物為凝固酶陰性葡萄球菌屬物種（CNS）且該第二微生物為凝固酶陽性葡萄球菌屬物種（CPS）。 59.        如實施方式58之方法，其中該第二微生物係金黃色葡萄球菌。 60.        如實施方式58或實施方式59中任一項之方法，其中該虛擬探針包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列的探針分子。 61.        如實施方式60之方法，其中具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列的該探針分子係計量探針。 62.        如實施方式61之方法，其中該臨限值為0.2。 63.        如實施方式58至62中任一項之方法，其中該虛擬探針包含具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列的探針分子。 64.        如實施方式63之方法，其中該虛擬探針包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列的第一探針分子及具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列的第二探針分子，其中該第一式及該第二式以信號比組合來自該第一探針及該第二探針之信號。 65.        如實施方式64之方法，其中信號比為第一探針的信號除以第二探針的信號。 66.        如實施方式64或實施方式65之方法，其中該第一式及該第二式各自將該信號比與預定截止值進行比較，其中該第一式之截止值及該第二式之截止值不同。 67.        如實施方式66之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號大於或等於該臨限值時，當該信號比大於或等於該第一式之截止值時，判定CNS存在於該樣本中。 68.        如實施方式66或實施方式67之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值時，當該信號比大於該第二式之截止值時，判定CNS存在於該樣本中。 69.        如實施方式66至68中任一項之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號大於或等於該臨限值時，當該信號比小於該第一式之截止值時，判定CPS存在於該樣本中。 70.        如實施方式66至69中任一項之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值時，當該信號比小於或等於該第二式之截止值時，判定CPS存在於該樣本中。 71.        如實施方式66至70中任一項之方法，其中該第一式之截止值為1.5且該第二式之截止值為3。 72.        如實施方式1至57中任一項之方法，其中該第一微生物為格氏鏈球菌且該第二微生物為咽峽炎鏈球菌。 73.        如實施方式72之方法，其中虛擬探針包含具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之核苷酸序列的探針分子。 74.        如實施方式73之方法，其中具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之核苷酸序列的探針分子為計量探針。 75.        如實施方式72至74中任一項之方法，其中虛擬探針包含具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之核苷酸序列的探針分子。 76.        如實施方式1至57中任一項之方法，其中該第一微生物及該第二微生物為腸內菌科細菌。 77.        如實施方式76之方法，其中該第一微生物及該第二微生物係選自產氣腸桿菌、阿氏腸桿菌及霍氏腸桿菌。 78.        如實施方式1至57中任一項之方法，其中該第一微生物為和緩鏈球菌且該第二微生物為肺炎鏈球菌。 79.        如實施方式78之方法，其中虛擬探針包含具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列的探針分子。 80.        如實施方式78至79中任一項之方法，其中虛擬探針包含具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列的探針分子。 81.        如實施方式80之方法，其中具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列的探針分子為計量探針。 82.        如實施方式1至57中任一項之方法，其中虛擬探針包含三個探針分子或由三個探針分子組成。 83.        如實施方式82之方法，其中該虛擬探針包含（i）能夠與第一目標核酸（例如，當該等目標核酸為PCR產物時，該第一擴增子集合中之第一擴增子）及第二目標核酸（例如，當該等目標核酸為PCR產物時，該第二擴增子集合中之第二擴增子）特異性雜交之第一探針分子；（ii）不同於該第一探針分子且能夠與該第一及第二目標核酸特異性雜交之第二探針分子；以及（iii）不同於該第一及第二探針分子且能夠與該第一及第二目標核酸特異性雜交之第三探針分子。 84.        如實施方式78至83中任一項之方法，其中該第一微生物為和緩鏈球菌且該第二微生物為肺炎鏈球菌。 85.        如實施方式84之方法，其中虛擬探針包含具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）之核苷酸序列的探針分子。 86.        如實施方式84或實施方式85之方法，其中虛擬探針包含具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列的探針分子。 87.        如實施方式84至86中任一項之方法，其中虛擬探針包含具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列的探針分子。 88.        如實施方式87之方法，其中具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列的探針分子為計量探針。 89.        如實施方式6至88中任一項之方法，其中選擇PCR條件，使得PCR擴增產物之長度為300至800個核苷酸。 90.        如實施方式89之方法，其中選擇PCR條件，使得PCR擴增產物長度為400至600個核苷酸。 91.        如實施方式36至90中任一項之方法，其中該初始樣本或測試樣本處於感染微生物中之一或多者之風險下。 92.        如實施方式36至91中任一項之方法，其中該初始樣本或測試樣本疑似感染微生物中之一或多者。 93.        如實施方式1至92中任一項之方法，其中該初始樣本或測試樣本為生物樣本、環境樣本、或食品。 94.        如實施方式93之方法，其中該初始樣本或測試樣本為選自以下之生物樣本：血液、血清、唾液、尿液、胃液、消化液、淚液、糞便、精液、陰道液、間質液、源於腫瘤組織之體液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺體分泌物、呼出氣體、脊髓液、毛髮、指甲、皮膚細胞、血漿、自鼻拭子獲得之體液、自鼻咽洗滌液獲得之體液、腦脊髓液、組織樣本、自咽喉拭子獲得之體液或組織、自傷口拭子獲得之體液或組織、生檢組織、胎盤液、羊水、腹膜透析液、臍帶血、淋巴液、腔液、痰、膿、微生物群、胎糞、乳汁或自前述任一者之加工、萃取、或分離之樣本。 95.        如實施方式94之方法，其中該生物樣本係： （a）    尿液、痰或自尿液加工、萃取、或分離之樣本； （b）    痰或自痰加工、萃取、或分離之樣本； （c）    傷口拭子或自傷口拭子加工、萃取、或分離之樣本； （d）    血液或自血液加工、萃取、或分離之樣本；或 （e）    腹膜透析液或自腹膜透析液加工、萃取、或分離之樣本。 96.        如實施方式93之方法，其中該初始樣本或測試樣本為選自以下之環境樣本：土壤、地下水、地表水、廢水或自前述任一者加工、萃取、或分離之樣本。 97.        如實施方式1至96中任一項之方法，其中電腦實施步驟（c），且其中步驟（c）包含在具有耦接至記憶體之一或多個處理器的電腦系統中執行一或多個電腦可讀指令，該記憶體儲存該一或多個電腦可讀指令以供該一或多個處理器執行，該一或多個電腦可讀指令包含用於以下者之指令：（i）接收來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號數據，及（ii）若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號數據大於或等於臨限值，則根據該第一式分析該信號數據，且若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值，則根據該第二式分析該信號數據。 98.        如實施方式97之方法，其進一步包含向使用者提供通知，其中該通知視需要係關於該測試樣本中存在或不存在該第一微生物及/或該第二微生物。 99.        一種可定址陣列，其包含： （a）    用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列之一或多個虛擬探針，各虛擬探針包含一組位置上可定址之寡核苷酸探針分子，其等各自處於該陣列上之不同的位置，其中該一或多個虛擬探針中之各探針分子包含與該第一基因體序列或該第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列，其中該等寡核苷酸探針分子中之一或多者為計量探針；及 （b）    視需要存在之一或多個對照探針分子。 100.     如實施方式99之可定址陣列，其中計量探針中之一或多者為屬探針。 101.     如實施方式99或實施方式100之可定址陣列，其包含至少兩個虛擬探針。 102.     如實施方式99或實施方式100之可定址陣列，其包含至少三個虛擬探針。 103.     如實施方式99或實施方式100之可定址陣列，其包含至少四個虛擬探針。 104.     如實施方式99或實施方式100之可定址陣列，其包含至少五個虛擬探針。 105.     如實施方式99或實施方式100之可定址陣列，其包含至少十個虛擬探針。 106.     如實施方式999至104中任一項之可定址陣列，其包含至多十個虛擬探針。 107.     如實施方式99至105中任一項之可定址陣列，其包含至多十五個虛擬探針。 108.     如實施方式99至107中任一項之可定址陣列，其中各虛擬探針包含計量探針。 109.     如實施方式99至108中任一項之可定址陣列，其中各虛擬探針包含2至4個寡核苷酸探針分子。 110.     如實施方式109之可定址陣列，其中各虛擬探針包含2至3個寡核苷酸探針分子。 111.      如實施方式99至110中任一項之可定址陣列，其包含12個或更多個探針分子。 112.     如實施方式111之可定址陣列，其包含12至100個探針分子。 113.     如實施方式111之可定址陣列，其包含12至50個探針分子。 114.     如實施方式111之可定址陣列，其包含25至75個探針分子。 115.     如實施方式111之可定址陣列，其包含50至100個探針分子。 116.     如實施方式111之可定址陣列，其包含12個探針分子。 117.     如實施方式111之可定址陣列，其包含14個探針分子。 118.     如實施方式111之可定址陣列，其包含84個探針分子。 119.     如實施方式實施方式99至118中任一項之可定址陣列，其中第一基因體序列及第二基因體序列分別為來自第一微生物及第二微生物之基因體序列。 120.     如實施方式119之可定址陣列，其中該等微生物為相同屬之成員。 121.     如實施方式120之可定址陣列，其中該等微生物為相同群之成員。 122.     如實施方式99至121中任一項之可定址陣列，其中探針分子中之一或多者包含聚胸苷尾。 123.     如實施方式122之可定址陣列，其中聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 124.     如實施方式123之可定址陣列，其中聚胸苷尾為15聚體。 125.     如實施方式99至124中任一項之可定址陣列，其中該第一基因體序列及該第二基因體序列各自包含對應於編碼rRNA之基因的核苷酸序列。 126.     如實施方式125之可定址陣列，其中編碼rRNA之基因為16S rRNA基因或23S rRNA基因。 127.     如實施方式99至124中任一項之可定址陣列，其中該第一基因體序列及該第二基因體序列各自包含對應於rRNA基因之間的基因間間隔區的核苷酸序列。 128.     如實施方式99至127中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區分來自真細菌物種之基因體序列與並非真細菌物種之微生物的基因體序列的探針分子。 129.     如實施方式99至128中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區分來自革蘭氏陽性細菌之基因體序列與來自革蘭氏陰性細菌之基因體序列的探針分子。 130.     如實施方式99至129中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同目之微生物之基因體序列的探針分子。 131.     如實施方式99至130中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同科之微生物之基因體序列的探針分子。 132.     如實施方式99至131中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同屬之微生物之基因體序列的探針分子。 133.     如實施方式99至132中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同群之微生物之基因體序列的探針分子。 134.     如實施方式99至133中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同物種之微生物之基因體序列的探針分子。 135.     如實施方式99至134中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）。 136.     如實施方式99至135中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）。 137.     如實施方式99至136中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）。 138.     如實施方式99至137中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）。 139.     如實施方式99至138中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）。 140.     如實施方式99至139中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）。 141.     如實施方式99至140中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含核苷酸序列包含以下的探針分子：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。 142.     一種偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於測試樣本或該測試樣本所來源之初始樣本中之方法，其包含： （a）    用如實施方式99至141中任一項之陣列探測該測試樣本，該陣列包含虛擬探針，該虛擬探針包含兩個或更多個探針分子，其中： （i）     各探針分子能夠與對應於該第一基因體之一或多個目標核酸及/或對應於該第二基因體之一或多個同源目標核酸特異性雜交， （ii）    該虛擬探針之該等探針分子中之至少一者為能夠與對應於該第一基因體之目標核酸及對應於該第二基因體之同源目標核酸雜交的計量探針，使得該計量探針與此類目標核酸之雜交可提供該測試樣本中目標核酸之相對量的度量， （iii）   該虛擬探針之該等探針分子無法個別地區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸；及 （iv）   該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸之雜交併不一致，使得該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之一或多個目標核酸的雜交可區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸； （b）    自該陣列洗滌未結合之核酸分子； （c）    偵測及/或定量該陣列上之各探針分子位置處之信號；及 （d）    若該等信號指示： （i）     與該陣列之該等探針分子雜交之目標核酸存在於該測試樣本中，則分析該等信號以確定對應於該第一基因體之目標核酸或對應於該第二基因體之目標核酸是否存在於該樣本中，由此確定該第一生物體或該第二生物體是否存在於該初始樣本或該測試樣本中；或 （ii）    在步驟（a）中並不產生與該虛擬探針之該等探針分子雜交之目標產物，則確定該初始樣本或該測試樣本不含有該第一生物體或該第二生物體。 143.     如實施方式142之方法，其中步驟（d）（i）之該分析包含（i）若來自該計量探針之信號大於或等於臨限值，則根據第一式分析在步驟（c）中偵測及/或定量之信號，及（ii）若來自該計量探針之信號小於該臨限值，則根據第二式分析在步驟（c）中偵測及/或定量之信號。 144.     如實施方式142或實施方式143之方法，其中對應於該第一基因體之一或多個目標核酸為第一擴增子集合且對應於該第二基因體之一或多個目標核酸為第二擴增子集合，並且其中該虛擬探針中之各探針分子能夠與該第一擴增子集合及/或該第二擴增子集合中之一或多個擴增子特異性雜交，且其中該等探針分子與該第一擴增子集合中之擴增子及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交併不一致，使得該等探針分子與該第一擴增子集合及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交可區分該第一擴增子集合及該第二擴增子集合。 145.     如實施方式144之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對該初始樣本進行PCR擴增反應來製備該測試樣本：能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增以在該第一基因體及第二基因體存在於該樣本中時分別產生該第一擴增子集合及第二擴增子集合。 146.     如實施方式142至145中任一項之方法，其中電腦實施步驟（d），且其中步驟（d）包含在具有耦接至記憶體之一或多個處理器的電腦系統中執行一或多個電腦可讀指令，該記憶體儲存該一或多個電腦可讀指令以供該一或多個處理器執行，該一或多個電腦可讀指令包含用於以下者之指令：（i）接收來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號數據，及（ii）若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號數據大於或等於臨限值，則根據該第一式分析該信號數據，且若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值，則根據該第二式分析該信號數據。 147.     如實施方式146之方法，其進一步包含向使用者提供通知，其中該通知視需要係關於該測試樣本中存在或不存在該第一微生物及/或該第二微生物。 148.     一種系統，其包含： （a）    光學讀取器，其用於產生如實施方式99至141中任一項之陣列的各探針分子位置之信號數據；及 （b）    一或多個處理器，其中： （i）     該等處理器中之至少一者經配置以自該光學讀取器接收信號數據； （ii）    該等處理器中之至少一者經配置以分析在該等虛擬探針中之該等探針分子與測試樣本中若存在之核酸分子雜交之後產生的該一或多個虛擬探針之信號數據，視需要其中該分析包含確定該測試樣本是否含有該第一基因體序列及/或該第二基因體序列；及 （iii）   該等處理器中之至少一者具有至用於輸出該分析之結果的儲存或顯示裝置或網路之介面。 149.     如實施方式148之系統，其包含光源，其能夠激發該陣列上之經螢光標記之分子。 150.     如實施方式148或實施方式149之系統，其進一步包含盤操作機器人，其能夠將PCR擴增反應之產物添加至該陣列且能夠自該陣列洗滌未結合之核酸分子。 151.     如實施方式1至98及142至147中任一項之方法，其使用如實施方式148至150中任一項之系統來執行。 152.     一種用於製備測試樣本之方法，該測試樣本用於偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於初始樣本中，該方法包含： （a）    使用如下PCR引子對該初始樣本進行PCR擴增反應：能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增以在該第一基因體及第二基因體存在於該初始樣本中時分別產生第一擴增子集合及第二擴增子集合； （b）    使步驟（a）之該PCR擴增產物與如實施方式99至141中任一項之陣列接觸，該陣列包含用於區分該第一微生物之第一基因體序列與該第二微生物之第二同源基因體序列的虛擬探針，其中該虛擬探針包含計量探針；及 （c）    自該陣列洗滌未結合之核酸分子。 153.     如實施方式152之方法，其進一步包含 （d）    偵測及/或定量該陣列上之各探針分子位置處之信號；及 （e）    若偵測到該等探針分子與該測試樣本中之核酸之雜交，則： （i）     若來自該計量探針之信號大於或等於臨限值，則根據第一式分析在步驟（d）中偵測及/或定量之信號，及 （ii）    若來自該計量探針之信號小於該臨限值，則根據第二式分析在步驟（d）中偵測及/或定量之信號。 154.     如實施方式152至153中任一項之方法，其中選擇PCR條件，使得PCR擴增產物之長度為300至800個核苷酸。 155.     如實施方式154之方法，其中選擇PCR條件，使得PCR擴增產物長度為400至600個核苷酸。 156.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）。 157.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）。 158.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）。 159.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）。 160.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）。 161.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）。 162.     一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。 163.     如實施方式156至162中任一項之寡核苷酸探針分子，其包含聚胸苷尾。 164.     如實施方式163之寡核苷酸探針分子，其中聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 165.     如實施方式164之寡核苷酸探針分子，其中聚胸苷尾為15聚體。 166.     如實施方式156至165中任一項之寡核苷酸探針分子，其包含標記。 167.     一種虛擬探針，其包含複數個寡核苷酸探針分子，其中該虛擬探針中之至少一個寡核苷酸探針分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列且該虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列。 168.     一種虛擬探針，其包含複數個寡核苷酸探針分子，其中該虛擬探針中之至少一個寡核苷酸探針分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之核苷酸序列且該虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之核苷酸序列。 169.     一種虛擬探針，其包含複數個寡核苷酸探針分子，其中該虛擬探針中之至少一個寡核苷酸探針分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列、該虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）之核苷酸序列且該虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列。 170.     如實施方式167至169中任一項之虛擬探針，其中各寡核苷酸探針分子包含聚胸苷尾。 171.     如實施方式170之虛擬探針，其中聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 172.     如實施方式171之虛擬探針，其中聚胸苷尾為15聚體。 173.     一種可定址陣列，其包含： （a）    一組位置上可定址之探針分子，其等各自在陣列上之不同的位置處，其中該組探針分子包含如實施方式156至166中任一項之寡核苷酸探針分子；及 （b）    視需要存在之一或多個對照探針分子。 174.     一種可定址陣列，其包含如實施方式167至172中任一項之虛擬探針，其中虛擬探針中之各探針分子在陣列中之不同的位置處。 175.     如實施方式174之可定址陣列，其進一步包含一或多個對照探針分子。 176.     一種套組，其包含兩個或更多個探針分子，該等探針分子係選自核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7之探針分子。 177.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子。 178.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子。 179.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 180.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子。 181.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 182.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 183.     如實施方式176之套組，其包含核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子，及核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 184.     如實施方式176至183中任一項之套組，其中探針分子經標記。 185.     如實施方式184之套組，其中探針分子用螢光標記進行標記。 186.     如實施方式176至183中任一項之套組，其中探針分子未經標記。 187.     如實施方式176至186中任一項之套組，其進一步包含一或多個能夠擴增第一基因體序列及第二同源基因體序列之PCR引子對。 9. 文獻之引用

本申請案中所引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他文獻皆以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的，引用的程度就如同個別地指示將各個別公開、專利案、專利申請案或其他文獻以引用之方式併入以用於所有目的一樣。在併入本文中之一或多個文獻之教示內容與本發明不一致之情況下，以本說明書之教示內容為準。

無

[ 圖 1A-1B]為根據自GenBank獲得之若干葡萄球菌屬（ Staphylococcus）物種之16S rRNA基因製得的樹枝狀圖（在圖1A與圖1B之間拆分）。樹係利用自助重抽分析（bootstrap analysis）使用CLC序列查看器軟體構築以展示數據之信賴度。葡萄球菌屬群之各物種用兩個由Gen Bank寄存編號展示之序列表示。樹之各節點處的自助重抽值（以整數計）定義跨越數個重複實驗之數據的信賴百分比。自助重抽值愈高，各別分類群之數據愈具支持性。各別物種之水平線稱為分枝且表示該物種之基因改變量。分枝長度之單位展示為改變或取代之數目除以序列之長度。

[ 圖 2A-2B]表示由16s rRNA及16s-23s rRNA基因體序列之多重排比產生之來自草綠色鏈球菌（ Streptococcusviridians）群的物種之樹枝狀圖（在圖2A與圖2B之間拆分）。I-牛鏈球菌（ Streptococcus bovis）群、II-咽峽炎鏈球菌（ Streptococcus anginosus）群、III-唾液鏈球菌（ Streptococcus salivarius）群、IV-和緩鏈球菌（ Streptococcus mitis）群、以及V-變形鏈球菌（ Streptococcus mutans）群。數字表示指示數據組之信賴百分比的自助重抽值。視排比樣式及其病原性重要性而定，物種闡述為三個群-I、II及III。

[ 圖 3]為16S rRNA及16S-23S rRNA ITS基因體序列、以及16S正向（16S Fw）、16S反向（16S Rv）、ITS正向（ITS Fw）、及ITS反向（ITS Rv）引子之圖。

[ 圖 4]說明可用於章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR方法的引子對，該引子對包含未延伸引子（其可為用於對稱PCR程序中之傳統引子）以及由與目標核酸互補之「A」區、包括「A」區之至少一部分之直接重複序列或反向重複序列的「B」區、及視需要存在之「C」區構成之延伸引子，該「C」區可包括間隔子序列及/或限制性核酸內切酶識別位點之所有的一部分。

[ 圖 5A-5C].圖5A說明延伸引子之分子間雜交，其在「B」區含有「A」區之至少一部分之反向重複序列時發生。圖5B說明延伸引子之分子間雜交，其在「B」區含有「A」區之至少一部分之直接重複序列時發生。圖5C說明延伸引子之分子內雜交，其在「B」區含有「A」區之至少一部分之反向重複序列時發生。較佳地，「A」區與「B」區之間的互補區處於或接近於「A」區之5'端。

[ 圖 6]說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應中的變性步驟。在變性步驟中，將PCR反應混合物（典型地含有生物樣本，該生物樣本含有目標核酸或處於含有目標核酸之風險下、不對稱引子對、熱穩定DNA聚合酶、及PCR試劑）加熱至高於目標核酸之解鏈點，使得目標核酸（若存在）及不對稱引子對中之延伸引子變性以形成單股。

[ 圖 7]說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應之指數階段的黏合步驟，其發生在未延伸引子之解鏈溫度以下。不對稱引子對中之未延伸引子及延伸引子兩者與其各別互補股雜交。圖7展示與目標DNA之黏合（亦稱為雜交或結合），如發生於PCR之初始循環中，但在後續循環中，黏合可能發生於引子與PCR產物中之互補序列之間。由於延伸引子中之「B」區及視需要存在之「C」區，PCR產物將具有彼等序列或其等之互補序列，如圖8B及圖9中所描繪。

[ 圖 8A-8B] ：圖8A及圖8B說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應之指數階段的延伸步驟，在此期間熱穩定DNA聚合酶使用互補DNA作為模板延伸引子DNA。延伸區以虛線描繪。圖8A中之模板為目標DNA之股，且圖8B中之模板為使用不對稱引子對及目標DNA產生之PCR產物之股。

[ 圖 9]說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應之線性階段的同時黏合及延伸步驟，其在未延伸引子之解鏈溫度以上及延伸引子之解鏈溫度以下發生，使用PCR產物股2作為模板。此使得PCR產物股2不對稱擴增，導致PCR反應結束時，相對於PCR產物股1分子產生過量PCR產物股2分子。

[ 圖 10A-B]說明可如何將兩個（圖10A）或三個（圖10B）探針分子用於凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase negative Staphylococcus；CNS）之虛擬探針中。來自PCR擴增產物與兩個或三個探針分子之雜交的信號可使用布林運算子（Boolean operator）組合以確定CNS是否存在於樣本中。

[ 圖 11A-B]展示當與來自和緩鏈球菌（圖11A）及肺炎鏈球菌（ Streptococcus pneumoniae）（圖11B）之16S rRNA擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號。

[ 圖 12]展示當與來自肺炎鏈球菌、和緩鏈球菌、及口腔鏈球菌（ Streptococcus oralis）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。

[ 圖 13]展示當與來自腸沙門氏菌（ Salmonella enterica）及大腸桿菌（ Escherichia coli）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。

[ 圖 14]展示當與來自肺炎克雷伯氏菌（ Klebsiella pneumoniae）及產酸克雷伯氏菌（ Klebsiella oxytoca）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。

[ 圖 15]展示當與來自陰溝腸桿菌（ Enterobacter cloacae）、阿氏腸桿菌（ Enterobacter asburiae）、及霍氏腸桿菌（ Enterobacter hormaechei）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。

[ 圖 16A-16B]展示濃度（CFU/ml）增加之凝固酶陰性葡萄球菌（人類葡萄球菌）及凝固酶陽性金黃色葡萄球菌的AllStaph-146abp/Sau-71p信號比（Y軸）。圖16A展示以線性Y軸描繪之比率且圖16B展示以對數Y軸描繪之比率。

                         
          <![CDATA[<110>  英商安全保護生技系統公司（Safeguard Biosystems Holdings Ltd.）]]>
          <![CDATA[<120>  基因體序列之改善之偵測及用於其之探針分子]]>
          <![CDATA[<130>  SGB-009WO]]>
          <![CDATA[<140>  TW 111102383]]>
          <![CDATA[<141>  2022-01-20]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/139,643]]>
          <![CDATA[<151>  2021-01-20]]>
          <![CDATA[<160>  7     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn第3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  AllStaph-146abp]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          ccagtcttat aggtaggtta yccacg                                            26
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Sau-71p]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          gcttctcgtc cgttcgctcg                                                   20
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          <![CDATA[<220>]]>
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          cagtctatgg tgtagcaagc tacggtat                                          28
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          <![CDATA[<211>  24]]>
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          tatccccctc taataggcag gtta                                              24
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          agctaataca acgcaggtcc atct                                              24
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          gatgcaagtg caccttttaa gcaa                                              24
          <![CDATA[<210>  7]]>
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          gatgcaagtg caccttttaa gtaa                                              24
          

Claims (46)

1. 一種偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於測試樣本或該測試樣本自其製備之初始樣本中之方法，其包含：  （a）    用包含複數個探針分子之虛擬探針（virtual probe）探測該測試樣本，其中： （i）     該虛擬探針包含至少兩個探針分子，其等各自能夠與對應於該第一基因體之一或多個目標核酸及/或對應於該第二基因體之一或多個同源目標核酸特異性雜交， （ii）    該等探針分子中之至少一者為能夠與對應於該第一基因體之目標核酸及對應於該第二基因體之同源目標核酸雜交的計量探針（meter probe），使得該計量探針與此類目標核酸之雜交可提供該測試樣本中目標核酸之相對量的度量， （iii）   該虛擬探針之該等探針分子無法個別地區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸，及 （iv）   該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸之雜交併不一致，使得該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸的雜交可區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸； （b）    偵測及/或定量來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號；及 （c）    若偵測到該等探針分子與該測試樣本中之核酸之雜交，則： （i）     若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號大於或等於臨限值，則根據第一式分析在步驟（b）中偵測及/或定量之該等信號，及 （ii）    若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的該信號小於該臨限值，則根據第二式分析在步驟（b）中偵測及/或定量之該等信號。
2. 如請求項1之方法，其中來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的該信號係原始信號。
3. 如請求項1之方法，其中來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的該信號係標準化信號。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該計量探針係屬探針。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中對應於該第一基因體之一或多個目標核酸為第一擴增子集合且對應於該第二基因體之一或多個目標核酸為第二擴增子集合，並且其中該虛擬探針中之各探針分子能夠與該第一擴增子集合及/或該第二擴增子集合中之一或多個擴增子特異性雜交，且其中該等探針分子與該第一擴增子集合中之擴增子及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交併不一致，使得該等探針分子與該第一擴增子集合及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交可區分該第一擴增子集合及該第二擴增子集合。
6. 如請求項5之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對該初始樣本進行PCR擴增反應來製備該測試樣本：能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增以在該第一基因體及第二基因體存在於該初始樣本中時分別產生該第一擴增子集合及第二擴增子集合。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該虛擬探針之該等探針分子為存在於陣列上之位置上可定址之探針分子，該等探針分子各自處於該陣列上之不同的位置處。
8. 如請求項7之方法，其中步驟（b）包含： （i）     使PCR擴增產物與該陣列接觸； （ii）    自該陣列洗滌未結合之核酸分子；及 （iii）   量測該陣列上之各探針分子位置處之標記之信號強度。
9. 如請求項5至8中任一項之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於編碼rRNA之基因的核苷酸序列。
10. 如請求項5至9中任一項之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於rRNA基因之間的基因間間隔區的核苷酸序列。
11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該第一微生物及該第二微生物為相同群之成員。
12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該等微生物中之一或多者為人類病原體或動物病原體。
13. 如請求項11至12中任一項之方法，其中該等微生物為細菌、病毒或真菌。
14. 如請求項11至13中任一項之方法，其中該等微生物為細菌。
15. 如請求項14之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於16S rRNA基因的核苷酸序列及/或對應於23S rRNA基因的核苷酸序列。
16. 如請求項15之方法，其中該第一擴增子集合及該第二擴增子集合各自包含對應於16S rRNA基因的核苷酸序列。
17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該第一式組合來自該等探針分子與目標核酸之雜交的信號，其係藉由（i）一或多個布林（Boolean）運算子；（ii）一或多個關係運算子；（iii）一或多個信號比；或（iv）（i）-（iii）之任何組合。
18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該第二式組合來自該等探針分子與目標核酸之雜交的信號，其係藉由（i）一或多個布林運算子；（ii）一或多個關係運算子；（iii）一或多個信號比；或（iv）（i）-（iii）之任何組合。
19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該虛擬探針包含兩個探針分子或由兩個探針分子組成。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該第一微生物為凝固酶陰性葡萄球菌屬物種（coagulase negative Staphylococcus sp.；CNS）且該第二微生物為凝固酶陽性葡萄球菌屬物種（coagulase positive Staphylococcus sp.；CPS）。
21. 如請求項20之方法，其中該第二微生物係金黃色葡萄球菌（ S. aureus）。
22. 如請求項20或請求項21中任一項之方法，其中該虛擬探針包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列的探針分子。
23. 如請求項22之方法，其中具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列的該探針分子係計量探針。
24. 如請求項20至23中任一項之方法，其中該虛擬探針包含具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列的探針分子。
25. 如請求項24之方法，其中該虛擬探針包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列的第一探針分子及具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列的第二探針分子，其中該第一式及該第二式以信號比組合來自該第一探針及該第二探針之信號。
26. 如請求項25之方法，其中該第一式及該第二式各自將該信號比與預定截止值進行比較，其中該第一式之截止值及該第二式之截止值不同。
27. 如請求項26之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號大於或等於該臨限值時，當該信號比大於或等於該第一式之截止值時，判定CNS存在於該樣本中。
28. 如請求項26或請求項27之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值時，當該信號比大於該第二式之截止值時，判定CNS存在於該樣本中。
29. 如請求項26至28中任一項之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號大於或等於該臨限值時，當該信號比小於該第一式之截止值時，判定CPS存在於該樣本中。
30. 如請求項26至29中任一項之方法，其包含當來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值時，當該信號比小於或等於該第二式之截止值時，判定CPS存在於該樣本中。
31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該初始樣本或測試樣本為生物樣本、環境樣本、或食品。
32. 如請求項31之方法，其中該樣本為血液或自血液加工、萃取、或分離之樣本。
33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中電腦實施步驟（c），且其中步驟（c）包含在具有耦接至記憶體之一或多個處理器的電腦系統中執行一或多個電腦可讀指令，該記憶體儲存該一或多個電腦可讀指令以供該一或多個處理器執行，該一或多個電腦可讀指令包含用於以下者之指令：（i）接收來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號數據，及（ii）若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號數據大於或等於臨限值，則根據該第一式分析該信號數據，且若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值，則根據該第二式分析該信號數據。
34. 如請求項33之方法，其進一步包含向使用者提供通知，其中該通知視需要係關於該測試樣本中存在或不存在該第一微生物及/或該第二微生物。
35. 一種可定址陣列，其包含： （a）    用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列之一或多個虛擬探針，各虛擬探針包含一組位置上可定址之寡核苷酸探針分子，其等各自處於該陣列上之不同的位置，其中該一或多個虛擬探針中之各探針分子包含與該第一基因體序列或該第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列，其中該等寡核苷酸探針分子中之一或多者為計量探針；及 （b）    視需要存在之一或多個對照探針分子。
36. 一種偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於測試樣本或該測試樣本所來源之初始樣本中之方法，其包含： （a）    用如請求項35之陣列探測該測試樣本，該陣列包含虛擬探針，該虛擬探針包含兩個或更多個探針分子，其中： （i）     各探針分子能夠與對應於該第一基因體之一或多個目標核酸及/或對應於該第二基因體之一或多個同源目標核酸特異性雜交， （ii）    該虛擬探針之該等探針分子中之至少一者為能夠與對應於該第一基因體之目標核酸及對應於該第二基因體之同源目標核酸雜交的計量探針，使得該計量探針與此類目標核酸之雜交可提供該測試樣本中目標核酸之相對量的度量， （iii）   該虛擬探針之該等探針分子無法個別地區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸；及 （iv）   該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸之雜交併不一致，使得該等探針分子與對應於該第一基因體及該第二基因體之一或多個目標核酸的雜交可區分對應於該第一基因體及該第二基因體之目標核酸； （b）    自該陣列洗滌未結合之核酸分子； （c）    偵測及/或定量該陣列上之各探針分子位置處之信號；及 （d）    若該等信號指示： （i）     與該陣列之該等探針分子雜交之目標核酸存在於該測試樣本中，則分析該等信號以確定對應於該第一基因體之目標核酸或對應於該第二基因體之目標核酸是否存在於該樣本中，由此確定該第一生物體或該第二生物體是否存在於該初始樣本或該測試樣本中；或 （ii）    在步驟（a）中並不產生與該虛擬探針之該等探針分子雜交之目標產物，則確定該初始樣本或該測試樣本不含有該第一生物體或該第二生物體。
37. 如請求項36之方法，其中步驟（d）（i）之該分析包含（i）若來自該計量探針之信號大於或等於臨限值，則根據第一式分析在步驟（c）中偵測及/或定量之信號，及（ii）若來自該計量探針之信號小於該臨限值，則根據第二式分析在步驟（c）中偵測及/或定量之信號。
38. 如請求項36或請求項37之方法，其中對應於該第一基因體之一或多個目標核酸為第一擴增子集合且對應於該第二基因體之一或多個目標核酸為第二擴增子集合，並且其中該虛擬探針中之各探針分子能夠與該第一擴增子集合及/或該第二擴增子集合中之一或多個擴增子特異性雜交，且其中該等探針分子與該第一擴增子集合中之擴增子及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交併不一致，使得該等探針分子與該第一擴增子集合及該第二擴增子集合中之擴增子之雜交可區分該第一擴增子集合及該第二擴增子集合。
39. 如請求項38之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對該初始樣本進行PCR擴增反應來製備該測試樣本：能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增以在該第一基因體及第二基因體存在於該樣本中時分別產生該第一擴增子集合及第二擴增子集合。
40. 如請求項36至39中任一項之方法，其中電腦實施步驟（d），且其中步驟（d）包含在具有耦接至記憶體之一或多個處理器的電腦系統中執行一或多個電腦可讀指令，該記憶體儲存該一或多個電腦可讀指令以供該一或多個處理器執行，該一或多個電腦可讀指令包含用於以下者之指令：（i）接收來自該虛擬探針中之該等探針分子與該測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號數據，及（ii）若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號數據大於或等於臨限值，則根據該第一式分析該信號數據，且若來自該計量探針與該樣本中之核酸之雜交的信號小於該臨限值，則根據該第二式分析該信號數據。
41. 如請求項40之方法，其進一步包含向使用者提供通知，其中該通知視需要係關於該測試樣本中存在或不存在該第一微生物及/或該第二微生物。
42. 一種系統，其包含： （a）    光學讀取器，其用於產生如請求項35之陣列的各探針分子位置之信號數據；及 （b）    一或多個處理器，其中： （i）     該等處理器中之至少一者經配置以自該光學讀取器接收信號數據； （ii）    該等處理器中之至少一者經配置以分析在該等虛擬探針中之該等探針分子與測試樣本中若存在之核酸分子雜交之後產生的該一或多個虛擬探針之信號數據，視需要其中該分析包含確定該測試樣本是否含有該第一基因體序列及/或該第二基因體序列；及 （iii）   該等處理器中之至少一者具有至用於輸出該分析之結果的儲存或顯示裝置或網路之介面。
43. 如請求項42之系統，其包含光源，其能夠激發該陣列上之經螢光標記之分子。
44. 如請求項42或請求項43之系統，其進一步包含盤操作機器人，其能夠將PCR擴增反應之產物添加至該陣列且能夠自該陣列洗滌未結合之核酸分子。
45. 一種用於製備測試樣本之方法，該測試樣本用於偵測具有第一基因體之第一微生物或具有第二基因體之相同屬的第二微生物是否存在於初始樣本中，該方法包含： （a）    使用如下PCR引子對該初始樣本進行PCR擴增反應：能夠與該第一基因體及該第二基因體兩者雜交且自該第一基因體及該第二基因體兩者起始PCR擴增以在該第一基因體及第二基因體存在於該初始樣本中時分別產生第一擴增子集合及第二擴增子集合； （b）    使步驟（a）之該PCR擴增產物與如請求項35之陣列接觸，該陣列包含用於區分該第一微生物之第一基因體序列與該第二微生物之第二同源基因體序列的虛擬探針，其中該虛擬探針包含計量探針；及 （c）    自該陣列洗滌未結合之核酸分子。
46. 如請求項45之方法，其進一步包含 （d）    偵測及/或定量該陣列上之各探針分子位置處之信號；及 （e）    若偵測到該等探針分子與該測試樣本中之核酸之雜交，則： （i）     若來自該計量探針之信號大於或等於臨限值，則根據第一式分析在步驟（d）中偵測及/或定量之信號，及 （ii）    若來自該計量探針之信號小於該臨限值，則根據第二式分析在步驟（d）中偵測及/或定量之信號。

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