TW201525145A - 用於偵測細菌污染之方法及組合物 - Google Patents

用於偵測細菌污染之方法及組合物 Download PDF

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Abstract

本發明提供用於偵測細菌污染之組合物、反應混合物、套組及系統，以及其使用方法。

Description

用於偵測細菌污染之方法及組合物 交叉參考
本申請案主張2014年7月25日申請之美國臨時申請案第61/858,495號之權利，該申請案係全文以引用方式併入本文中。
移植組織及輸血產品之微生物污染係嚴重醫療問題。血庫面臨在發放用於給患者輸注之前測試每一血小板袋之微生物污染之重大挑戰。此挑戰一部分與血小板樣品相對較短的儲放壽命有關，通常係5-7天，且有時更短。關於血小板之挑戰因標準儲存條件而變得更複雜。與其他大多數可移植組織不同，血小板無法忍受冷凍，且即使經受極短時間之致冷亦會自接受者之循環快速消散。此對血小板存活之冷卻效應被認為不可逆並使得血小板不適於轉輸。在血小板暴露於低於20℃之溫度時，其快速經歷指示損傷之形狀改變。需要在轉輸前將血小板保持在室溫(例如22-25℃)下已對血小板儲存造成了一系列獨特的高成本且複雜的後勤要求。由於血小板在室溫下具有代謝活性，其通常在透氣容器中經受恆定攪動以容許氣體交換，從而防止代謝酸中毒之毒性後果。該等儲存條件有利於細菌生長，因此產生較高細菌感染風險。由於依賴於藉由培養偵測之篩選方法偵測污染所耗時間可長於可用儲放壽命，經常在將污染血小板輸注至患者中之後，在培養結 果變得可用時才隨後通知醫師血小板已被污染。根據美國血庫協會(A.A.B.B.)標準5.1.5.1，指導血庫或轉輸服務使用多種方法限制並偵測所有血小板濃縮物中之細菌污染。然而，轉輸細菌污染血小板之風險仍可高達1,000個單位中之1個單位，且該等事件中之10%至25%可能導致對患者之不良影響。儘管某一污染可能源自供體菌血症，但在採集時因皮膚上或血液包中之細菌污染係主要污染源，其無法經由供體診斷篩選來解決。
減輕污染之常用方法包括預防性措施(例如手臂清潔、使所採集血液之第一部分轉向及過濾)及培養方法。如當前污染比率所證實，該等程序仍有不足。此外，由於基於培養之偵測方法需要長培育時間(有時幾天)，樣品在其大部分可用壽命期間可能無法使用，且在使用該等樣品時，偵測可能未完成。對於生長相對緩慢之細菌污染尤其如此。舉例而言，對於芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcal sp.)、鏈球菌屬(Streptococcal sp.)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、變異庫克菌(Kocuria varians)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)及丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp.)，估計使用標準培養方法之平均偵測時間分別係24小時、27小時、34小時、47小時、56小時、87小時及97小時。
一種市售測試稱為BacT/ALERT測試(bioMérieux公司，Durham,N.C.)。細菌偵測係基於增殖細菌之二氧化碳排放。在培養品底部之對二氧化碳靈敏之液體乳液感測器變色且係經由感測器上反射之光的變化來偵測。用於細菌偵測之另一種方法涉及量測血小板製劑樣品中之氧含量。實例係Pall eBDS測試(Pall公司，Port Washington,N.Y.)。偵測方法量測樣品袋內空氣中之氧含量作為細菌之代用標記物。使用氧分析儀來量測具有血小板之袋或包之頂隙氣體中之氧百分比。若所採集血小板樣品中存在細菌，則在培育期間經由樣品中細菌之代謝活 性及增殖消耗之氧量增加，導致樣品袋內血漿以及空氣之氧含量出現可量測的減少。儘管對細菌生長之非專用量測允許偵測多種細菌，但靈敏度相對較低且需要長培育時間。
基於培養之標準篩選之替代性方法包括細菌抗原偵測及基於核酸之篩選。對基於抗原之方法之主要限制在於，倘若細菌病原體之譜系不明，則其無法直接應用於測試樣品。已提出對常見細菌核酸序列(例如16S rRNA)之偵測來達成較寬偵測譜，但迄今為止已認為該等方法之靈敏度及特異性不如目前的培養方法，且不適合於血小板樣品之早期測試。
本發明提供用於偵測生物樣品(例如血小板樣品)之污染之方法、組合物、反應混合物、套組及系統，其既具有寬偵測範圍亦具有高偵測特異性及靈敏度。根據本發明偵測污染亦顯著快於基於培養之篩選方法。
在一態樣中，本發明提供偵測複數個細菌物種、例如至少8個細菌物種中之任一者對樣品之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含使樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在單一反應混合物中產生可偵測量之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，該反應混合物包含單一引子對及單一可偵測探針，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含可偵測探針與其雜交之保守序列，且該保守序列在該至少8個細菌物種之間一致；及偵測該探針與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生可偵測信號，該可偵測信號指示該至少8個細菌物種中之任一者對該樣品之細菌污染。在一些實施例中，該樣品係血液樣品或血沉棕黃層樣品，且該污染預測或診斷個體之敗血症。在一些實施例中，樣品係血小板樣品。在一些實施例中，血小板樣品係藉由血球分離來分離之 血小板濃縮物。在一些實施例中，自小於5mL血小板濃縮物分離之核酸經受核酸擴增反應。在一些實施例中，擴增子係自細菌16S rRNA多核苷酸模板生成。在一些實施例中，在轉輸至接受者中之前完成對細菌污染之偵測。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之不大於300個鹼基或不大於150個鹼基之擴增子。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之100-200個鹼基之擴增子。在一些實施例中，所有細菌物種皆係在相同反應中用具有不同可偵測標記之探針偵測之革蘭氏(Gram)陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或二者之組合。在一些實施例中，至少8個細菌物種包含複數個革蘭氏陽性細菌物種及複數個革蘭氏陰性細菌物種。在一些實施例中，細菌物種選自由以下組成之群：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、大腸桿菌(Escherichia coli)、柯氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、藤黃微球菌及產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)。在一些實施例中，該方法包含偵測樣品中至少10種或15個細菌物種中之任一者之細菌污染。在一些實施例中，單一引子對包含第一引子，其包含如表2中所述序列(例如，SEQ ID NO：4、7或9)之至少10個鄰接核苷酸；及第二 引子，其包含如表2中所述序列(例如，SEQ ID NO：5、6、8或10)之至少10個核苷酸。在一些實施例中，第一及第二引子選自表15中所揭示之引子組或其任何組合。在一些實施例中，第一及第二引子對展現與表2或表15中所揭示之引子或其補體中之任一者在最佳比對時至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。在一些實施例中，探針包含表3中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，核酸擴增反應含有小於5pg之來自細菌污染之起始核酸。在一些實施例中，核酸擴增反應係使用選自由以下組成之群之方法來進行：聚合酶連鎖反應、即時聚合酶連鎖反應、等溫擴增、鏈置換擴增、滾環式擴增、連接酶連鎖反應、轉錄介導的擴增、固相擴增、基於核酸序列之擴增(NASBA)及線性擴增。在一些實施例中，核酸擴增反應係在孔中、在板中、在管中、在室中、在液滴中、在流動槽中、在載玻片中、在晶片中、附接至固體基板、附接至珠粒或在乳液中進行。在一些實施例中，可偵測信號具有跨越至少5log之線性偵測範圍。在一些實施例中，該方法進一步包含基於探針信號測定細菌污染之量。
在另一態樣中，本發明提供偵測樣品之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含使樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在單一反應混合物中產生可偵測量之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，該反應混合物包含單一引子對及單一可偵測探針，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含可偵測探針與其雜交之保守序列，且該樣品或其部分在擴增前未在高於35℃之溫度下加以培養；及偵測該探針與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生可偵測信號，該可偵測信號指示該樣品之細菌污染。在一些實施例中，該樣品係血液樣品或血沉棕黃層樣品，且該污染預測或診斷個體之敗血症。在一些實施例中，樣品 係血小板樣品。在一些實施例中，血小板樣品係藉由血球分離來分離之血小板濃縮物。在一些實施例中，自小於5mL血小板濃縮物分離之核酸經受核酸擴增反應。在一些實施例中，自小於5mL血小板濃縮物分離之核酸經受核酸擴增反應。在一些實施例中，擴增子係自細菌16S rRNA多核苷酸模板生成。在一些實施例中，在轉輸至接受者中之前完成對細菌污染之偵測。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之不大於300個鹼基或不大於150個鹼基之擴增子。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之100-200個鹼基之擴增子。在一些實施例中，該方法包含偵測樣品中至少10種或15個細菌物種中之任一者之細菌污染。在一些實施例中，單一引子對包含第一引子，其包含如SEQ ID NO：4、7或9中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；及第二引子，其包含如SEQ ID NO：5、6、8或10中所述序列之至少10個核苷酸。在一些實施例中，探針包含表3中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，核酸擴增反應含有小於5pg之來自細菌污染之起始核酸。在一些實施例中，核酸擴增反應係使用選自由以下組成之群之方法來進行：聚合酶連鎖反應、即時聚合酶連鎖反應、等溫擴增、鏈置換擴增、滾環式擴增、連接酶連鎖反應、轉錄介導的擴增、固相擴增、基於核酸序列之擴增(NASBA)及線性擴增。在一些實施例中，核酸擴增反應係在孔中、在板中、在管中、在室中、在液滴中、在流動槽中、在載玻片中、在晶片中、附接至固體基板、附接至珠粒或在乳液中進行。在一些實施例中，可偵測信號具有跨越至少5log之線性偵測範圍。在一些實施例中，該方法進一步包含基於探針信號測定細菌污染之量。
在一態樣中，本發明提供在獲得樣品後24小時內快速偵測樣品之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含使該樣品或其部分在多種條件下在單一反應混合物中用單一引子對及單一可偵測探針經 受核酸擴增反應以產生可偵測量之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含可偵測探針與其雜交之保守序列，且約1pg-5pg來自該等物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及在獲得該樣品後約24小時內，藉由該探針偵測與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生指示樣品之細菌污染之可偵測信號，由此自獲得該樣品約24小時內偵測污染。在一些實施例中，該樣品係血液樣品或血沉棕黃層樣品，且該污染預測或診斷個體之敗血症。在一些實施例中，樣品係血小板樣品。在一些實施例中，血小板樣品係藉由血球分離來分離之血小板濃縮物。在一些實施例中，自小於5mL血小板濃縮物分離之核酸經受核酸擴增反應。在一些實施例中，偵測產生指示血小板樣品之細菌污染之可偵測信號，該血小板樣品之細菌載量為約1.0菌落形成單位/mL(CFU/mL)。在一些實施例中，自小於5mL血小板濃縮物分離之核酸經受核酸擴增反應。在一些實施例中，擴增子係自細菌16S rRNA多核苷酸模板生成。在一些實施例中，在轉輸至接受者中之前完成對細菌污染之偵測。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之不大於300個鹼基或不大於150個鹼基之擴增子。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之100-200個鹼基之擴增子。在一些實施例中，該方法包含偵測樣品中至少10種或15個細菌物種中之任一者之細菌污染。在一些實施例中，單一引子對包含第一引子，其包含如SEQ ID NO：4、7或9中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；及第二引子，其包含如SEQ ID NO：5、6、8或10中所述序列之至少10個核苷酸。在一些實施例中，探針包含表3中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，核酸擴增反應含有小於5pg之來自細菌污染之起始核酸。在一些實施例中，核酸擴增反應係使用選自由以下組成之群之方法來進行：聚合酶連鎖反應、即時聚合酶 連鎖反應、等溫擴增、鏈置換擴增、滾環式擴增、連接酶連鎖反應、轉錄介導的擴增、固相擴增、基於核酸序列之擴增(NASBA)及線性擴增。在一些實施例中，核酸擴增反應係在孔中、在板中、在管中、在室中、在液滴中、在流動槽中、在載玻片中、在晶片中、附接至固體基板、附接至珠粒或在乳液中進行。在一些實施例中，可偵測信號具有跨越至少5log之線性偵測範圍。在一些實施例中，該方法進一步包含基於探針信號測定細菌污染之量。
在另一態樣中，本發明提供偵測樣品(例如個體之生物樣品)中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含用單一引子對對該樣品或其部分實施核酸擴增反應以產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，其中約1pg-5pg來自該等物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及用一或多種可偵測探針偵測該擴增子，其中一或多種可偵測探針中之每一者與保守序列特異性雜交，且該保守序列在複數個不同屬之細菌物種之間一致。在一些實施例中，該樣品係血液樣品或血沉棕黃層樣品，且該污染預測或診斷個體之敗血症。在一些實施例中，樣品係血小板樣品。在一些實施例中，陰性對照樣品之CT較含有1pg-5pg來自至少5個細菌物種中之任一者之DNA之樣品的CT高至少5個循環。在一些實施例中，一或多種可偵測探針包含不多於5種不同探針或不多於2種不同探針。在一些實施例中，一或多種可偵測探針由1種探針組成。在一些實施例中，在轉輸至接受者中之前完成對細菌污染之偵測。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之不大於300個鹼基或不大於150個鹼基之擴增子。在一些實施例中，擴增反應產生可偵測量之100-200個鹼基之擴增子。在一些實施例中，所有該等細菌物種皆係在相同反應中用具有不同可偵測標記之探針偵測之革蘭氏陽性細 菌、革蘭氏陰性細菌或二者之組合。在一些實施例中，複數個細菌物種包含複數個不同屬之革蘭氏陽性細菌物種及複數個不同屬之革蘭氏陰性細菌物種。在一些實施例中，一或多種可偵測探針包含第一探針，其與在革蘭氏陽性細菌物種之中常見且在至少一些革蘭氏陰性物種中不存在之保守序列特異性雜交；及第二探針，其與在革蘭氏陰性細菌物種之中常見且在至少一些革蘭氏陽性物種中不存在之保守序列特異性雜交。在一些實施例中，細菌物種選自由以下組成之群：金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、顆粒丙酸桿菌、綠膿桿菌、黏質沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌、模仿葡萄球菌、藤黃微球菌及產氣腸桿菌。在一些實施例中，該方法包含偵測樣品中至少10種或15個細菌物種中之任一者之細菌污染。在一些實施例中，單一引子對包含第一引子，其包含如SEQ ID NO：4、7或9中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；及第二引子，其包含如SEQ ID NO：5、6、8或10中所述序列之至少10個核苷酸。在一些實施例中，探針包含表3中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，核酸擴增反應含有小於5pg之來自細菌污染之起始核酸。在一些實施例中，核酸擴增反應係使用選自由以下組成之群之方法來進行：聚合酶連鎖反應、即時聚合酶連鎖反應、等溫擴增、鏈置換擴增、滾環式擴增、連接酶連鎖反應、轉錄介導的擴增、固相擴增、基於核酸序列之擴增(NASBA)及線性擴增。在一些實施例中，核酸擴增反應係在孔中、在板中、在管中、在室中、在液滴中、在流動槽中、在載玻片中、在晶片中、附接至固體基板、附接至珠粒或在乳液中進行。在一些實施例中，探針產生具有跨越至少5log之線性偵測範圍之信號。在一些實施 例中，該方法進一步包含基於該探針信號測定該複數個細菌物種之豐度。
在一態樣中，本發明提供用於擴增及偵測16S rRNA多核苷酸之一部分之組合物。在一些實施例中，該部分之長度小於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個核苷酸。在一個實施例中，組合物包含第一引子，其包含如表2或表15中所述序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：9)之至少10個鄰接核苷酸；第二引子，其包含如表2或表15中所述序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：10)之至少10個鄰接核苷酸；及探針其包含如表3中所述序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：16)或其補體之至少10個鄰接核苷酸。在一個實施例中，組合物包含引子，其在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中擴增長度為至少50個核苷酸之擴增子，該擴增子與表1中所列示序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：1-3)中之任一者在最佳比對時具有90%序列一致性；及一或多種探針，其與該擴增子之任一股特異性雜交。在一些實施例中，組合物位於容器中，例如孔、板、管、室、流動槽或晶片。在一些實施例中，組合物呈脫水形式。在一些實施例中，在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中，藉由該等引子及探針進行之約1pg-5pg來自複數個目標物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30。
在另一態樣中，本發明提供偵測血小板樣品中至少5個細菌物種中之任一者之細菌污染之方法。該方法包含：使樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在反應混合物中產生可偵測量之不大於約800個鹼基之擴增子，該反應混合物包含第一正向引子及第一反向引子，其中該第一正向引子及該第一反向引子各自與在至少5種不同細菌基因組之間保守之單獨區域雜交；自該反應混合物偵測指示存在該量之擴增子之信號，由此偵測血小板樣品中至少5個細菌物種中之任一者之細菌污染。在一個實施例中，第一正向及第一反向引子各自與 在至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或或甚至更多種不同細菌基因組之間保守之單獨區域雜交。保守區域可涵蓋金黃色葡萄球菌(基因庫(GenBank)登錄號NC_007622)之16S rRNA中9至28、32至48、522至545、888至903、916至937、939至973、975至994、957至981、1093至1125、1184至1206、1231至1252、1378至1396、1398至1422或1496至1516之區域，或以下細菌基因組中之任一者中之相應區域：金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、黏質沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌、丙酸桿菌屬、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌、模仿葡萄球菌、藤黃微球菌及產氣腸桿菌。可利用本文所揭示引子(包括表15中所列示之引子組)中之任一者來實踐此方法或本文所揭示之其他方法。在某一實施例中，該第一正向引子及該第一反向引子各自展現與目標細菌序列之該單獨區域在最佳比對時至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同源性。在某一實施例中，反應混合物進一步包含第二正向引子，其展現與至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個細菌物種中之任一者或全部在最佳比對時至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同源性。在某一實施例中，反應混合物進一步包含第二反向引子，其展現與至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個細菌物種中之任一者或全部在最佳比對時至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同源性。同源性區域可包括(但不限於)本文所揭示之任何保守區域，例如金黃色葡萄球菌(基因庫登錄號NC_007622)之16S rRNA 中之9至28、32至48、522至545、888至903、916至937、939至973、975至994、957至981、1093至1125、1184至1206、1231至1252、1378至1396、1398至1422或1496至1516，或本文所提及細菌基因組中之任一者中之相應區域。若期望，則反應混合物進一步包含可偵測標記，包括(但不限於)DNA結合染料或本文揭示之其他標記分子。在某一實施例中，核酸擴增係在多種條件下實施，使得約1pg-5pg來自至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個細菌物種中之任一者之DNA之循環臨限值(CT)小於30。
在一態樣中，本發明提供用於擴增及偵測16S rRNA多核苷酸之一部分之反應混合物。在一些實施例中，該部分之長度小於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個核苷酸。在一些實施例中，反應混合物包含樣品核酸；引子，其在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中擴增長度為至少50個核苷酸之擴增子，該擴增子與SEQ ID NO：1-3中之任一者在最佳比對時具有90%序列一致性；探針，其與該擴增子之任一股特異性雜交；及聚合酶；其中該反應混合物位於反應位點中。在一些實施例中，反應位點係液滴、孔、板、管、室、流動槽或晶片。在一些實施例中，在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中，藉由該等引子及探針進行之約1pg-5pg來自複數個目標物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30。
在一態樣中，本發明提供用於偵測樣品(例如血小板樣品)中之細菌污染之套組。在一個實施例中，該套組包含第一引子，其包含如表2或表15中所述序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：9)之至少10個鄰接核苷酸；第二引子，其包含如表2或表15中所述序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：10)之至少10個鄰接核苷酸；探針，其包含表3中所述序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：16)或其補體之至少10個鄰接核苷 酸。
在一態樣中，本發明提供使用本發明套組之方法。在一個實施例中，該方法包含用單一引子對對樣品或其部分實施核酸擴增反應以產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，其中約1pg-5pg來自複數個不同屬之細菌物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及用一或多種可偵測探針偵測該擴增子，其中一或多種可偵測探針中之每一者與保守序列特異性雜交，且該保守序列在複數個不同屬之細菌物種之間一致。
在一態樣中，本發明提供用於偵測樣品(例如血小板樣品、血液樣品或血沉棕黃層樣品)中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之系統。在一個實施例中，該系統包含電腦，其經組態以接收對樣品實施偵測反應之客戶要求；擴增系統，其因應該客戶要求對該樣品或其部分實施核酸擴增反應，其中該擴增反應使用單一引子對及單一探針產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，且另外其中1pg-5pg來自至少5個屬中之任一者之DNA之擴增之CT小於30；及報告生成器，其向接受者發送報告，其中該報告含有偵測該探針產生之信號強度之結果。在一些實施例中，報告生成器基於該探針產生之信號強度將該樣品鑑別為被污染或未污染。在一些實施例中，接受者係該客戶。
在一態樣中，本發明提供電腦可讀媒體。在一些實施例中，電腦可讀媒體包含在由一或多個處理器執行後，實現偵測血小板樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之方法之代碼。在一個實施例中，在執行該等代碼後實現之方法包含接收對樣品實施偵測反應之客戶要求；因應該客戶要求對該樣品或其部分實施核酸擴增反 應，其中該擴增反應使用單一引子對及單一探針產生可偵測量之16S rRNA之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，且另外其中1pg-5pg來自至少5個屬中之任一者之DNA之擴增之CT小於30；及生成含有偵測該探針產生之信號強度之結果之報告。
以引用方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均係以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地且個別地指出將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。
本發明的新穎特徵詳細闡釋於隨附申請專利範圍中。參照下文 闡述其中利用本發明原理之說明性實施例之詳細說明及附圖將更好地理解本發明之特徵和優點，在附圖中：
圖1係圖解說明核酸擴增反應結果之圖。
圖2係圖解說明核酸擴增分析之偵測範圍之圖。
圖3A及3B係圖解說明核酸擴增反應結果之圖。
圖4A及4B係圖解說明核酸擴增反應結果之圖。
圖5係繪示實例樣品分析系統之圖解。
圖6A及6B圖解說明Liu等人所述之引子與探針之間之雜交的樣品分析之結果。
圖7A係圖解說明核酸擴增反應結果之圖。
圖7B係圖解說明核酸擴增分析之偵測範圍之圖。
圖8A-G係圖解說明核酸擴增反應結果之圖。
圖9係圖解說明核酸擴增反應結果之圖。
圖10A係圖解說明三重實施之核酸擴增反應結果之圖。
圖10B係圖解說明所得擴增核酸之解鏈曲線分析結果之圖。
除非另外指示，否則本文所揭示之一些實施例的實踐採用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因組學及重組DNA之為業內所熟知之習用技術。例如，參見Sambrook及Green,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第4版(2012)；書系Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯)；書系Methods In Enzymology(Academic Press公司)，PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編輯(1995))，Harlow及Lane編輯(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications，第6版(R.I.Freshney編輯(2010))。
除非上下文明確指示其他含義，否則說明書及申請專利範圍中使用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，術語「細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。
術語「多核苷酸」、「核苷酸」、「核苷酸序列」、「核酸」及「寡核苷酸」可互換使用。其係指任何長度核苷酸之聚合形式(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其類似物。多核苷酸可具有任何三維結構，且可實施任何已知或未知功能。以下係多核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段之編碼或非編碼區、自連鎖分析界定之多個基因座(基因座)、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、短干擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重組多核苷酸、具支鏈多核苷酸、質體、載體、任何序列之分離DNA、任何序列之分離RNA、核酸探針及引子。多核苷酸可包含一或多種經修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，可在組裝聚合物之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。非核苷酸組份可中斷核苷酸序列。多核苷酸可在聚合後藉由 (例如)與標記組份偶聯經進一步修飾。
一般而言，術語「目標多核苷酸」係指起始核酸分子群中具有目標序列之核酸分子或多核苷酸，期望確定其存在、數量及/或核苷酸序列或該等分子中之一或多者之變化。一般而言，術語「目標序列」係指核酸單一鏈上之核酸序列。目標序列可係基因、調控序列、基因組DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、miRNA、rRNA)或其他分子之一部分。目標序列可係來自樣品之目標序列或二級目標(例如擴增反應產物)。
一般而言，「核苷酸探針」、「探針」或「標籤寡核苷酸」係指用於藉由與相應目標序列雜交在雜交反應中偵測或鑑別其相應目標多核苷酸之多核苷酸。因此，核苷酸探針可與一或多個目標多核苷酸雜交。標籤寡核苷酸可與樣品中之一或多個目標多核苷酸完全互補，或含有一或多個不與樣品中之一或多個目標多核苷酸之相應核苷酸互補之核苷酸。
「雜交」係指其中一或多個多核苷酸反應形成複合物之反應，該複合物係經由核苷酸殘基之鹼基之間的氫鍵來穩定。氫鍵可藉由Watson Crick鹼基配對、Hoogstein結合或以任何其他序列特異性方式發生。複合物可包含兩條鏈形成雙螺旋結構、三條或更多條鏈形成多鏈複合物、單一自雜交鏈或其任一組合。雜交反應可構成更廣泛過程中之一個步驟，例如PCR之起始，或內核酸酶對多核苷酸之酶裂解。能與給定序列雜交之序列稱為給定序列之「補體」。
術語「可雜交」在應用於多核苷酸時係指多核苷酸形成經由核苷酸殘基之鹼基之間的氫鍵穩定之複合物之能力。氫鍵可藉由Watson Crick鹼基配對、Hoogstein結合或以任何其他序列特異性方式來發生。複合物可包含兩條鏈形成雙螺旋結構、三條或更多條鏈形成多鏈複合物、單一自雜交鏈或其任一組合。雜交反應可構成更廣泛過程中 之一個步驟，例如PCR反應之起始，或核酶對多核苷酸之酶裂解。與給定序列雜交之序列稱為給定序列之「補體」。
「互補」係指核酸與另一核酸序列藉由傳統Watson-Crick或其他非傳統類型形成氫鍵之能力。互補百分比指示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵(例如，Watson-Crick鹼基配對)之殘基的百分比(例如，10個中之5、6、7、8、9、10個係50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。「完全互補」意指核酸序列之所有鄰接殘基皆將與第二核酸序列中相同數目之鄰接殘基氫鍵結。如本文所用之「實質上互補」係指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸之區域中，互補程度為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%，或係指兩個核酸在嚴格條件下雜交。
如本文所用之雜交之「嚴格條件」係指使對目標序列具有互補性之核酸主要與目標序列雜交，且實質上不與非目標序列雜交之條件。嚴格條件一般具有序列依賴性，且端視因子數而變。一般而言，序列愈長，序列與其目標序列特異性雜交之溫度愈高。嚴格條件之非限制性實例詳細闡述於以下文獻中：Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes，第一I部分，第二章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」,Elsevier,N.Y.。
術語「個體(subject)」、「個體(individual)」及「患者」在本文中可互換使用，其係指脊椎動物、較佳哺乳動物、更佳人類。哺乳動物包括(但不限於)鼠類、猿、人類、農場動物、運動動物及寵物。亦涵蓋活體內獲得或活體外培養之生物實體之組織、細胞及其後代。
如本文所用之「表現」係指自DNA模板轉錄多核苷酸(例如轉錄為mRNA或其他RNA轉錄物)之過程及/或隨後將所轉錄mRNA翻譯為肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及所編碼多肽可統稱為「基因產物」。若多核苷酸源自基因組DNA，則表現可包括在真核細胞中剪接mRNA。
如本文所用之「血小板樣品」及「血小板濃縮物」可互換使用，其係指個體之包含源自血小板純化過程之血小板之生物樣品。血小板可藉由多種方法(例如藉由離心或血球分離)自一或多種其他血液組份純化分離。隨後可對該等經純化血小板進行組合、稀釋、劃分或進一步純化，其皆產生包含源自血小板純化過程之血小板之樣品。
在一態樣中，本發明提供偵測血小板樣品中複數個細菌物種(例如至少8個細菌物種)中之任一者之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含使樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在單一反應混合物中產生可偵測量之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，該反應混合物包含單一引子對及單一可偵測探針，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含可偵測探針與其雜交之保守序列，且該保守序列在該至少8個細菌物種之間一致；及偵測該探針與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生可偵測信號，該可偵測信號指示該血小板樣品中該至少8個細菌物種中之任一者之細菌污染。
在另一態樣中，本發明提供偵測血小板樣品之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含使樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在單一反應混合物中產生可偵測量之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，該反應混合物包含單一引子對及單一可偵測探針，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含可偵測探針與其雜交之保守序列，且該樣品或 其部分在擴增前未在高於35℃之溫度下加以培養；及偵測該探針與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生可偵測信號，該可偵測信號指示該血小板樣品之細菌污染。
在一態樣中，本發明提供在獲得血小板樣品後24小時內快速偵測該樣品中之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含使該樣品或其部分在多種條件下在單一反應混合物中用單一引子對及單一可偵測探針經受核酸擴增反應以產生可偵測量之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含可偵測探針與其雜交之保守序列，且約1pg-5pg來自該等物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及在獲得該樣品後約24小時內，藉由該探針偵測與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生指示該血小板樣品之細菌污染之可偵測信號，由此自獲得該樣品約24小時內偵測污染。
在另一態樣中，本發明提供偵測個體之生物樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之方法。在一個實施例中，該方法包含用單一引子對對該樣品或其部分實施核酸擴增反應以產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800、700、600、500、400、300、200、150或100個鹼基之擴增子，其中約1pg-5pg來自該等物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及用一或多種可偵測探針偵測該擴增子，其中一或多種可偵測探針中之每一者與保守序列特異性雜交，且該保守序列在複數個不同屬之細菌物種之間一致。
在各個態樣中之任一者中，核酸可源自多種樣品來源。核酸可視情況但並非必須在進一步操作(例如在核酸擴增反應中)之前經分離及/或純化。舉例而言，生物樣品可不經單獨提取步驟即經受聚合酶連鎖反應(PCR)程序，使得自未純化樣品擴增無細胞核酸。作為另一 實例，樣品可不將核酸自其他細胞組份純化分離即在即將進行核酸擴增反應之前或在擴增反應期間經受細胞裂解條件。在一些實施例中，在使核酸經受擴增反應之前自生物樣品純化核酸(例如DNA、RNA或二者)。各種核酸純化方法為業內已知，且可隨生物樣品之類型而變。舉例而言，生物樣品可包括來自個體之組織及/或流體。一般而言，生物流體包括與活生物體相關之任何經處理或未經處理之流體，包括(但不限於)血液，包括全血、溫血或冷血及儲存血液或新鮮血液；經處理血液，例如經至少一種生理溶液(包括(但不限於)鹽水、營養素及/或抗凝劑溶液)稀釋之血液；血液組份，例如血小板濃縮物(PC)、富血小板血漿(PRP)、貧血小板血漿(PPP)、無血小板血漿、血漿、新鮮冷凍血漿(FFP)、得自血漿之組份、濃縮紅血球(PRC)、過渡區物質或血沉棕黃層(BC)；源自血液或血液組份或源自骨髓之相似血產品；自血漿分離並再懸浮於生理流體或低溫防護流體中之紅血球；及自血漿分離並再懸浮於生理流體或低溫防護流體中之血小板。生物樣品之其他非限制性實例包括皮膚、心臟、肺、腎、骨髓、乳房、胰臟、肝、肌肉、平滑肌、膀胱、膽囊、結腸、腸、腦、前列腺、食管、甲狀腺、血清、唾液、尿液、胃液及消化液、淚液、糞便、精液、陰道液、源自腫瘤組織之間隙液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺體分泌物、脊髓液、頭髮、指甲、皮膚細胞、血漿、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、腦脊液、組織、咽喉拭子、生檢、胎盤液、羊水、臍帶血、增強液(emphatic fluid)、腔液、痰、膿、微生物區、胎糞、母乳及/或其他排泄物或身體組織。在一些實施例中，欲測試樣品係全血。在一些實施例中，欲測試樣品係血沉棕黃層。在一些實施例中，所分析組織係欲移植或手術移植組織之一部分，例如器官(例如心臟、腎、肝、肺等)、皮膚、骨骼、神經組織、腱、血管、脂肪、角膜、血液或血液組份。在一些實施例中，樣品來自個體，例如 哺乳動物，包括(但不限於)鼠類、猿、人類、農場動物、運動動物或寵物。在一些實施例中，對樣品中污染之偵測係醫療行為(例如作出診斷或治療個體)之基礎。舉例而言，污染可診斷或預測個體之敗血症。可採取矯正性醫療介入，例如投與治療劑。
在一些實施例中，欲測試樣品係血小板樣品。將血小板自全血中之其他組份純化分離之方法為業內已知，包括利用離心及/或過濾之方法(例如血球分離)。在作為全血之組份分離時，可對血小板進行濃縮，再懸浮於血漿及/或血小板添加液中，藉由通過過濾器件去白血球及/或儲存於保持在約22℃溫度之平臺上之血小板儲存袋中。血小板樣品可包含來自單獨純化程序之血小板樣品池或其部分。在一些實施例中，血小板樣品係純化血小板樣品之一部分，已藉由(例如)離心自該部分移除血小板。
核酸可使用業內已知之任何適宜方法自生物樣品來提取。舉例而言，核酸可藉由用酚、酚/氯仿/異戊醇或類似調配物(包括TRIzol及TriReagent)進行有機提取來純化。提取技術之其他非限制性實例包括：(1)有機提取，之後乙醇沈澱，例如使用酚/氯仿有機試劑(Ausubel等人，1993)，且使用或不使用自動化核酸提取器(例如341型DNA提取器，可自Applied Biosystems(Foster City,Calif.)購得)；(2)固定相吸附方法(美國專利第5,234,809號；Walsh等人，1991)；及(3)鹽誘導核酸沈澱方法(Miller等人，(1988)，該等沈澱方法通常稱作「鹽析」方法。核酸分離及/或純化之另一實例包括使用核酸可特異性或非特異性結合之磁粒(例如珠粒)，之後使用磁鐵分離該等粒子，且自粒子洗滌並溶析核酸(例如，參見美國專利第5,705,628號)。在一些實施例中，可在上文分離方法之前實施酶消化步驟，以幫助自樣品消除不期望蛋白質，例如用蛋白酶K或其他類似蛋白酶消化。例如，參見美國專利第7,001,724號。若期望，則可將RNA酶抑制劑添加至裂 解緩衝液中。對於某些細胞或樣品類型，可期望將蛋白質變性/消化步驟增加至方案中。純化方法可係關於分離DNA、RNA(包括(但不限於)mRNA、rRNA、tRNA)或二者。當在提取程序期間或之後將DNA及RNA二者一起分離時，可採用其他步驟將一者或二者自另一者單獨純化。亦可生成所提取核酸之子部分，例如依據大小、序列或其他物理或化學特徵來純化。除了初始核酸分離步驟以外，可在後續操作之後實施核酸之純化，以(例如)移除過量或不期望試劑、反應物或產物。
在各個態樣中之任一者中，核酸擴增反應可包括多種核酸擴增方法中之任一者。一般而言，「擴增」係指增加目標序列拷貝數之任何過程。多種基於擴增之用於目標核酸之偵測及量化之方法為業內已知。聚合酶連鎖反應(PCR)使用多個變性、引子對與相對鏈退火及引子延伸之循環以使目標序列拷貝數指數式增加。在稱為RT-PCR之變化形式中，使用反轉錄酶(RT)自RNA製備互補DNA(cDNA)，然後藉由PCR擴增cDNA以產生DNA之多個拷貝(例如，參見美國專利第5,322,770號及第5,310,652號)。
擴增方法可涉及溫度變化(例如在熱變性步驟中)，或可係不包括熱變性步驟之等溫過程。等溫擴增方法之實例係鏈置換擴增，常稱作SDA，其使用以下之循環：引子序列對與目標序列之相對鏈退火，在dNTP存在下進行引子延伸以產生雙螺旋半硫代磷酸化引子延伸產物，內核酸酶介導之半修飾限制內核酸酶識別位點之切口形成，及聚合酶介導之自切口之3’端之引子延伸以置換現有鏈並產生用於下一輪引子退火、切口形成及鏈置換之鏈，從而導致產物的幾何擴增(例如，參見美國專利第5,270,184號及美國專利第5,455,166號)。嗜熱SDA(tSDA)在基本上相同之方法中在較高溫度下使用嗜熱內核酸酶及聚合酶(歐洲專利第0684315號)。
擴增方法之其他實例包括滾環式擴增(RCA)(例如，Lizardi,「Rolling Circle Replication Reporter Systems，」美國專利第5,854,033號)；解旋酶依賴性擴增(HDA)(例如美國專利申請案第US 20040058378號)及環介導之等溫擴增(LAMP)(例如，Notomi等人，「Process for Synthesizing Nucleic Acid，」美國專利第6,410,278號)。
核酸擴增反應之其他實例包括基於轉錄之擴增方法，例如基於核酸序列之擴增，亦稱作NASBA(例如，Malek等人，美國專利第5,130,238號)；依賴於使用擴增探針分子自身之RNA複製酶(一般稱為Qβ複製酶)之方法(例如，Lizardi,P.等人(1988)BioTechnol.6,1197-1202)；及自持續序列複製(例如，Guatelli,J.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878；Landgren(1993)Trends in Genetics 9,199-202；及HELEN H.LEE等人NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES(1997))。另一種基於轉錄之擴增方法係轉錄介導的擴增，一般稱為TMA，其在溫度、離子強度及pH實質上恆定之條件下自催化合成目標核酸序列之多個拷貝，其中目標序列之多個RNA拷貝自催化生成額外拷貝(例如，參見美國專利第5,480,784號；及美國專利第5,399,491號)。核酸擴增方法之其他實例包括連接酶連鎖反應(例如，參見美國專利第5,494,810號及第5,830,711號)及固相擴增方法(例如橋式擴增，其使用附接至固體表面(例如載玻片或珠粒)之引子；例如，參見美國專利第5,641,658號及第7,985,565號)。
一般而言，SDA可如下文所述。將單鏈目標核酸(通常係DNA目標序列)與SDA引子連接。「SDA引子」一般具有25-100個核苷酸之長度，且約35個核苷酸之SDA引子較佳。SDA引子與目標序列3’端之區域實質上互補，且該引子在其5’端(在與目標互補之區域外部)具有係限制內核酸酶(有時稱作「切口形成酶」或「切口形成內核酸酶」)之識別序列之序列。然後SDA引子與目標序列雜交。SDA反應混合物亦 含有聚合酶(「SDA聚合酶」)及所有四種去氧核苷-三磷酸(亦稱作去氧核苷酸或dNTP，即dATP、dTTP、dCTP及dGTP，常用於引子延伸反應中)之混合物，其中至少一種物質係經取代或修飾之dNTP；由此延伸SDA引子以形成經修飾引子，有時稱作「新合成鏈」。經取代dNTP經修飾使得其將抑制含有該境修士dNTP之鏈中之裂解，但不會抑制另一鏈上之裂解。適宜經取代dNTP之實例包括(但不限於)2’去氧腺苷5’-O-(1-硫代三磷酸)、5-甲基去氧胞苷5’-三磷酸、2’-去氧尿苷5’-三磷酸及7-去氮-2’-去氧鳥苷5’-三磷酸。另外，dNTP之取代可在納入新合成鏈中之後發生；例如，可使用甲基化酶將甲基添加至合成鏈中。另外，若所有核苷酸皆經取代，則聚合酶可具有5’→3’外核酸酶活性。然而，若少於所有核苷酸經取代，則聚合酶較佳缺少5’→3’外核酸酶活性。如彼等業內人士可瞭解，識別位點/內核酸酶對可係眾多種已知組合中之任一者。選擇內核酸酶在識別位點或在該識別位點之3’或5’處裂解鏈，且不裂解互補序列，此乃因該酶僅裂解一條鏈或由於納入經取代核苷酸。適宜識別位點/內核酸酶對為業內已知，包括(但不限於)HincII、HindII、AvaI、Fnu4HI、TthIIII、NcII、BstXI、BamHI等。繪示適宜酶及其相應識別位點以及所用經修飾dNTP之圖表參見以引用方式併入本文中之美國專利第5,455,166號。在形成切口後，使用聚合酶(「SDA聚合酶」)使剛形成切口之鏈5’→3’延伸，由此產生另一新合成鏈。所選聚合酶應能在切口位點起始5’→3’聚合，亦應置換切口下游之聚合鏈，且應缺少5’→3’外核酸酶活性(此可另外藉由添加阻斷劑來實現)。SDA中之適宜聚合酶包括(但不限於)DNA聚合酶I之Klenow片段、SEQUENASE 1.0及SEQUENASE 2.0(U.S.Biochemical)、T5 DNA聚合酶及Phi29 DNA聚合酶。一般而言，SDA不需要熱循環。一般將反應溫度設定為高至足以防止非特異性雜交但低至足以容許特異性雜交；此溫度通常係約37 ℃至約42℃，端視酶而定。在某一實施例中，對於本文所述之其他擴增技術，第二引子延伸反應可使用互補目標序列來實施，從而在設定時間段期間顯著促進擴增。亦即，第二引子核酸與第二目標序列(與第一目標序列實質上互補)雜交，以形成第二雜交複合物。添加酶，之後解離第二雜交複合物，導致生成多個新合成第二鏈。因此，擴增可為線性或非線性(例如指數式)。
NASBA概述於以下文獻中：美國專利第5,409,818號；Sooknanan等人，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，第12章(第261-285頁)，Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,1995；及「Profiting from Gene-based Diagnostics」,CTB International Publishing公司，N.J.,1996，該等文獻皆係以引用方式併入。NASBA與TMA及QBR二者極為類似。轉錄介導擴增(TMA)概述於美國專利第5,399,491號、第5,888,779號、第5,705,365號、第5,710,029號中，該等案件皆係以引用方式併入。NASBA與TMA之間之主要差異在於，NASBA利用添加RNA酶H來實現RNA降解，且TMA依賴於反轉錄酶之固有RNA酶H活性。一般而言，該等技術可闡述如下。將單鏈目標核酸(通常係RNA目標序列(有時稱為「第一目標序列」或「第一模板」)與第一引子(在本文中通常稱為「NASBA引子」，但「TMA引子」亦適宜)連接。下文闡述以DNA目標序列起始。該等引子一般具有25-100個核苷酸之長度，且約50-75核苷酸之NASBA引子較佳。第一引子較佳係DNA引子在其3’端具有與第一模板之3’端實質上互補之序列。第一引子亦在其5’端具有RNA聚合酶啟動子(或其補體(反義)，端視系統之組態而定)。然後使第一引子與第一模板雜交以形成第一雜交複合物。反應混合物亦包括反轉錄酶(「NASBA反轉錄酶」)及四種dNTP之混合物，使得第一NASBA引子延伸形成經修飾第一引子，其構成RNA(第一模板)及DNA(新合成鏈)之雜交複合物。「反轉錄 酶」或「RNA引導之DNA聚合酶」在本文中意指能自DNA引子及RNA模板合成DNA之酶。適宜RNA引導之DNA聚合酶包括(但不限於)禽類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(「AMV RT」)及莫洛尼(Moloney)鼠類白血病病毒RT。在擴增反應係TMA時，反轉錄酶進一步包含RNA降解活性。除了上位列示之組份以外，NASBA反應亦包括RNA降解酶(本文中有時亦稱作核糖核酸酶)，其將水解RNA：DNA雜合體之RNA且不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA。適宜核糖核酸酶包括(但不限於)來自大腸桿菌及小牛胸腺之RNA酶H。核糖核酸酶活性降解雜交複合物中之第一RNA模板，導致雜交複合物解離，留下第一單鏈新合成DNA鏈(有時稱為「第二模板」)。另外，NASBA反應亦包括第二NASBA引子，一般包含DNA(但對於本文中之所有探針及引子，亦可使用核酸類似物)。此第二NASBA引子在其3’端具有與第二模板之3’端實質上互補之序列，且亦含有功能啟動子之反義序列及轉錄起始位點之反義序列。因此，此引子序列在用作合成第三DNA模板之模板時含有足夠資訊，以容許RNA聚合酶之特異性且有效之結合及在期望位點起始轉錄。反義啟動子及轉錄起始位點可係T7 RNA聚合酶之反義啟動子及轉錄起始位點，但亦可使用其他RNA聚合酶啟動子及起始位點。第二引子與第二模板雜交，且亦存於反應中之DNA聚合酶(亦稱作「DNA引導之DNA聚合酶」)合成第三模板(第二新合成DNA鏈)，產生包含兩條新合成DNA鏈之第二雜交複合物。最終，所包括之RNA聚合酶及所需之四種核糖核苷三磷酸(核糖核苷酸或NTP)導致合成RNA鏈(第三新合成鏈，其與第一模板基本上相同)。RNA聚合酶(在本文中有時稱為「DNA引導之RNA聚合酶」)識別啟動子並在起始位點特異性起始RNA合成。另外，RNA聚合酶對每個DNA雙螺旋較佳合成若干個RNA拷貝。較佳RNA聚合酶包括(但不限於)T7 RNA聚合酶及其他噬菌體RNA聚合酶，包括噬菌體T3、噬菌體φII、沙門桿菌屬 (Salmonella)噬菌體sp6或假單胞菌屬(Pseudomonas)噬菌體gh-1之RNA聚合酶。在一些實施例中，以起始DNA目標序列、包含RNA聚合酶啟動子之第一引子及DNA聚合酶使用TMA及NASBA，以與包含啟動子序列之新合成鏈生成雙鏈DNA雜合體。然後使雜合體變性並添加第二引子。
等溫擴增反應之另一實例係單一引子等溫擴增(SPIA)。此擴增技術揭示於WO2001020035及美國專利第6,251,639號中，其係以引用方式併入本文中。通常，該方法包括使嵌合RNA/DNA擴增引子與探針或目標雜交。較佳地，探針之DNA部分位於RNA之3’處。視情況，該方法包括使包含終止多核苷酸序列之多核苷酸與模板中相對於複合引子與模板之雜交位於5’處之區域雜交。在引子與模板雜交後，用DNA聚合酶使引子延伸。隨後，用自RNA/DNA雜合體裂解RNA之酶自複合引子裂解RNA。隨後，使另一RNA/DNA嵌合引子與模板雜交，使得自目標探針置換第一延伸引子。重複延伸反應，藉此生成探針序列之多個拷貝。在僅使用一個SPIA引子時，擴增反應線性進展。在亦使用與第一引子延伸產物互補之反向SPIA引子時，擴增反應係非線性的。
在一些實施例中，核酸擴增反應係PCR反應。有利於藉由PCR擴增目標序列之條件可藉由業內已知方法來確定，可在過程中之多個步驟中優化，且取決於反應中要素之特徵，例如目標類型、目標濃度、欲擴增之序列長度、目標及/或一或多個引子之序列、引子長度、引子濃度、所用聚合酶、反應體積、一或多種要素對其他一或多種要素之比率及其他特徵，可改變其中之一些或所有特徵。一般而言，PCR涉及以下步驟：使欲擴增目標變性(若為雙鏈)、使一或多個引子與目標雜交及藉由DNA聚合酶使引子延伸，且重複該等步驟(或「循環」)以擴增目標序列。此過程中之步驟可優化以獲得不同結果，例如增加 產率，減少假產物之形成，及/或提高或降低引子退火之特異性。優化方法為業內已知且包括對擴增反應中要素之類型或數量之調節及/或對過程中給定步驟之條件的調節，例如具體步驟之溫度、具體步驟之持續時間及/或循環次數。在一些實施例中，擴增反應包含至少5、10、15、20、25、30、35、50或更多次循環。在一些實施例中，擴增反應包含不多於5、10、15、20、25、35、50或更多次循環。循環可含有任一數目之步驟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個步驟，且在所循環步驟之前及/或之後可實施一或多個彼等所循環步驟中未包括之步驟(例如初始解鏈步驟或最終培育步驟)。步驟可包含適於達成給定步驟之目的(包括但不限於引子退火、引子延伸及鏈變性)之任何溫度或溫度梯度。步驟可具有任何持續時間，包括(但不限於)約、小於約或大於約1秒、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、60秒、70秒、80秒、90秒、100秒、120秒、180秒、240秒、300秒、360秒、420秒、480秒、540秒、600秒或更久，包括無限直至手動中斷。可以任一順序組合包含不同步驟之任一數目之循環。在一些實施例中，組合包含不同步驟之不同循環，使得組合中之總循環數為約、小於約或大於約5、10、15、20、25、30、35、50或更多次循環。
在各個態樣中任一者之一些實施例中，核酸擴增反應包含一或多個引子(例如約、大於約或小於約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個引子)之3’端延伸。在一些實施例中，核酸擴增反應中之引子延伸僅涉及一對引子。在其他實施例中，核酸擴增反應中之引子延伸涉及多個引子對，例如2、3、4、5或更多引子對。在一些實施例中，引子對由第一引子及第二引子組成，其中第一引子包含可與一或多個目標多核苷酸之至少一部分雜交之序列，且另外其中第二引子包含可與第一引子延伸產物之補體之至少一部分雜交之序列。在目標多 核苷酸係雙鏈時，第二引子中可與第一引子延伸產物之補體之至少一部分雜交之序列亦可與目標多核苷酸之互補鏈之至少一部分雜交。在擴增反應含有複數個引子對時，該複數個引子對可分開(如在每一對之兩個不同引子中)，重疊(例如一個正向引子與兩個或更多個不同反向引子配對)或為分開對與重疊對之組合。擴增引子可具有任何適宜長度，例如約、小於約或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100或更多個核苷酸，其任一部分或全部可與相應目標序列(例如約、小於約或大於約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸)互補。通常，在引子包含互補部分及非互補部分時，與目標序列互補之部分位於引子之3’端。引子對可經設計以擴增任一期望長度之目標序列。如本文所用之「擴增子」係指在核酸擴增反應中以單鏈或雙鏈形式自目標多核苷酸擴增之目標序列。在擴增子係藉由引子對擴增時，引子對一般位於擴增子兩側，使得一個引子在目標序列之5’端雜交且另一引子與目標序列之3’端之補體雜交。在一些實施例中，擴增子長度為約或小於約1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25個或更少核苷酸。在一些實施例中，擴增子之長度為約或大於約50、100、200、300、400、500、750、1000個或更多個核苷酸。在一些實施例中，擴增子長度介於該等端點中之任兩個之間，例如長度為25-1000、30-500、50-400、50-250、50-150或100-200個核苷酸。引子可基於對多種設計考量中任一者之適應性來選擇，該等設計考量可單獨使用或與本文所揭示或業內已知之任何其他設計考量組合使用。用於引子之可選設計考量之其他非限制性實例包括：避免運行相同核苷酸(例如成列之3、4、5或更多個相同核苷酸)；靠近無重疊探針雜交位點之探針(例如介於引子之3’端與沿同一股之探針之5’端之間約或小於約0、1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、30、40、50、75、100或更多個核苷酸)；G-C含量在約20%-80%內，解鏈溫度(Tm)在所選範圍內(例如約55-65℃、58-62℃或58-60℃)；在3’端之最後5個核苷酸內具有不大於兩個G及/或C鹼基；對中之引子具有相似Tm(例如相同Tm或Tm彼此相差約1-2℃)；最小二級結構(例如在最佳摺疊時約或少於約5、4、3、2或1對Watson-Crick配對鹼基，例如藉由用mFold分析來測定(例如，參見Zuker等人，Nucl.Acid Res,2003,31：3406-3415))；在反應中引子之間呈同二聚體或異二聚體之最小雜交(例如在最佳比對時約或少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1對Watson-Crick配對鹼基)；及引子與相應探針之間之最小雜交(例如在最佳比對時約或少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1對Watson-Crick配對鹼基)。在一些實施例中，引子特異性擴增長度為約或至少約25、50、75、100、125、150或175個核苷酸且與表1中之序列(或其補體)在最佳比對時具有約或至少約80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%或更高序列一致性之擴增子。確定最佳序列比對之方法及算法為業內已知，可使用其中之任一者來測定序列一致性百分比。用於測定兩個序列之間之序列一致性之算法之一實例包括如由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)在blast.ncbi.nlm.nih.gov維護之基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)。
在一些實施例中，將引子對固定在固體載體上。固體載體之實例包括(但不限於)無機材料，例如基於二氧化矽之基板(例如玻璃、石英、熔融二氧化矽、矽或諸如此類)、其他半導體材料；及有機材料，例如聚合物材料(例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、纖維素、瓊脂糖或多種常用作反應媒介載體之有機基板材料中之任一者)。除了多種可用作固體載體之材料外，固體載體結構可 呈多種物理組態中之任一者，包括(但不限於)微粒、珠粒、奈米粒子、奈米晶體、纖維、微纖維、奈米纖維、奈米線、奈米管、墊、平面片材、平面晶圓或載玻片、多孔板、包括其他結構之光學載玻片、毛細管、微流體通道及諸如此類。在一些實施例中，在固體載體上之擴增包含橋式擴增。橋式擴增之一般方法為業內已知。例如，參見WO/1998/044151及WO/2000/018957。
尤其令人關注者係能與在至少5、10、15、20或更多個不同細菌基因組之間保守之區域特異性雜交之引子序列。舉例而言，選擇各自與在至少5、10、15、20或更多個不同細菌基因組之間保守之單獨區域雜交之正向及反向引子。該等保守區域包括(但不限於)金黃色葡萄球菌(基因庫登錄號NC_007622)之16S rRNA中之9至28、32至48、522至545、888至903、916至937、939至973、975至994、957至981、1093至1125、1184至1206、1231至1252、1378至1396、1398至1422或1496至1516，或以下細菌基因組中之任一者中之相應區域：金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、黏質沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌、丙酸桿菌屬、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌、模仿葡萄球菌、藤黃微球菌及產氣腸桿菌。
在一些實施例中，標的引子能與至少5、10、15、20或更多個不同細菌基因組之保守區域特異性雜交，且因此容許特異性擴增及偵測至少5、10、15、20或更多個不同細菌基因組中之任一類型。該等引子及其組之設計容許同時測定眾多組細菌株系之細菌感染。在某一實施例中，該偵測係在單一擴增反應中進行，其中使用單一引子對且視情況使用一或多個可選引子以提供額外細菌覆蓋範圍。該等引子及其組可結合本文所揭示之探針或其他標記分子(例如DNA結合染料(例 如，SYBR®綠))及諸如此類來使用。
核酸擴增反應中之引子延伸可藉由業內已知之任何適宜聚合酶來實施，例如DNA聚合酶，其大多可在市場上購得。DNA聚合酶可包含DNA依賴性DNA聚合酶活性、RNA依賴性DNA聚合酶活性或DNA依賴性及RNA依賴性DNA聚合酶活性。DNA聚合酶可係熱穩定或非熱穩定的。DNA聚合酶之實例包括(但不限於)Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Klenow片段及其變體、修飾產物及衍生物。在一些實施例中，使用細菌產生之酶經高度純化，使得無模板對照擴增反應在約或大於約25、30、35、40、45個或更多個PCR反應循環後不產生高於背景值之擴增信號。
在各個態樣中任一者之一些實施例中，在擴增過程期間及/或在其完成時偵測核酸擴增產物。擴增產物偵測可在擴增分析中即時進行。在一些實施例中，擴增產物可用螢光DNA結合劑(包括(但不限於)DNA插入劑及DNA溝結合劑)直接可視化。由於納入雙鏈DNA分子中之插入劑之量通常與擴增DNA產物之量成比例，故可藉由使用習用光學系統量化所插入染料之螢光便捷地測定擴增產物之量。DNA結合染料之非限制性實例包括SYBR®綠、SYBR藍、DAPI、碘化丙啶、赫斯特(Hoechst)、SYBR金、溴乙錠、吖啶(acridine)、原黃素(proflavine)、吖啶橙、吖啶黃素(acriflavine)、螢光香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰樹鹼(ellipticine)、道諾黴素(daunomycin)、氯 喹(chloroquine)、偏端黴素D(distamycin D)、色黴素(chromomycin)、胡米銨(homidium)、光輝黴素(mithramycin)、多吡啶釕、安麯黴素(anthramycin)及諸如此類。
在一些實施例中，在核酸擴增反應中採用序列特異性寡核苷酸探針以有利於對擴增產物之偵測及/或量化。基於探針之定量擴增依賴於藉由(例如)探針與擴增產物內目標序列之間之特異性雜交對期望擴增產物之序列特異性偵測。目標特異性探針之實例包括(但不限於)TaqMan®探針及分子信標。用於實施基於探針之定量擴增之一般方法為業內已知(例如，參見美國專利第5,210,015號)。雜交可在不同嚴格性下實施。適宜雜交條件一般使得探針與目標多核苷酸之間之識別相互作用既具有足夠特異性亦具有足夠穩定性，以提供寡核苷酸探針及/或引子與既定目標序列之間之優先雜交。提高雜交反應嚴格性之條件為業內已知且包括優化退火溫度及/或鹽濃度。寡核苷酸探針可具有任何適宜長度，例如約、小於約或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100或更多個核苷酸，其任一部分或全部可與相應目標序列(例如約、小於約或大於約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸)互補。在一些實施例中，在單一核酸擴增反應中使用複數個探針，例如約或小於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個探針。在一些實施例中，單一核酸擴增反應僅含有兩個探針，例如一個與來自一或多種革蘭氏陽性細菌(例如約或大於約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種)之序列特異性雜交之探針，及另一個與來自一或多種革蘭氏陰性細菌(例如約或大於約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種)之序列特異性雜交之探針。在一些實施例中，單一核酸擴增反應僅含有一個探針，例如與在複數個不同細菌物種(例如約或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、25、30、40、50或更多個物種)之間一致及/或在來自複數個不同屬(例如約或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多個屬)之細菌之間一致之序列特異性雜交之探針。探針可基於對多種設計考量中任一者之適應性來選擇，該等設計考量可單獨使用或與本文所揭示或業內已知之任何其他設計考量組合使用。用於探針之可選設計考量之其他非限制性實例包括：避免運行相同核苷酸(例如成列之3、4、5或更多個相同核苷酸)；靠近無重疊之擴增引子雜交位點(例如介於引子之3’端與沿同一股之探針之5’端之間約或小於約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、30、40、50、75、100或更多個核苷酸)；G-C含量在約20%-80%內，解鏈溫度(Tm)在所選範圍內(例如較相應引子Tm高約8-10℃)；及所含C多於G；在5’端上無G。在一些實施例中，探針與長度為約或至少約25、50、75、100、125、150或175個核苷酸且與表1中之序列在最佳比對時具有約或至少約80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%或更高序列一致性之擴增子特異性雜交。用於確定最佳序列比對之方法及算法為業內已知，可使用其中之任一者來測定序列一致性百分比。用於測定兩個序列之間之序列一致性之算法之一實例包括如由國家生物技術資訊中心在blast.ncbi.nlm.nih.gov維護之基本局部比對搜索工具(BLAST)。
對於在雜交分析期間形成之探針-目標複合物之便捷偵測，可使核苷酸探針與可偵測標記偶聯。適宜可偵測標記可包括可藉由以下方式偵測之任何組合物：光化學、生物化學、光譜、免疫化學、電學、光學或化學方式。眾多種適宜可偵測標記為業內已知，其包括螢光標記、化學發光標記、放射性同位素標記、酶標記及配體。用於偵測或量化雜交強度之偵測方法通常會依賴於上文所選擇標記。舉例而言，放射性標記可使用照相軟片或磷光成像儀來偵測。螢光標記物可使用 光偵測器偵測所發射光來偵測並量化。在一些實施例中，單一反應中複數個探針中之每一者偶聯至不同可偵測標記(例如具有不同發射光譜之螢光染料)，使得可區分對應於不同目標之擴增之信號。酶標記通常係藉由提供具有基板之酶並量測藉由基板上之酶的作用產生之反應產物來偵測；且最後，比色標記係藉由簡單地使有色標記可視化來偵測。
在一些實施例中，所結合探針之雜交係使用TaqMan分析來偵測(PE Biosystems,Foster City,Calif.；例如，參見美國專利第5,962,233號及第5,538,848號，其係以引用方式併入本文中)。該分析係在PCR反應期間實施。TaqMan分析利用DNA聚合酶(例如AMPLITAQ DNA聚合酶)之5’-3’外核酸酶活性。在PCR反應中包括序列特異性探針。典型TaqMan探針係具有5’-報告基因染料(例如，螢光染料)及3’-淬滅劑染料之寡核苷酸。在PCR期間，若探針與其目標結合，則AMPLITAQ聚合酶之5’-3’核溶解活性在報告基因與淬滅劑染料之間裂解探針。分離報告基因染料與淬滅劑染料導致螢光增加。信號隨每一PCR循環而累積，且可用螢光計監測。多種報告基因-淬滅劑對為業內已知。一些對經由螢光共振能量轉移(FRET)相互作用。在FRET中常用作報告基因或淬滅劑之分子包括(但不限於)螢光黃染料(例如，FAM、JOE及HEX)、玫瑰紅染料(例如，R6G、TAMRA、ROX)、青色素染料(例如，Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy7)、DABCYL及EDANS。螢光染料是否用作報告基因或淬滅劑係由其激發及發射光譜以及其所配對之螢光染料來確定。舉例而言，FAM係由波長為488nm之光最有效激發，且發射500至650nm光譜之光，且發射最大值為525nm。FAM係與(例如)作為淬滅劑之TAMRA一起使用之適宜報告基因標記，其激發最大值在514nm。使自螢光染料吸收之能量耗散之非螢光或暗淬滅劑之實例包括由Biosearch Technologies公司(Novato, Calif.,USA)銷售之Black Hole QuenchersTM。Black Hole QuenchersTM係包含至少三個選自經取代或未經取代之芳基或雜芳基化合物或其組合之基團之結構，其中該等殘基中之至少兩者係經由環外重氮鍵連接(例如，參見國際公開案第WO2001086001號)。其他暗淬滅劑包括Iowa Black淬滅劑(例如，Iowa Black FQTM及Iowa Black RQTM)、Eclipse®暗淬滅劑(Epoch Biosciences公司，Bothell,Wash.)及ZenTM淬滅劑(Integrated DNA Technologies公司；Coralville,IA)。淬滅劑之其他非限制性實例亦提供於美國專利第6,465,175號中。
在一些實施例中，經結合探針之雜交係使用分子信標寡核苷酸探針來偵測，例如美國專利第5,925,517號、PCT申請案第WO1995013399號及美國專利第6,150,097號中所述。在典型分子信標中，中心目標識別序列兩側之臂在探針未與目標鏈雜交時彼此雜交，形成髮夾結構，其中該目標識別序列位於髮夾結構之單鏈環中，且臂序列形成雙鏈莖狀物雜合體。在探針與目標雜交時，形成相對剛性之螺旋，從而使莖狀物雜合體解開並迫使臂分開。FRET對(例如螢光團EDANS及淬滅劑DABCYL(或本文所述或業內已知之其他對))可藉由烷基間隔體附接至臂。在分子信標未與目標鏈雜交時，淬滅螢光團之發射。在分子信標與目標鏈雜交時，FRET對分離，且未淬滅螢光團之發射。所發射螢光係存在目標鏈之信號。可在核酸擴增反應期間在PCR反應中每一循環結束時用(例如)螢光計偵測信號。信號強度隨目標序列之數量增加而提高。
如Whitcombe等人，Detection Of PCR Products Using Self-probing Amplicons and Fluorescence,Nature Biotechnology 17：804-807(1999年8月)所揭示，PCR產物之偵測可用自探測擴增子來完成。全蠍(Scorpion)因子載有包含探針元件、一對自身互補之莖狀物序列及螢光團/淬滅劑對之5’延伸。藉由包括封阻性六乙二醇(HEG)單體來「保 護」延伸免於被拷貝。在一輪自引子PCR延伸後，現將新合成目標區域附接至與探針相同之鏈。在第二輪變性及退火後，使探針與目標雜交，隨後探針發螢光。因此，如本文所述之「探針」可作為引子之一部分存在。
在各個態樣中任一者之一些實施例中，在核酸擴增反應中擴增之目標序列係保守細菌多核苷酸之一部分之序列。在一些實施例中，保守多核苷酸之擴增部分在不同細菌屬之間展現約或大於約80%、85%、90%、95%、97.5%或更高同源性。保守多核苷酸序列之實例包括(但不限於)在以下基因中發現之核苷酸序列：16S rRNA基因、23S rRNA基因、5S rRNA基因、5.8S rRNA基因、12S rRNA基因、18S rRNA基因、28S rRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、cox1基因及nifD基因。在一些實施例中，保守多核苷酸係16S rRNA多核苷酸之一部分(例如rRNA、rDNA、擴增產物或該等之組合)。幾乎40,000個長度大於1250個核苷酸之經比對16S rDNA序列之列表可參見Greengenes網絡應用，其係由Lawrence Berkeley National Laboratory運營之可公開訪問之數據庫。其他可公開訪問之數據庫包括基因庫、密西根州立大學(Michigan State University)之核糖體數據庫計劃、Max Planck Institute之Marine Microbiology's Silva數據庫及National Institute of Health's NCBI。擴增目標序列之非限制性實例顯示於表1中。在一些實施例中，擴增子之長度為約或至少約25、50、75、100、125、150或175個核苷酸，且與表1中之序列在最佳比對時具有約或至少約80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%或更高序列一致性。用於測定最佳序列比對之方法及算法為業內已知，可使用其中之任一者來測定序列一致性百分比。用於測定兩個序列之間之序列一致性之算法之一實例包括如由國家生物技術資訊中心在blast.ncbi.nlm.nih.gov維護之基本局部比對搜索工具(BLAST)。
在一些實施例中，保守多核苷酸之一部分係藉由由第一引子及第二引子組成之引子對特異性擴增，該等引子可與在複數個不同細菌物種(例如約或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多個)之間一致及/或在來自複數個不同屬(例如約或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多個)之細菌之間一致之序列特異性雜交。用單一通用引子對擴增可由此在單一反應中擴增來自複數種不同生物體之多核苷酸。在一些實施例中，引子對包含第一引子，其在其3’端包含至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或更多個來自表1中之序列之鄰接核苷酸；及第二引子，其在其3’端包含至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或更多個來自相同表1序列之鄰接核苷酸之補體。在一些實施例中，核酸擴增反應中之一或多個引子在其3’端包含至少約10、11、12、13、14、15或所有選自表2之序列之核苷酸。在一些實施例中，在其3’端包含至少約10個來自SEQ ID NO：4之核苷酸之第一引子係與在其3’端包含至少約10個來自SEQ ID NO：5或6之核苷酸之第二引子組合使用。在一些實施例中，在其3’端包含至少約10個來自SEQ ID NO：7之核苷酸之第一引子係與在其3’端包含至少約10個來自SEQ ID NO：8之核苷酸之第二引子組合使用。在一些實施例中，在其3’端包含至少約10個來自SEQ ID NO：9之核苷酸之第一引子係與在其3’端包含至少約10個來自SEQ ID NO：10之核苷酸之第二引子組合使用。
在各個態樣之一些實施例中，在單一反應中偵測複數種生物體之存在、不存在及/或數量。在一些實施例中，所偵測生物體係微生物，其非限制性實例包括病毒、類病毒、細菌、古細菌、真菌及原生動物。在一些實施例中，微生物係細菌。所偵測細菌可係革蘭氏陽性 細菌、革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌之組合。可在單一反應中偵測之細菌之非限制性實例包括以下中之兩者或更多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多者)：金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、顆粒丙酸桿菌、綠膿桿菌、黏質沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌、模仿葡萄球菌、藤黃微球菌及產氣腸桿菌。在一些實施例中，所有所偵測細菌皆係用與所有欲偵測細菌之間共享之序列互補之單一探針來偵測。兩側為一對通用引子且藉由其來擴增之目標序列可在複數種具有保守多核苷酸之不同生物體之間不同(例如具有一或多個插入、缺失、取代或其組合)，在複數種具有保守多核苷酸之不同生物體之間一致，或該等之組合。通常，兩側為一對通用引子且藉由其擴增之目標序列包含核苷酸序列之一或多個保守內部區域，該等區域在複數個不同細菌物種(例如約或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多個)之間一致及/或在來自複數個不同屬(例如約或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多個)之細菌之間一致，該保守內部區域可用作探針之目標。在一些實施例中，保守內部區域在複數個革蘭氏陽性細菌之間一致，且在革蘭氏陰性細菌之間不一致，或反之亦然。在一些實施例中，保守內部區域之長度為約或至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75、100或更多個核苷酸。在一些實施例中，引子經選擇使得欲偵測物種及/或屬之間之擴增子序列在欲偵測物種及/或屬之間具有約或至少約80%、85%、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%或更高 序列一致性。在一些實施例中，引子經選擇以產生在欲偵測物種及/或屬之間之目標長度內之擴增子，例如本文所述之任何擴增子長度。
在一些實施例中，藉由所擴增保守內部區域與探針寡核苷酸之間之雜交偵測(且視情況量化)複數個細菌物種及/或屬。一般而言，來自與保守內部區域特異性雜交之探針之正信號指示目標序列之存在，指示至少一種具有該目標序列之生物體存於核酸源自其之樣品中。以此方式，可用常見探針偵測複數個物種及/或屬之存在、不存在及/或數量。在一些實施例中，探針包含來自表1中之序列或與其互補之序列之至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或更多個鄰接核苷酸。在一些實施例中，核酸擴增反應中之一或多種探針包含選自表3之序列或其補體之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸。在一些實施例中，使用一或多種包含來自SEQ ID NO：11、12或13(或其補體)之至少10個核苷酸之探針來偵測藉由基於SEQ ID NO：4-6之引子擴增之擴增產物。在一些實施例中，使用一或多種包含來自SEQ ID NO：14或15(或其補體)之至少10個核苷酸之探針來偵測藉由基於SEQ ID NO：7-8之引子擴增之擴增產物。在一些實施例中，使用包含來自SEQ ID NO：16(或其補體)之至少10個核苷酸之探針來偵測藉由基於SEQ ID NO：9-10之引子擴增之擴增產物。
在各個態樣中任一者之一些實施例中，引子及探針經選擇以使目標多核苷酸偵測之靈敏度最大化。在一些實施例中，靈敏度係根據循環臨限值(CT)來量測。在PCR之初始循環中，螢光信號幾乎無變化。此定義擴增曲線(螢光強度對循環數之曲線)之基線。高於基線之螢光增加指示累積PCR產物之偵測。固定螢光臨限值可設定於基線上方。參數CT定義為螢光經過固定臨限值之循環數分數，通常係統計學上顯著高於基線或背景且處於擴增之對數-線性相中之強度。用於計算給定反應或反應組中之螢光臨限值之軟體通常包括於即時PCR分析 軟體包中。一種用於設定臨限值之常用方法係測定基線(背景)平均信號並將臨限值設定為基線平均信號之10倍。或者，可將臨限值設定為基線發射之標准偏差之約10倍。一組標準品之初始目標拷貝數之對數對CT之曲線通常係直線。量化目標在未知樣品中之量係藉由量測CT及使用標準曲線測定起始拷貝數來完成。在一些實施例中，偵測具有經約或大於約3、4、5、6、7、8或更多對數之偵測線性範圍。在一些實施例中，可藉由擴增反應中之探針偵測之約或小於約10pg、5pg、4pg、3pg、2pg、1pg、0.5pg、0.1pg或介於該等值中任一者之間之範圍(例如0.5-4pg、1pg-5pg、1pg-3pg等)之來自細菌物種中之任一者之基因組DNA之擴增之CT小於30。在一些實施例中，可藉由擴增反應中之探針偵測之約或小於約15000、10000、5000、2500、1500、1000、500、200、100、50或更少起始拷貝之目標序列之擴增之CT小於30。在一些實施例中，可藉由擴增反應中之探針偵測之約1pg來自細菌物種中之任一者之基因組DNA之擴增之CT為約或小於約30、29、28、27、26、25或更低。在一些實施例中，陰性對照樣品之CT較含有可藉由擴增反應中之探針偵測之約100pg、10pg、5pg、4pg、3pg、2pg、1pg、0.5pg、0.1pg或介於該等值中任一者之間之範圍(例如0.5-4pg、1pg-5pg、1pg-3pg、5pg-10pg等)之來自細菌物種中之任一者之基因組DNA之樣品之CT高至少2個循環(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個循環)。通常，陰性對照係具有所有反應試劑，但不添加模板(例如添加水來代替模板，或添加已知缺少目標擴增子之多核苷酸，例如在細菌-特異性擴增子情形中之人類基因組DNA)之擴增反應。在一些實施例中，在來自約或小於約25mL、20mL、15mL、10mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1mL、0.1mL或更少之血小板濃縮物之核酸中偵測細菌污染。在一些實施例中，在不首先培育樣品以促進細菌生長(例如在高於約30℃、35℃或37℃之溫度下 培育)之情況下對血小板樣品或其部分實施擴增。在一些實施例中，偵測產生指示血小板樣品之細菌污染之可偵測信號，該血小板樣品之細菌載量為在血小板樣品中約或小於約50、25、10、5、4、3、2、1、0.1或更少菌落形成單位/mL(CFU/mL)。在一些實施例中，在源自少於50000、40000、30000、25000、20000、15000、10000、7500、5000、2500、1250、1000、750、500、250、100、50、25、10、5或更少CFU之核酸存於偵測反應中時，偵測產生指示血小板樣品之細菌污染之可偵測信號。在一些實施例中，獲得含有源自5至50000 CFU、500至25000 CFU、1000至10000 CFU或25至2500 CFU之核酸之反應的可偵測信號。在一些實施例中，偵測係在轉輸所捐獻血小板樣品之前完成，且若偵測到正信號(指示細菌污染)，則不將所捐獻血小板轉輸至接受者中。在一些實施例中，具有等於或高於所揭示偵測臨限值中之任一者之污染之樣品之正信號係在自個體獲得樣品(例如自個體抽取血液)約48、24、12、6、4、2小時或更短時間內偵測。
在本文所述任一態樣之一些實施例中，不論樣品係在何時採集，偵測程序係在即將使用生物樣品之前(例如在將血液樣品或血液源樣品、例如血小板樣品投與個體之前)起始，且在該使用之前產生結果。舉例而言，可在計劃使用生物樣品之前約或小於約12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時測試生物樣品之污染，且偵測結果係在該計劃使用時間之前(例如使用前1、2、3、4、5小時或更長時間)獲得。在一些實施例中，在計劃使用約5小時內測試樣品，且在該計劃使用之前獲得結果。在一些實施例中，在計劃使用約2小時內測試樣品，且在該計劃使用之前獲得結果。在一些實施例中，在計劃使用約1小時內測試樣品，且在該計劃使用之前獲得結果。在一些實施例中，若藉由偵測方法偵測到細菌污染，則棄去不用該生物樣品。在一些實施例中，若未偵測到細菌污染，則該生物樣品之計劃使用繼 續進行。在一些實施例中，在使用前測試之樣品係在計劃使用前約或大於約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更長時間採集。在一些實施例中，在使用前測試之樣品係在計劃使用前約或大於約5天採集。
在一態樣中，本發明提供用於本文所揭示方法中之任一者之系統。在一些實施例中，該系統用於偵測樣品、例如血小板樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染。在一個實施例中，該系統包含：電腦，其經組態以接收對樣品實施偵測反應之客戶要求；擴增系統，其因應該客戶要求對該樣品或其部分實施核酸擴增反應，其中該擴增反應使用單一引子對及單一探針產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約500個鹼基之擴增子，且另外其中1pg-5pg來自至少5個屬中之任一者之DNA之擴增之CT小於30；及報告生成器，其向接受者發送報告，其中該報告含有偵測該探針產生之信號強度之結果。
在一些實施例中，電腦包含一或多個處理器。處理器可與一或多個控制器、計算單元及/或電腦系統之其他單元相連，或若期望則植入韌體中。若在軟體中實現，則可將常式儲存於任一電腦可讀記憶體中，例如RAM、ROM、快閃記憶體、磁碟、雷射磁碟或其他儲存媒體中。同樣，此軟體可經由任何已知傳輸方法傳輸至計算器件中，包括(例如)經由諸如電話線、網際網路、無線連接等通訊通道，或經由諸如電腦可讀磁碟、快閃驅動器等可輸送媒體來傳輸。多個步驟可以各種區塊、操作、工具、模組或技術形式來實現，其繼而可在硬體、韌體、軟體或其任一組合中實現。當在硬體中實現時，一些或所有區塊、操作、技術等可在(例如)定製積體電路(IC)、應用專用積體電路(ASIC)、現場可程式邏輯陣列(FPGA)、可程式邏輯陣列(PLA)等中實現。在一些實施例中，電腦經組態以接收對樣品實施偵測反應之 客戶要求。電腦可直接(例如藉助由客戶或輸入客戶要求之使用者操作之諸如鍵盤、滑鼠或觸控螢幕等輸入器件)或間接(例如經由有線或無線連接，包括經網際網路)接收客戶要求。客戶之非限制性實例包括提供樣品之個體、醫務人員、臨床醫師、實驗室人員、保險公司人員或健康照護行業中之其他人員。
在一些實施例中，該系統包含因應電腦所收到之客戶要求對樣品或其部分實施核酸擴增反應之擴增系統。擴增系統可包括液體處置器、溫度循環器、光學偵測器及/或用於分析偵測數據之處理器。在一些實施例中，藉由擴增系統使樣品處理、核酸分離、擴增及/或分析中之一或多個步驟自動化。在一些實施例中，自動化可包含使用一或多個液體處置器及相關軟體。可利用若干種市售液體處置系統來運行該等過程之自動化(例如，參見來自Perkin-Elmer、Caliper Life Sciences、Tecan、Eppendorf、Apricot Design、Velocity 11之液體處置器)。在一些實施例中，偵測包含即時偵測儀器。實例性即時儀器包括(但不限於)ABI PRISM® 7000序列偵測系統、ABI PRISM® 7700序列偵測系統、Applied Biosystems 7300即時PCR系統、Applied Biosystems 7500即時PCR系統、Applied Biosystems 7900 HT快速即時PCR系統(皆來自Applied Biosystems)；LightCyclerTM系統(Roche Diagnostics GmbH)；Mx3000PTM即時PCR系統、Mx3005PTM即時PCR系統及Mx4000®多路定量PCR系統(Stratagene,La Jolla,Calif.)；及Smart Cycler系統(Cepheid，由Fisher Scientific分銷)。用於處理及/或分析樣品之自動化系統之其他非限制性實例包括COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®系統(Roche Molecular Systems)、TIGRIS DTS系統(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、PANTHER系統(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、BD MAXTM系統(Becton Dickinson)、GeneXpert系統(Cepheid)、Filmarray®(BioFire Diagnostics)、iCubate系統、IDBox系統(Luminex)、EncompassMDxTM(Rheonix)、LiatTM分析儀(IQuum)、Biocartis分子診斷平臺、Enigma® ML系統(Enigma Diagnosstics)、T2Dx®系統(T2 Biosystems)、Verigene®系統(NanoSphere)、Great Basin之診斷系統、UnyveroTM系統(Curetis)、PanNAT系統(Micronics)、SpartanTM RX系統(Spartan Bioscience)、Atlas io系統(Atlas Genetics)、Idylla平臺(Biocartis)、ARIES(Luminex)、GenMark之自動化PCR平臺(例如eSensor系統)、3M Integrated Cycler(Focus Diagnostics)及Alere i自動化PCR平臺(Alere)。對即時儀器之說明尤其可參見其各別製造商使用手冊；McPherson；DNA Amplification：Current Technologies and Applications,Demidov及Broude編輯，Horizon Bioscience,2004；及美國專利第6,814,934號。
在一些實施例中，該系統包含向接受者發送報告之報告生成器，其中該報告含有偵測探針產生之信號強度之結果。報告生成器可因應擴增系統產生螢光強度數據自動發送報告，例如以即時PCR分析軟體實施之數據分析的形式發送。或者，報告生成器可因應操作者之指令發送報告。報告可含有原始信號強度數據、經處理信號強度數據(例如圖形顯示、CT值之標誌、模板多核苷酸起始量之計算)、偵測到或未偵測到細菌污染之結論及/或來源樣品中污染之量之量化(例如以CFU/mL表示)。可使用任何適宜通訊媒體將報告傳送至在當地或遠程位置之接受者。舉例而言，通訊媒體可係網路連接、無線連接或網際網路連接。報告可經該等網路或連接(或任何其他用於傳送資訊之適宜方式，包括(但不限於)郵寄實體報告，例如打印輸出之報告)傳送以供接受者接收及/或審查。接受者可為(但不限於)客戶、個體、健康照護提供者、健康照護管理者或電子系統(例如一或多個電腦及/或一或多個伺服器)。在一些實施例中，報告生成器將報告發送至接受者器 件，例如個人電腦、電話、數位板或其他器件。報告可在線觀看，儲存於接受者器件中或打印。
圖5圖解說明用於偵測樣品之細菌污染之實例系統。該系統可理解為可自媒體(例如軟體)及/或網路埠(例如自網際網路)讀取指令之邏輯裝置，其可視情況連接至具有固定媒體之伺服器。電腦系統可包含以下中之一或多者：CPU、磁碟驅動器、諸如鍵盤及/或滑鼠等輸入器件及顯示器(例如監視器)。數據通訊(例如指令或報告之傳送)可經由連接至在當地或遠程位置之伺服器之通訊媒體來達成。通訊媒體可包括任何傳送及/或接收數據之方式。舉例而言，通訊媒體可為網路連接、無線連接或網際網路連接。此一連接可經全球資訊網(World Wide Web)提供通訊。
在一態樣中，本發明提供電腦可讀媒體，其包含在由一或多個處理器執行後，實現根據本文所揭示方法中之任一者之方法之代碼。在一些實施例中，電腦可讀媒體之執行實現偵測生物樣品、例如血小板樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之方法。在一個實施例中，電腦可讀媒體之執行實現包含以下之方法：因應客戶要求對樣品實施偵測反應，因應客戶要求對該樣品或其部分實施核酸擴增反應，其中擴增反應使用單一引子對及單一探針產生可偵測量之16S rRNA之不大於約500個鹼基之擴增子，且另外其中1pg-5pg來自至少5個屬中之任一者之DNA之擴增之CT小於30；及生成含有偵測該探針產生之信號強度之結果之報告。
電腦可讀媒體可採取多種形式，包括(但不限於)有形存儲媒體、載波媒體或物理傳送媒體。非揮發性儲存媒體包括(例如)光碟或磁碟，例如任一電腦中之儲存器件中之任一者或諸如此類，例如可用於實現計算步驟、處理步驟等。揮發性儲存媒體包括動態記憶體，例如電腦之主記憶體。有形傳送媒體包括同軸電纜；銅導線及光纖，包括 在電腦系統內構成匯流排之導線。載波傳送媒體可採取電信號或電磁信號或者聲波或光波(例如在射頻(RF)及紅外(IR)數據通訊期間產生之彼等)的形式。因此，電腦可讀媒體之常見形式包括(例如)：軟碟、軟性磁碟、硬碟、磁帶、任一其他磁性媒體、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任一其他光學媒體、穿孔卡、紙帶、具有孔型樣之任一其他實體儲存媒體、RAM、PROM及EPROM、FLASH-EPROM、任一其他記憶體晶片或記憶體匣、輸送數據或指令之載波、輸送此一載波之電纜或鏈路、或電腦可自其讀取程式碼及/或數據之任一其他媒體。該等形式之電腦可讀媒體中之多者可參與將一或多個指令之一或多個序列載送至處理器以供執行。
在一態樣中，本發明提供用於擴增並偵測保守多核苷酸之至少一部分之組合物。組合物可以任一組合包含本文所揭示與多個態樣中之任一者相關之一或多個要素。在一些實施例中，保守多核苷酸係16S rRNA多核苷酸(例如16S rRNA、含有16S rRNA基因之DNA、16S rRNA及/或rDNA擴增產物或該等之組合)。在一些實施例中，所擴增之16S rRNA多核苷酸之部分之長度為約或小於約1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50個或更少核苷酸。在一些實施例中，組合物包含：第一引子，其包含SEQ ID NO：9之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸；第二引子，其包含SEQ ID NO：10之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸；及探針，其包含SEQ ID NO：16之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸。在一些實施例中，組合物包含引子，其在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中擴增長度為至少50個核苷酸之擴增子，該擴增子與SEQ ID NO：1-3中之任一者在最佳比對時具有90%序列一致性；及探針，其與該擴增子之任一股特異性雜交。在一些實施例中，引子及探針係根據本文所揭示之 一或多個參數加以選擇。舉例而言，引子及探針可經選擇使得約1pg-5pg來自複數個目標物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30。組合物可含於任一適宜容器中，例如多孔板之孔、板、管、室、流動槽、室或通道微流體器件之通道或晶片。在一些實施例中，組合物呈脫水形式，例如黏著至容器表面之珠粒或膜。
在一態樣中，本發明提供用於擴增及偵測保守多核苷酸之反應混合物。反應混合物可以任一組合包含本文所揭示與多個態樣中之任一者相關之一或多個要素。在一些實施例中，保守多核苷酸係16S rRNA多核苷酸(例如16S rRNA、含有16S rRNA基因之DNA、16S rRNA及/或rDNA擴增產物或該等之組合)。在一些實施例中，所擴增之16S rRNA多核苷酸之部分之長度為約或小於約1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50個或更少核苷酸。在一些實施例中，反應混合物包含：第一引子，其包含SEQ ID NO：9之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸；第二引子，其包含SEQ ID NO：10之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸；及探針，其包含SEQ ID NO：16之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸。在一些實施例中，反應混合物包含引子，其在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中擴增長度為至少50個核苷酸之擴增子，該擴增子與SEQ ID NO：1-3中之任一者在最佳比對時具有90%序列一致性；及探針，其與該擴增子之任一股特異性雜交。在一些實施例中，引子及探針係根據本文所揭示之一或多個參數加以選擇。舉例而言，引子及探針可經選擇使得約1pg-5pg來自複數個目標物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30。反應混合物可含於任一適宜反應位點中。反應位點可為容器，例如多孔板之孔、板、管、室、流動槽、室或微流體器件之通道或晶片。反應位點可係溶液內之分區，例如液滴(例如在上 浮混合物(emersion mixture)中)。在一些實施例中，組合物呈脫水形式，例如黏著至容器表面之珠粒或膜。
在一態樣中，本發明提供用於偵測生物樣品、例如血小板樣品之細菌污染之套組。套組可以任一組合包含本文所揭示與多個態樣中之任一者相關之一或多個要素。在一些實施例中，套組包含：第一引子，其包含SEQ ID NO：9之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸；第二引子，其包含SEQ ID NO：10之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸；及探針，其包含SEQ ID NO：16之至少約10、11、12、13、14、15個或所有核苷酸。套組中之試劑及其他材料可含於任一適宜容器中，且可呈即刻可用形式，或需要與套組中之其他試劑或使用者供應之試劑組合(例如濃縮組合物之稀釋或凍乾組合物之重構)。套組可提供緩衝液，其非限制性實例包括碳酸鈉緩衝液、碳酸氫鈉緩衝液、硼酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液及其組合。套組可包含對照樣品，例如用於DNA提取程序之對照之已知細菌及/或用作陽性對照或量化標準品之純化DNA。在一些實施例中，套組包含根據本文所揭示之一或多種方法使用套組之指令。在一些實施例中，使用該套組之方法包含用單一引子對對樣品或其部分實施核酸擴增反應以產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約500個鹼基之擴增子，其中約1pg-5pg來自複數個不同屬之細菌物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及用一或多種可偵測探針偵測該擴增子，其中一或多種可偵測探針中之每一者與保守序列特異性雜交，且該保守序列在複數個不同屬之細菌物種之間一致。
實例
以下實例係出於闡釋本發明之各個實施例之目的給出且不意欲以任何方式限制本發明。本發明實例以及本文所述之方法目前代表較佳實施例，具有實例性，且不欲限制本發明之範圍。熟習此項技術者將瞭解其中之變化及如由申請專利範圍之範圍界定之本發明之精神內涵蓋之其他用途。
實例1：
評估相應擴增子之實例引子對及實例探針之特異性、偵測範圍及偵測多種來自多個不同屬之細菌物種之能力。在此實例中，使用具有序列SEQ ID NO：9之引子、具有序列SEQ ID NO：10之引子及具有序列SEQ ID NO：16之探針來擴增並偵測16S rRNA基因之保守部分。引子及探針係針對序列SEQ ID NO：3來設計。用指示量之細菌基因組DNA以及引子、探針、酶、dNTP及其他標準試劑準備即時PCR反應。
為評估引子-探針組合之靈敏度，一式雙份地準備含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg及0.1pg大腸桿菌DNA提取物之擴增反應。一式四份地製備含有所有共用試劑但用水替代DNA提取物之無模板對照。即時PCR擴增結果之圖形顯示顯示於圖1中。繪製沿y軸(0至10)之任意螢光強度之對數標尺對沿x軸(0至40)之循環數之曲線。自左至右，第一對曲線對應於10ng樣品(平均CT為約14.5)，之後重疊曲線對對應於1ng、100pg、10pg、1pg及0.1pg樣品(CT為約17.5、21、24.5、 27.5及31)。不期望受限於理論，可能四個無模板對照樣品之約36之CT之擴增信號可得自商業獲得酶中之殘留細菌多核苷酸。然而，使用此引子及探針之組合之特異性擴增信號提供6對數之偵測範圍，且0.1pg起始模板係在陰性對照信號前至少5個完整循環時偵測到。事實上，在此範圍內之偵測係線性的，如圖2中所示(在此範圍內R2為約0.999，且擴增效率為約95.5%)，且因此可用於量化未知樣品中之起始材料之量。
在類似擴增反應系列中，測試此引子及探針組之對100pg來自金黃色葡萄球菌Mu3(亦稱為甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌)、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌及肺炎鏈球菌之DNA以及10pg用於比較之大腸桿菌及無模板對照(NTC)之擴增及偵測，該等樣品皆為一式雙份。應注意，所測試細菌包括革蘭氏陽性細菌及革蘭氏陰性細菌二者。即時擴增結果顯示於表4中(「EP」係指終點)。
在另一擴增反應系列中，測試相同引子及探針組對擴增及偵測1pg或10pg來自金黃色葡萄球菌Mu3、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、顆粒丙酸桿菌、綠膿桿菌、黏質沙雷氏菌及大腸桿菌之DNA(如所指示)與無模板對照(NTC)相比之靈敏度。即時擴增結果顯示於表5A中(星號表示自平均值及標准偏差(SD)之計算排除之離群值；「反應」縮寫為「rxn」)。
準備類似反應以測試作為模板之來自蠟狀芽孢桿菌之DNA(100pg)之擴增，且準備用於大腸桿菌模板(100pg)及無模板對照之單獨反應用於比較。即時擴增結果顯示於表5B中。
實例2：探針與引子組之比較
如實例1使用如下文所指示之三個引子組中之一者及相應探針準備用於100pg金黃色葡萄球菌、100pg大腸桿菌或無模板對照(NTC)之即時PCR反應。引子組1由具有序列SEQ ID NO：4之正向引子及兩個反向引子(一個具有序列SEQ ID NO：5且另一個具有序列SEQ ID NO：6)組成。引子組1之擴增產物係用三種具有SEQ ID NO：11-13之序列 之探針之混合物來偵測，該等產物中之每一者係基於與不同報告基因之結合獨立偵測。引子組1探針經設計以共同偵測眾多種細菌。例如，SEQ ID NO：12經設計以偵測除了金黃色葡萄球菌及大腸桿菌以外之物種。用於每一引子組1擴增反應之最終試劑濃度如下：1×Taqman Universal Master Mix II；500nM之每一引子；及500nm之每一探針。引子組2由具有序列SEQ ID NO：7之引子及具有序列SEQ ID NO：8之引子組成。引子組2之擴增產物係用兩種具有序列SEQ ID NO：14-15之探針之混合物來偵測，該等產物中之每一者係基於與不同報告基因之結合獨立偵測。引子組2探針經設計以共同偵測眾多種細菌，其中SEQ ID NO：14經設計以偵測多種革蘭氏陰性細菌(但並非排他性地)，且SEQ ID NO：15經設計以偵測多種革蘭氏陽性細菌(但係排他性地)。用於每一引子組2擴增反應之最終試劑濃度如下：1×Taqman Universal Master Mix II；500nM之每一引子；及500nm之每一探針。引子組3由如實例1中詳述之引子對組成，其擴增產物係用具有序列SEQ ID NO：16之探針來偵測。引子組3探針經設計以偵測多種細菌。用於每一引子組3擴增反應之最終試劑濃度如下：1×Taqman Universal Master Mix II；500nM之每一引子；500nm之探針。PCR擴增係根據TaqMan套組製造商建議(Life Technologies-Applied Biosystems,Carlsbad,CA)來實施。對於每一模板，每一擴增係以一式雙份實施，且每一者之CT(CT 1及CT 2)提供於表6中。如表6所指示，多種探針產生與實例1中所述探針-引子組所獲得類似之結果。探針SEQ ID NO：12之結果如基於其所設計用於之序列所預期。SEQ ID NO：14-15之結果如基於其所設計用於之序列所預期。舉例而言，SEQ ID NO：14產生革蘭氏陰性細菌大腸桿菌之早期CT。同樣，SEQ ID NO：15產生革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌之最早CT，同時亦能偵測大腸桿菌，但CT較遲。
實例3：模擬血小板樣品-無來自人類DNA之信號
來自患者樣品、例如血小板樣品之DNA提取物通常將包括人類基因組DNA。因此，在人類基因組DNA存在下在擴增反應中測試引子及探針之樣品組。如實例1準備即時PCR反應，包括相同引子及探針。然而，擴增反應包括10ng人類基因組DNA代替細菌DNA，或包括水作為無模板對照，二者皆係一式雙份。人類DNA及無模板對照之即時PCR擴增結果之圖形顯示分別顯示於圖3A及3B中。直至約循環39之前未獲得人類DNA樣品之擴增信號(FAM)，指示引子及探針對細菌序列具有特異性且會特異性擴增含有人類DNA之混合樣品中之彼等 序列。此外，人類DNA樣品之終點信號強度實際上低於無模板對照，表明樣品中之人類DNA可在晚期循環中實際上減少潛在非特異性擴增產物之形成。
實例4：探針組比較
實例1-3顯示本發明引子及探針之細菌多核苷酸偵測之特異性及靈敏度。在此實例中，比較實例1中所述引子及探針(統稱為「組3」)與Liu等人(Chin.J.Blood Transfusion，2008年9月，第21卷，第9期)及Nadkarni等人(Microbiology(2002),148,257-266)所述之引子及探針之靈敏度。Liu及Nadkarni闡述具有序列SEQ ID NO：17(TCCTACGGGAGGCAGCAGT)及SEQ ID NO：18(GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT)之引子擴增細菌16S rRNA之466bp區域之用途，其係用具有序列SEQ ID NO：19(CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC)之探針來偵測，統稱為「Liu組」。Nadkarni闡述，由於不能識別具有在多種細菌之間足夠保守之相應引子及探針目標序列之擴增子，此大型擴增子係人工選擇。在第一比較中，比較100pg金黃色葡萄球菌、100pg大腸桿菌或無模板對照(NTC)之即時PCR擴增之偵測效率。擴增及偵測100pg金黃色葡萄球菌之結果圖示說明於圖4A中，其中組3之結果在頂部且Liu組之結果在底部。擴增及偵測100pg大腸桿菌之結果圖示說明於圖4B中，其中組3之結果在頂部且Liu組之結果在底部。該等圖式闡釋，使用組3之偵測一致且穩健。用Liu組對同樣100pg之偵測較弱，發生於較遲CT。
第二比較重複上文用於組3與Liu組之比較之條件，使用較低量之目標DNA。在此第二比較中，反應中僅包括10pg大腸桿菌DNA，其係與無模板對照反應同時運行。每一反應條件係以一式雙份運行。即時擴增結果顯示於表7中。
表7第二比較中之結果闡釋，Liu組未靈敏至足以區分10pg細菌DNA與無模板對照，且因此不足以偵測此一低含量之污染。與之相比，使用組3之10pg DNA之CT較無模板對照早約7個循環，指示對細菌DNA之靈敏度顯著提高。不期望受限於理論，可能組3之較短擴增子(組3之約143bp，對應於SEQ ID NO：3；與之相比，Liu組為約466bp)及/或擴增子內之較低變異性改良分析之靈敏度。Liu組之靈敏度較低之其他潛在促成因子包括SEQ ID NO：17引子之相對穩定的同二聚化(圖6A)，及此引子與SEQ ID NO：19探針之間之雜交(圖6B)。為評估引子-引子及引子-探針雜交，使用OligoAnalyzer 3.1(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)使用默認設置(目標類型-DNA；寡聚物濃度-0.25μM；Na+濃度-50mM；Mg++濃度-0mM；dNTP濃度-0mM)來測試二聚體形成。慮及Nadkarni之結果，既令人驚訝亦令人意外的是，針對16S rRNA目標序列之引子及探針可在多個細菌物種及屬之間提供該靈敏度及特異性。
實例4：不同淬滅劑之效應
由於實例4中使用之反應條件與Liu中使用之反應條件相當，故測 試使用不同淬滅劑之可能效應。實例3中之組3探針使用ZenTM內部淬滅劑(Integrated DNA Technologies公司；Coralville,IA)，而Liu組探針使用3’-末端Iowa BlackR淬滅劑(Integrated DNA Technologies公司；Coralville,IA)，Liu等人使用原始位置。為測試不同淬滅劑之效應，如實例1使用組3引子及相應FAM-標記探針及Zen淬滅劑或3’-末端Iowa Black淬滅劑來準備即時PCR反應。測試該等引子-探針組合對一數量範圍之大腸桿菌DNA之偵測，如下文所指示。對於每一模板以一式雙份準備反應。即時擴增結果顯示於表8中。如淬滅劑之間之相當結果所示，所用淬滅劑之差異不會造成靈敏度之差異。
實例5：偵測血小板樣品中之模仿葡萄球菌
在37℃下在ATCC營養培養液中培養模仿葡萄球菌過夜。將培養物用純水稀釋且平鋪在營養瓊脂板上，且在37℃培育過夜後計數活菌落，以測定菌落形成單位(cfu)之濃度。滴定模仿葡萄球菌培養物並正規化至5μL純水中以產生5μL具有100000、10000、1000、100、50、25或0 cfu之樣品。0 cfu樣品僅係水，且用作陰性對照。然後將該等5μL細菌樣品中之每一者添加至在6天前藉由血球分離採集之195μL回收(salvaged)人類血小板中。該等樣品之有效cfu/mL分別係500000、50000、5000、500、250、125及0。DNA係使用GeneJET基因組DNA純化套組(Thermo Scientific)自200μL樣品提取，且將DNA溶析至45μL溶析緩衝液中。以一式三份準備30個循環之即時PCR反應並使用如實例1之探針及引子及約14uL之每一溶析物運行，使得每一反應之cfu數分別為約31250、3125、312.5、31.3、15.6、7.6及0。反應亦含有GoTaq MDx熱起始聚合酶(Promega)，且使用Step One Plus即時PCR機(Life Technologies)來實施。所得擴增曲線圖提供於圖7A中，且沿x軸之每一方格代表兩個循環。曲線組自左至右對應於31250、31250、3125、312.5、31.3及15.6，且7.6及0位於極右側。此實驗之偵測限制由此至少下降至15.6 cfu，且平均CT為約26.9。圖7A圖示說明在該等條件下之定量線性。31250、31250、3125、312.5、31.3、15.6、7.6及0 cfu/反應之單獨擴增曲線分別展示於圖8A-G中。即時擴增結果亦概述於表9中。模仿葡萄球菌滴定之結果類似於在上文實例中使用DNA摻入程序所獲得之結果。PCR擴增效率高，且未觀察到非特異性擴增結果。
實例6：偵測血小板樣品中之多種不同活細菌
製備表10中所列示18個細菌物種之細菌樣品，且如實例5中與回收血小板組合。對於含有表10中之細菌1-12之樣品，且對於12個僅含血小板之樣品，DNA係使用Maxwell 16 MDx儀器(Promega)及Maxwell 16 LEV血液DNA套組(Promega)來提取。對於含有表10中之細菌13-18之樣品，且對於6個僅含血小板之樣品，DNA係使用GeneJET基因組DNA純化套組(Thermo Scientific)手動提取。以一式三份準備30個循環之即時PCR反應，且如實例5中(使用如實例1之探針及引子)運行。包括每一反應之cfu數在內之結果提供於表11中。測試所有72個血小板樣品。對於所有含有細菌之樣品，偵測到正信號，而對於僅含血小板之對照，未偵測到正信號。因此，在該等複合物-混合物條件下，分析具有100%靈敏度及100%特異性。
實例7：偵測全血及血沉棕黃層中活細菌之污染
回收全血及血沉棕黃層樣品係自史丹福血液中心(Stanford Blood Center)獲得。樣品摻有大腸桿菌細菌(如實例5中)或大腸桿菌DNA。DNA係使用DNeasy血液及組織套組(Qiagen)自加料樣品來提取。以一式三份準備40個循環之即時PCR反應並使用如實例1之探針及引子及104 cfu/反應或10pg細菌DNA/反應運行。即時PCR係如實例5(使用如實例1之探針及引子)中使用Step One Plus即時PCR機(Life Technologies)來實施。加料全血樣品及加料血沉棕黃層樣品之結果分別提供於表12及13中。即使在該等低含量下亦偵測到污染，指示此方法可用於早期偵測敗血症。
實例8：DNA滴定及偵測血小板樣品中之金黃色葡萄球菌DNA
金黃色葡萄球菌Mu3基因組DNA係自ATCC(項目號700698D-5)獲得。滴定DNA且將其正規化至5μL純水中以產生5μL具有 10000.0pg、3333.3pg、1111.1pg、370.4pg、123.5pg或0pg細菌DNA之樣品。0pg樣品僅係水，且用作陰性對照。然後將該等5μL細菌DNA樣品中之每一者添加至在10天前藉由血球分離採集之200μL回收人類血小板中。該等樣品之有效pg/mL分別係48780.5、16260.2、5420.1、1806.7、602.2及0。DNA係藉由自動化程序使用Maxwell 16 MDx儀器(Promega)及Maxwell 16 LEV血液DNA套組(Promega)自該等205μL樣品提取。以一式三份(對於陰性對照有6個複製品)準備30個循環之即時PCR反應，且如實例5(使用如實例1中之探針及引子)中運行。每一反應含有2μL DNA提取物溶析物(來自總計50μL中)，分別代表約400pg、133.3pg、44.4pg、14.8pg、4.9pg及0pg之起始DNA/反應(假定100%有效回收)。所得擴增曲線圖提供於圖9中，且沿x軸之每一方格代表兩個循環。曲線組自左至右對應於含有400pg、133.3pg、44.4pg、14.8pg、4.9pg及0pg之反應。定量結果概述於表14中。對於血小板樣品中之細菌DNA滴定所獲得之結果類似於對於緩衝液中之稀釋物(如在實例1中)所獲得之結果。偵測靈敏度高，且樣品在約27.5之CT時之正偵測信號代表約4.9pg或更少起始材料。特異性亦高，此乃因對於6個陰性對照樣品中之任一者皆未偵測到正信號。預期，自動化提取將使程序性污染造成之假正信號最小化。
實例9：使用標的引子及DNA結合劑偵測細菌污染
即時PCR係使用含有250pg金黃色葡萄球菌Mu3 DNA (ATCC700698D-5)、SEQ ID NO.51及52之引子對及DNA結合染料(例如，SYBR®綠)以及Fast SYBR® Green Master Mix(AB Applied Biosystems)中提供之其他試劑之反應混合物來實施。圖10A繪示即時擴增曲線，其顯示金黃色葡萄球菌DNA之指數式擴增。結果代表三重實驗。然後使所得PRC反應經受解鏈曲線分析。圖10B繪示在預期指示金黃色葡萄球菌DNA之特異性擴增之溫度之單一峰。此實驗顯示，標的引子對適用於基於染料之對擴增細菌核酸之偵測。
實例10：使用標的引子偵測多種不同類型之細菌株系
本文揭示能偵測約20個細菌株系中任一類型之細菌之引子對主體，該等細菌株系常作為生物樣品中之污染源而被發現。具體而言，表2及表3中闡述之所有引子及探針皆已測試且顯示能利用本文所揭示或業內已知之方法特異性擴增表1中之一或多個目標細菌序列。另外，表15列示序列之實例性配對，該等序列已經測試及/或藉由序列同源性顯示係能使用上文實例中揭示之方法特異性擴增所列示細菌株系有效引子。具體而言，含有兩個引子(SEQ ID NO 9及10)之引子組3已經測試且顯示可在單一擴增反應中特異性擴增且因此可偵測約20個細菌株系，該等細菌株系涵蓋金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、顆粒丙酸桿菌、綠膿桿菌、黏質沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌、模仿葡萄球菌、藤黃微球菌及產氣腸桿菌。
此引子組中之其他SEQ ID NO(即SEQ ID NO.47及48)係可選的，此乃因在單一反應中擴增上文所提及之細菌株系不需要該等序列。SEQ ID NO.47及/或SEQ ID No.48在用於與SEQ ID NO.9及10相同之反應混合物中時能提高擴增靈敏度並增強對丙酸桿菌屬之偵測。
類似地，引子組1-2及4-25各自已經測試及/或藉由序列同源性顯示能擴增所列示之細菌株系。標注為「內含」之引子展現與在「細菌目標覆蓋範圍」欄下列示之所列示細菌株系之保守區域之至少85%、90%或95%序列同源性。名為「可選」之引子已經測試及/或藉由序列同源性預測可在與「內含」引子中之一或多者一起使用時提供對所列示細菌基因組之更具特異性之擴增。「可選」序列通常展現與目標細菌基因組在最佳比對時至少99%或100%序列同源性。此一系列發現顯示該等引子組之技術優點，此乃因其既具有特異性亦能覆蓋眾多種常在生物樣品中出現之細菌株系。
儘管已在本文中顯示並闡述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將瞭解，該等實施例僅作為實例來提供。熟習此項技術者現將構想出多種不背離本發明之變更、改變及取代。應理解，可在實踐本發明時採用對本文中所述本發明實施例之多種替代。以下申請專利範圍意欲界定本發明之範圍，且由此覆蓋該等申請專利範圍及其等效內容之範圍內的方法及結構。

Claims (47)

  1. 一種偵測血小板樣品中至少8個細菌物種中之任一者之細菌污染之方法，其包含：使該樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在單一反應混合物中產生可偵測量之不大於約800個鹼基之擴增子，該反應混合物包含單一引子對及單一可偵測探針，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含該可偵測探針與其雜交之保守序列，且該保守序列在該至少8個細菌物種之間一致；及偵測該探針與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生可偵測信號，該可偵測信號指示該血小板樣品中該至少8個細菌物種中之任一者之細菌污染。
  2. 一種偵測血小板樣品之細菌污染之方法，其包含：使該樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在單一反應混合物中產生可偵測量之不大於約800個鹼基之擴增子，該反應混合物包含單一引子對及單一可偵測探針，其中該引子對位於該擴增子兩側，該擴增子包含該可偵測探針與其雜交之保守序列，且該樣品或其部分在擴增前未在高於35℃之溫度下加以培養；及偵測該探針與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生可偵測信號，該可偵測信號指示該血小板樣品之細菌污染。
  3. 一種在獲得血小板樣品後24小時內快速偵測該樣品中之細菌污染之方法，其包含：使該樣品或其部分在多種條件下在單一反應混合物中用單一引子對及單一可偵測探針經受核酸擴增反應，以產生可偵測量之不大於約800個鹼基之擴增子，其中該引子對位於該擴增子兩 側，該擴增子包含該可偵測探針與其雜交之保守序列，且約1pg至5pg來自任一物種之DNA之擴增之循環臨限值(CT)小於30；及在獲得該樣品後約24小時內，藉由該探針偵測與該擴增子之雜交，其中該探針之該雜交產生指示該血小板樣品之細菌污染之可偵測信號，由此自獲得該樣品約24小時內偵測該污染。
  4. 一種偵測個體之生物樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之方法，其包含：用單一引子對對該樣品或其部分實施核酸擴增反應，以產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800個鹼基之擴增子，其中約1pg至5pg來自該等物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及用一或多種可偵測探針偵測該擴增子，其中該一或多種可偵測探針中之每一者與保守序列特異性雜交，且該保守序列在複數個不同屬之細菌物種之間一致。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該血小板樣品係藉由血球分離來分離之血小板濃縮物。
  6. 如請求項5之方法，其中自小於5mL之該血小板濃縮物分離之核酸經受該核酸擴增反應。
  7. 如請求項3之方法，其中該偵測產生指示血小板樣品之細菌污染之可偵測信號，該血小板樣品之細菌載量為約1.0菌落形成單位/mL(CFU/mL)。
  8. 如請求項4之方法，其特徵在於以下中之一或多者：(a)其中陰性對照樣品之CT較含有1pg至5pg來自該複數個細菌物種中之任一者之DNA之樣品之CT高至少5個循環；(b)其中該生物樣品係血小板樣品；(c)其中該一或多種可偵測探針包含不多於5種不同探針或不 多於2種不同探針；及(d)其中該一或多種可偵測探針包含不多於2種不同探針。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該擴增子係自細菌16S rRNA多核苷酸模板生成。
  10. 如請求項1至4中任一項之方法，其特徵在於以下中之一或多者：(a)其中對細菌污染之該偵測係在轉輸至接受者中之前完成；(b)其中該擴增反應產生可偵測量之不大於300個鹼基或不大於150個鹼基之擴增子；(c)其中該擴增反應產生可偵測量之100個至200個鹼基之擴增子；(d)其中該單一引子對包含第一引子，其包含如SEQ ID NO：4、7或9中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；及第二引子，其包含如SEQ ID NO：5、6、8或10中所述序列之至少10個核苷酸；(e)其中該探針包含表3中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸；(f)其中該核酸擴增反應含有小於5pg之來自該細菌污染之起始核酸；(g)其中該核酸擴增反應係使用選自由以下組成之群之方法來進行：聚合酶連鎖反應、即時聚合酶連鎖反應、等溫擴增、鏈置換擴增、滾環式擴增、連接酶連鎖反應、轉錄介導的擴增、固相擴增、基於核酸序列之擴增(NASBA)及線性擴增；(h)其中該核酸擴增反應係在孔中、在板中、在管中、在室中、在液滴中、在流動槽中、在載玻片中、在晶片中、附接至固體基板、附接至珠粒或在乳液中進行。
  11. 如請求項1或4中任一項之方法，其中所有該等細菌物種皆係革 蘭氏(Gram)陽性細菌。
  12. 如請求項1或4中任一項之方法，其中所有該等細菌物種皆係革蘭氏陰性細菌。
  13. 如請求項1之方法，其中該至少8個細菌物種包含複數個革蘭氏陽性細菌物種及複數個革蘭氏陰性細菌物種。
  14. 如請求項4之方法，其中該複數個細菌物種包含複數個不同屬之革蘭氏陽性細菌物種及複數個不同屬之革蘭氏陰性細菌物種。
  15. 如請求項14之方法，其中該一或多種可偵測探針包含第一探針，其與在該等革蘭氏陽性細菌物種之中常見且在該等革蘭氏陰性物種中不存在之保守序列特異性雜交；及第二探針，其與在該等革蘭氏陰性細菌物種之中常見且在該等革蘭氏陽性物種中不存在之保守序列特異性雜交。
  16. 如請求項1或4之方法，其中該等細菌物種選自由以下組成之群：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、大腸桿菌(Escherichia coli)、柯氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、藤黃 微球菌(Micrococcus luteus)及產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)。
  17. 如請求項1至4中任一項之方法，其包含偵測樣品中至少10個細菌物種中之任一者之細菌污染，或樣品中至少15個細菌物種中之任一者之細菌污染。
  18. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該可偵測信號具有跨越至少5log之線性偵測範圍。
  19. 如請求項18之方法，其進一步包含基於探針信號測定細菌污染之量。
  20. 如請求項4之方法，其中該探針產生具有跨越至少5log之線性偵測範圍之信號。
  21. 如請求項20之方法，其進一步包含基於該探針信號測定該複數個細菌物種之豐度。
  22. 一種用於擴增及偵測16S rRNA多核苷酸之一部分之組合物，該部分之長度小於約800個核苷酸，該組合物包含：第一引子，其包含如SEQ ID NO：9中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；第二引子，其包含如SEQ ID NO：10中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；及探針，其包含如SEQ ID NO：16中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸。
  23. 如請求項22之組合物，其中該組合物位於容器中。
  24. 一種用於擴增及偵測16S rRNA多核苷酸之一部分之組合物，該部分之長度小於約800個核苷酸，該組合物包含：引子，其在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中擴增長度為至少50個核苷酸之擴增子，該擴增子與SEQ ID NO：1至3中之 任一者在最佳比對時具有90%序列一致性；及探針，其與該擴增子之任一股特異性雜交。
  25. 如請求項24之組合物，其中該組合物位於容器中。
  26. 如請求項24之組合物，其中，在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中，藉由該等引子及探針進行之約1pg至5pg來自複數個目標物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30。
  27. 一種用於擴增及偵測16S rRNA多核苷酸之一部分之反應混合物，該部分之長度小於約800個核苷酸，該反應混合物包含樣品核酸；引子，其在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中擴增長度為至少50個核苷酸之擴增子，該擴增子與SEQ ID NO：1至3中之任一者在最佳比對時具有90%序列一致性；探針，其與該擴增子之任一股特異性雜交；及聚合酶；其中該反應混合物位於反應位點中。
  28. 如請求項27之反應混合物，其中該反應位點係液滴、孔、板、管、室、流動槽或晶片。
  29. 如請求項27之反應混合物，其中，在與目標16S rRNA多核苷酸之擴增反應中，藉由該等引子及探針進行之約1pg至5pg來自複數個目標物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30。
  30. 一種用於偵測血小板樣品之細菌污染之套組，該套組包含：第一引子，其包含如SEQ ID NO：9中所述序列之至少10個鄰接核苷酸；第二引子，其包含如SEQ ID NO：10中所述序列之至少10個鄰接核苷酸； 探針，其包含如SEQ ID NO：16中所述序列或其補體之至少10個鄰接核苷酸。
  31. 一種使用如請求項30之套組之方法，該方法包含：用單一引子對對樣品或其部分實施核酸擴增反應以產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800個鹼基之擴增子，其中約1pg至5pg來自複數個不同屬之細菌物種中之任一者之DNA之擴增的循環臨限值(CT)小於30；及用一或多種可偵測探針偵測該擴增子，其中該一或多種可偵測探針中之每一者與保守序列特異性雜交，且該保守序列在複數個不同屬之細菌物種之間一致。
  32. 一種用於偵測血小板樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之系統，其包含：電腦，其經組態以接收對樣品實施偵測反應之客戶要求；擴增系統，其因應該客戶要求對該樣品或其部分實施核酸擴增反應，其中該擴增反應使用單一引子對及單一探針產生可偵測量之16S rRNA多核苷酸之不大於約800個鹼基之擴增子，且另外其中1pg至5pg來自至少5個屬中之任一者之DNA之擴增之CT小於30；及報告生成器，其向接受者發送報告，其中該報告含有偵測該探針產生之信號強度之結果。
  33. 如請求項32之系統，其中該報告生成器基於該探針產生之該信號強度將該樣品鑑別為被污染或未污染。
  34. 如請求項32之系統，其中該接受者係該客戶。
  35. 一種偵測血小板樣品中至少5個細菌物種中之任一者之細菌污染之方法，其包含：使該樣品或其部分在多種條件下經受核酸擴增反應以在反應 混合物中產生可偵測量之不大於約800個鹼基之擴增子，該反應混合物包含第一正向引子及第一反向引子，其中該第一正向引子及該第一反向引子各自與在至少5種不同細菌基因組之中保守之單獨區域雜交；自該反應混合物偵測指示存在該量之擴增子之信號，由此偵測血小板樣品中該至少5個細菌物種中之任一者之細菌污染。
  36. 如請求項35之方法，其中該第一正向及第一反向引子各自與在至少15個不同細菌基因組之中保守之單獨區域雜交。
  37. 如請求項35之方法，其中該第一正向引子及該第一反向引子各自展現與該單獨區域在最佳比對時至少80%之序列同源性。
  38. 如請求項35之方法，其中反應混合物進一步包含第二正向引子，其展現與該至少5個細菌基因組中之任一者或全部在最佳比對時至少80%之序列同源性。
  39. 如請求項35之方法，其中反應混合物進一步包含第二反向引子，其展現與該至少5個細菌基因組中之任一者或全部在最佳比對時至少80%之序列同源性。
  40. 如請求項35之方法，其中該反應混合物進一步包含可偵測標記。
  41. 如請求項40之方法，其中該可偵測標記係DNA結合染料。
  42. 如請求項35之方法，其中該擴增子包含目標16S rRNA多核苷酸。
  43. 如請求項35之方法，其中該至少5個細菌物種選自由以下組成之群：金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌Mu3；表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜酸乳桿菌、單核球增多性李斯特菌、顆粒丙酸桿菌、綠膿桿菌、黏質 沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌Mu50、小腸大腸炎耶氏桿菌、模仿葡萄球菌、藤黃微球菌及產氣腸桿菌。
  44. 如請求項35之方法，其中該核酸擴增係在多種條件下實施，使得約1pg至5pg來自該至少5個細菌物種中之任一者之DNA的循環臨限值(CT)小於30。
  45. 如請求項3之方法，其中對細菌污染之該偵測係在將該血小板樣品轉輸至接受者中之前完成。
  46. 如請求項35之方法，其中對細菌污染之該偵測係在將該血小板樣品轉輸至接受者中之前完成。
  47. 一種電腦可讀媒體，其包含在由一或多個處理器執行後，實現偵測血小板樣品中複數個不同屬之細菌物種中之任一者之細菌污染之方法之代碼，該方法包含：接收對樣品實施偵測反應之客戶要求；因應該客戶要求對該樣品或其部分實施核酸擴增反應，其中該擴增反應使用單一引子對及單一探針產生可偵測量之16S rRNA之不大於約800個鹼基之擴增子，且另外其中1pg至5pg來自至少5個屬中之任一者之DNA之擴增的CT小於30；及生成報告，其含有偵測該探針產生之信號強度之結果。
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