CN112575097B - 一种用于检测蜡样芽孢杆菌的液相芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测8种蜡样芽孢杆菌的DNA序列，连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的DNA探针，包括：从蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214中分别选取的一种DNA片段。本发明结合Bio‑Rad公司的Bio‑Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测8种蜡样芽孢杆菌的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了利用分子生物学方法对蜡样芽孢杆菌检测的技术空白，对于这一重要致病菌的临床鉴定和流行病学监测具有重要意义。

Description

一种用于检测蜡样芽孢杆菌的液相芯片及应用

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于8种蜡样芽孢杆菌检测的液相芯片及应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是一种兼性厌氧型革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤﹑水﹑空气﹑动物肠道中，与人类关系密切。由于蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见细菌，主要污染淀粉制品、乳和乳制品，特定条件下可产生肠毒素，可引起人的呕吐型和腹泻型食物中毒。

我国2013年发布的出入境检验检疫行业标准（SNT0176-2013）和2014年发布的国家标准（GB4789.14-2014）中，对于食品中蜡样芽孢杆菌的检测均采用在获得细菌纯培养物的基础上，进行生化鉴定或菌落计数的手段，检验周期在48-72小时之间，试验耗时长、且准确性不高；最新2014年发布的出入境检验检疫行业标准（SNT3932-2014）中，建议采用实时荧光定量PCR的方法对蜡样芽孢杆菌进行鉴定，虽然检测时间有所缩短，但仍需要对于待检测样品进行9-18小时的培养。上述检测方法只能将蜡样芽孢杆菌检测至种的水平，且检测通量低，难以满足菌株流行性溯源和快速检测的需求。

血清学检测方法具有操作简便和结果判读直观的特点，自上世纪30年代以来被广泛应用，被认为具有最好的特异性和灵敏性，该方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株。目前，大多数重要致病菌都建立了基于表面多糖抗原的血清学分型系统，并且该分型体系已被广泛应用于检验检疫和疾病预防控制系统。然而，传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；2）抗血清的生产和质控较为困难；3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长（2-6天）。

建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。液相芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针，在液相中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着液相芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。

细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。其中，O多糖（O抗原）和荚膜多糖（K抗原）的结构多样性，是细菌血清型分型的基础。而同一细菌内O抗原和/或K抗原的多样性，是由于编码合成O抗原和/或K抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的。这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇和/或K抗原基因簇。根据前期研究，蜡样芽孢杆菌的细菌表面多糖抗原基因簇均位于编码DNA结合调控因子的基因和fabZ两个持家基因之间，且基因簇信息已被破译，这使得采用分子生物学方法，实现对上述蜡样芽孢杆菌的分子血清学检测成为可能。

发明内容

本发明在前期分析并获得8种蜡样芽孢杆菌基因簇及其各自特异基因的基础上，提供了用于检测8种蜡样芽孢杆菌的特异寡核苷酸序列，结合Bio-Rad公司的Bio-Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测8种蜡样芽孢杆菌的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了蜡样芽孢杆菌的分子血清学分型技术的空白，对于该菌的临床鉴定和流行病学监测具有重要意义。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸是从蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因中选取的一种DNA片段。

上述的寡核苷酸DNA片段为SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID (5'-3')

NO: 1 GTTGGGGATAAAGTTGTCAC

选取自蜡样芽孢杆菌G6235的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6235

NO: 2 TTTCGTTGTTAGGAACTGC

选取自蜡样芽孢杆菌G6206的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6206

NO: 3 AATCCGGGAATGGGACAT

选取自蜡样芽孢杆菌G6239的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6239

NO: 4 TTTTTGCGTTATGGATGC

选取自蜡样芽孢杆菌G2724的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G2724

NO: 5 TGATAAATGGATAGAGGCTGT

选取自蜡样芽孢杆菌G6211的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6211

NO: 6 ATGAATCAGCAATAGCGATAG

选取自蜡样芽孢杆菌G6217的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6217

NO: 7 TTTTTGCCGCAATGACAT

选取自蜡样芽孢杆菌G6207的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6207

NO: 8 GAAATATACTGCAATTATTCGAA

选取自蜡样芽孢杆菌G6214的wzm基因，用于检测蜡样芽孢杆菌G6214。

本发明进一步公开了所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测8种蜡样芽孢杆菌的悬液芯片方面的应用。检测的实验结果显示该悬液芯片可以完成8种蜡样芽孢杆菌中至少一种菌的检测。

本发明更进一步公开了连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：

（1）在蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物个1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；

（2）在蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；

（3）利用步骤（2）特异探针与不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针微球的偶联；

（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；

（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；

（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测。

其中，步骤（1）所述的引物包括SEQ ID NO: 9-24所示的核苷酸序列，各条序列(5'-3')及其对应的作用如下：

P1 （SEQ ID NO: 9）CTACCAAAATCGTGAGCAA

扩增蜡样芽孢杆菌G6235wzm基因的上游引物

P2 （SEQ ID NO: 10）AGTCCCTTCTTCTTCCTCC

扩增蜡样芽孢杆菌G6235wzm基因的下游引物

P3 （SEQ ID NO: 11）GTGATTAACTCTGCTAGACCAA

扩增蜡样芽孢杆菌G6206wzm基因的上游引物

P4 （SEQ ID NO: 12）AGCCGAACCTATCACACC

扩增蜡样芽孢杆菌G6206wzm基因的下游引物

P5 （SEQ ID NO: 13）AGTGCCAATGTTGCCTTC

扩增蜡样芽孢杆菌G6239wzm基因的上游引物

P6 （SEQ ID NO: 14）AGCGAGAGGGATTGTTACA

扩增蜡样芽孢杆菌G6239wzm基因的下游引物

P7 （SEQ ID NO: 15）CTGGTTTTCTGGGGTCTG

扩增蜡样芽孢杆菌G2724wzm基因的上游引物

P8 （SEQ ID NO: 16）ATTTGCCCCTCCCATAAT

扩增蜡样芽孢杆菌G2724wzm基因的下游引物

P9 （SEQ ID NO: 17）CTTATGTGCGGGGTTACTA

扩增蜡样芽孢杆菌G6211wzm基因的上游引物

P10 （SEQ ID NO: 18）AGATTCAAAAAACTCCCACAT

扩增蜡样芽孢杆菌G6211wzm基因的下游引物

P11 （SEQ ID NO: 19）TTTTGGTTTCAGCGGGTA

扩增蜡样芽孢杆菌G6217wzm基因的上游引物

P12 （SEQ ID NO: 20）CATCATCATCTGCTATCGCTA

扩增蜡样芽孢杆菌G6217wzm基因的下游引物

P13 （SEQ ID NO: 21）TCCGTTGGGAATAGTGCT

扩增蜡样芽孢杆菌G6207wzm基因的上游引物

P14 （SEQ ID NO: 22）TAAAATCTCCCTGCCAAA

扩增蜡样芽孢杆菌G6207wzm基因的下游引物

P15 （SEQ ID NO: 23）TACAAAATGTAGGAGCGGTA

扩增蜡样芽孢杆菌G6214wzm基因的上游引物

P16 （SEQ ID NO: 24）AGAATTATCTAATCCTTTATGCA

扩增蜡样芽孢杆菌G6214wzm基因的下游引物

本发明公开的用于检测8种蜡样芽孢杆菌的液相芯片及应用所具有的积极效果在于：

（1）本发明首次公开了用于重要食源性致病菌-蜡样芽孢杆菌鉴定的技术手段，可用于8种蜡样芽孢杆菌菌株的临床鉴定和流行病学监测。

（2）该液相芯片检测体系可在24小时内完成对临床样品的检测，可同时检测8种蜡样芽孢杆菌，具有检测时间短和检测通量高的优点。

附图说明

图1为本发明中液相芯片对于8种蜡样芽孢杆菌检测的结果输出柱状图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

8种蜡样芽孢杆菌特异引物的设计和制备

（1）选取8种蜡样芽孢杆菌的wzm基因为靶基因序列。

（2）将选取的针对不同蜡样芽孢杆菌的靶基因序列导入引物设计软件PrimerPrimier 5.0中，设定参数。其中，选择正义链和互补链输出模式；序列扩增长度150-350bp；Haripin：无；Dimer：无：False Priming：无；Cross Dimer：无。运行程序，得到针对每个血清型的正义链和反义链各1对特异引物序列。

（3）将设计好的引物序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，并利用PAGE纯化，备用。其中，反义链引物的合成，需要在DNA序列的5’端连接生物素基团进行标记。

实施例2

蜡样芽孢杆菌特异探针的设计和制备

（1）选取蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因为靶基因序列。。

（2）将选取的针对不同蜡样芽孢杆菌的靶基因序列导入引物设计软件PrimerPrimier 5.0中，设定参数。其中，只选择正义链输出模式；Haripin：无；Dimer：无：FalsePriming：无；Cross Dimer：无，序列的位置位于实施例1中正义链和反义链引物位置以内。运行程序，得到针对每个血清型的1条特异探针。

（3）将设计好的探针序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，同时在序列的5’末端连接12个碳原子作为连接臂，并在最后1个碳原子末端连接1个氨基基团，利用PAGE纯化，备用。

实施例3

特异探针与微球的偶联（需要避光操作）

（1）涡旋仪上以最高转速悬浮微球30 s，核对微球、探针编号，进行标记。

（2）取80 微升微球于1.5mL低吸附离心管中，12000转/分钟，离心5分钟。

（3）弃上清，用10微升浓度为 0.1 mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶液（MES）（pH4.5）重悬，彻底涡旋，使微球分散；

（4）加入4 微升探针(提前置于室温)和2.5微升新鲜配制的浓度为10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液（EDC）,混匀，室温黑暗孵育30 分钟（每隔15 min振荡混匀一番）。

（5）再加2.5 微升新鲜配制的10 mg/mL的EDC溶液混匀，室温黑暗孵育30分钟。

（6）加入500微升浓度为0.02%的吐温20溶液（TWEEN-20），混匀，12000转/分钟，离心5分钟。

（7）弃上清，加入500微升浓度为 0.1%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS），重悬沉淀40秒，12000转/分钟，离心5分钟。

（8）弃上清，加入23 微升的Tris-EDTA缓冲液（pH8.0），重悬沉淀，高速涡旋30秒，4度并黑暗储存待用。

实施例4

蜡样芽孢杆菌PCR体系的建立

（1）针对获得的纯培养细菌，挑取细菌单菌落至10 µL去离子水中，或过夜培养的细菌菌液10 µL，沸水浴中处理15 min置于冰上1 min后，8000 rpm离心1 min，即可获得DNA粗提液；

对于食品样品，取10g固体或半固体样品或5mL液体样品，置于20 mL LB培养基中，37度震荡培养3 h，后取1 mL培养物，加入 500µL去离子水，重悬混匀，8000 rpm离心5min，弃去上清，加入100µL去离子水，沸水浴中处理15 min，置于冰上1 min后，8000 rpm离心1min，即可获得DNA粗提液。

（2）取上述基因组DNA提取液1微升为模板，加入PCR反应混合液中。PCR反应混合液成分见表1。

表1. PCR反应混合液成分

（3）将反应混合物置于PCR仪（Biometra）中，设定循环参数并运行。循环参数如下：

实施例5

多重PCR产物与探针-微球偶联产物的杂交

（1）将全部准备好的探针-微球偶联产物，最大转速涡旋混匀，每种探针-微球偶联产物取2.5微升混合，用1.5×TMAC杂交缓冲液稀释200倍，振荡混匀。

（2）取上述探针-微球混合液33微升，加入PCR产物17微升，形成共50微升的杂交反应体系。空白对照则加17 微升的Tris-EDTA缓冲液（pH8.0）代替PCR产物。

（3）将上述杂交反应体系置于PCR仪中，设定反应参数并运行。反应参数如下：

实施例6

杂交产物的洗涤与染色

（1）将PCR管中的杂交产物转移到96孔板中，12000转/分钟，离心1分钟，加入70 微升的1×TMAC缓冲液洗涤2次，每次洗涤后12000转/分钟，离心1分钟。

（2）利用1×TMAC缓冲液将Streptavidin-PE荧光素稀释250倍，每孔中加入80 微升稀释后的荧光素溶液。

（3）将96孔板置于杂交炉中，55℃，500 转/分钟，振荡反应20分钟。

实施例7

杂交产物的上机检测（利用Bio-Plex 200悬液芯片系统）

（1）打开仪器电源和连接电脑的电源，点击电脑桌面的Bio-Plex Manager按钮，进入软件界面。

（2）在仪器配套的MCV板中加入ddH2O和70%异丙醇溶液，置于机器中后，点击软件界面的Start up按钮，后根据界面提示点击Warm up按钮进行预热，一般预热30分钟。

（3）预热结束后，在MCV板中加入编号为CAL1和CAL2的校正液，点击Calibrate按钮，进行仪器的校正。其中CAL1和CAL2校正液在加入前需恢复至室温，并斡旋混合30秒以上。

（4）校正完成后，点击工具栏的New按钮，打开方法编辑Protocol窗口，按照提示填入微球编号和对应的探针编号。编辑结束后，点击Format Plate按钮，按照96孔板的加样顺序依次设定检测背景（B）和待检样本（X）的检测位置。取出仪器中的MCV板，加入盛有样品的96孔板，点击run Protocol按钮开始检测。

（5）上述程序完成后，根据软件界面提示，保存数据为Excel表格，用于后续分析。

点击工具栏的Shut down按钮，按照屏幕提示进行操作，提示结束后先关闭电脑的Bio-Plex Manager程序，再关闭机器电源和电脑电源。检测结果表明：本发明的液相芯片可以实现对8种蜡样芽孢杆菌的检测。

实施例8

灵敏度检测

（1）将每种蜡样芽孢杆菌菌株接种至5 mL LB培养基中，37℃，180转/分钟的摇床中过夜培养，收集2 mL菌体。

（2）利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（产品号DP302），按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取。

（3）用NanoDrop OD仪对提取的基因组浓度进行测定，使加入对应反应体系的基因组DNA分别为100ngg、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg。

（4）按照实施例4-6的反应步骤进行多重PCR反应与液相芯片的杂交与染色反应，并利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测。结果表明：液相芯片系统对于蜡样芽孢杆菌基因组DNA的检测灵敏度为1ng。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种用于检测蜡样芽孢杆菌的液相芯片及应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttggggata aagttgtcac 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttcgttgtt aggaactgc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatccgggaa tgggacat 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttttgcgtt atggatgc 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgataaatgg atagaggctg t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaatcagc aatagcgata g 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttttgccgc aatgacat 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaaatatact gcaattattc gaa 23

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctaccaaaat cgtgagcaa 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtcccttct tcttcctcc 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgattaact ctgctagacc aa 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agccgaacct atcacacc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agtgccaatg ttgccttc 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agcgagaggg attgttaca 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctggttttct ggggtctg 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atttgcccct cccataat 18

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cttatgtgcg gggttacta 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agattcaaaa aactcccaca t 21

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttttggtttc agcgggta 18

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

catcatcatc tgctatcgct a 21

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tccgttggga atagtgct 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

taaaatctcc ctgccaaa 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tacaaaatgt aggagcggta 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agaattatct aatcctttat gca 23

Claims (3)

1.可用于连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的DNA探针，其特征为：从蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因中分别选取的一种DNA片段，其探针序列依次如SEQ ID NO: 1-8所示。

2.权利要求1所述可用于连接标记有不同荧光染料磁性微球上的任意1种或几种DNA探针在制备用于检测8种蜡样芽孢杆菌中至少一种菌悬液芯片方面的应用。

3.含有权利要求1所述的DNA探针的悬液芯片制备方法，主要包含以下步骤：

（1）在蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因内部，设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物各1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；所述的引物序列依次如SEQ ID NO: 9-24所示；

（2）在蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214的wzm基因内部设计并制备DNA探针， 每条DNA探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的标记有荧光染料的磁性微球进行偶联；

（3）利用步骤（2）的DNA探针与不同荧光染料磁性微球进行偶联；

（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；

（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的DNA探针进行杂交和染色；

（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测。

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