CN105331693B - 对类志贺邻单胞菌8种o抗原分型的基因液相芯片及检测方法 - Google Patents
对类志贺邻单胞菌8种o抗原分型的基因液相芯片及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种对8种类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides，P.S）的O抗原进行分型的液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行O抗原分型的方法。本发明以类志贺邻单胞菌O抗原基因簇内的特异基因，包括Wzx，Wzy等为靶基因，建立了对8种类志贺邻单胞菌的O抗原分型液相芯片和分型方法，为肠道及水环境中类志贺邻单胞菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的基因芯片检测肠道及水环境中的类志贺邻单胞菌，并且对其进行O抗原分型，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等诸多优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种对样品中类志贺邻单胞菌8种菌株O抗原分型的基因液相芯片及其制备方法。本发明还设计利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
背景技术
液相芯片，也称为微球体悬浮芯片（suspension array，liquid chip），是基于xMAP技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫性、蛋白质、核酸就爱南侧、基因研究等领域，该技术已经成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
利用液相芯片检测时，先后加入样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随后利用仪器（如Luminex 100）对微球进行检测和结果分析。Luminex 100采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量（即定量）。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定量分析。
志贺邻单胞菌，是一种革兰氏阴性菌，隶属于肠杆菌科邻单胞菌属。类志贺邻单胞菌在水、鱼类、多种哺乳动物及人类肠道中发现，能引起人的腹泻，是一种重要的肠道致病菌。
目前对类志贺邻单胞菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理生化特征、血清学反应等方法，类志贺邻单胞菌的O抗原分型属于血清学反应的一种。由于环境和抗体的多样性，形成了O抗原的多样性，而根据O抗原的多样性可以对类志贺邻单胞菌的不同菌株进行分型鉴定。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种检测环境中八种致病微生物的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋白。其主要特征在于所述的捕获探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：
（1）从类志贺邻单胞菌O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75，O76八种菌的O抗原基因簇特异基因序列中所选取的核酸序列；
（2）所述（1）中选取的DNA序列的互补DNA序列。
其中上述的基因液相芯片的从类志贺邻单胞菌O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75， O76八种菌的O抗原基因簇特异基因序列中所选取的核酸序列中所选取的核酸序列具有从SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:24所示的DNA序列中的一种或多种DNA序列；
另外，上述检测液相芯片还包括所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所示的一条或多条引物顺序；基因液相芯片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上机检测；
本发明的一个重要目的就是液相芯片的实际应用，其特征在于该液相芯片用于类志贺邻单胞菌O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75，O76八种菌中至少一种的类志贺邻单胞菌分型鉴定；
由上述的技术方案可见，本发明首次将液相芯片技术引入类志贺邻单胞菌O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中8种类志贺邻单胞菌O血清型检测液相芯片及其检测方法，利用本发明的液相芯片可以达到鉴定样品中常见的类志贺邻单胞菌O血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中类志贺邻单胞菌O抗原分型具有重要的应用价值。
附图说明：
图1八种菌探针特异性比较；
图2类志贺邻单胞菌O26液相芯片灵敏度检测；
图3类志贺邻单胞菌O75液相芯片灵敏度检测；
图注：图1-3中O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75，O76代表类志贺邻单胞菌O血清型八种菌株。
实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所用到的类志贺邻单胞菌菌种来源如下表1所示：
表1 本实验所用到的菌种
a,CNCTC: Czech National Collection of Type Cultures, the CzechRepublic
实施例1
引物、探针的设计与制备
1、探针的筛选
特异性探针是整个液相芯片技术核心部分，一般采用先设计特异性探针，然后再根据探针位置来设计相应的引物。由于后期多重PCR的要求，因此在前期设计探针时，应注重保证探针的长度控制在18bp左右，GC含量控制在30-60%。前期设计探针时，利用生物信息学脚本对O抗原基因簇中特异基因进行多重比对，对每一个靶基因设计了多条特异探针这样不仅保证可以筛选出既保守又特异的探针，还能更加确保检测结果的可靠性。要想得到既保守又特异的探针如果仅仅靠生物信息学分析是远远不够的，有时候很符合上述条件的探针在实际杂交过程中却得不到稳定的阳性信号。因此设计好的探针必须经过实际芯片上机检测进行反复的筛选，才能保证真正有效地探针。
本研究经过反复多次的实验筛选，最终获得了每种菌特异的探针序列，如表2所示：
表2 本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌
2、特异基因的筛选
类志贺邻单胞菌O抗原通过两种途径合成O抗原，一种是wzy依赖型途径合成O抗原，另一种是通过ABC-transporter途径合成O抗原。在前者中，wzx/wzy基因是十分特异的，可以直接作为设计探针的候选基因，而在后者中，因为没有像wzx/wzy这么特异的基因，所以只能选择相对特异的基因，通常会是一些稀有的单糖基因或者是糖基转移酶。本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计探针引物。
3、引物的设计
以挑选出来的八种类志贺邻单胞菌的特异基因为模板设计液相芯片引物。利用Primer Premier 5.0设计引物，设定好引物的长度、引物类型、碱基数目等参数后运行软件，从输出结果中找出Tm值=50℃±3℃、碱基数在18-25bp之间、引物间无二聚体、引物内部无二级结构且扩增片段包含探针序列的引物。并且最终要保证所有引物PCR扩增出来的目的片段在100~300bp之间。利用设计好的引物多重PCR，最终得到的引物如表3所示：
表3 芯片所用到的引物：
实施例2
基因液相芯片的制备
1、选取编码微球（bio-rad或Luminex公司），每一条探针对应一个微球编号，8种类志贺邻单胞菌的8条探针就需要8个不同的微球编号，如075号微球偶联大肠杆菌O12血清型的探针，取约1.25×106个置于离心管，12000 rpm/min，离心3-5分钟，小心移去上清；
2、加入10 uL 0.1M的2-（n-吗啉代）乙磺酸溶液，充分震荡混匀，稍微离心；
3、用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至0.1mmol/L；加入4uL稀释类志贺邻单胞菌O12血清型的探针于075号微球悬浮液中，振荡混匀；
4、加入2.5 uL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混合液中，振荡，室温避光孵育30分钟；
5、重复步骤4；
6、用1 mL 0.02% Tween20洗涤一次，12000rpm/min离心3-5分钟；
7、小心弃上清，微球重悬于1 mL 0.1%SDS中，振荡混匀；
8、12000rpm/min离心3-5分钟，小心弃上清，微球重悬于30 uL pH8.0 TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球；
9、用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度；
10、把偶联好的检测微球放在4℃避光保存，每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
实施例3
样本（分离于任何适合类志贺邻单胞菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液）核酸的提取
1、取1.5 mL菌液离心管中，8000 rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次。
2、加入250 μL 50 mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，12000 rpm离心5分钟，弃上清。
3、加入250 μL 50 mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，再加10 μL 0.45M EDTA(pH8.0)，充分悬浮，37℃温浴20分钟。
4、加入10 μL 20 mg/mL溶菌酶，37℃温浴20分钟。
5、加入1.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。
6、加入15 μL 10%SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次。
7、加2 μL 20 mg/mL RNAse，65℃水浴30分钟。
8、用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。
9、在通风橱中加入250 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。
10、在通风橱中加入250 μL氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管。
11、加入2.5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80℃沉淀DNA。12000 rpm ，4℃离心15 min。
12、用1 mL 70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65℃，10 min烘干。
13、用30 μL TE溶解，并于-20 ℃冰箱备用。
实施例4、样本PCR扩增
以提取的核酸溶液作为PCR反应的模板，PCR反应体系及反应条件：
反应结束后以2%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。
实施例5
检测
1、悬摇、超声处理微球（已交联探针）20秒以重悬之；
2、配制混合微球工作液：用1.5х TMAC杂交液将各组微球稀释至150个/ul；（注：每个反应需要33ul混合微球工作液）
3、悬摇、超声处理微球20秒以混匀工作液；
4、向每个反应孔及空白对照孔中加入33ul工作液；
5、向每个空白孔中加入17ul TE（pH8.0）；而向每个样品孔中分别加入已生物素化的扩增产物17ul；
6、用枪上下吹吸数次以混匀各反应孔；
7、盖好反应板以防止挥发，将其置于95-100℃5分钟以使PCR产物双链变性；
8、之后再将反应板置于52℃15分钟；
9、配制新鲜的显色液：用1х TMAC杂交液将streptavidin-R-phycoerythrin（链霉亲和素-藻红蛋白）配成2-4 ug/ml；（注：每孔需75ul显色液）
10、用1х TMAC杂交液将1.2um的Millipore filter plate预湿一下，之后再负压抽空；之后将杂交好的反应液移入已预湿的孔中，用负压抽空以去除上清；之后再每孔加入75ul显色液，并用排枪上下吹吸数次以重悬反应液；迅速将反应液移回PCR板中；
11、将反应板再置于杂交温度54℃，120 r/min孵育15分钟；
12、反应完成后，在52℃上，用Luminex 100机器检测；
13、BIO-Plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对微球表面结合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测作为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值（MedianFluorescence Intensity， MFI）,也就是读取的这种编号的微球群（>100个）的每个微球信号强度的统计平均值。
结果判读：当待检测样本的MFI值为其对应的检测背景信号强度的5倍以上时即判为阳性。
实施例6
灵敏度检测
为了探究该发明的检测灵敏度，我们对8种类志贺邻单胞菌中的O26,O75两种菌进行灵敏度检测实验，具体方法如下：
①用NanoDrop OD仪对提取的基因组浓度进行测定，并分别稀释为100ng/μL、10ng/μL、1 ng/μL、100 pg/ul、10 pg/ul、1 pg/ul、100 fg/ul、10 fg/ul、 1 fg/ul。
②对基因组进行PCR扩增，芯片杂交，上机检测。
③检测结果见图2和图3。
结果表明：
（1）本发明对于类志贺邻单胞菌基因组样品的灵敏度是1pg/uL。
（2）本发明可以在较低的DNA浓度下对类志贺邻单胞菌O抗原抗原进行分型。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
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Claims (3)
1.一种对样品中八种类志贺邻单胞菌O抗原分型的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋白；其主要特征在于捕获探针包含从类志贺邻单胞菌O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75，O76八种菌的O抗原基因簇特异基因序列中所选取的核苷酸；所述的从类志贺邻单胞菌O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75，O76八种菌的O抗原基因簇特异基因序列是从SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:24所示的基因芯片选用的捕获探针序列；所述的引物序列：为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所示的一对引物。
2.权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的基因液相芯片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上机检测。
3.权利要求1所述的液相芯片在用于制备非诊断目的的类志贺邻单胞菌O12，O17，O25，O26，O33，O37，O75，O76八种菌中至少一种的O抗原分型检测方面的应用，其中的检测探针包括SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:24所示的DNA序列中的至少一种；所述的类志贺邻单胞菌指的是分离于志贺邻单胞菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |