CN110129461A

CN110129461A - 对类志贺邻单胞菌三种血清型o抗原分型的基因液相芯片及检测方法

Info

Publication number: CN110129461A
Application number: CN201910315471.4A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 王晓晨; 宁可馨; 刘倩; 李雨佳; 席道义; 曹勃阳
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2019-08-16

Abstract

本发明涉及一种对三种血清型类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides，Ps）的O抗原使用基于MGB探针的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系进行分析。本发明以类志贺邻单胞菌O抗原基因簇内的特异基因，即wzx为靶基因，建立了对3种类志贺邻单胞菌的O抗原分型的三组引物及MGB探针，为肠道及水环境中类志贺邻单胞菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的MGB探针检测肠道及水环境中的类志贺邻单胞菌，并且对其进行O抗原分型，具有高灵敏度、高特异性及快速检测等诸多优点。

Description

对类志贺邻单胞菌三种血清型O抗原分型的基因液相芯片及检测方法

技术领域

本发明涉及一种对样品中类志贺邻单胞菌三种血清型菌株O抗原分型的Taqman-MGB技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的MGB探针进行检测的方法。

背景技术

类志贺邻单胞菌，是一种革兰氏阴性菌，隶属于肠杆菌科邻单胞菌属。类志贺邻单胞菌在水、鱼类、多种哺乳动物及人类肠道中发现，能引起人的腹泻，是一种重要的肠道致病菌。目前对类志贺邻单胞菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理生化特征、血清学反应等方法，类志贺邻单胞菌的O抗原分型属于血清学反应的一种。由于环境和抗体的多样性，形成了O抗原的多样性，而根据O抗原的多样性可以对类志贺邻单胞菌的不同菌株进行分型鉴定。

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。其技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′ 端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。

利用Taqman MGB PCR检测时，扩增反应在25 μL的总体积中进行，包括12.5 μLPremix Ex Taq^TM（Takara），0.3 μL各10 μM正向和反向引物，0.3 μL 10 μM探针，0.2 μLROXII，1 μL DNA和11 μl ddH₂O。一个方案包括在95 ℃下进行3分钟的初始变性步骤，然后在95 ℃下变性15秒，在60 ℃下退火45秒进行40个循环，一式三份进行7500实时PCR 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），随后利用仪器（如7500 Software）进行检测和结果分析。Ct值<30 则为阳性。

本发明人曾申请过：一种对样品中八种类志贺邻单胞菌O抗原分型的基因液相芯片，主要是解决对8种类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides，P.S）的O抗原进行分型的液相芯片及其制备方法，本申请和已经公开的专利申请的区别在于：(1) 这三种类志贺邻单胞菌为新获得的血清型菌株，不在8种之内；(2) 首次破译了三种O抗原基因簇；(3) 检测手段不在利用液相芯片(因扩增和杂交分开进行，时间稍长)，而是采纳Taqman MGB PCR检测(扩增和杂交同时进行，时间更短；同时采用MGB探针，特异性更好)。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对样品中三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型的MGB探针，该探针含有 5' 报告染料（FAM）和 3' 非荧光猝灭剂（NFQ），在 3' 末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于所述的三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型指的是：从类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种菌的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQ IDNO:7-SEQ ID NO:9所示的DNA序列中的一种DNA序列。

本发明所述对样品中三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型的Taqman引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6所示的引物。

本发明所述的MGB探针，其特征在于所述的探针序列：具有SEQ ID NO:7-SEQ IDNO:9所示的探针。

本发明进一步公开了对样品中三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型的MGB探针，在用于类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型中至少一种的O抗原分型检测方面的应用。其中该MGB探针用于类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型中至少一种的O抗原分型检测。所述的类志贺邻单胞菌指的是分离于任何适合类志贺邻单胞菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。实验结果显示：

（1）本发明对于类志贺邻单胞菌基因组样品的灵敏度为O18为0.09 ng；O37和O45为9pg；（2）本发明可以在较低的DNA浓度下对类志贺邻单胞菌O抗原进行分型。

本发明提供的一种检测环境中三种血清型的Taqman-MGB PCR体系，该体系包括：Premix Ex Taq^TM（Takara），10 μM正向和反向引物，10 μM探针，ROXII，1μL DNA和ddH₂O。其主要特征在于所述的根据从类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物和探针：

（1）从类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用Primer Express设计的引物长度约为25 nt，Tm在55-60 ℃之间；PCR产物在50-200 bp之间。如果正向引物的 3' 末端距离探针的 5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。

（2）从类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用Primer Express设计的探针长度为15-30 nt，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。

本发明是Taqman-MGB PCR实时荧光定量技术的实际应用，用于类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型中至少一种的类志贺邻单胞菌分型鉴定。

由上述的技术方案可见，本发明首次将Taqman-MGB PCR技术引入类志贺邻单胞菌O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中3种类志贺邻单胞菌O血清型检测MGB探针及其检测方法，利用本发明的MGB探针可以达到鉴定样品中常见的类志贺邻单胞菌O血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中类志贺邻单胞菌O抗原分型具有重要的应用价值。

附图说明

图1三种血清型探针自身阳性结果：O18：Ct=21.87； O37：Ct=18.26：O45：Ct=15.86；

图2类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型探针特异性检测（ O37-18：Ct=35.86；O45-18：Ct=32.41；O18-37：Ct=36.42；O45-37：Ct=37；O18-45：Ct=33.82；O37-45：Ct=35.72）；

图3类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型灵敏度检测（O18：灵敏度为0.09 ng；O37：灵敏度为9 pg；O45：灵敏度为9 pg）；

图注：图1-3中O18，O37，O45代表类志贺邻单胞菌O血清型三种菌株。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

本发明所用到的类志贺邻单胞菌菌种来源如下表1所示：

表1 本实验所用到的菌种

实施例1

引物、探针的设计

1、特异基因的筛选

类志贺邻单胞菌 O 抗原通过两种途径合成 O 抗原，一种是 wzy 依赖型途径合成 O抗原，另一种是通过 ABC-transporter 途径合成 O 抗原。在前者中， wzx/wzy 基因是十分特异的，可以直接作为设计探针的候选基因，而在后者中，因为没有像 wzx/wzy 这么特异的基因，所以只能选择相对特异的基因，通常会是一些稀有的单糖基因或者是糖基转移酶。本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计探针引物。

2、引物和探针的设计

以挑选出来的三种类志贺邻单胞菌的特异基因为模板设计 Taqman-MGB 的引物和探针。使用Primer Express 3.0根据加工 wzx 基因的序列设计 TaqMan MGB 探针和引物。引物和探针的GC％含量在40-70％之间，避免了环发夹结构，自身二聚体和交叉二聚体的形成。通过使用BLAST搜索将它们的序列与GenBank中的所有序列进行比较来验证引物和探针的特异性。每种引物和探针的数量和序列信息列于表2和3中。

探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。

引物的长度约为25 nt，Tm 在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20 nt（通常为10nt或更少），则可能更好。

表2 Taqman-MGB所用到的引物

表3 Taqman-MGB所用到的探针

实施例2

样本核酸的提取（分离于任何适合类志贺邻单胞菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液）

1、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。

水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；

2、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；

3、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500-550 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；

4、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清；

5、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；

6、重复步骤5一次；

7、开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发；

8、得到的DNA用50-100 µL ddH2O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；

9、定浓度至300 ng/µL。

实施例3

样本PCR扩增

以提取的核酸溶液作为PCR反应的模板，PCR反应体系及反应条件：

PCR反应体系（25 µL）：

实施例4阳性检测

1、Real-Time PCR 体系（25 µL）：

2、Real-Time PCR反应条件：

3、检测结果

见图1 三种菌探针自身阳性结果，结果表明：在类志贺邻单胞菌基因组样品O18、O37和O45的三组MGB探针能够自身识别。

实施例5

特异性检测

1、Real-Time PCR 体系（25µL）：

2、Real-Time PCR反应条件：

3、检测结果：

结果表明：

（1）在类志贺邻单胞菌基因组样品O18的体系中分别加入O37和O45的基因组，其Ct值均大于30，O18的MGB探针特异性良好；

（2）在类志贺邻单胞菌基因组样品O37的体系中分别加入O18和O45的基因组，其Ct值均大于30，O37的MGB探针特异性良好；

（3）在类志贺邻单胞菌基因组样品O45的体系中分别加入O18和O37的基因组，其Ct值均大于30，O45的MGB探针特异性良好；

实施例6

灵敏度检测

为了探究该发明的检测灵敏度，我们对3种类志贺邻单胞菌中的O18，O37，O45进行灵敏度检测实验，具体方法如下：

①用NanoDrop OD仪对提取的基因组浓度进行测定，基因组用量分别为90 ng，9 ng，0.9 ng，0.09 ng，9 pg，0.9 pg，0.09 pg，9 fg。

②对基因组进行Real-Time PCR，Taqman引物和探针杂交，上机检测。

③检测结果见图3。

结果表明：

（1）本发明对于类志贺邻单胞菌基因组样品的灵敏度为O18为0.09 ng；O37和O45为9pg。

（2）本发明可以在较低的DNA浓度下对类志贺邻单胞菌O抗原进行分型。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 对类志贺邻单胞菌三种血清型O抗原分型的基因液相芯片及检测方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcacctaac actcgagtca aat 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtgatgcaa ggcgttaact att 23

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acaagtgtaa taagaactca agcagtaaca 30

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccacgcgcag caacaac 17

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatcttgaag ttctccacta tggctata 28

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcactctcaa ctccatcata tgaaa 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taacgtcatc aaagggat 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaccagatg tttaaccc 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tattttgcca atcacactta c 21

Claims

1.一种对样品中三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型的MGB探针，该探针含有 5' 报告染料（FAM）和 3' 非荧光猝灭剂（NFQ），在 3' 末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于所述的三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型指的是：从类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种菌的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:9所示的DNA序列中的一种DNA序列。

2.权利要求1所述对样品中三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型的Taqman引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6所示的引物。

3.权利要求1所述的MGB探针，其特征在于所述的探针序列：具有SEQ ID NO:7-SEQ IDNO:9所示的探针。

4.权利要求1所述对样品中三种血清型类志贺邻单胞菌O抗原分型的MGB探针，在用于类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型中至少一种的O抗原分型检测方面的应用。

5.权利要求4所述的MGB探针的应用，其特征在于该MGB探针用于类志贺邻单胞菌O18，O37，O45三种血清型中至少一种的O抗原分型检测。

6.权利要求4所述的应用，其中所述的类志贺邻单胞菌指的是分离于任何适合类志贺邻单胞菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。