CN111748641A - 一种对普罗威登斯菌o19、o20、o28、o30等血清型o抗原分子分型的检测方法 - Google Patents

一种对普罗威登斯菌o19、o20、o28、o30等血清型o抗原分子分型的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对普罗威登斯菌（Providencia）O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型的O抗原使用基于MGB探针的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系进行分析。本发明以普罗威登斯菌O抗原基因簇特异基因为靶基因，设计并筛选了用于普罗威登斯菌的O抗原分型的引物及MGB探针，并建立了相应的实时荧光PCR（RT‑PCR）检测方法，为利用分子生物学手段对亲水气单胞菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的MGB探针检测大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本中的普罗威登斯菌，并且对其进行O抗原分型，具有高灵敏度、高特异性及快速检测等诸多优点。

Description

一种对普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30等血清型O抗原分子分 型的检测方法
技术领域
本发明涉及对样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型菌株O抗原分型的Taqman-MGB技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的MGB探针进行检测的方法。
背景技术
普罗威登斯菌，0.6-0.8×1.5-2.5μm，与肠杆菌科的一般定义符合，兼性厌氧 ，属革兰氏阴性直杆菌，以周生鞭毛运动，不出现集群。氧化脱氨苯丙氨酸和色氨酸。分离于腹泻大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本。普罗威登斯菌是条件致病菌，能引起腹泻，肠道外感染和尿道感染等疾病。常见的普罗威登斯菌有产碱普罗维斯登菌(P.alcalifaciens) 、雷氏普罗威登斯菌 (P.rettgeri) 、拉氏普罗威登斯菌(P.rustigianii)、 斯氏普罗威登斯菌 (P.stuartii)。随着抗生素和免疫抑制剂的广泛应用耐药细菌呈现上升趋势，但是在血清水平上，利用创伤抗血清进行鉴定受到变异、可用性和特异性的限制，所以需要一个更具体可行的分子分型方案。已知细菌表面多糖对不同的血清有特异性，如O抗原或荚膜，而根据O抗原的多样性可以对普罗威登斯菌的不同菌株进行分型鉴定。
TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′ 端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。 探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。 产生的PCR产物在50-200 bp之间。 引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3' 末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。
利用Taqman MGB PCR检测时，扩增反应在25 μL的总体积中进行，包括12.5 μLPremix Ex TaqTM（Takara），0.3 μL各10 μM正向和反向引物，0.3 μL 10 μM探针，0.2 μLROXII，0.3 μL DNA和11 μl ddH2O。 一个方案包括在95 ℃下进行3分钟的初始变性步骤，然后在95 ℃下变性15秒，在60 ℃下退火45秒进行40个循环，一式三份进行7500实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），随后利用仪器（如ABI 7500）进行检测和结果分析。Ct值<30 且出现扩增曲线则为阳性。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了对样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原分型的MGB探针，该探针含有 5' 报告染料（FAM）和 3' 非荧光猝灭剂（NFQ），在 3' 末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于所述的普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原分型指的是：从普罗威登斯菌血清型的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQ ID NO:13- SEQ ID NO:18所示的核苷酸探针序列。
本发明所述对样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原分型的TaqMan引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
本发明进一步公开了对样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原分型的MGB探针，用于特异性快速检测普罗威登斯菌O抗原分型方面的应用。其中该MGB探针用于普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型中的O抗原分型检测。所述的普罗威登斯菌指的是分离于任何适合普罗威登斯菌生活的环境中所得到的样品的纯培养物的粗提液。实验结果显示本发明可以在较低的DNA浓度下对普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原进行分型。
本发明提供的一种检测环境中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型的Taqman-MGB PCR体系，该体系包括：Premix Ex TaqTM（Takara），10 μM正向和反向引物，10 μM探针，ROXII，0.3μL DNA和ddH2O。其主要特征在于所述的根据从普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物和探针：
（1）从普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用Primer Express3.0设计的引物长度约为25 nt，Tm在55-60 ℃之间；PCR产物在50-200bp之间。如果正向引物的 3' 末端距离探针的 5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。
（2）从普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用Primer Express3.0设计的探针长度为15-30 nt，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。本发明是Taqman-MGB PCR技术的实际应用，用于普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型分型鉴定。
由上述的技术方案可见，本发明首次将Taqman-MGB PCR技术引入普罗威登斯菌Sv4血清型O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型检测MGB探针及其检测方法，利用本发明的MGB探针可以达到鉴定样品中常见的普罗威登斯菌血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36抗原分型具有重要的应用价值。
附图说明
图1为普罗威登斯菌血清型探针阳性检测；其中
1-1 为O19血清型探针阳性结果：O19：Ct=16.93；
1-2 为O20血清型探针阳性结果：O20：Ct=15.92；
1-3 为O28血清型探针阳性结果：O28：Ct=17.91；
1-4 为O30血清型探针阳性结果：O30：Ct=15.7；
1-5 为O31血清型探针阳性结果：O31：Ct=16.85；
1-6 为O36血清型探针阳性结果：O36：Ct=16.5；
图2为普罗威登斯菌血清型探针特异性检测；其中
2-1、2-2为O19血清型探针特异性检测结果：O19-2：Ct=35.93；O19-4：Ct=35.9；O19-5：Ct=32.89；O19-6：Ct=34.92；O19-7：Ct=35.93；O19-8：Ct=34.91；O19-11：Ct=35.93；O19-12：Ct=35.95；O19-13：Ct=34.92；O19-14：Ct=35.94；O19-15：Ct=34.92；O19-16：Ct=33.82；O19-17：Ct=31.81；O19-20：Ct=30.96；O19-21：Ct=32.68；O19-22：Ct=33.23；O19-24：Ct=30.93；O19-25：Ct=33.14；O19-27：Ct=32.76；O19-28：Ct=32.19；O19-29：Ct=31.9；O19-31：Ct=32.92；O19-33：Ct=33.93；O19-36：Ct=32.92；O19-40：无Ct值，无扩增曲线；O19-43：Ct=33.94；O19-44：Ct=33.94；O19-45：Ct=33.93；O19-46：Ct=33.93；O19-47：Ct=33.94；O19-48：Ct=33.94；O19-49：Ct=33.93；O19-50：Ct=33.94；O19-51：Ct=33.93；O19-52：Ct=33.93；O19-53：Ct=33.94；O19-54：Ct=33.94；O19-55：Ct=33.95；O19-56：Ct=33.93；O19-57：Ct=33.93；O19-60：Ct=33.92；O19-61：Ct=32.92；
2-3、2-4为O20血清型探针特异性检测结果： O20: O20-2：Ct=36.99；O20-4：Ct=36.98；O20-5：Ct=35.37；O20-6：无Ct值，无扩增曲线；O20-7：Ct=37.09；O20-8：Ct=36.96；O20-11：Ct=36.98；O20-12：Ct=36.95；O20-13：Ct=36.92；O20-14：Ct=37.09；O20-15：Ct=36.94；O20-16：Ct=35.93；O20-17：Ct=37.03；O20-19：Ct=35.38；O20-21：Ct=36.97；O20-22：Ct=36.94；O20-24：Ct=37.06；O20-25：Ct=35.93；O20-27：Ct=35.93；O20-28：Ct=36.93；O20-29：Ct=36.95；O20-31：Ct=32.96；O20-33：Ct=33.79；O20-36：Ct=35.36；O20-40：Ct=33.97；O20-43：Ct=36.93；O20-44：Ct=35.93；O20-45：Ct=36.94；O20-46：Ct=34.95；O20-47：Ct=33.67；O20-48：Ct=36.94；O20-49：Ct=36.95；O20-50：无Ct值，无扩增曲线；O20-51：Ct=35.96；O20-52：Ct=34.94；O20-53：Ct=35.85；O20-54：Ct=35.57；O20-55：Ct=36.95；O20-56：Ct=35.95；O20-57：Ct=34.95；O20-60：Ct=36.91；O20-61：Ct=36.96；
2-5、2-6为O28血清型探针特异性检测结果：O28-2：Ct=37.17；O28-4：Ct=36.93；O28-5：Ct=34.58；O28-6：Ct=36.98；O28-7：无Ct值，无扩增曲线；O28-8：Ct=36.95；O28-11：Ct=35.96；O28-12：无Ct值，无扩增曲线；O28-13：Ct=36.96；O28-14：无Ct值，无扩增曲线；O28-15：无Ct值，无扩增曲线；O28-16：无Ct值，无扩增曲线；O28-17：Ct=34.78；O28-19：Ct=30.06；O28-20：Ct=33.15；O28-21：Ct=35.32；O28-22：Ct=34.02；O28-24：无Ct值，无扩增曲线；O28-25：Ct=35.72；O28-27：Ct=31.5；O28-28：Ct=37.07；O28-29：Ct=33.28；O28-31：Ct=35.37；O28-33：Ct=34.94；O28-36：Ct=32.6；O28-40：Ct=34.45；O28-43：Ct=35.83；O28-44：Ct=32.25；O28-45 ：无Ct值，无扩增曲线；O28-46：Ct=30.83；O28-47：Ct=34.96；O28-48：Ct=36.84；O28-49：Ct=36.67；O28-50：无Ct值，无扩增曲线；O28-51：Ct=34.13；O28-52：Ct=34.15；O28-53：Ct=37.21；O28-54：Ct=36.06；O28-55：Ct=37.36；O28-56：无Ct值，无扩增曲线；O28-57：无Ct值，无扩增曲线；O28-60：Ct=35.53；O28-61：Ct=35.66；
2-7为O30血清型探针特异性检测结果： O30-2：无Ct值，无扩增曲线；O30-4：无Ct值，无扩增曲线；O30-5：Ct=36.88；O30-6：无Ct值，无扩增曲线；O30-7：无Ct值，无扩增曲线；O30-8：Ct=37.03；O30-11：Ct=35.04；O30-12：Ct=35.52；O30-13：Ct=37；O30-14：Ct=36.95；O30-15：Ct=37.07；O30-16：Ct=36.99；O30-17：Ct=36.92；O30-19：Ct=35.25；O30-20：Ct=37.03；O30-21：无Ct值，无扩增曲线；O30-22：Ct=35.91；O30-24：Ct=35.52；O30-25：Ct=37.18；O30-27：Ct=37.05；O30-28：Ct=37.04；O30-29：无Ct值，无扩增曲线；O30-31：Ct=37.39；O30-33：Ct=37.19；O30-36：Ct=37.02；O30-40：Ct=37.04；O30-43：Ct=37；O30-44：Ct=36.98；O30-45：Ct=37.27；O30-46：Ct=37.04；O30-47：无Ct值，无扩增曲线；O30-48：无Ct值，无扩增曲线；O30-49：无Ct值，无扩增曲线；O30-50：Ct=37.17；O30-51：Ct=33.82；O30-52：Ct=35.97；O30-53：Ct=36；O30-54：Ct=34.91；O30-55：Ct=35.94；O30-56：无Ct值，无扩增曲线；O30-57：Ct=35.93；O30-60：Ct=32.98；O30-61：Ct=35.82；
2-8、2-9为O31血清型探针特异性检测结果： O31-2：Ct=36.97；O31-4：Ct=36.92；O31-5：无Ct值，无扩增曲线；O31-6：无Ct值，无扩增曲线；O31-7：Ct=35.93；O31-8：Ct=35.95；O31-11：Ct=36.94；O31-12：Ct=34.92；O31-13：无Ct值，无扩增曲线；O31-14：Ct=35.92；O31-15：Ct=36.93；O31-16：Ct=36.93；O31-17：无Ct值，无扩增曲线；O31-19：无Ct值，无扩增曲线；O31-20：无Ct值，无扩增曲线；O31-21：无Ct值，无扩增曲线；O31-22：Ct=37.05；O31-24：无Ct值，无扩增曲线；O31-25：Ct=35.94；O31-27：无Ct值，无扩增曲线；O31-28：无Ct值，无扩增曲线；O31-29：Ct=37.03；O31-31：无Ct值，无扩增曲线；O31-33：无Ct值，无扩增曲线；O31-36：Ct=35.95；O31-40：无Ct值，无扩增曲线；O31-43：无Ct值，无扩增曲线；O31-44：Ct=36.97；O31-45：Ct=36.82；O31-46：无Ct值，无扩增曲线；O31-47：无Ct值，无扩增曲线；O31-48：无Ct值，无扩增曲线；O31-49：无Ct值，无扩增曲线；O31-50：无Ct值，无扩增曲线；O31-51：无Ct值，无扩增曲线；O31-52：无Ct值，无扩增曲线；O31-53：无Ct值，无扩增曲线；O31-54：无Ct值，无扩增曲线；O31-55：无Ct值，无扩增曲线；O31-56：无Ct值，无扩增曲线；O31-57：无Ct值，无扩增曲线；O31-60：Ct=36.87；O31-61：无Ct值，无扩增曲线；
2-10、2-11为O36血清型探针特异性检测结果：O36: O36-2：Ct=36.92；O36-4：Ct=34.68；O36-5：Ct=36.82；O36-6：Ct=36.99；O36-7：Ct=35.22；O36-8：Ct=35.26；O36-11：Ct=36.92；O36-12：Ct=35.75；O36-13：Ct=33.89；O36-14：Ct=35.96；O36-15：Ct=34.67；O36-16：Ct=36.94；O36-17：Ct=35.67；O36-19：Ct=33.65；O36-20：Ct=32.02；O36-21：Ct=36. 71；O36-22：Ct=33.44；O36-24：无Ct值，无扩增曲线；O36-25：Ct=35.92；O36-27：Ct=35.52；O36-28：Ct=31.99；O36-29：Ct=33.81；O36-31：Ct=35.24；O36-33：Ct=36.99；O36-40：Ct=35.9；O36-43：Ct=36.97；O36-44：Ct=35.95；O36-45：Ct=34.91；O36-46：Ct=33.55；O36-47：Ct=36.96；O36-48：Ct=37.09；O36-49：Ct=34.96；O36-50：Ct=36.9；O36-51：Ct=36.92；O36-52：Ct=36.91；O36-53：Ct=37.07；O36-54：Ct=34.43；O36-55：Ct=35.43；O36-56：Ct=36.95；O36-57：Ct=37.08；O36-60：Ct=37.09；O36-61：Ct=36.9。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
本发明所用到的普罗威登斯菌菌种来源如下表1所示：
表1 本实验所用到的菌种
Figure 127865DEST_PATH_IMAGE001
a Department of Immunobiology of Bacteria Institute of Microbiology andImmunology University of Lodz←Hungarian National Collection Medical Bacteria(National Insititute of Hygiene,Budapest,Hungary)
实施例1
引物、探针的设计
1、特异基因的筛选
普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36 血清型 O 抗原通过两种途径合成 O 抗原，一种是 wzy 依赖型途径合成 O 抗原，另一种是通过 ABC-transporter 途径合成 O 抗原。在前者中， wzx/wzy 基因是十分特异的，可以直接作为设计探针的候选基因，而在后者中，因为没有像 wzx/wzy 这么特异的基因，所以只能选择相对特异的基因，通常会是一些稀有的单糖基因或者是糖基转移酶。本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计探针引物。
2、引物和探针的设计
以挑选出来的普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型的特异基因为模板设计Taqman-MGB 的引物和探针。使用Primer Express 3.0根据加工 wzy 基因的序列设计TaqMan MGB 探针和引物。引物和探针的GC％含量在40-70％之间，避免了环发夹结构，自身二聚体和交叉二聚体的形成。通过使用BLAST搜索将它们的序列与GenBank中的所有序列进行比较来验证引物和探针的特异性。每种引物和探针的数量和序列信息列于表2和3中。
探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。
引物的长度约为25 nt，Tm 在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3' 末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10nt或更少），则可能更好。
表2 Taqman-MGB所用到的引物
Figure 966377DEST_PATH_IMAGE002
表3 Taqman-MGB所用到的探针
Figure 949376DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
样本核酸的提取（分离于任何适合普罗威登斯菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液）
1、将待测样品用无菌水稀释，通常稀释倍数为1：10（例如10g固体样品或10ml液体样品溶于90ml无菌水中），制成菌液母液（只取液体）。
将菌液母液用无菌水再稀释5个梯度：1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5，将每个梯度菌液分别均匀涂于LB固体培养基上37℃培养。待平板上生长出单个菌落时，将菌落挑起接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养（此步接种操作均在超净台中进行）。
2、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1 min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。
水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；
3、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；
4、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500-550 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；
5、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清；
6、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；
7、重复步骤6一次；
8、开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发；
9、得到的DNA用50-100 µL ddH2O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；
10、定浓度至300 ng/µL。
实施例3
阳性检测
1、Real-Time PCR 体系（25 µL， 以O19为例）
Figure 875744DEST_PATH_IMAGE004
2、Real-Time PCR反应条件：
Figure 578865DEST_PATH_IMAGE005
3、检测结果
图1为普罗威登斯菌各血清型探针自身检测结果，结果表明：每个反应体系都出现了良好的扩增曲线，表明每个血清型的检测体系均可以实现对应血清型的准确检测。
实施例4
特异性检测
1、Real-Time PCR 体系（25µL， 以O19部分检测为例）
Figure 932485DEST_PATH_IMAGE006
Figure 402781DEST_PATH_IMAGE007
2、Real-Time PCR反应条件：
Figure 788632DEST_PATH_IMAGE008
3、检测结果：
结果表明：
在普罗威登斯菌基因组样品O19、O20、O28、O30、O31、O36的体系中加入其他血清型的基因组，结果如图2所示，并未出现扩增曲线，表明各血清型的MGB探针特异性良好。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种对普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30等血清型O抗原分子分型的检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ctcgcatata cgaatgggag tca 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgtgagtagt gatgtttcaa gcattt 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttccataaga aaaaagatcg ggaat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cgaacttatt aggagctgca tacca 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gatggccccc tttgtaattg ta 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cagatgcgcc agataaaatt gag 23
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cagtatcgtc gctatacagt tcacaa 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
accatattca cggtattcag caatg 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gctaggcttt gggtttgatg at 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
agccaggttc ccaaccataa g 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
acgggtaccc tagattcaca tctt 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
cccaagtgat attccaagcg tat 23
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
cagcaggtat acccgc 16
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
cattttcacc acgacttt 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
catgaataat caaagaatcc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
caattacatg agctaggtcc 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
actacactgt aattagtcag ca 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
tattcactta ttgactcatt cc 22

Claims (4)

1.一种对样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原分型的Taqman特异性引物，其特征在于具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述特异性引物的MGB探针，该探针含有 5' 报告染料（FAM）和3' 非荧光猝灭剂（NFQ），在 3' 末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于具有SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述对样品中普罗威登斯菌O19、O20、O28、O30、O31、O36血清型O抗原分型的Taqman特异性引物和MGB探针在用于特异性快速检测普罗威登斯菌O抗原分型方面的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中所述的普罗威登斯菌指的是：分离于适合普罗威登斯菌生活的环境中所得到的样品的纯培养物的粗提液。
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