CN114854886A

CN114854886A - 一种迟缓爱德华菌实时荧光pcr检测方法及应用

Info

Publication number: CN114854886A
Application number: CN202210755672.8A
Authority: CN
Inventors: 郭玺; 刘斌; 武潘; 王婧
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-08-05

Abstract

本发明涉及基于MGB探针的实时荧光PCR反应快速检测体系对4种迟缓爱德华菌血清型菌株进行检测。本发明以4种血清型迟缓爱德华菌的wzx基因为靶基因，设计和筛选了针对每一个血清型的Taqman特异性引物及MGB探针，并建立了实时荧光PCR检测方法。利用本发明提供的方法可以准确、快速、灵敏地对4种迟缓爱德华菌血清型菌株进行分子生物学检测。

Description

一种迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方法及应用

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于迟缓爱德华菌4种血清型的实时荧光PCR检测方法及应用。

背景技术

迟缓爱德华菌可在大多数水环境中生存，是一种人畜共患病菌，可对多种经济型鱼类造成感染，造成严重的经济损失。同时，该菌也可以感染哺乳动物及人类，其中最常见的感染疾病是胃肠炎，若不慎引发肠外或全身感染，还可导致较高的死亡率。

细菌的血清型与致病性密切相关，同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着很大差异。血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是应用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；血清的生产和质控较为困难；同一血清型菌株与不同抗血清容易发生交叉反应等。

细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。其中，编码O抗原翻转酶的wzx基因和聚合酶的wzy基因，通常具备血清型特异性，被用作利用分子生物学手段开发致病菌血清型鉴定技术的检测靶标。

TaqMan实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理是，将标记有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得循环阈值（Ct值），即可表征检测样品的类型和含量。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术，它在探针3′ 端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配，就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。

利用Taqman MGB PCR检测时，扩增反应在25 μL的总体积中进行，包括12.5 μLPremix Ex Taq^TM（Takara），0.3 μL各10 μM正向和反向引物，0.3 μL 10 μM探针，0.2 μLROXII，0.2 μL 待检测样品的核酸DNA和11.2 μL ddH₂O。一个方案包括在95 ℃下进行2分钟的初始变性步骤，然后在95 ℃下变性30秒，在60 ℃下退火30秒进行40个循环，利用实时荧光PCR 系统进行检测和结果分析。Ct值<26 且出现扩增曲线，则判断样品为阳性，否则为阴性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可对迟缓爱德华菌4种血清型进行鉴定的实时荧光PCR检测技术，为这种致病菌的快速检测提供有效的技术手段。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种对不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物，其特征是在迟缓爱德华菌4种血清型菌株G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取的2个DNA片段，其序列如SEQID NO:1-SEQ ID NO:8所示。

本发明同时也公开了对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的MGB探针，其特征是2个Taqman引物的内部，且含有5'报告染料（FAM）和3'非荧光猝灭剂（NFQ），在3'末端与小沟结合物（MGB）缀合，其序列如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12所示。

本发明所述的不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物和MGB探针，上述体系的组成成分和浓度如下：

本发明更进一步公开了对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物和MGB探针在用于检测迟缓爱德华菌方面的应用。实验结果显示，可以实现对迟缓爱德华菌4种血清型的准确检测，对于基因组DNA的检测灵敏度可达1ng，且自获得基因组DNA或纯培养菌落计，可在3个小时内完成检测。

本发明更加详细的描述如下：

本发明涉及一种对不同的迟缓爱德华菌4种血清型分别特异的Taqman引物序列，MGB探针序列及实时荧光PCR检测方法。其中：所述的Taqman引物是在迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取的2个DNA片段，其序列如SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:8所示。

SEQ ID (5'-3')

NO:1 TTGATGCCTTCTCCTTTCGATT

扩增迟缓爱德华菌G6053 wzx基因的上游引物P1

NO:2 AGGAGAGGCACCCCAAAAA

扩增迟缓爱德华菌G6053 wzx基因的下游引物P2

NO:3 TGTCTCTGCGGCCGTTATTA

扩增迟缓爱德华菌G6057 wzx基因的上游引物P3

NO:4 TGCCATAACCCCACCGATA

扩增迟缓爱德华菌G6057wzx基因的下游引物P4

NO:5 TGTTTTTTATGGAGGTAAGGTTAATGGT

扩增迟缓爱德华菌G6058 wzx基因的上游引物P5

NO:6 GGTGGTACCCAAACAAGAATGC

扩增迟缓爱德华菌G6058 wzx基因的下游引物P6

NO:7 GGCGCTGAAGCAGTTGGTA

扩增迟缓爱德华菌G6059 wzx基因的上游引物P7

NO:8 TTCCTTGCAATGCCTGCTTA

扩增迟缓爱德华菌G6059 wzx基因的下游引物P8

所述的MGB探针是从迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取，且在相应菌株对应的2条Taqman引物内部筛选得到的，且含有 5' 报告染料（FAM）和 3'非荧光猝灭剂（NFQ），在 3' 末端与小沟结合物（MGB）缀合，其序列如SEQ ID NO:9- SEQ IDNO:12所示。

SEQ ID (5'-3')

NO: 9 AAGTATCTAAAGGAAGCATTG

用于迟缓爱德华菌G6053 wzx基因检测的探针T1

NO: 10 TCAATCGGCAACCGG

用于迟缓爱德华菌G6057 wzx基因检测的探针T2

NO: 11 CTGGCGAGATTCT

用于迟缓爱德华菌G6058 wzx基因检测的探针T3

NO: 12 TATAATTCCGCTGATAAGC

用于迟缓爱德华菌G6059 wzx基因检测的探针T4

实验结果显示：

（1）本发明提供的技术准确性好，可以实现对迟缓爱德华菌共4个血清型的准确检测。对于迟缓爱德华菌G6053，其对应的体系1实时荧光PCR检测结果Ct=16；对于迟缓爱德华菌G6057，其对应的体系2实时荧光PCR检测结果Ct=17；对于迟缓爱德华菌G6058，其对应的体系3实时荧光PCR检测结果Ct=19；对于迟缓爱德华菌G6059，其对应的体系4实时荧光PCR检测结果Ct=17。可见，每个体系对于各自对应血清型的实时荧光PCR检测CT值均小于26的标准，可判断为阳性结果。如图1-1至图1-4所示。

（2）本发明提供的技术特异性好，1-4每个体系除了可以检测自身对应的血清型外（CT值小于26），对于其他血清型的菌株，均无扩增曲线出现，可判断为阴性结果。如下表和图2-1至图2-4所示。

表迟缓爱德华菌实时荧光PCR特异性反应结果

（3）本发明提供的技术灵敏度高，可以实现对1ng迟缓爱德华菌基因组DNA的准确检测。

本发明主要提供了利用分子生物方法，对致病菌-迟缓爱德华菌菌株进行检测的技术手段，主要难点在于特异性Taqman引物和MGB探针的筛选与确定。

本发明公开的迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方法及应用所具有的积极效果在于：

（1）首次公开了利用分子生物学手段，对迟缓爱德华菌菌株进行检测的技术手段，对于该菌的临床检测和流行病学监控提供了有效方法。

（2）检测灵敏度高：对于基因组DNA的检测灵敏度可达1ng。

（3）检测时间短：利用该技术手段，自获得基因组DNA或纯培养菌落计，可在3个小时内完成检测。

附图说明

图1为迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测体系中每个体系对于相应血清型菌株的自身检测结果；其中1为体系1对于迟缓爱德华菌G6053的检测结果，2为体系2对于迟缓爱德华菌G6057的检测结果，3为体系3对于迟缓爱德华菌G6058的检测结果，4为体系4对于迟缓爱德华菌G6059的检测结果；

图2为迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测体系中每个体系的特异性实验检测结果；其中1为体系1对于迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058和G6059的检测结果的合并展示，只有G6053生成了扩增曲线；2为体系2对于迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058和G6059的检测结果的合并展示，只有G6057生成了扩增曲线；3为体系3对于迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058和G6059的检测结果的合并展示，只有G6058生成了扩增曲线；4为体系4对于迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058和G6059的检测结果的合并展示，只有G6059生成了扩增曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中迟缓爱德华4种菌来源为中国海洋大学从鱼体中分离并赠送。

实施例1

引物、探针的设计

1、特异基因的筛选

迟缓爱德华菌的O抗原合成基因簇中，存在3类基因，分别是：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因（wzx和wzy）。其中，寡糖单位处理酶基因最具有型别的特异性，糖基转移酶基因次之，单糖合成酶基因特异性较差。因此，选择G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因作为特异基因，进行特异引物和探针的设计。

2、引物和探针的设计

使用Primer Express 3.0，根据每个血清型的特异基因序列设计 TaqMan MGB 探针和引物。引物和探针的GC％含量在40-70％之间，避免了环发夹结构，自身二聚体和交叉二聚体的形成。通过使用BLAST搜索将它们的序列与GenBank中的所有序列进行比较来验证引物和探针的特异性。

探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和非荧光猝灭剂（NFQ），且在3' 末端与小沟结合物（MGB）缀合。

引物的长度约为25 nt，Tm 在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20 nt（通常为10nt或更少），则可能更好。

实施例2

样本核酸的提取

1、针对获得的纯培养细菌，采用以下方式进行处理：

（1）挑取细菌单菌落至10 µL去离子水中，或过夜培养的细菌菌液10 µL，沸水浴中处理15 min。

（2）置于冰上1 min后，8000 rpm离心1 min。

（3）取3 µL 上清液作为下一步实时荧光PCR反应的模板。

2、对于临床样品，采用以下方式进行处理：

（1）将固体或半固体样品10g，或液体样品5mL置于20 mL LB培养基中，37度震荡培养3 h。

（2）取1 mL（1）中的培养物，8000 rpm离心5min，弃去上清。

（3）加入 500µL去离子水，重悬混匀，8000 rpm离心5min，弃去上清。

（4）加入100µL去离子水，沸水浴中处理15 min。

（5）置于冰上1 min后，8000 rpm离心1 min。

（6）取3 µL 上清液作为下一步实时荧光PCR反应的模板。

实施例3

实时荧光PCR扩增检测

以实施例2提取的核酸溶液作为实时荧光PCR反应的模板，分别加入1-4每个实时荧光PCR反应体系，放入实时荧光定量基因扩增仪（本实施例选择美国ABI公司的7500型实时荧光定量PCR仪），按如下条件进行反应。

反应条件：

检测结果中，某个体系的CT值小于26，则判断样品中含有该体系对应的迟缓爱德华菌菌株。

实施例4

灵敏度检测

（1）将每种迟缓爱德华菌菌株接种至5 mL LB培养基中，37℃，180转/分钟的摇床中过夜培养，收集2 mL菌体。

（2）利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（产品号DP302），按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取。

（3）用NanoDrop OD仪对提取的基因组浓度进行测定，并将其浓度调整为3300 ng/μL，并依次逐级梯度稀释。如此，加入对应反应体系的基因组DNA分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg。

（4）按照实施例3的反应步骤进行实时荧光PCR反应，结果表明：对于基因组DNA的检测灵敏度为1ng。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方法及应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgatgcctt ctcctttcga tt 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggagaggca ccccaaaaa 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtctctgcg gccgttatta 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgccataacc ccaccgata 19

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgttttttat ggaggtaagg ttaatggt 28

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggtaccc aaacaagaat gc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcgctgaag cagttggta 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttccttgcaa tgcctgctta 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagtatctaa aggaagcatt g 21

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaatcggca accgg 15

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctggcgagat tct 13

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tataattccg ctgataagc 19

Claims

1.一种对不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物，其特征是在4种血清型的迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取的2个DNA片段，其引物序列依次如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8所示。

2.一种对4种血清型的迟缓爱德华菌分别特异的MGB探针，其特征是位于权利要求1中2个Taqman引物的内部，且含有5'报告染料FAM和3'非荧光猝灭剂NFQ，在3'末端与小沟结合物MGB缀合，其探针序列依次如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12所示。

3.权利要求1所述的对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物在用于检测迟缓爱德华菌方面的应用。

4.权利要求2所述的MGB探针在用于检测迟缓爱德华菌方面的应用。