CN111394488A - 用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用 - Google Patents

用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用 Download PDF

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许琮
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Abstract

本发明提供了用于检测铜绿假单胞菌O抗原共19个血清型的特异寡核苷酸序列，连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸包括：（1）铜绿假单胞菌O抗原1‑5型、7‑14型、16型、18‑20型的wzy基因中；（2）铜绿假单胞菌O抗原6型的wbpP基因中；（3）铜绿假单胞菌O抗原17型的插入序列IS中；以及（4）铜绿假单胞菌O抗原2型和6型wzy β 基因中各自选取的一种DNA片段。本发明结合Bio‑Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测铜绿假单胞菌O抗原共19个血清型的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了利用分子生物学方法对铜绿假单胞菌进行血清学分型和检测的技术空白，对于这一重要致病菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。

Description

用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用
技术领域
本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于铜绿假单胞菌19个血清型分型的液相芯片及应用。
背景技术
铜绿假单胞菌是一种重要的革兰氏阴性条件致病菌，是医院内感染的重要病原菌之一。特别是接受免疫抑制治疗（如癌症治疗）、烧伤治疗，以及HIV患者和囊性纤维化患者，更易受到铜绿假单胞菌的感染。此外，近年来随着临床上多重耐药铜绿假单胞菌菌株的不断增加，使得临床用药和治疗更加困难，其结果是由耐药性铜绿假单胞菌导致感染的发病率和死亡率的增加。
目前，国内大多医院采用传统技术检测病原微生物（包括铜绿假单胞菌在内），即对细菌进行培养和单菌落分离后，进行生化指标的检测，或通过免疫学鉴定（免疫荧光、免疫电镜、血细胞凝集试验等）等方法做出诊断。该方法具有较好的特异性，但是往往灵敏度较低、检测用时长。
血清学检测方法具有操作简便和结果判读直观的特点，自上世纪30年代以来被广泛应用，被认为具有最好的特异性和灵敏性，该方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株。目前，大多数重要致病菌都建立了基于表面多糖抗原的血清学分型系统，并且该分型体系已被广泛应用于检验检疫和疾病预防控制系统。但是，血清学检测在应用中存在一些缺陷，如交叉反应严重、抗血清不全等。
建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。液相芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针，在液相中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着液相芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。
铜绿假单胞菌的O抗原是其血清型多样性的遗传基础。在铜绿假单胞菌中，有2种形式的O抗原存在，分别是普通多糖抗原（CPA，A Band）和O-特异性抗原（OSA，B Band）。 CPA由3个鼠李糖链接的3糖重复单位构成。OSA由3-5个不同单糖构成的异糖重复单位组成，上述重复单位的不同单糖组成和不同排列形式导致了铜绿假单胞菌的OSA的多样性，构成了其血清型的分类基础。根据OSA的结构不同，铜绿假单胞菌可以分为20个血清型。除了O抗原15型外，其余19个铜绿假单胞菌的OSA合成基因簇已经被解析，这些基因簇在每个血清型中均位于himD/ihfB和wbpM基因之间。这一信息使得采用分子生物学方法，以O抗原合成基因簇中的特异基因为目标，实现对铜绿假单胞菌进行分子血清学分型成为可能。
发明内容
本发明在分析铜绿假单胞菌19个O抗原血清型基因簇及其各自特异基因的基础上，提供了用于检测铜绿假单胞菌O抗原共19个血清型的特异寡核苷酸序列，结合Bio-Rad公司的Bio-Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测铜绿假单胞菌19个O抗原血清型的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了铜绿假单胞菌的分子血清学分型技术的空白，对于该菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸序列包括下述DNA片段：
（1）铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因中选取的一种DNA片段；
（2）铜绿假单胞菌O抗原6型的wbpP基因中选取的一种DNA片段；
（3）铜绿假单胞菌O抗原17型的插入序列IS中选取的一种DNA片段
（4）铜绿假单胞菌O抗原2型和6型wzy β 基因中选取的一种DNA片段
上述的寡核苷酸DNA片段为SEQ ID NO: 1-14所示的核苷酸序列如下：
SEQ ID (5'-3')
NO: 1 GGCTTATGCCGGTGGTAA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原1型
NO: 2 GCAGTCCCTGCTAACTGTA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型
NO: 3 TTGCTGCTTTCGGTTGTT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原2/16型
NO: 4 GGGCTCTATCAGGAACTCTTACT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原3型
NO: 5 TTTTGGATTTTCTGCCGGGGCG 用于检测铜绿假单胞菌O抗原4型
NO: 6 TGCTGATTGCAGCCAGAG 用于检测铜绿假单胞菌O抗原6型
NO: 7 ATATTTTATTCTCGTGGGGTTCT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原7/8型
NO: 8 GGATACCCGGTCACGCT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原9型
NO: 9 TTTGATGATAAATCGGCTCA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原10/19型
NO: 10 CACATGCAAGTGCTCGTT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原11型
NO: 11 TGGGATACCTTCTCCTGAC 用于检测铜绿假单胞菌O抗原12型
NO: 12 CATGTTGGGTTTTTTGATT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原13型
NO: 13 CACGTTGGGTTTTTGATT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原14型
NO: 14 CTCTCGTCCTTGGTCGTA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原17型
本发明进一步公开了所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测铜绿假单胞菌19个O抗原血清型中至少一种血清型的悬液芯片方面的应用。检测的实验结果显示：该悬液芯片可以完成铜绿假单胞菌19个O抗原血清型中至少一种血清型的检测。例如在进行的82例临床铜绿假单胞菌菌株中，检测出：9株属于O1型；5株属于O2/O16型；3株属于O3型；2株属于O4型；39株属于O6型；1株属于O7/O8型；2株属于O9型；21株属于O11型。本发明公开的致病菌临床检测方法对流行病学监测具有很重要的意义。
本发明更进一步公开了连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：
（1）在铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因内部，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS内部，以及O抗原2型和6型wzy β 基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物个1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；
（2）在铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因内部，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS内部，以及O抗原2型和6型wzy β 基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；
（3）利用步骤（2）特异探针与不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针微球的偶联；
（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；
（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；
（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测。
其中，步骤（1）所述的引物包括SEQ ID NO: 15-42所示的核苷酸序列，各条序列(5'-3')及其对应的作用如下：
P1 （SEQ ID NO: 15）TAGGTAGTTCTGGCGGTGTAG 扩增铜绿假单胞菌O抗原1型wzy基因的上游引物；
P2 （SEQ ID NO: 16）ATTATTATTTTCTTCTCACGCTCT 扩增铜绿假单胞菌O抗原1型wzy基因的下游引物；
P3 （SEQ ID NO: 17）GATGTTGGTGGGCGGTA 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型wzy基因的上游引物；
P4 （SEQ ID NO: 18）AACACCAGAGCCAAGCATT 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型wzy基因的下游引物；
P5 （SEQ ID NO: 19）TTTCAGAGTTGACCGACTACCT 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/16型wzy β 基因的上游引物；
P6 （SEQ ID NO: 20）ATCGCACTCCCGTAACAA 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/16型wzy β 基因的下游引物；
P7 （SEQ ID NO: 21）TATGAGGATGCCTTGACG 扩增铜绿假单胞菌O抗原3型wzy基因的上游引物；
P8 （SEQ ID NO: 22）GACCTTAACATCCCACCG 扩增铜绿假单胞菌O抗原3型wzy基因的下游引物；
P9 （SEQ ID NO: 23）TTGTTGCTGTCATCGGTTC 扩增铜绿假单胞菌O抗原4型wzy基因的上游引物；
P10 （SEQ ID NO: 24）AGCCCAGAAGACCCTAAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原4型wzy基因的下游引物；
P11 （SEQ ID NO: 25）GTGCGGTCCTTGGTTAGC 扩增铜绿假单胞菌O抗原6型wbpP基因的上游引物；
P12 （SEQ ID NO: 26）ACTCTGCACCTTGGCATCT 扩增铜绿假单胞菌O抗原6型wbpP基因的下游引物；
P13 （SEQ ID NO: 27）TGCTGTCATTGCTGCTGC 扩增铜绿假单胞菌O抗原7/8型wzy基因的上游引物
P14 （SEQ ID NO: 28）AGCACAGAAGAGGCTAGCA 扩增铜绿假单胞菌O抗原7/8型wzy基因的下游引物；
P15 （SEQ ID NO: 29）ATTGAGCGGGAATAGCAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原9型wzy基因的上游引物；
P16 （SEQ ID NO: 30）CTCCCTGATTCTCATCCA 扩增铜绿假单胞菌O抗原9型wzy基因的下游引物；
P17 （SEQ ID NO: 31）GGCGGGATGTTAGTTTCG 扩增铜绿假单胞菌O抗原10/19型wzy基因的上游引物；
P18 （SEQ ID NO: 32）GCATTAGCGACTCACCGA 扩增铜绿假单胞菌O抗原10/19型wzy基因的下游引物；
P19 （SEQ ID NO: 33）TGTACTGGCTTCGTTGGG 扩增铜绿假单胞菌O抗原11型wzy基因的上游引物；
P20 （SEQ ID NO: 34）AAGGAATTTATCCGCAGTAGA 扩增铜绿假单胞菌O抗原11型wzy基因的下游引物；
P21 （SEQ ID NO: 35）CGATGTATGTTCGCTCCAA 扩增铜绿假单胞菌O抗原12型wzy基因的上游引物；
P22 （SEQ ID NO:36）GTCTCTATCGGCCACTGTTG 扩增铜绿假单胞菌O抗原12型wzy基因的下游引物；
P23 （SEQ ID NO: 37）GCACCTTTCTTGGCTTATT 扩增铜绿假单胞菌O抗原13型wzy基因的上游引物；
P24 （SEQ ID NO: 38）GAACTGATACCGTCGCTCA 扩增铜绿假单胞菌O抗原13型wzy基因的下游引物；
P25 （SEQ ID NO: 39）TACGGCACCTTTCTTGGC 扩增铜绿假单胞菌O抗原14型wzy基因的上游引物；
P26 （SEQ ID NO: 40）GATACCGCCGCTCAAGAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原14型wzy基因的下游引物；
P27 （SEQ ID NO: 41）AGTCCGTTGATGTTCTCGTT 扩增铜绿假单胞菌O抗原17型插入序列IS的上游引物
P28 （SEQ ID NO: 42）CTACCTGATGCTGGTGAAGAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原17型插入序列IS的下游引物；
本发明公开的用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用所具有的积极效果在于：
（1）本发明首次公开了用于重要院内致病菌-铜绿假单胞菌血清学分子分型的技术手段，填补了利用分子生物学手段进行铜绿假单胞菌血清型分型的技术空白，可用于铜绿假单胞菌不同血清型的临床检测和流行病学监测。
（2）该液相芯片检测体系可在24小时内完成对临床样品的检测，可同时检测19个血清型的铜绿假单胞菌，具有检测时间短和检测通量高的优点。
附图说明
图1为本发明中铜绿假单胞菌各血清型的多重PCR电泳检测图；
图2为本发明中液相芯片对于铜绿假单胞菌各血清型检测的结果输出柱状图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
用于特异性检测的菌株来源
Figure 286097DEST_PATH_IMAGE001
Figure 247099DEST_PATH_IMAGE002
实施例1
铜绿假单胞菌19个O抗原血清型特异引物的设计和制备
（1）选取铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS，以及O抗原2型和6型wzy β 基因为靶基因序列。
（2）将选取的针对不同血清型铜绿假单胞菌的靶基因序列导入引物设计软件Primer Primier 5.0中，设定参数。其中，选择正义链和互补链输出模式；序列扩增长度150-350bp；Haripin：无；Dimer：无：False Priming：无；Cross Dimer：无。运行程序，得到针对每个血清型的正义链和反义链各1对特异引物序列。
（3）将设计好的引物序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，并利用PAGE纯化，备用。其中，反义链引物的合成，需要在DNA序列的5’端连接生物素基团进行标记。
实施例2
铜绿假单胞菌血清型特异探针的设计和制备
（1）选取铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS，以及O抗原2型和6型wzy β 基因为靶基因序列。
（2）将选取的针对铜绿假单胞菌各个血清型的靶基因序列导入引物设计软件Primer Primier 5.0中，设定参数。其中，只选择正义链输出模式；Haripin：无；Dimer：无：False Priming：无；Cross Dimer：无，序列的位置位于实施例1中正义链和反义链引物位置以内。运行程序，得到针对每个血清型的1条特异探针。
（3）将设计好的探针序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，同时在序列的5’末端连接12个碳原子作为连接臂，并在最后1个碳原子末端连接1个氨基基团，利用PAGE纯化，备用。
实施例3
特异探针与微球的偶联（需要避光操作）
（1）涡旋仪上以最高转速悬浮微球30 s，核对微球、探针编号，进行标记。
（2）取80 微升微球于1.5mL离心管中，12000转/分钟，离心2分钟。
（3）弃上清，用10微升浓度为 0.1 mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶液（MES）（pH4.5）重悬，彻底涡旋，使微球分散；
（4）加入2 微升探针(提前置于室温)和6 微升新鲜配制的浓度为10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液（EDC）,混匀，室温黑暗孵育30 分钟（每隔15 min振荡混匀一番）。
（5）再加6 微升新鲜配制的10 mg/mL的EDC溶液混匀，室温黑暗孵育30分钟。
（6）加入1 毫升浓度为0.02%的吐温20溶液（TWEEN-20），混匀，12000转/分钟，离心2分钟。
（7）弃上清，加入1 毫升浓度为 0.1%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS），重悬沉淀40秒，12000转/分钟，离心2分钟。
（8）弃上清，加入25 微升的Tris-EDTA缓冲液（pH8.0），重悬沉淀，高速涡旋30秒，4度并黑暗储存待用。
实施例4
铜绿假单胞菌多重PCR体系的建立
（1）首先利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（产品号DP302），按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取。
（2）取上述基因组DNA提取液0.5微升为模板，加入PCR反应混合液中。PCR反应混合液成分见表1：
表1. PCR反应混合液成分
Figure 754304DEST_PATH_IMAGE003
（3）将反应混合物置于PCR仪（Biometra）中，设定循环参数并运行。循环参数如下：
Figure 357324DEST_PATH_IMAGE004
实施例5
多重PCR产物与探针-微球偶联产物的杂交
（1）将全部准备好的探针-微球偶联产物，最大转速涡旋混匀，每种探针-微球偶联产物取2微升混合，用1.5×TMAC杂交缓冲液稀释250倍，振荡混匀。
（2）取上述探针-微球混合液33微升，加入PCR产物17微升，形成共50微升的杂交反应体系。空白对照则加17 微升的Tris-EDTA缓冲液（pH8.0）代替PCR产物。
（3）将上述杂交反应体系置于PCR仪中，设定反应参数并运行。反应参数如下：
Figure 531953DEST_PATH_IMAGE005
实施例6
杂交产物的洗涤与染色
（1）将PCR管中的杂交产物转移到96孔板中，12000转/分钟，离心1分钟，加入70 微升的1×TMAC缓冲液洗涤2次，每次洗涤后12000转/分钟，离心1分钟。
（2）利用1×TMAC缓冲液将Streptavidin-PE荧光素稀释250倍，每孔中加入80 微升稀释后的荧光素溶液。
（3）将96孔板置于杂交炉中，55℃，500 转/分钟，震荡反应30分钟。
实施例7
杂交产物的上机检测（利用Bio-Plex 200悬液芯片系统）
（1）打开仪器电源和连接电脑的电源，点击电脑桌面的Bio-Plex Manager按钮，进入软件界面。
（2）在仪器配套的MCV板中加入ddH2O和70%异丙醇溶液，置于机器中后，点击软件界面的Start up按钮，后根据界面提示点击Warm up按钮进行预热，一般预热30分钟。
（3）预热结束后，在MCV板中加入编号为CAL1和CAL2的校正液，点击Calibrate按钮，进行仪器的校正。其中CAL1和CAL2校正液在加入前需恢复至室温，并斡旋混合30秒以上。
（4）校正完成后，点击工具栏的New按钮，打开方法编辑Protocol窗口，按照提示填入微球编号和对应的探针编号。编辑结束后，点击Format Plate按钮，按照96孔板的加样顺序依次设定检测背景（B）和待检样本（X）的检测位置。取出仪器中的MCV板，加入盛有样品的96孔板，点击run Protocol按钮开始检测。
（5）上述程序完成后，根据软件界面提示，保存数据为Excel表格，用于后续分析。
点击工具栏的Shut down按钮，按照屏幕提示进行操作，提示结束后先关闭电脑的Bio-Plex Manager程序，再关闭机器电源和电脑电源。检测结果表明：本发明的液相芯片可以实现对19个铜绿假单胞菌O抗原血清型中至少一种血清型的检测。
实施例8
用于检测铜绿假单胞菌血清型的液相芯片在临床检测上使用情况及结果：
（1）收集了血清型未知的铜绿假单胞菌临床分离株共82株。
（2）将上述临床分离株，分别于LB培养基37度过夜培养8小时。
（3）利用天根生化科技（北京）有限公司的基因组DNA提取试剂盒，按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取。
（4）按照实施例3的步骤进行特异探针和微球的偶联，以及按照实施例4的步骤进行多重PCR，后分别按照实施例5、6、7的步骤进行多重PCR产物与探针-微球偶联产物的杂交、杂交产物的洗涤与染色以及利用Bio-Plex 200悬液芯片系统对杂交产物进行检测。
（5）检测结果表明，在82例临床铜绿假单胞菌菌株中，9株属于O1型；5株属于O2/O16型；3株属于O3型；2株属于O4型；39株属于O6型；1株属于O7/O8型；2株属于O9型；21株属于O11型。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcttatgcc ggtggtaa 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcagtccctg ctaactgta 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgctgcttt cggttgtt 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggctctatc aggaactctt act 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttttggattt tctgccgggg cg 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgctgattgc agccagag 18
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atattttatt ctcgtggggt tct 23
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggatacccgg tcacgct 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttgatgata aatcggctca 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cacatgcaag tgctcgtt 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgggatacct tctcctgac 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
catgttgggt tttttgatt 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cacgttgggt ttttgatt 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctctcgtcct tggtcgta 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
taggtagttc tggcggtgta g 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
attattattt tcttctcacg ctct 24
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gatgttggtg ggcggta 17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacaccagag ccaagcatt 19
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tttcagagtt gaccgactac ct 22
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atcgcactcc cgtaacaa 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tatgaggatg ccttgacg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gaccttaaca tcccaccg 18
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttgttgctgt catcggttc 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agcccagaag accctaat 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtgcggtcct tggttagc 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
actctgcacc ttggcatct 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgctgtcatt gctgctgc 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
agcacagaag aggctagca 19
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
attgagcggg aatagcat 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ctccctgatt ctcatcca 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ggcgggatgt tagtttcg 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gcattagcga ctcaccga 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgtactggct tcgttggg 18
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aaggaattta tccgcagtag a 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cgatgtatgt tcgctccaa 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtctctatcg gccactgttg 20
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gcacctttct tggcttatt 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gaactgatac cgtcgctca 19
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tacggcacct ttcttggc 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gataccgccg ctcaagat 18
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
agtccgttga tgttctcgtt 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ctacctgatg ctggtgaaga t 21

Claims (3)

1.连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸序列包括下述DNA片段：
（1）铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因中选取的一种DNA片段；
（2）铜绿假单胞菌O抗原6型的wbpP基因中选取的一种DNA片段；
（3）铜绿假单胞菌O抗原17型的插入序列IS中选取的一种DNA片段
（4）铜绿假单胞菌O抗原2型和6型wzy β 基因中选取的一种DNA片段
上述的寡核苷酸DNA片段为SEQ ID NO: 1-14所示的核苷酸序列如下：
SEQ ID (5'-3')
NO: 1 GGCTTATGCCGGTGGTAA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原1型
NO: 2 GCAGTCCCTGCTAACTGTA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型
NO: 3 TTGCTGCTTTCGGTTGTT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原2/16型
NO: 4 GGGCTCTATCAGGAACTCTTACT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原3型
NO: 5 TTTTGGATTTTCTGCCGGGGCG 用于检测铜绿假单胞菌O抗原4型
NO: 6 TGCTGATTGCAGCCAGAG 用于检测铜绿假单胞菌O抗原6型
NO: 7 ATATTTTATTCTCGTGGGGTTCT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原7/8型
NO: 8 GGATACCCGGTCACGCT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原9型
NO: 9 TTTGATGATAAATCGGCTCA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原10/19型
NO: 10 CACATGCAAGTGCTCGTT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原11型
NO: 11 TGGGATACCTTCTCCTGAC 用于检测铜绿假单胞菌O抗原12型
NO: 12 CATGTTGGGTTTTTTGATT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原13型
NO: 13 CACGTTGGGTTTTTGATT 用于检测铜绿假单胞菌O抗原14型
NO: 14 CTCTCGTCCTTGGTCGTA 用于检测铜绿假单胞菌O抗原17型。
2.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测铜绿假单胞菌O抗原19个血清型中至少一种血清型方面的应用。
3.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：
（1）在铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因内部，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS内部，以及O抗原2型和6型wzy β 基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物各1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；
（2）在铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因内部，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS内部，以及O抗原2型和6型wzy β 基因内部设计并制备用DNA探针， 每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；
（3）利用步骤（2）特异探针与不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针微球的偶联；
（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；
（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；
（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测；
其中，步骤（1）所述的引物包括SEQ ID NO: 15-42所示的核苷酸序列，各条序列(5'-3')如下：
P1 （SEQ ID NO: 15）TAGGTAGTTCTGGCGGTGTAG 扩增铜绿假单胞菌O抗原1型wzy基因的上游引物；
P2 （SEQ ID NO: 16）ATTATTATTTTCTTCTCACGCTCT 扩增铜绿假单胞菌O抗原1型wzy基因的下游引物；
P3 （SEQ ID NO: 17）GATGTTGGTGGGCGGTA 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型wzy基因的上游引物；
P4 （SEQ ID NO: 18）AACACCAGAGCCAAGCATT 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型wzy基因的下游引物；
P5 （SEQ ID NO: 19）TTTCAGAGTTGACCGACTACCT 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/16型wzy β 基因的上游引物；
P6 （SEQ ID NO: 20）ATCGCACTCCCGTAACAA 扩增铜绿假单胞菌O抗原2/16型wzy β 基因的下游引物；
P7 （SEQ ID NO: 21）TATGAGGATGCCTTGACG 扩增铜绿假单胞菌O抗原3型wzy基因的上游引物；
P8 （SEQ ID NO: 22）GACCTTAACATCCCACCG 扩增铜绿假单胞菌O抗原3型wzy基因的下游引物；
P9 （SEQ ID NO: 23）TTGTTGCTGTCATCGGTTC 扩增铜绿假单胞菌O抗原4型wzy基因的上游引物；
P10 （SEQ ID NO: 24）AGCCCAGAAGACCCTAAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原4型wzy基因的下游引物；
P11 （SEQ ID NO: 25）GTGCGGTCCTTGGTTAGC 扩增铜绿假单胞菌O抗原6型wbpP基因的上游引物
P12 （SEQ ID NO: 26）ACTCTGCACCTTGGCATCT 扩增铜绿假单胞菌O抗原6型wbpP基因的下游引物；
P13 （SEQ ID NO: 27）TGCTGTCATTGCTGCTGC 扩增铜绿假单胞菌O抗原7/8型wzy基因的上游引物；
P14 （SEQ ID NO: 28）AGCACAGAAGAGGCTAGCA 扩增铜绿假单胞菌O抗原7/8型wzy基因的下游引物
P15 （SEQ ID NO: 29）ATTGAGCGGGAATAGCAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原9型wzy基因的上游引物
P16 （SEQ ID NO: 30）CTCCCTGATTCTCATCCA 扩增铜绿假单胞菌O抗原9型wzy基因的下游引物；
P17 （SEQ ID NO: 31）GGCGGGATGTTAGTTTCG 扩增铜绿假单胞菌O抗原10/19型wzy基因的上游引物；
P18 （SEQ ID NO: 32）GCATTAGCGACTCACCGA 扩增铜绿假单胞菌O抗原10/19型wzy基因的下游引物；
P19 （SEQ ID NO: 33）TGTACTGGCTTCGTTGGG 扩增铜绿假单胞菌O抗原11型wzy基因的上游引物；
P20 （SEQ ID NO: 34）AAGGAATTTATCCGCAGTAGA 扩增铜绿假单胞菌O抗原11型wzy基因的下游引物；
P21 （SEQ ID NO: 35）CGATGTATGTTCGCTCCAA 扩增铜绿假单胞菌O抗原12型wzy基因的上游引物；
P22 （SEQ ID NO:36）GTCTCTATCGGCCACTGTTG 扩增铜绿假单胞菌O抗原12型wzy基因的下游引物；
P23 （SEQ ID NO: 37）GCACCTTTCTTGGCTTATT 扩增铜绿假单胞菌O抗原13型wzy基因的上游引物；
P24 （SEQ ID NO: 38）GAACTGATACCGTCGCTCA 扩增铜绿假单胞菌O抗原13型wzy基因的下游引物；
P25 （SEQ ID NO: 39）TACGGCACCTTTCTTGGC 扩增铜绿假单胞菌O抗原14型wzy基因的上游引物；
P26 （SEQ ID NO: 40）GATACCGCCGCTCAAGAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原14型wzy基因的下游引物；
P27 （SEQ ID NO: 41）AGTCCGTTGATGTTCTCGTT 扩增铜绿假单胞菌O抗原17型插入序列IS的上游引物；
P28 （SEQ ID NO: 42）CTACCTGATGCTGGTGAAGAT 扩增铜绿假单胞菌O抗原17型插入序列IS的下游引物。
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