CN114196768A

CN114196768A - 用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法

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Publication number: CN114196768A
Application number: CN202111560716.3A
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 王楚芳; 叶青华; 杨宁; 陈惠元; 刘振杰; 张菊梅; 吴诗; 王涓; 丁郁; 薛亮; 陈谋通; 庞锐
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114196768B; CN117344036A; CN117344037A; CN117165703A; CN117210592A; CN117165702A; CN117286270A

Abstract

本发明公开了用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性新分子靶标及其快速检测方法，属于基因检测领域。本发明的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7任一项所示。本发明的检测方法具有检测时间短、检测成本低、操作简单、特异性强的优点，无需铜绿假单胞菌诊断血清即可检测出目标血清群铜绿假单胞菌菌株，更加具有实用性。

Description

用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种普遍存在的非发酵革兰氏阴性细菌，也是一种条件性病原体，可感染患有各种疾病的患者，包括癌症、艾滋病、严重烧伤创面、手术后创面和囊性纤维化，我国疾控中心已将其列为水源性重要致病菌。铜绿假单胞菌不同血清群的菌株已经被广泛的表征，不同血清群的铜绿假单胞菌与菌株毒力、致病性、临床致死率和成膜能力以及耐药都相关，对铜绿假单胞菌的血清分型诊断有对流行病学观察和临床用药等方面具有重要意义。

日本生研所生产的分型血清试剂盒在铜绿假单胞菌感染的流行病学调查现在比较常用。该血清分型有3个群即多价血清I群、Ⅱ群和Ⅲ群，再细分为A～N 14种单价血清群，主要用于铜绿假单胞菌的流行病学调查。多价血清I群(包括单价血清A、C、H、I、L群)主要分布于食品和自然环境中，其中A群是鲜奶中常见的血清菌株，多价血清Ⅱ群(包括单价B、J、K、M群)主要分布于临床菌株中，冯永军等人发现100个医院样本分离株中B群菌株占据了50％，多价血清Ⅲ群(包含单价D、E、F、G、N)是最为常见的血清群，主要来源于主要来自动物出血性肺炎和动物食品。在水貂出血性肺炎病原PA的血清群种类中流行血清群最多的为G群。

铜绿假单胞菌耐药、毒力、流行病学暴发与血清群直接相关，其中G(O抗原6型)、E(O抗原11型)血清群是引起人类医院流行病学暴发的主要血清群，E群也是高毒力血清群之一。血清玻片凝集法是铜绿假单胞菌血清分型的“金标准”，但存在不足之处，如诊断血清质量要求高，成本昂贵，且如果血清凝集反应迟缓或特异性差，容易对结果误判。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统血清分型方法最具潜力的检测技术之一。目前，针对铜绿假单胞菌血清群检测的快速检测方法研究也有报导，但是数量不多。基于开放阅读框铜绿假单胞菌I群特异性基因LMG 14071；E群特异性基因LMG14079；G群特异性基因CIP 59.39；B群特异性基因LMG 14072、LMG 14075、LMG 14083；O抗原乙酰基特异性基因。上述基于现有的特异性基因是对开放阅读框的比对筛选之后获得，而针对全基因组数据建立的血清群PCR和qPCR检测靶标及引物的研究报道几乎没有。经对现有技术的文献检索，尚未发现与本发明的7个单铜绿假单胞菌常见血清群特异性新分子靶标及相应的PCR和qPCR检测方法报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法。本发明的检测方法具有检测时间短、检测成本低、操作简单、特异性强的优点，无需铜绿假单胞菌诊断血清即可检测出目标血清群铜绿假单胞菌菌株，更加具有实用性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一组用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标，所述特异性新分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一项所示。

泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics AnalysisPipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。提取目标血清群铜绿假单胞菌菌株特有的非核心基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对铜绿假单胞菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除能比对到已知的目标血清群铜绿假单胞菌蛋白的序列，剩下的则为目标血清群铜绿假单胞菌菌株新获得的特有基因。本申请发明人通过大量的筛选和设计验证，最终得到上述特异性分子靶标。本发明的特异性分子靶标对铜绿假单胞菌对应血清群覆盖率为100％且具有很好的特异性，在铜绿假单胞菌其他血清群和非铜绿假单胞菌菌株中不存。

本发明还提供用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的引物组，所述引物组用于检测SEQID NO.1～SEQ ID NO.7任一项所述特异性分子靶标；其中，用于检测SEQ ID NO.1所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；用于检测SEQ ID NO.2所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.3所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；用于检测SEQ ID NO.4所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；用于检测SEQ ID NO.5所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.6所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；用于检测SEQ IDNO.7所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。

本发明还提供用于鉴定铜绿假单胞菌血清群的引物组，所述引物组用于检测SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7任一项所述特异性分子靶标；其中，用于检测SEQ ID NO.2所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；用于检测SEQ ID NO.3所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；用于检测SEQ ID NO.5所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；用于检测SEQ ID NO.7所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示。

本发明根据所筛选设计得到的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标设计了一系列的引物组，经过大量的筛选和验证发现，最终得到的引物组用于铜绿假单胞菌血清群鉴别时具有很好的特异性，其对铜绿假单胞菌覆盖率为100％，克服了现有铜绿假单胞菌血清群鉴定靶标存在的在非铜绿假单胞菌菌株也能检出的缺点。

本发明还提供一种用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法，包括以下步骤：

(1)使用上述任一项所述引物组中的至少一组对待测样品DNA进行PCR扩增；

(2)采用进行凝胶电泳检测扩增产物；

(3)分析判断扩增产物是否含目标菌。

本发明的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法通过对7个铜绿假单胞菌常见血清群特异性分子靶标的保守序列设计扩增引物，并通过对样品进行扩增，采用凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果出现相应的单一扩增条带，则判断样品中含有对应的目标血清群铜绿假单胞菌，如没有出现相应的单一条带，则判断样品中不含目标菌。

作为本发明所述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的PCR扩增的反应体系包括：10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl2 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μmol/L引物对1.0μL、Tag酶1U、DNA模板1-2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述PCR反应条件为：98℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸60s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

本发明还提供一种用于定量检测铜绿假单胞菌主要血清群的方法，所述方法采用述引物组中的至少一组对待测样品DNA进行qPCR扩增并分析扩增结果。

本发明的用于定量检测铜绿假单胞菌主要血清群的方法采用qPCR检测方法，根据铜绿假单胞菌常见血清群特异性分子靶标保守序列SEQ ID NO.2设计多价血清II群的引物、根据SEQ ID NO.3设计多价血清III群的引物、根据SEQ ID NO.5设计单价血清E群的引物、根据SEQ ID NO.7设计单价血清G群的引物，并通过荧光定量扩增仪进行扩增。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果扩增结果产生荧光信号，说明样品中含有目标血清群铜绿假单胞菌；如果不产生荧光信号，则样品中不含有目标血清群铜绿假单胞菌。

作为本发明所述的用于定量检测铜绿假单胞菌血清群的方法的优选实施方式，所述qPCR扩增的扩增体系包括2×TB GreenPremix反应液10μL，模板DNA100ng，10μmol/L引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL；所述qPCR扩增的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行45个循环。

本发明还提供上述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标或所述的引物组在鉴别铜绿假单胞菌血清群中的应用。

本发明还提供上述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标或所述的引物组在定量检测铜绿假单胞菌血清群中的应用。

本发明还提供一种用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

本发明的有益效果：(1)本发明首次使用泛基因组方法学获得铜绿假单胞菌主要血清群靶标，所述的基于铜绿假单胞菌血清群的特异性靶标建立的方法能够快速准确的鉴定铜绿假单胞菌主要血清群，包括多价血清II群、III群和单价血清E群和G群；(2)本发明的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群特异性新分子靶标及其对应的PCR和qPCR引物对铜绿假单胞菌对应血清群覆盖率为100％；(3)本发明的用于定量检测铜绿假单胞菌血清群的方法线性理想，对纯菌的检出限最低可为10¹CFU/mL，本发明建立的检测方法灵敏度好，与现有文献报导方法相当或者能优于1～3个数量级，且本发明建立的方法抗干扰能力强，在大肠菌群浓度达到10⁸CFU/mL时，对铜绿假单胞菌血清群的检测也不形成干扰；(4)本发明的方法整个检测过程大约需要15小时左右，而传统方法大约需要3～5天才能完成，本发明所述的检测方法大大节省了检测时间，提高了检测时效。

附图说明

图1为铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群PCR检测方法特异性评价电泳结果；

图2为铜绿假单胞菌多价血清Ⅲ群PCR检测方法特异性评价电泳结果；

图3为铜绿假单胞菌单价血清E群PCR检测方法特异性评价电泳结果；

图4为铜绿假单胞菌单价血清G群PCR检测方法特异性评价电泳结果；

图5为铜绿假单胞菌多价血清II群qPCR鉴定方法特异性评价结果示意图；

图6为铜绿假单胞菌多价血清II群纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图7为铜绿假单胞菌多价血清II群纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图8为铜绿假单胞菌多价血清III群qPCR鉴定方法特异性评价结果示意图；

图9为铜绿假单胞菌多价血清III群纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图10为人工污染样本铜绿假单胞菌多价血清III群qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图11为铜绿假单胞菌单价血清E群(与其铜绿假单胞菌他血清群之间比较)的qPCR鉴定方法特异性评价结果示意图；

图12为铜绿假单胞菌单价血清E群纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图13为人工污染样本铜绿假单胞菌单价血清E群qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图14为铜绿假单胞菌单价血清G群的qPCR鉴定方法特异性评价结果示意图；

图15为铜绿假单胞菌单价血清G群纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意图；

图16为人工污染样本铜绿假单胞菌单价血清G群qPCR定量检测方法建立的结果示意图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1铜绿假单胞菌血清群特异性分子靶标的设计筛选

根据GenBank数据库及本团队自测的不同血清群铜绿假单胞菌全基因组DNA序列，通过比较基因组学分析，主要根据铜绿假单胞菌的泛基因组分析结果获得铜绿假单胞菌常见血清群菌株特有的非必需基因。采用原核生物泛基因组自动化分析软件PGAP中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息，并筛选出铜绿假单胞菌常见血清群的特异性基因片段。提取目标血清群铜绿假单胞菌菌株特有的7个特异性基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回铜绿假单胞菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除能比对到已知的目标血清群铜绿假单胞菌蛋白的序列，剩下的则为目标血清群铜绿假单胞菌菌株新获得的特有的基因。通过大量的筛选和设计验证，最终得到的铜绿假单胞菌常见血清群特异性分子靶标，所述的分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示。

实施例2铜绿假单胞菌多价血清特异性分子靶标PCR快速检测方法的建立

本实施例提供了铜绿假单胞菌多价血清特异性分子靶标PCR快速检测方法的建立，分别根据铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群、Ⅲ群、E群和G群的特异性新分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：分别根据实施例1所述的特异性分子靶标核苷酸序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7设计特异性扩增引物，引物序列表1所示。

(2)DNA模板制备：分别将铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群、Ⅲ群、E群和G群菌株在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

(3)PCR检测体系及扩增程序：分别使用所述引物1～7对待测样品DNA进行扩增。a.PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl2 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μmol/L引物组1.0μL、Tag酶1U、DNA模板1-2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；b.PCR检测条件为：98℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

(4)凝胶电泳检测扩增产物。

(5)结果分析：a.如电泳结果扩增产物分别在113bp、273bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群菌株。b.如电泳结果扩增产物分别在110bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有铜绿假单胞菌多价血清Ⅲ群菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有铜绿假单胞菌多价血清Ⅲ群菌株。c.如电泳结果扩增产物分别在313bp、110bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有铜绿假单胞菌多价血清E群菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有铜绿假单胞菌多价血清E群菌株。d.如电泳结果扩增产物分别在298bp、229bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有铜绿假单胞菌多价血清G群菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有铜绿假单胞菌多价血清G群菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

分别对上述铜绿假单胞菌多价血清特异性分子靶标PCR快速检测方法的特异性进行评价。

实验方法：

(1)分别取15株铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群(包括单价血清群B、J、K、M)、12株多价血清I群(包括单价群A、C、H、I、L)、12株多价血清Ⅲ群(包括单价群D、E、F、G、N)共39株铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌等32株非铜绿假单胞菌按照上述方法进行PCR检测。

(2)分别取31株铜绿假单胞菌多价血清Ⅲ群(包括单价群D、E、F、G、N)，10株铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群(包括单价血清群B、J、K、M)、12株铜绿假单胞菌多价血清I群(包括单价群A、C、H、I、L)共53株铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌等32株非铜绿假单胞菌按照上述方法进行PCR检测。

(3)分别取10株铜绿假单胞菌单价血清E群为目标菌、单价血清群A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、混合Ⅰ群未分型、混合Ⅱ群未分型等菌株为非目标血清群铜绿假单胞菌共计38株铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌等32株非铜绿假单胞菌菌按照上述方法进行PCR检测。

(4)分别取15株铜绿假单胞菌单价血清G群为目标菌、单价血清群A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、混合Ⅰ群未分型、混合Ⅱ群未分型等菌株为非目标血清群铜绿假单胞菌共计45株铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌等32株非铜绿假单胞菌菌按照上述方法进行PCR检测。

实验结果：

(1)结果如图1所示，该检测方法只有铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表2所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

(2)结果如图2所示，该检测方法只有铜绿假单胞菌多价血清群Ⅲ显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表3所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

(3)结果如图3所示，SEQ ID NO.4序列建立的检测方法只有铜绿假单胞菌单价血清E群显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌菌株均无特异性条带；SEQ ID NO.5序列建立的检测方法在铜绿假单胞菌单价血清E群显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌菌株均无特异性条带，在除铜绿假单胞菌非目标菌中的偶见对其他菌的扩增，该方法适用于在鉴定到菌种后进行血清分型的鉴别。所用菌株及检测结果如下表4所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

(4)结果如图4所示，该检测方法均只有铜绿假单胞菌单价血清G群显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表5所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表1铜绿假单胞菌多价血清特异性PCR检测引物序列

表2铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群特异性评价PCR试验结果

表3铜绿假单胞菌混合Ⅲ群特异性评价PCR试验结果

表4铜绿假单胞菌单价血清E群特异性评价PCR试验结果

表5铜绿假单胞菌单价血清G群特异性评价PCR试验结果

实施例3鉴定铜绿假单胞菌多价血清群的qPCR定量检测方法

本实施例提供鉴定铜绿假单胞菌多价血清II群、III群、E群和G群的qPCR定量检测方法，包括以下步骤：

(1)引物设计:分别根据实施例1中的所述序列SEQID NO.2、SEQID NO.3、SEQIDNO.5和SEQID NO.7设计特异性qPCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序如表6所示。

(2)DNA模板制备：将铜绿假单胞菌多价血清II群、III群、E群和G群菌株在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

(3)qPCR扩增：分别使用所述的引物组8～11对待测样品DNA进行qPCR扩增。取qPCR扩增体系于RocheLightCycler 96荧光定量扩增仪上进行；a.qPCR扩增体系：2×TBGreenPremix 10μL，引物(10μmol/L)1μL+1μL，模板DNA 100ng，灭菌双蒸水补足体积至20μL；b.qPCR扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行45个循环。

(4)利用软件LightCycler 96SW1.1分析扩增结果是否符合预期。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有相应多价血清群的铜绿假单胞菌；如果不产生荧光信号，则样品中不含有多价血清群铜绿假单胞菌。

qPCR检测方法的特异性评价结果

实验方法：

(1)分别取15株铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群(包括单价血清群B、J、K、M)、12株多价血清I群(包括单价群A、C、H、I、L)、12株多价血清Ⅲ群(包括单价群D、E、F、G、N)共39株铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌等32株非铜绿假单胞菌按照上述方法进行qPCR检测。

(2)分别取31株铜绿假单胞菌多价血清Ⅲ群(包括单价群D、E、F、G、N)，10株铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群(包括单价血清群B、J、K、M)、12株铜绿假单胞菌多价血清I群(包括单价群A、C、H、I、L)共53株铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌等32株非铜绿假单胞菌按照上述方法进行qPCR检测。

实验结果：

(1)结果如图5所示，该检测方法只有铜绿假单胞菌多价血清Ⅱ群产生荧光信号，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌株均无对应的荧光信号。所用菌株及检测结果如下表7所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

(2)结果如图8所示，该检测方法只有铜绿假单胞菌多价血清群Ⅲ菌株产生荧光信号，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌株均无荧光信号。所用菌株及检测结果如下表8所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

(3)SEQID NO.5序列建立的检测方法在铜绿假单胞菌单价血清E群显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌菌株均无特异性条带，在除铜绿假单胞菌非目标菌中的偶见对其他菌的扩增，结果如图11所示，该方法适用于在鉴定到菌种后进行血清分型的鉴别。所用菌株及检测结果如下表9所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

(4)结果如图3所示，该检测方法均只有铜绿假单胞菌单价血清G群显示出特异性扩增条带，其他血清群铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表10所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表6铜绿假单胞菌多价血清II群特异性qPCR检测引物序列

表7铜绿假单胞菌多价血清II群特异性评价qPCR试验结果

表8铜绿假单胞菌多价血清III群特异性评价qPCR试验结果

表9铜绿假单胞菌单价血清E群特异性评价qPCR试验结果

表10铜绿假单胞菌单价血清G群特异性评价qPCR试验结果

实施例4铜绿假单胞菌多价血清群纯培养液qPCR定量检测方法灵敏度评价

实验方法：分别使用传统血清鉴定方法鉴定为多价血清II群、III群、E群和G群的铜绿假单胞菌分离株PA17C85、PA17C105、PA17C67和PA206052将培养至浓度为10⁸CFU/mL，使用0.85％的无菌生理盐水按照10倍梯度稀释，得浓度为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸，10⁹CFU/mL的菌株纯培养物，按照实施例3进行DNA模板的提取，即分别为铜绿假单胞菌多价血清II群、III群、E群和G群qPCR的检测标准品，按照实施例3进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。绘制标准曲线：以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为铜绿假单胞菌的标准曲线。

实验结果：

(1)标准曲线如图6所示，引物组8对纯菌的检测限为10³CFU/mL，所述铜绿假单胞菌多价血清II群的拟合标准曲线为y＝-3.0183x+44.393，相关系数R2＝0.9903。

(2)标准曲线如图9所示，引物组9检测限为10¹CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-2.6719x+42.047，相关系数R2＝0.9933。

(3)标准曲线如图12所示，引物组10对纯培养液的检测限为10²CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-3.3684x+53.696，相关系数R2＝0.9909。

(4)标准曲线如图15所示，引物组11对纯培养液的检测限为10²CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-2.79x+45.188，相关系数R2＝0.9922。

实施例5人工加标样本铜绿假单胞菌多价血清qPCR定量检测方法灵敏度评价

实验方法：对瓶装矿泉水成品水灭菌制备无菌样品，经NA营养琼脂平板培养后结果显示处理后的样品中无微生物存在，保证后续实验样品中的微生物均来源于人工污染。NA计数平板结果显示人工污染样品的铜绿假单胞菌初始菌液浓度为7.3×10⁹CFU/mL。使用0.85％的无菌生理盐水对人工污染样品的均质液进行10倍梯度稀释，以制备含铜绿假单胞菌菌浓度为10¹CFU/mL～10⁹CFU/mL的人工污染模拟样品。以各梯度均质液中提取的细菌基因组DNA为模板，以无菌蒸馏水为空白对照，按照实施例3进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。按照实例2中曲线拟合方式建立对应的人工加标样本标准曲线。

实验结果：

(1)标准曲线如图7所示，引物组8对人工污染样本的检测限为8.5×10⁴CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-1.795x+38.229，相关系数R2为0.9903。

(2)标准曲线如图10所示，引物组9对人工污染样品的检测限为8.7×10²CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-2.7903x+45.75，相关系数R2为0.9905。

(3)标准曲线如图13所示，引物组10对人工污染样品的检测限为1.56×10³CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-1.396x+39.605，相关系数R2为0.9807。

(4)标准曲线如图16所示，引物组11对人工污染样品的检测限为8.9×10³CFU/mL，所述铜绿假单胞菌的拟合标准曲线为y＝-3.0815x+49.582，相关系数R2为0.9887。

实施例5铜绿假单胞菌常见血清群疑似菌株的检测

利用实施例2～3中的铜绿假单胞菌常见血清群PCR和qPCR检测方法对37个水样进行全菌检测，水样样品来源于珠江水源以及本实验室网管水，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法。利用本发明方法，目标血清群铜绿假单胞菌检出菌株数分别如下表11所示：铜绿假单胞多价血清Ⅱ群共3株、铜绿假单胞多价血清Ⅲ群共7株、铜绿假单胞单价血清E群共3株(在细菌鉴定到属于铜绿假单胞菌之后再进行鉴定)、铜绿假单胞单价血清G群共3株，经铜绿假单胞菌传统方法诊断血清鉴定是目标血清群铜绿假单胞菌(表)。通过本实施例说明本发明的铜绿假单胞菌常见血清群的7种PCR和4种qPCR检测方法可靠性高。

表11铜绿假单胞菌常见血清群特异性靶标与传统血清分型以及现有靶标对实际水样检测的结果对比

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东环凯生物科技有限公司

<120> 用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法

<130>

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1121

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgactaaag ttgctcattt gacatcggtt cactcgcgtt atgatattcg tatatttcga 60

aagcagtgta gaacactctc tcaatacgga tacgatgtgt atctggttgt cgcagatggt 120

aagggtgatg aagtcaagga tggtgtaagg attgttgatg tcggagtact ctcaggtcgc 180

ttgagtcgta ttctaaaaac cacccgaaaa atttatgaac aggctttggc gcttggggct 240

gatgtctatc attttcatga tcccgaactg atacctgttg gtcttcgact gaaaaagcaa 300

ggtaagcagg ttatcttcga ctcccatgag gatgtgccga agcaactgct gagtaaacct 360

tacatgcgac cgtttttacg ccgtgtagtg gctgtgttat tttcctgcta tgagaaatat 420

gcatgcccta agctggatgc agtccttacg gcaacgccgc atattcgtga aaaatttaaa 480

aatattaatg ggaatgttct agatattaat aactttccca tgttgggtga gttggatgcg 540

atggttcctt gggcaagcaa gaaaactgaa gtctgctacg tcggtggtat cacttccatt 600

cgtggtgttc gtgaagtcgt taagagtctt gagtgcttga agtcctcggc gcgcttgaat 660

ttagtgggaa agttttcaga gccagagata gaaaaagaag tcagagcgct caagggatgg 720

aactccgtta acgaacatgg tcagcttgat cgagaagatg ttcgtcgtgt actcggtgac 780

tctgttgccg ggttggtgac atttctccca atgcctaatc atgttgatgc acaacctaat 840

aagatgttcg agtatatgtc gtcgggaatc cctgtgatcg cttccaattt tcctctctgg 900

cgggaaattg ttgaaggtag caattgtggt atatgcgtag atcctctaag tcctgctgcc 960

attgctgaag cgatcgacta tctggtaagt aatccgtgtg aggcggcagc gctgggacgt 1020

aatggccagc gggcagtgaa cgaacgttat aactgggatt tggaagggcg caaactagcg 1080

cggttctatt ccgatctact gagtaagcga gattccatat g 1121

<210> 2

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgactgacg aaatacaaaa gcacggcggt gtagctggcg atatcgatct ggttgagctg 60

gttcgaggat tatgggagga gaagtggata gttcttatat tttctttgct aggtattttg 120

tttgcagcta tctacgcttt tctcagtact cctgtctatg aggcccgcat agcgattttg 180

cctccgtcgt tgagtgatgt ggcaggtttc aatcagggac gtaccaggga aaccgggctt 240

ggtcccttca aggtccagga tgtgtactct gtttttgttc gcaacctgca ggctgatgga 300

actcgtcatc gttttttcaa tgagacctat ttgccttctt tggatgaaga gcttcgttcg 360

gtttcgcgtg atgcgctcta taaaaggttc actgatcaga taagtattag tttgccgggg 420

aaagactttc cgggtcgtta tcttgttgcg attgaacagg aggatccgga gcgtgcggcg 480

agttgggttc gtcggtatat agctgatgcg gccgagattt ctattcagga aatgttgaac 540

aatgcgcatc gcgagattga ggtcaaggct cgagatattg agcagcgcat acagaacttg 600

cgagagaatg ccaaggcaag acgtgaagat cgtattgttc agctcaagga ggcgttgaag 660

gtcgcgggtg cgctgaaatt ggaggagcct ccactgatca gtgggcaatc ctctgaggag 720

ctctcggcta tcatgaatgg aagtctgatg tatatgcgtg gcagtaaggc gattatggcc 780

gagattcaga cattggaggc gcgtagctct gatgatcctt ttattccggc gttgcgtact 840

cttcaggagc agcagttatt gctgagtagc ttgcgtgtta attcggagcg ggtttctgtt 900

tttcgacaag acggtccgat agaaacgccg gactcaccag ttcgtccaag gagagcgatg 960

attttgattt ttgggttgat aattggtggt gtgcttggtg gttttctggc gttgtgccgg 1020

atttttttga agaagtatgc tcgttag 1047

<210> 3

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggccttga ccgtcaacac caacatcgct tcgctgaaca ctcagcggaa cctgaacaac 60

tcttccgcgt cgctgaacac ttcgctgcag cgtctgtcca ccggttcgcg catcaacagc 120

gccaaggacg acgccgccgg cctgcagatc gccaaccgtc tgaccagcca ggtcaacggc 180

ctgaacgtgg ctaccaagaa cgccaacgac ggtatctccc tggcgcagac cgctgaaggc 240

gccctgcagc agtcgaccaa catcctgcag cgtatgcgtg acctgtccct gcagtcggcc 300

aacggctcca acagcgactc cgagcgtacc gctctgaacg gcgaagtgaa gcaactgcag 360

aaagaactgg atcgtatcag caacaccacc accttcggtg gccgcaagct gctcgacggt 420

tccttcggcg tcgccagctt ccaggtgggt tcggccgcca acgaaatcat cagcgtcggc 480

atcgacgaga tgagcgcaga gtcgctgaac ggcacctact tcaaggctga cggcggcggc 540

gcggtcactg ctgcaaccgc ttcgggcacc gtcgacatcg cgatcggcat caccggcggc 600

agcgccgtga acgtcaaggt cgacatgaag ggcaacgaaa ccgccgagca ggcggctgcc 660

aagatcgccg ctgcggtcaa cgacgccaac gtcggcatcg gtgccttcag cgacggcgat 720

accatcagct atgtttccaa agctggcaag gatggctccg gtgcgatcac tagcgcggtt 780

tccggcgttg tcatcgctga caccggcagc accggcgtag gcaccgcggc tggcgtaacc 840

ccttccgcta ccgctttcgc caagaccaac gacaccgtcg ccaagatcga catctccacc 900

gcgaagggcg ctcagtccgc cgtgctggtg atcgacgagg cgatcaagca gatcgacgcc 960

cagcgtgccg acctcggtgc ggtgcagaac cgcttcgaca acaccatcaa caacctgaag 1020

aacatcggtg agaacgtatc ggctgctcgc ggccggatcg aagacaccga cttcgcagcc 1080

gaaaccgcca acctgaccaa gaaccaagtg ctgcaacaag ccggcaccgc gatcctggcc 1140

caggccaacc agctgccgca gtcggttctg agcctgctgc gctaa 1185

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgagtgact caaatgaagc taaggtagcg aagtggatgg agaaggaaac gctggctgag 60

catctggggc ctctgcttga acgttacgat gtaaaatacc gtgggcatgg gattatttat 120

gtcgaccacg aacaatacaa tattttaacc attcagcaaa ttcttgcgga catgagttcc 180

tatctaggcg tttcaaaaga gctgattcgc tctaggttga tagactttgg ttggctcatc 240

gatgtccgca gagtcttgcc tgtccgggac agtgctgcgc gtgtcattga caatctggag 300

tcttgggcgg cggacgaacc agaggagaat gcccccgaaa tggacgatca atatgaccga 360

gattaa 366

<210> 5

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atgcatgtat tcgatgctca gtcgcgtgtc atgttcgaca gtaatcgcga gattgtgcgg 60

tttgttggag gggcgcagga gtgggagtta tacgcccata accctaattg gcccggaggt 120

atgcacatgc aaacatgggc acttccatat ccatatgggt tgtccaccta ttttctggtg 180

agtcatttta atctaaagca tatctatact ctggaacccc ctcgtatagg gttcctgtac 240

aattcccggg ccatgatttt cgtctcctcg ttagttccgg atgagatcgg atttaagttc 300

aactggccac tcattgttgt cgcgtaa 327

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgcctaaaa cagcacaagt gatcgcagcc gtgtatgacg aagaccacga cgccggaagg 60

gtcgtcggac ggtcactcaa aagccttcgt gaagcagtcg gattgaccca gctacagatg 120

gctcgaaagc ttggcgtagg ccaggcagct atttccaaaa ttgaagcccg aggtgatgtg 180

cagatttctt ctttgaagaa atatgttgac gcactaggag catcgctacg gatagaggca 240

gcattcaaag cagatagcga gatatctact cgccttcgag aagagctggc attagaagag 300

cactcagata gacagctggt gctaccaata tttagtagtg atgagatatt tcttgaagaa 360

tctaaagatt taatcctgag cattcatccg caatactccg ataagattct ggcaggtaaa 420

aaaactgttg agttgagaag aagattccca ttgacgacag ctaaggggac aaaggtttat 480

atttattcaa catctcctgt tagagctata gttggttcgg cggaaattgc aggaataata 540

aagctcccaa taaaggacat gtggaagaaa tattcaaagt gtgcattcat caaaaaacag 600

gcttttgaat cttactttga ggggctaagt gaaggttttg cgctggagtt aaagaatgca 660

caagcttttg ataagcctat tgagcttttg gagttaaggg agcgctttaa ctttactccg 720

cctcaatcat tcatttacgc aaagcaggaa atgcgcagag cactcatgga tgagcagaca 780

agcctatcta attga 795

<210> 7

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgacgcaca acaaaatctg tgccaaaatc gcctcagtag ctattgttgg gtggcgctca 60

gggggtagtg tggagcagta cgttgatagt gggagtgccc ggtataggga ttatcaggat 120

atttctgaac gaaagggttc ctgtctcata ttttttgccg cttttctatc gcttttctgg 180

ccgacctcgg tagggggagt gattgtcagc tatctaccaa tagtatcaat tttgttatct 240

tgctttcttt tgcttatcta ttcggttggt gggaaattta tagcggtcaa tgtttttgtt 300

ttttgctttt tctttttgtt gctgcttttt tttacaataa tatctccgtt tcaagagtat 360

acttttggcg ccatttttcc ctatttggca atgggcgtgg ttcttatgat ttcgccttct 420

attgatgttg gcgattgctc aagaagactg tttcatctga tggctgttct ccttataatt 480

ttagggtttg gggtggtgtt tcatgtggat tttataaggc agtttatatt taaattttat 540

caggcgtact atgaagacct gtatttgtat atggtcgaat atggggataa gccagtaggg 600

ccttttgcga ctcattctat atctgctttt atatacgctg ttttcgctat tatttatctt 660

cgtctatcgc atgtttctag tggggctaag tcggtagctt atttcttgct gtcgctcttg 720

tttttttctt tgattgttct tcttaaatca ttttcagcta ttgcgatttc ttccttgctt 780

gcgtctatgt attttctttg gttgctgtct cgcgctaaag tgctggcaat actatttatg 840

ggatttttga ttgtttgtgt gttttccctc gttgatctta catctttcta tgagctcatt 900

gagaaacttt tgtcgagcga cgccaatggc ttgcgcggca ggtattccgc cggtaatcga 960

cttgatggaa cttatgaatt tttgcttaat aatcctctga tggcgatcgg gatgacgtct 1020

tctccgcaga tagcgtttgg tgataatttt atatctgact atgtgattag gactggtgtt 1080

tttggttatc ttgcagttct tttttccgtt gttgtttatt ttctttcctc cttgaggggg 1140

atggttgcta ttgcttttgc tgtcggaata gttgttttgg cggatctcgg ttatccgctc 1200

ctcacgaact tcagagcaat ttttcttttc ccagtattca ttgccatgtg gtgttaccct 1260

ggggactccc cgcatcgctc ctga 1284

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttgacatcgg ttcactcgc 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcatcaccct taccatctgc 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ttatgggagg agaagtgg 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

caaagaaggc aaataggtc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ccgtcaacac caacatcgc 19

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aaagcggtag cggaagg 17

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

taaggtagcg aagtggatgg a 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ggcattctcc tctggttcg 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cgagattgtg cggtttgt 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tggaagtgcc catgtttg 18

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

atcgctacgg atagaggcag cattc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cgaaccaact atagctctaa cagga 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ctgttttcgc tattatttat cttcg 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gaaaacacac aaacaatcaa aaatc 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gtggcaggtt tcaatcaggg 20

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tcatccaaag aaggcaaata ggt 23

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tcgtatcagc aacaccacca c 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

cgccgtcagc cttgaagta 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gcgagattgt gcggtttgtt 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

tggaagtgcc catgtttgc 19

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cagtacgttg atagtgggag tgc 23

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

cgaggtcggc cagaaaa 17

Claims

1.用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标，其特征在于，所述特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7任一项所示。

2.用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的引物组，其特征在于，所述引物组用于检测SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.7任一项所述特异性分子靶标；其中，用于检测SEQ ID NO.1所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；用于检测SEQ ID NO.2所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.3所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；用于检测SEQ ID NO.4所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；用于检测SEQ ID NO.5所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.6所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；用于检测SEQ ID NO.7所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。

3.用于鉴定铜绿假单胞菌血清群的引物组，其特征在于，所述引物组用于检测SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7任一项所述特异性分子靶标；其中，用于检测SEQ ID NO.2所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；用于检测SEQ ID NO.3所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；用于检测SEQ ID NO.5所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；用于检测SEQ ID NO.7所述分子靶标的引物组的序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示。

4.一种用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)使用权利要求2～3任一项所述引物组中的至少一组对待测样品DNA进行PCR扩增；

(2)采用进行凝胶电泳检测扩增产物；

(3)分析判断扩增产物是否含目标菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR扩增的反应体系包括：10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl2 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μmol/L引物对1.0μL、Tag酶1U、DNA模板1-2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述PCR反应条件为：98℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸60s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

6.一种用于定量检测铜绿假单胞菌血清群的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求3所述引物组中的至少一组对待测样品DNA进行qPCR扩增并分析扩增结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增的扩增体系包括2×TBGreen Premix反应液10μL，模板DNA100ng，10μmol/L引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL；所述qPCR扩增的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行45个循环。

8.根据权利要求1所述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标或权利要求2～3任一项所述的引物组在鉴别铜绿假单胞菌血清群中的应用。

9.根据权利要求1所述的用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标或权利要求3所述的引物组在定量检测铜绿假单胞菌血清群中的应用。

10.一种用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2～3任一项所述的引物组。