CN110512012A - 一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重pcr引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物及其应用。所述特异性靶标通过比较基因组学和生物信息学挖掘获得，该组靶标具有准确度高和特异性好的特点。本发明针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标LMOf2365_2361、lmo1083、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，使用特异性引物可对单增李斯特菌血清型进行PCR鉴定。本发明提供的血清型鉴定引物具有准确度高、特异性好的特点。

Description

一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的 多重PCR引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物及其应用。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，会导致许多食品中的污染，并可承受食品加工过程中常见的环境压力。单增李斯特菌抗盐碱、耐冷，在20％的盐浓度下仍可存活，在4℃下仍可生长繁殖。单增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人类病原体，主要感染老年人、孕妇、儿童和免疫功能低下者。李斯特菌病的临床表现包括脑膜炎、脑炎、流产、发热性胃肠炎和败血症等，李斯特菌病的死亡率高达30％。因此，大多数国家都对食品中的单增李斯特菌进行严格控制，特别是在即食食品中。

根据菌体和鞭毛抗原的血清型反应，单增李斯特菌可被分为13个血清型，分别为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7型。其中，1/2a、1/2b、1/2c、4b这4种血清型是主要的血清型，99％的人类李斯特菌病由这四种血清型的菌株引起。1/2a血清型是食品中最为常见的血清型，但李斯特菌病的暴发性流行大多是由4b血清型的菌株引起的，这说明4b血清型可能具有更强的毒力。以上13种血清型可进一步被分为5个血清群(serogroup)，1/2a和3a型属于IIa群，1/2b、3b和7型属于IIb群，1/2c和3c型属于IIc群，4b、4d和4e型属于IVb群，4a和4c型属于L群。对单增李斯特菌的血清型鉴定，在其流行株的监测、食品安全性评估及暴发疫情的病原学溯源中具有重要的应用价值。

目前，对单增李斯特菌血清型的鉴定方法主要是血清型方法(可见出入境检验检疫行业标准SN-T 2521-2010)，此种方法需要使用菌毛抗原和菌体抗原，成本较高，操作复杂，易发生交叉反应，且鉴定周期较长，完成一次鉴定需要3天以上的时间。本发明利用PCR方法进行单增李斯特菌血清型的鉴定具有成本低、周期短、操作简单、鉴定结果容易判读的特点。

现有专利中，单增李斯特菌血清型的PCR鉴定引物，如CN 107746890 A、CN103602739 A等专利中使用的引物使用Primer-BLAST进行验证，发现仍缺少准确度和特异性都较好的单增李斯特菌血清型PCR鉴定引物；并且，目前所广泛使用的单增李斯特菌PCR血清型分型方法，即US 2006/0257894 A1专利中的方法，需要5对引物才能对单增李斯特菌共5种血清群中的4种进行区分，而理论上，只需要4对引物即可实现单增李斯特菌所有5中血清群的区分。因此，对单增李斯特菌血清型的新PCR鉴定靶标和新PCR鉴定引物的挖掘，有助于提高单增李斯特菌血清型PCR鉴定的准确度和特异性，并有望使用更少的引物实现更多血清型的鉴定。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物及其应用。

本发明提供的基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物是一组对单核细胞增生李斯特氏菌进行血清群分型鉴定的PCR引物，其与现有技术相比较，使用的引物对更少。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种鉴定单增李斯特菌血清型群的PCR引物，使用的血清群IIb、IVb特异性靶标基因为LMOf2365_2361(NCBI Gene ID:2797113)，血清群IIa、IIb、IIc特异性靶标基因为lmo1083(NCBI Gene ID:986257)、血清群IIc的特异性靶标基因为lmo1119(NCBIGene ID:985160)、单增李斯特菌特异性靶标基因lmo0733(NCBI Gene ID:985919)。

本发明提供的一组基于多重靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的PCR引物，包括LMOf2365_2361引物、lmo1083引物、lmo1119引物及lmo0733引物；

所述LMOf2365_2361引物包括正向引物LMOf2365_2361-F及反向引物LMOf2365_2361-R；所述正向引物LMOf2365_2361-F如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物LMOf2365_2361-R如SEQ ID NO:2所示；

所述lmo1083引物包括正向引物lmo1083-F及反向引物lmo1083-R；所述正向引物lmo1083-F如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物lmo1083-R如SEQ ID NO:4所示；

所述lmo1119引物包括正向引物lmo1119-F及反向引物lmo1119-R；所述正向引物lmo1119-F如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物lmo1119-R如SEQ ID NO:6所示；

所述lmo0733引物包括正向引物lmo0733-F及反向引物lmo0733-R；所述正向引物lmo0733-F如SEQ ID NO:7所示，所述反向引物lmo0733-R如SEQ ID NO:8所示。

本发明提供的一组基于多重靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的PCR引物能够应用在鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型中。

本发明提供的一组基于多重靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的PCR引物在鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型中的应用时，包括如下步骤：

(1)将待测样品进行增菌培养，获得增菌样品；

(2)提取步骤(1)所述增菌样品的基因组DNA；

(3)将步骤(2)所得的基因组DNA为模板DNA，采用所述LMOf2365_2361引物、lmo1083引物、lmo1119引物以及lmo0733引物(特异性引物组合物)进行PCR反应，获得PCR产物；

(4)将步骤(3)所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果对步骤(1)所述样品进行单核细胞增生李斯特氏菌血清群判定；所述的电泳结果是以下情况之一：

a.有且仅有分子量大小为771bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIa；

b.有且仅有分子量大小为771bp、396bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIb；

c.有且仅有分子量大小为771bp、243bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIc；

d.有且仅有分子量大小为396bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IVb；

e.有且仅有分子量大小为500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群L；

f.无DNA条带，判定为非单核细胞增生李斯特氏菌。

进一步地，步骤(3)所述LMOf2365_2361引物、lmo1083引物、lmo1119引物以及lmo0733引物分别为特异性靶标基因LMOf2365_2361、lmo1083、lmo1119、以及lmo0733的特异性引物。

本发明提供的一组基于多重靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的PCR引物，这组PCR引物序列是单核细胞增生李斯特氏菌血清群的特异性靶标基因LMOf2365_2361、lmo1083、lmo1119以及lmo0733所设计的。所述的特异性引物组合物由序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:8所示的引物组成。

本发明提供的一种鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物，引物序列为：LMOf2365_2361-F(SEQ ID NO:1)：5’-ATTACAAGATAAATGGGTTCGC-3’，如SEQ ID NO:1所示，

LMOf2365_2361-R(SEQ ID NO:2)：5’-CATAGGTACTGGAGGGCATAGAC-3’，如SEQ IDNO:2所示，

其对应的特征片段为396bp；

lmo1083-F(SEQ ID NO:3)：5’-GGTGGGGCAGGTTTTATTG-3’，如SEQ ID NO:3所示，

lmo1083-R(SEQ ID NO:4)：5’-AGAAAGATTCAAATCGTCAACAA-3’，如SEQ ID NO:4所示，

其对应的特征片段为771bp；

lmo1119-F(SEQ ID NO:5)：5’-GTGGTTCTGGTCTTGCCTTAG-3’，如SEQ ID NO:5所示，

lmo1119-R(SEQ ID NO:6)：5’-GATTGAGAAAGAGGGTTGAAAA-3’，如SEQ ID NO:6所示，

其对应的特征片段为243bp；

lmo0733-F(SEQ ID NO:7)：5’-AAAGCAATCAGAAAATCAAAAGG-3’，如SEQ ID NO:7所示，

lmo0733-R(SEQ ID NO:8)：5’-GTACGATTTTATACGTTCTTCCGC-3’，如SEQ ID NO:8所示，

其对应的特征片段为500bp。

使用本发明提供的鉴定引物建立的鉴定单增李斯特菌血清型的PCR方法，具体包括如下步骤：

(1)将待测单增李斯特菌菌株接种至TSB培养基中进行增菌培养，得到增菌培养液；

(2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；

(3)步骤(2)所得的基因组DNA为模板DNA，采用权利要求1所述特异性靶标基因LMOf2365_2361、lmo1083、lmo1119、以及lmo0733的特异性引物组合物进行PCR反应，获得PCR产物；所述的特异性引物组合物由序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:8所示的引物组成。

(4)将步骤(3)所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果对步骤(1)所述样品进行单核细胞增生李斯特氏菌血清群判定；所述的电泳结果是以下情况之一：

a.有且仅有分子量大小为771bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIa；

b.有且仅有分子量大小为771bp、396bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIb；

c.有且仅有分子量大小为771bp、243bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIc；

d.有且仅有分子量大小为396bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IVb；

e.有且仅有分子量大小为500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群L；

f.无DNA条带，判定为非单核细胞增生李斯特氏菌。

上述方法中，步骤(2)中所述的提取增菌样品的基因组DNA，其方法为本领域的常规细菌基因组DNA提取方法，具体步骤如下：取3mL菌液于离心管中，离心1min，弃上清液，收集菌体；加800μL裂解缓冲液(40mM Tris-醋酸，pH 7.8的20mM醋酸钠，1mM EDTA，10％SDS)，吹打混匀；加400μL 5M NaCl混匀后，离心12min；将上清液移至另一离心管中，加入10μLRNaseA(10mg/mL)37℃温浴30min；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25︰24︰1)抽提，充分混匀抽提；离心8min收集上清，用氯仿抽提一次，离心8min后吸取上清至新的离心管内；加2倍体积无水乙醇沉淀DNA后离心8min，用体积百分比浓度为70％乙醇溶液洗涤沉淀2次。干燥后，溶于100μL TE中于-20℃保存备用。也可采用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，如天根生化的细菌基因组DNA提取试剂盒、生工生物的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、Solarbio的细菌基因组DNA提取试剂盒等。

步骤(3)中所述的PCR扩增反应，是指在PCR反应体系中，在DNA聚合酶和所述引物对的作用下，通过依次经95～98℃变性、53～55℃退火和68～72℃延伸的反应条件下循环反应30～35次，以单增李斯特菌基因组DNA为模板DNA，以dNTP为底物，对所述模板中的与所述引物对互补的特异片段区域进行扩增累积。所述的PCR反应体系，包含PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、本发明所述的引物对以及模板DNA。其中所述的PCR反应缓冲液包含pH为8～9.5的0～20mM Tris HCl,30～100mMKCl和1～4mM MgCl2；所述的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶，其工作浓度为0.02～0.2U/μL；所述的dNTP为dATP，dGTP，dTTP和dCTP四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例组成的混合物，其浓度为各0.2～0.3mM；所述模板DNA浓度为2.146fg/μL～2.146ng/μL；所述引物对浓度为各0.2～0.4μM。本发明所用的PCR反应体系除了引物序列和模板DNA外，其余组成均为常规PCR方法常用配方，为本领域普通技术人员所熟知和掌握，可自行按配方配制，也可采用商品化的试剂盒。目前，市场上已有多种用于常规PCR反应的试剂盒，均适用于本发明方法，如New England Biolabs(NEB)的Hot Start Taq 2X MasterMix、Taq 5X Master Mix等，Takara的ExPCR Amplification Kit等，TOYOBO的KODFX等，以及Invitrogen的Taq DNA Polymerase、AmpliTaq DNA Polymerase等。本发明所述的PCR反应条件也是常规PCR反应条件，本领域普通技术人员根据其掌握的常规PCR方法知识和所用的DNA聚合酶类型可轻易确定变性、退火及延伸所用的时间和温度；此外，也可根据商品化试剂盒中说明书所提供的条件进行反应。

本发明公开了一组单增李斯特菌血清型的特异性靶标及其对应的血清型鉴定引物。所述特异性靶标通过比较基因组学和生物信息学挖掘获得，该组靶标具有准确度高和特异性好的特点。本发明针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标LMOf2365_2361、lmo1083、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，使用特异性引物可对单增李斯特菌血清型进行PCR鉴定。本发明的血清型鉴定引物具有准确度高、特异性好的特点。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供了一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物，这组PCR引物仅有4对引物，即实现了对单增李斯特菌4种血清群的分型鉴定，与现有技术相比，不仅降低了鉴定的成本，同时还具有准确度高、特异性好、鉴定速度快、操作简单的优点。

附图说明

图1a为实施例2中基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物的特异性评价的部分电泳结果图；

图1b为实施例2中基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物的特异性评价的另一部分电泳结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

挖掘单增李斯特菌血清型的PCR鉴定引物

从NCBI上下载已知血清型信息的133个单增李斯特菌基因组，为保证数据的统一性和可比性，使用Prodigal软件对这些基因组上的编码序列进行预测。在IIa、IIb、IIc、IVb、L五个血清群中各选择一个基因组作为参考基因组，将其编码序列与133个基因组进行比对，得出每个血清群的参考基因组的基因在133个基因组中的分布，从而得出一个血清群或是多个血清群共有的特异基因。将最少3个特异基因进行组合，即可有效判断单增李斯特菌菌株所属的血清群，从而推断其血清型。本发明筛选得到单增李斯特菌血清群IIb、IVb特异性靶标基因LMOf2365_2361(NCBI Gene ID:2797113)、血清群IIa、IIb、IIc特异性靶标基因lmo1083(NCBI Gene ID:986257)、血清群IIc特异性靶标基因lmo1119(NCBI Gene ID:985160)、单增李斯特菌特异性靶标基因lmo0733(NCBI Gene ID:985919)。使用软件PrimerPremier 6对各个特异性靶标进行引物设计，确定引物序列如下：

LMOf2365_2361-F：5’-ATTACAAGATAAATGGGTTCGC-3’，如SEQ ID NO:1所示；

LMOf2365_2361-R：5’-CATAGGTACTGGAGGGCATAGAC-3’，如SEQ ID NO:2所示；

lmo1083-F：5’-GGTGGGGCAGGTTTTATTG-3’，如SEQ ID NO:3所示；

lmo1083-R：5’-AGAAAGATTCAAATCGTCAACAA-3’，如SEQ ID NO:4所示；

lmo1119-F：5’-GTGGTTCTGGTCTTGCCTTAG-3’，如SEQ ID NO:5所示；

lmo1119-R：5’-GATTGAGAAAGAGGGTTGAAAA-3’，如SEQ ID NO:6所示；

lmo0733-F：5’-AAAGCAATCAGAAAATCAAAAGG-3’，如SEQ ID NO:7所示；

lmo0733-R：5’-GTACGATTTTATACGTTCTTCCGC-3’，如SEQ ID NO:8所示。

为了验证本发明鉴定引物的准确性，使用在线工具Primer-Blast将设计的各对引物与NCBI的NT数据库中属于Bacteria分支的序列分别进行比对，进行模拟PCR，得到在目标序列上扩增产物的列表。根据本发明的判定方法得出模拟PCR的鉴定结果，并与数据库中该序列对应菌株的血清型信息相对比，以评价本发明鉴定引物的准确性。本发明的PCR鉴定引物在NT数据库的217个单增李斯特菌基因组中，正确地鉴定了其中216个基因组对应菌株的血清型。使用陈健舜等(CN 103602739 A)，以及陆兆新等(CN 107746890 A)的发明中的引物进行相同的验证，两项发明分别可以正确地鉴定NR数据库中207个和86个基因组对应菌株的血清型，如表1所示，表1为本发明提供的一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物的准确性评价表。由表1可见，本发明的一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物相比于现有的血清型鉴定引物，有更高的准确率。

表1

采用以上所述的引物对，可以建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。

所述的PCR反应体系总体积为50μL，所述PCR反应体系包含10×PCR反应缓冲液5μL，模板DNA1μL，余者为无菌DEPC水；其中在PCR反应体系中含有dNTP0.25mM，引物LMOf2365_2361-F、LMOf2365_2361-R、lmo1083-F、lmo1083-R、lmo1119-F、lmo1119-R、lmo0733-F及lmo0733-R各0.2μM，Taq酶2.5U。

PCR反应程序为：95℃预变性3min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性15s、53℃退火15s、72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min。

鉴定结果的判定：取5μL的PCR反应产物在质量百分比浓度2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，若只出现771bp和500bp的条带，则判定为血清群IIa，即血清型1/2a或3a；若只出现771bp、396bp和500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现771bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出现396bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；若无以上条带，则判定为非单增李斯特菌。

实施例2本发明的一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物的特异性评价

对本发明的单增李斯特菌血清型PCR鉴定引物的特异性评价共使用了10株单增李斯特菌，分别为血清群IIa的CICC 21633、CICC 21662，血清群IIb的242-2、CICC 21632，血清群IIc的CICC 21634、CMCC 54002，血清群IVb的GIM 1.347，以及血清群L的ATCC 19114、2006-1和3877-1。

特异性评价共使用了20株非单增李斯特菌，分别为英诺克李斯特菌(Listeriainnocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、维德曼氏芽胞杆菌(Bacillus wiedmannii)、雷金斯堡约克氏菌(Yokenellaregensburgei)、格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)、东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillusamylolyticus)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)、厦门希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、解酪蛋白巨大球菌(Macrococcuscaseolyticus)、格式乳球菌(Lactococcusgarvieae)。

将10株单增李斯特菌和20株非单增李斯特菌分别接种到10mL的LB液体培养基中，在37℃增菌12h后，取菌悬液1mL，使用天根生化科技(北京)有限公司的细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，得到30份基因组DNA。

将提取得到的30份基因组DNA分别取1μL做PCR反应，PCR反应体系和反应程序如实施例1中所述。取PCR反应产物进行电泳，并如实施例1中所述判断单增李斯特菌血清型的鉴定结果。PCR鉴定结果如表2、图1a、图1b所示；其中，表2为PCR反应体系特异性评价实验采用的菌株及其鉴定结果表，图1a和图1b中的M均表示为DL 1,000 DNA Marker，泳道1-10为单增李斯特菌，泳道11-24为非单增李斯特菌，每个泳道对应的菌种和菌株名称见表2所示。实验结果表明(表2、图1a和图1b)，本发明提供的一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物对10株不同血清型的单增李斯特菌菌株，皆可正确地鉴定其所属的血清群，具有较高的准确度；对20株非单增李斯特菌的菌种，使用本发明的引物皆鉴定为阴性，因此，本发明的基于多重靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的PCR引物也具有较高的特异性。

表2

表2中“-”表示鉴定结果为非单增李斯特菌。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 1

attacaagat aaatgggttc gc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 2

cataggtact ggagggcata gac 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 3

ggtggggcag gttttattg 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 4

agaaagattc aaatcgtcaa caa 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 5

gtggttctgg tcttgcctta g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 6

gattgagaaa gagggttgaa aa 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 7

aaagcaatca gaaaatcaaa agg 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)

<400> 8

gtacgatttt atacgttctt ccgc 24

Claims (3)

1.一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物，其特征在于，包括LMOf2365_2361引物、lmo1083引物、lmo1119引物及lmo0733引物；

所述LMOf2365_2361引物包括正向引物LMOf2365_2361-F及反向引物LMOf2365_2361-R；所述正向引物LMOf2365_2361-F如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物LMOf2365_2361-R如SEQ ID NO:2所示；

所述lmo1083引物包括正向引物lmo1083-F及反向引物lmo1083-R；所述正向引物lmo1083-F如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物lmo1083-R如SEQ ID NO:4所示；

所述lmo1119引物包括正向引物lmo1119-F及反向引物lmo1119-R；所述正向引物lmo1119-F如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物lmo1119-R如SEQ ID NO:6所示；

所述lmo0733引物包括正向引物lmo0733-F及反向引物lmo0733-R；所述正向引物lmo0733-F如SEQ ID NO:7所示，所述反向引物lmo0733-R如SEQ ID NO:8所示。

2.权利要求1所述的一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物在鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型中的应用。

3.根据权利要求2所述的一组基于特异性靶标鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR引物在鉴定单核细胞增生李斯特氏菌血清型中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将待测样品进行增菌培养，获得增菌样品；

（2）提取步骤（1）所述增菌样品的基因组DNA；

（3）将步骤（2）所得的基因组DNA为模板DNA，采用所述LMOf2365_2361引物、lmo1083引物、lmo1119引物以及lmo0733引物进行PCR反应，获得PCR产物；

（4）将步骤（3）所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果对步骤（1）所述样品进行单核细胞增生李斯特氏菌血清群判定；所述的电泳结果是以下情况之一：

a．有且仅有分子量大小为771bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIa；

b. 有且仅有分子量大小为771bp、396bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIb；

c. 有且仅有分子量大小为771bp、243bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IIc；

d. 有且仅有分子量大小为396bp和500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群IVb；

e. 有且仅有分子量大小为500bp的DNA条带，判定为单核细胞增生李斯特氏菌血清群L；

f. 无DNA条带，判定为非单核细胞增生李斯特氏菌。