CN100572556C - 来自拓扑异构酶基因区域的核酸探针和广范围引物,以及使用它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于鉴定细菌的种和诊断细菌感染的核酸探针和广范围引物。具体地，本发明涉及来源于位于引起感染的细菌的拓扑异构酶基因的保守序列附近的超变区的特异核酸探针。本发明还涉及来源于拓扑异构酶基因的保守区的广范围引物。具体地，该引物来源于gyrB和/或parE蛋白的编码基因的保守区。此外，本发明涉及这些核酸探针和广范围引物用于诊断细菌感染的用途以及使用这些核酸探针和广范围引物的诊断方法。

Description

来自拓扑异构酶基因区域的核酸探针和广范围引物，以及使用它们的方法
发明领域
本发明涉及用于鉴定细菌的种和诊断细菌感染的核酸探针和广范围引物。具体地，本发明涉及来源于超变区的特异探针，该超变区位于引起感染的细菌的拓扑异构酶基因的保守序列附近。本发明也涉及来源于拓扑异构酶基因的保守序列的广范围引物。此外，本发明涉及这些用于诊断细菌感染的核酸探针和广范围引物，以及使用这些核酸探针和广范围引物的诊断方法。
发明背景
呼吸道感染是医生诊所就诊的最常见原因。在芬兰，每1000个居民中约有13例肺炎。甚至更频繁地诊断出急性上颌窦炎和耳炎。例如，据估计在芬兰每年约有200000例耳炎(主要是儿童)。呼吸道感染加重保健体系的负担，并给社会带来大量的费用。很难计算由急性呼吸道感染引起的准确费用，因为这些主要费用由所谓的间接费用组成，例如缺勤(Rautakorpi等，Scandinavian Journal of InfectiousDiseases.33(12)：920-6，2001，Infektiotaudit，ed.Eskola，Huovinen jaValtonen 1998)。急性呼吸道感染是造成全世界数百万人死亡的原因，其中主要是儿童。
除了病毒之外，呼吸道感染是由多种细菌引起：化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(链球菌组A)是扁桃体炎的主要病原体。不治疗扁桃体炎会带来急性并发症的风险，例如扁桃体周围脓肿。此外，化脓性链球菌引起扁桃体炎后遗症，包括风湿热和肾小球肾炎都是重症的、甚至绝症。肺炎门诊病人的最主要的病原体是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，其中肺炎球菌是引起肺炎的最主要和最严重的病原体。低频率诱发肺炎的细菌的种是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)和Coxiella bumetii。另一方面，结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起肺结核。此外，在免疫缺陷患者中诊断出由稀有的分支杆菌(Mycobacterium)和诺卡氏菌(Nocardia)种类引起的肺炎。除了肺炎链球菌，上颌窦炎和中耳炎症(中耳炎)的病原体包括流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)。尽管频率低，耳炎差异球菌(Alloiococcus otitidis)也引起耳炎。
当时诊断细菌呼吸道感染主要基于细菌培养检验。然而细菌培养检验比较慢，并且基于培养的诊断方法通常是取样后数天有时多达数周给出结果。此外，在实验室条件下细菌培养不都是成功的。结果是：使用培养方法不适合于所讨论的细菌的事实，或病人在取样前接受抗菌剂治疗的事实。在诊断咽炎中，基于抗原检验的快速方法是对细菌培养检验的补充方法，但该方法仅对有限的病原体有效(链球菌组A)。在诊断一些细菌感染(例如，肺炎衣原体和肺炎支原体)中，也可使用血清学方法，但是这些方法从感染开始后数周才给出结果。因此，它们不能用于病人的急性治疗中。
基于核酸扩增和杂交的分子方法试图解决上述细菌培养检验的问题。在这些方法的帮助下，病原体同时得以检验和鉴定，导致更快诊断和避免需要额外的培养测试。抗生素也不会以干扰培养检验的程度来干扰分子方法。
细菌诊断中使用的一种分子方法是基于使用广范围引物的所谓的广范围PCR(聚合酶链式反应)。那时最普通的广范围PCR方法是基于使用可识别编码核糖体RNA(16S rDNA/rRNA或23SrDNA/rRNA)的细菌染色体基因的保守DNA序列的引物。在基于广范围PCR的细菌鉴定中，实际的鉴定步骤是通过克隆和对扩增的PCR产物进行测序而得以进行(参见EP-B1 613502，美国专利号6,001,564，和美国专利申请号0020055101)。
广范围细菌PCR方法有一定范围应用于临床细菌诊断中，尽管它最适合鉴定来自分离培养的细菌和真菌种，并且为商业化检验目的，例如MicroSeq(Applied Biosystems)，也已建立起来。然而，这些检验法并未广泛使用，因为PCR产物的测序是费时费力。并且，分析它们和必要设备，例如测序仪器，价格昂贵，并且实施检验需要专门受过培训的人员。此外，在多种微生物感染时，需要进行大规模的克隆实验。
在细菌诊断中使用的另一种方法是多重PCR，其基于在一个反应混合物中集合的多种特异性寡核苷酸。当鉴定引起中耳炎的病原体时，Hendolin等(Journal of Clinical Microbiol-ogy，35：11，1997)使用多重PCR方法。
尽管多重PCR程序相对敏感和快速，它还是有一些缺点。众所周知较短的DNA片段扩增效率高于较长的DAN片段。因此，如果相同样本包括两个不同的细菌的种，有可能较短片段的细菌DNA扩增效率更高，影响该方法的敏感度。此外，使用多重PCR仅能同时鉴定几个细菌的种，因为实际上它不可能涉及适应于超过一打特异引物对的实例，以至于引物在相同PCR条件下是有功能的。因此，多重PCR不可用于，例如呼吸道感染的诊断，已知该感染包含超过十种临床上重要的病原体。
所谓的正常菌群的细菌也带来基于多重PCR的微生物诊断中的问题。仅仅几打细菌的种的基因组已经被全部测序绘图，这些细菌的种的多数是已知疾病的病原体。因此，关于正常菌群及其DNA序列的信息非常少。这就是为什么专门基于PCR扩增的细菌的种特异性PCR引物和细菌诊断几乎不可能。
使用核糖体RNA有一些缺点。很难借助于rRNA分子，彼此辨别相关细菌的种，因为当将它们彼此比较时，这些分子的序列不含有足够的可变区。甚至在多个菌种间发现了差别，这些可变位点通常分布在全部rRNA分子(如16SrRNA的长度约是1500个核苷酸)，其限制用于诊断的分子方法的用途。实践中，仅仅通过测序全部rRNA编码基因，相关细菌的种从而彼此得以辨别。然而，甚至这种方法不总是足以彼此辨别细菌的种。
发明简述
本发明目的是提供用于感染疾病的细菌诊断的工具和方法，尤其是引起呼吸道感染的细菌，但所述工具和方法不含有上述的细菌诊断的缺点。具体地，本发明目的是基于分子方法提供用于细菌诊断的新工具和新方法，该工具和方法是敏感的、有效的，和种特异的，以及能仅鉴定预期的种。发明的另一个目的是提供方法，通过该方法可诊断感染性细菌，具体是那些引起呼吸道感染的细菌，并且该方法明显地快于以前的方法，借此在感染早期对患者开出正确和有效的抗菌剂治疗的处方，以致于感染持续期得以缩短，以及潜在有害的风险、甚至危险生命的并发症得以降低。
本发明提供来源于超变区的种特异性寡核苷酸探针，所述超变区位于拓扑异构酶的编码基因具体是gyrB/parE基因的保守区附近，在多个细菌的种中，这些超变区在碱基序列中显著不同。使用这些种特异性探针，可同时检测和鉴定多个引起感染的细菌。
本发明还提供广范围或广范围引物，该引物起源于拓扑异构酶的编码基因具体是gyrB/parE基因的保守区，并有效扩增引起感染的、甚至来自临床样本的包括大量的外源(非细菌的)DNA细菌DNA。
此外，本发明提供可克服现有技术的缺陷的简单、快速、敏感和特异性方法。使用这些方法，临床上重要的细菌的种可从临床样本或细菌培养中得以可靠地鉴定和诊断。
本发明涉及在常规杂交条件下，与位于细菌的拓扑异构酶基因的保守序列附近的超变区杂交的寡核苷酸探针序列，所述细菌可引起感染，具体是呼吸道感染，并且探针序列包含SEQ.ID.NR：1至69描述的任一序列，和/或其反向或互补序列，或其功能片段。
引起感染的细菌的种的实例，具体是呼吸道感染，包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、和坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)，编码拓扑异构酶的基因实例是编码gyrB和parE蛋白的基因。
本发明的寡核苷酸探针序列的长度优选是15-30核苷酸，更优选是20至30和最优选21至25核苷酸。
本发明还涉及上述寡核苷酸探针序列在检测、鉴定或分类细菌的种中的用途。
本发明还涉及寡核苷酸探针的混合物，其包括优选与SEQ.ID.NR：1至69相同的所有序列，和/或其反向或互补序列，或上述序列的功能片段的任一组合。在一个实施方案中，预期的探针混合物固定在固体支持物上。优选地，包括SEQ.ID.NR：1至69描述的所有序列、和/或其反向或互补序列的寡核苷酸探针混合物，固定于固体支持物上。
本发明还涉及DNA引物的新混合物，其包括与引起呼吸道感染的细菌的拓扑异构酶编码基因，具体是gyrB和/或parE蛋白的编码基因，的保守区序列杂交的序列，其包括包括SEQ.ID.NR：76或77描述的序列或其功能片段。
此外，本发明涉及用于在临床样本中检测和鉴定引起呼吸道感染的细菌的方法，其包括a)使用上述引物混合物，扩增分离于临床样本的DNA；b)在杂交条件下，将扩增的DNA与预期的上述探针组合进行接触；和c)检测可能的杂交复合体的形成。
本发明方法的一个优选实施方案包括通过链式聚合酶反应，扩增来自临床样本的DNA，以及将扩增的DNA与固定于固体支持物上的细菌的种特异性寡核苷酸探针进行接触。
在本发明方法的一个优选实施方案中，合适的标记核苷酸用于扩增分离于临床样本的DNA，来制备可检测的靶链。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，扩增的和可能的标记靶DNA与固体支持物接触，优选是处理过的玻璃，其中本发明的所有种特异性寡核苷酸探针，其具有SEQ.ID.NR：1至69的描述的序列和/或其反向或互补序列，已经附着于固体支持物。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，扩增的和可能的标记靶DNA与固体支持物接触，优选是处理过的玻璃，其中引起呼吸道感染的一个或几个指定细菌的种的本发明的特异性寡核苷酸探针固定于固体支持物，所述特异性寡核苷酸探针具有来自表4A和4B的SEQ.ID.NR.1至7、8至14、15至16、17至20、21至25、26至29、30至33、34至38、39至42、43至47、48至50、51至55、56至60、61至65，和66至69描述的对应序列，和/或其反向或互补序列，或其任意合适的组合。
本发明还涉及用于诊断引起感染的、具体是引起呼吸道感染的细菌的诊断试剂盒，包括a)如上定义的本发明的引物混合物，b)如上定义的本发明的细菌的种特异性寡核苷酸探针序列混合物，任意固定于固体支持物，c)阳性和任意阴性对照探针序列，和任意的d)扩增、杂交、纯化洗涤、和/或检测步骤中需要的试剂。
附图简介
图1表示限定了保守序列的超变gyrB基因区的实例(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catharralis)。灰色盒标明保守区，它们作为gyrB/parE广范围引物的退火位点。超变区，细菌的种特异探针据此设计，位于这些保守序列之间(下划线位点)。
图2表示在微阵列表面杂交结果的实例。分离于金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养分离物的gyrB基因的扩增DNA，用作靶链(不对称Cy-5-dCTP标记PCR产物)。玻片含有四条特异性gyrB寡核苷酸探针(表4A：寡核苷酸探针21至24)，所述探针全部特异性结合金黄色葡萄球菌靶链。此外，所有5条阳性对照寡核苷酸可给出检测信号。在玻片上，金黄色葡萄球菌靶链不结合其它寡核苷酸探针。
图3表示由实施例7的PCR扩增结果，其中，已知为肺炎链球菌特异性的引物在链球菌属的细菌的测试中进行比较，而已知为粘膜炎莫拉氏菌特异性的引物在莫拉氏菌属的细菌测试中进行比较，然而结果显示，所讨论的引物不是细菌的种特异性，而它们也扩增正常菌群的细菌。
发明详述
本发明基于试图找到在引起感染的细菌的诊断中，较之核糖体RNA的应用更具特异性的替代物的研究。该研究着力于细菌的有生活力的其他基因。拓扑异构酶旋转酶B(gyrB或拓扑异构酶II)和parE蛋白(拓扑异构酶IV的其他亚单位)是细菌中重要的分子，因为它们为DNA包装所必需。在进化过程中，这些分子的某些DNA片段序列几乎保持不变，即保守的。在本说明书中，术语“保守区”指在不同的引起呼吸道感染的细菌的种之间，拓扑异构酶基因或蛋白质，其核苷酸序列或等价氨基酸序列几乎保持不变。通常保守区是蛋白质具有功能的最重要的区域。然而，GyrB/ParE分子不如核糖体RNA分子保守。因为研究的分子是蛋白质，编码这些蛋白质的基因由于遗传密码子的性质在核酸水平上比起编码结构性RNA分子(如16SrRNA分子)的基因包含更多的差异。在进化过程中，GyrB/ParE分子作为一个整体不如结构性RNA分子保持不变。在GyrB/ParE分子中可以发现短的DNA片段，在不同的细菌的种中，其变化是如此之大，以至于这些DNA片段被认为是种特异性的。这些序列是高度可变序列，在本说明书中指这样的拓扑异构酶基因，其DNA序列在不同的细菌间其核苷酸序列之不同达到了赋予细菌以种特异性的程度，而且，其位于拓扑异构酶保守序列的附近，而且任意地由保守序列限制或标志出。
上述特点被用于细菌菌株的种特异性寡核苷酸的设计中。在细菌的种特异性探针(寡核苷酸)的设计中，使用基于序列对比的策略。将靶细菌的种的gyrB和parE基因，与参考细菌的对应基因进行序列对比。这些序列获自EMBL公开序列数据库，在无法从公共数据库获得序列的情况下，通过克隆来自细菌的种的gyrB/parE基因序列片段得以生成。序列通过扩增来自细菌培养分离物的合意的gyrB/parE DNA片段得以生成。然后合意的DNA序列片段被克隆和测序图1显示两个细菌的种(流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌的超变gyrB基因区的实例，所述超变区通过保守基因区得以结合。灰色盒标明保守区，它们作为gyrB/parE广范围引物的退火位点。超变区，细菌的种特异性探针据此设计，位于这些保守序列之间(下划线位点)。
使用BioEdit程序盒和ClustalW对列算法，进行序列对比。计算对列的连续序列，手动鉴别合适的保守区。这些区域指在目的细菌的种的基因中是保守的、但在参照细菌的种的基因中至少没有全部被找到的序列片段。具有合适长度(如21-25个核苷酸)的寡核苷酸序列选自于比较分析的区域。使用FastA算法程序，将选择的寡核苷酸序列与EMBL原核序列数据库进行比较。当与非目的细菌的种的gyrB/parE序列比较时，选出具有至少两处不匹配的寡核苷酸序列用于进一步分析。估算寡核苷酸的融解温度(Tm)，并检查发夹结构的信息。挑选没有明显二级结构和具有高于45℃的Tm的寡核苷酸，用于特异性测试。在既有分离于多个细菌的种(实施例3，表3)的纯DNA样品、又有临床患者样品(实施例6，表5)的实验室条件下，测试寡核苷酸探针的特异性。
本发明的寡核苷酸探针包括SEQ.ID.NR：1至69、描述的序列或其反向或互补序列。它们可有不同的长度，唯有这些寡核苷酸探针的合意的种的特异性和功能性确定它们在杂交反应中的合适长度。寡核苷酸探针的长度通常是15至30，优选20至30，最优选21至25个核苷酸。此外，这些探针以不同方法得以修饰(如修饰核苷酸，包括例如次黄嘌呤核苷)。多种化合物或基团(如氨基酸基团)或其它分子，例如检测需要的标签，能附着于探针，或者它们完全没有修饰。图4A和4B显示优选的细菌的种特异性探针的序列及其特异性，并且它们具有与SEQ.ID.NR：1至69描述的序列。对本领域技术人员而言，显然这些寡核苷酸序列的天然的、反向或互补序列是同等合适。同样地，假如种特异性维持不变，前述寡核苷酸序列的功能片段可用作探针。
为了设计PCR引物，使用ClustalW队列算法，通过BioEdit程序，将选自不同fylogenetic组(表2)的细菌的种gyrB蛋白的氨基酸序列进行序列对比。在对比研究中，找到一些保守区，并作为用于广范围引物设计的起始点。parE蛋白与gyrB蛋白相关，并且在某些细菌的种(革兰氏阳性菌)的这两个基因中找到上述的保守区。将保守氨基酸序列反向翻译为对应的核酸序列。依赖于自然的遗传密码，在引物序列中存在几个简并区。基于保守序列，在实验室中设计并测试几条引物对(特异性和敏感度测试)。基于实验室测试，可以总结出使用一些引物对可成功扩增纯细菌DNA，并且使用这些引物可扩增所有细菌的gyrB/parE基因。因此所讨论的引物作为用于细菌的通用或广范围引物。
已证实与其他引物对相比，一条引物对具有更高的敏感度，并且可用该引物对测试临床样本。然而，发现无法使用该引物对进行扩增来自含有大量的人DNA的临床样本的细菌DNA。由此重新设计引物对，根据简并性探寻可选择的新引物，该引物一方面扩增来自临床样本的DNA，另一方面还具有高特异性以致于能扩增引起呼吸道感染的所有细菌的gyrB/parE蛋白。表1显示功能型引物对。使用这些引物对，彼此在种系发生上远缘的细菌的所有gyrB/parE基因(表3)，甚至在大量的人DNA存在下，得以扩增。
表1.gyrB/parE广范围引物
  引物名称gB1F   5′-＞3′序列CGTCCWGGKATGTAYATHGG
  gB2R   CCHACRCCRTGWAAWCCDCC
在引物序列中：
W代表碱基A或T，
K代表碱基G或T，
Y代表碱基C或T，
H代表碱基A或C或T，
R代表碱基A或G，和
D代表碱基A或G或T。
引物混合物包含由几个不同引物选择方案组成的混合物。例如，关于gB1F引物，其混合物包括W代表碱基A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)的引物。
根据本发明，通过能证明杂交的任一合适的方法，将特异性探针用于鉴定引起感染的病原体，具体是引起呼吸道感染的细菌。对于本领域技术人员，这些方法是众所周知的，这些方法可在溶液中和在结合DNA的固体支持物上进行，例如在硝酸纤维素膜或尼龙膜，或玻璃上。
本发明方法的一个优选实施方案中，使用DNA微阵列技术进行细菌鉴定。在说明书中，DNA微阵列或DNA芯片指已知的核酸序列以预先确定的顺序固定在上面的基片。如果固定在微阵列的核酸片段短于100碱基对(通常大约20-30碱基对)，微阵列被称为寡核苷酸阵列。
在本发明方法中，用于分析的样品可以是从怀疑患有感染疾病的患者中得到的细菌培养物、组织片段、例如唾液或呼吸道纤毛样品的分泌物样品、血样，或其他合适的样品。具体是用于分析的样品是适于临床诊断应用的分泌物样品。
使用任何常规方法，例如使用商业化DNA分离试剂盒(如HighPure PCR Template Preparation Kit，Roche；NucleoSpin，BDBiosciencesClontech；或QlAamp DNA迷你试剂盒，Qiagen)或使用传统的酚仿或相当的有机溶剂抽提法，通过手动或使用适于进行DNA分离的特殊设备，从样品中分离用于分析的DNA。因为可靠、快速和可重复性，优选使用商业化试剂盒。
本发明方法的DNA扩增中使用的试剂是常规用于DNA扩增的任何试剂，这在本领域技术人员之中也是众所周知的。合适的和节省成本的试剂，其是商业上可利用的，包括不同类型的Taq DNA聚合酶及其缓冲液(如AmpliTaqGOLD、AmpliTaqLD、DyNAzyme、TaqPlusPrecision，和HotStartTaq)、核苷酸或预先制备的核苷酸混合物(如Sigma、Applied Bio-systems、Amersham Biosystems)、MgCl2(通常使用来自Taq聚合酶生产商的产品)，和Cy5-dCTP(如NENLifeSciences、Amersham Biosciences)。
本发明方法中，使用任意常规已知方法进行克隆，例如使用商业化克隆试剂盒(如Qiagen PCR克隆试剂盒、QIAGEN或TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen)。使用任何适于本目的的测序仪(如AppliedBiosystems，model 373A，377，或3100，或Bio-Rad Sequi-Gen GT)对克隆产物进行测序，或者对产物手动测序。手动或使用为本目的设计的测序分析程序(Applied Biosystems Sequencer或Vector NTI SuiteVersion 7，InforMax)来分析序列。
扩增用到的设备可以是任何合适的装置(如T1Thermocycler，Biometra，或GenAmp PCR system 2700，Applied Biosystems)。实际上，适于DNA扩增的所有装置和设备都可以使用，也可通过将反应试管从一个温度转至另一个温度来进行手动扩增。此外，也可以在DNA微阵列上直接进行扩增。
使用任何商业化方法。(High Pure Produet Purification Kit，Roche；MicroSpin S-400，或S-300HR柱，Amersham Biosciences；或QlAquickPCR纯化试剂盒，Qiagen)，或使用有机溶剂抽提法进行纯化PCR产物。扩增产物也可用于杂交反应，而不需要任何额外的纯化或抽提步骤。
为了形成单链靶链，使用任何已知的消化方法。这些方法包括，如不对称PCR、核酸外切酶处理，或直接将单链靶链合成于微阵列表面(如matriXarray，Roche Applied Science)。本发明也包括在杂交反应中使用双链PCR产物中的应用。在本发明的这方面，不对称PCR是生成单链靶链的优选方法。
本发明方法中，为了生成标记的靶链，可使用任何合适的标记物。合适的标记法包括荧光标记(如Cy5、Cy3、Cy2、TexasRed、FITC、Alexa 488、TMR、FluorX、ROX、TET、HEX)、放射性标记(如32p、33p、33S)、和化学发光标记(如HiLight Single-Color Kit)。本发明中，优选Cy5-dCTP荧光标记(Amersham Biosciences)。本发明也包括不需要标记中的应用，例如基于电脉冲(如MotorolaeSensor)的核酸检测的那些应用。
当在固体支持物上进行杂交时，用于杂交的探针通过共价或非共价结合固定在固体支持物的表面。或者，使用其他化学、电子化学或类似的固定方法。探针固定在上面的基片或支持物，可选自玻璃、塑料、金属、尼龙、硝酸纤维素、聚丙烯酰胺、硅、或这些材料的复合物得以制备，基片的大小在几个毫米到几个分米中变化。对用到的基片表面进行氨基硅烷处理或任何其他的表面处理，例如环氧硅烷，或者使用不需要任何单独表面处理的基片。用于寡核苷酸探针的优选基片是氨基硅烷处理的显微镜载玻片(如Genorama，Asper Biotech Ltd.，Estonia)。
使用任何适于本目的的商业化阵列仪(如Qarray-mini阵列系统，Lucidea阵列点样仪，OmniGrid，或GeneMachines阵列仪)将探针点样固定(print)在微阵列支持物的表面上，或用移液枪将它们手动点样在支持物表面上。或者，使用照相平板印刷术在表面上直接合成探针。
杂交中用到的杂交混合物的组分可以不同于工作实施例中显示的组分，例如，可改变盐组分和/或浓度(如2-4×SSC或SSPE)，或使用商业化杂交液(如ArrayHyb，Sigma)。此外，在杂交混合物中，使用变性或稳定添加剂(如甲酰胺，DMSO，即二甲基亚砜)或降低非特异性结合的物质(如BSA，即牛血清蛋白，或ssDNA，即鲑精DNA)。可在多种杂交温度下进行杂交(通常在40-70℃)，进行杂交需要的时间取决于应用从几分钟到一天而变化。在恒温箱或特殊杂交装置(如GeneTAC HybStation或Lucidea Slidepro Hybridizer)中以代替水浴，进行杂交。杂交后洗涤步骤在它们的持续时间、体积、温度、和洗液组分方面变化，因此不同于作为例证的方法。也可使用单独装置实施微阵列载玻片的洗涤步骤。有时不需要洗涤步骤，因为微阵列载玻片在杂交后立即得以分析。在一优选的方法中，57℃水溶是合适的杂交条件。在这些条件下将载玻片杂交12-16小时。
使用可应用于本目的的任何设备或阅读器(如GeneTAC UC4，GenePix Personal 4100A，或Agilent DNA Microarray Scanner)，分析微阵列或芯片。如果使用荧光标签标记靶链，例如使用荧光显微镜，分析可得以进行。如果使用放射性标签，通过放射自显影术分析芯片或膜。如果在电子微阵列的表面进行杂交以及分析因此基于电子检测，使用为本目的设计的特殊设备分析微阵列。
仅仅几打细菌的种的基因组已经被全部测序绘图，这些细菌的种的多数是已知的病原体。因此，关于正常菌群及及其DNA序列的信息非常少。所以，专门基于PCR扩增的细菌的种特异性PCR引物和细菌诊断几乎不可能。
本发明方法不会遇上现有技术的问题。本发明方法的扩增步骤是非常敏感，并且不管细菌的种是革兰氏阴性或是革兰氏阳性(表3)，使用本发明的广范围引物，有效扩增来自不同种系发生的细菌的种的某个基因区(gyrB/parE)。此外，PCR产物长度短(约300碱基对)，其促进了扩增反应的效率。
设计用于gyrB/parE基因区的细菌的种特异性探针，该基因区的可变性显著地高于例如16SrRNA基因区，后者以前已用于细菌诊断中。尽管使用本方法的广范围引物还可有效地扩增正常菌群的细菌的种，也不会出现假阳性反应，因为本发明的探针是高度种特异性，仅仅鉴别它们被设计用于检测的那些细菌。当将来自肺炎链球菌的培养分离物扩增的靶链杂交到载玻片上，靶链仅仅和肺炎链球菌的特异探针以及阳性对照进行杂交。另一方面，杂交来自正常菌群扩增的靶链，例如轻链球菌(Streptococcus mitis)，产物将不会结合任何病原体探针；在这方面，仅仅阳性对照探针将发出信号(实施例7，表6)。本发明的所有寡核苷酸特异探针与多种菌种交叉测试，包括一些属于正常菌群的细菌的种，并且发现没有交叉反应出现(图2，表6)。因此，本发明的方法比相似类型的前述方法更加敏感和特异性。
本发明的诊断试剂盒可用于诊断引起感染的细菌，具体是引起呼吸道感染的那些细菌。试剂盒包括如上详细说明的本发明的DNA引物混合物，和如上详细说明的本发明的细菌的种特异性寡核苷酸探针序列的任何合适的和理想的混合物，所述序列任意地结合固定于支持物，和合适的阳性和任意阴性对照的探针序列，以及在扩增、杂交、纯化、洗涤和/或以上详细讨论的检测步骤中需要的任何试剂。本发明优选的诊断试剂盒含有DNA引物混合物，其包括具有与SEQ.ID.NR：76和77描述的序列，含有在表面附着SEQ.ID.NR：1至69描述的寡核苷酸探针序列的芯片，阳性和任意阴性对照，和实施本发明方法需要的任意试剂。下文中，本发明通过实施例得以更准确地阐述。当描述方法时，涉及不同的设备、材料、温度、化学品或本申请中使用的等价物。在本发明的不同应用中，这些因素以合适的方式自然地变化。因此，本发明及其实施方案不限于以下描述的实施例。
实施例1.根据本发明设计PCR引物
为了设计PCR引物，使用ClustalW队列算法，通过BioEdit程序，对来自不同种系发生群(表2)的多种细菌的种的gyrB蛋白(GyrB)和相关蛋白ParE的氨基酸序列进行序列对比。在GyrB的对比序列中找到几个保守基因区。从所研究的革兰氏阳性菌的种的parE基因中也找到相同的保守区。
这些保守氨基酸序列用作广范围引物设计的起始位点。首先将它们反向翻译为对应的核酸序列。由于遗传密码的简并性，在这些核酸序列中观测到几个简并性位点。此后，基于保守序列，合成多种引物对(定购于Sigma-Genosys，England，www.siama-aienosys.co.uk)并对特异性和敏感度进行测定。使用以下实施例4中描述的方法，通过扩增分离于表4所示细菌的种的DNA，进行测定特异性。通过分析分离于流感嗜血杆菌分离培养物中的DNA的最低浓度，确定引物对的敏感度，其中使用以下实施例4中描述扩增和鉴定方法，用不同的引物对进行扩增和测定。
基于这些测定结果，应该指出一些引物对可成功扩增纯细菌DNA，并且使用这些引物，可扩增所有研究的细菌的种的gyrB/parE基因。因此这些引物作为细菌的广范围引物而起作用。引物的敏感度有变化，具有最高敏感度的引物对用于研究临床样本(耳炎基质样品)。然而，发现引物对不足够敏感，因为它不能扩增来自于含有大量的人DNA的临床样本的细菌DNA。
为此，根据简并性而变化的新引物对得以合成(定购于Sigma-Genosys，England，www.sigma-genosys.co.uk)。使用纯细菌DNA和使用分离于临床样本的DNA(表5)，通过前述的方法研究特异性和敏感度。功能引物对是引物混合物，其含有序列：
CGTCCWGGKATGTAYATHGG(SEQ.ID.NO：76)
和CCHACRCCRTGWAAWCCDCC(SEQ.ID.NO：77)，其分别命名为gB1F(正向引物混合物)和gB2R(反向引物混合物)(表1)，其中
W代表碱基A或T，
K代表碱基G或T，
Y代表碱基C或T，
H代表碱基A或C或T，
R代表碱基A或G，和
D代表碱基A或G或T。
使用这种引物混合物，鉴定所有研究的细菌的种的gyrB和/或parE基因的第一部分的保守序列。它扩增了来自于临床样本的DNA，保持了充分广范围的特异性，因此允许扩增来自引起呼吸道感染(参见实施例6和7)的所有菌种的gyrB/parE基因。具体地，引物混合物能用于扩增种系发生上远缘的细菌的gyrB/parE基因，甚至在样品包括大量的人DNA的情况下。
表2.用于序列对比的gyrB蛋白的氨基酸序列的细菌。
属 种
拟杆菌(Bacteroides) 脆弱(fragilis)
分枝杆菌(Mycobacteriun) 结核(tuberculosis)
链球菌(Streptococcus) 肺炎(pneumoniae)
热袍菌Thermototga 海栖(Maritima)
衣原体Chlamydia 肺炎(pneumoniae)
衣原体Chlamydia 沙眼(thrachomatis)
疏螺旋体Borrelia 伯氏(burgdorferi)
埃希氏菌(Escherichia) 大肠(coli)
奈瑟氏球菌(Neisseria) 淋病(gonorrhoeae)
嗜血杆菌(Haemophilus) 流感(influenzae)
粘球菌(Myxococcus) Xanthus
弧形杆菌(Campylobacter) 空肠(jejuni)
卷旋杆菌(Helicobacter) 幽门(pylori)
巴尔通体(Bartonella) 杆状(bacilliformis)
超嗜热菌(Aquifex) 气生(aeolicus)
表3.测试引物和探针的敏感度和特异性中用到的菌株。
  菌种   供方代码(样品类型)
  流感嗜血杆菌   ATCC 51907D(DNA)
  淋病奈瑟氏球菌   ATCC 53420D(DNA)
  肺炎分枝杆菌   ATCC 15531D(DNA)
  嗜肺军团菌   ATCC 33152D(DNA)
  绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)   ATCC 47085D(DNA)
  粘膜炎莫拉氏菌   DSM 9143(菌种)
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)   DSM 20231(菌种)
  化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)   DSM 20565(菌种)
  肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)   DSM 20566(菌种)
  坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)   DSM 20698(菌种)
  大肠杆菌(Escherichia coli)   DSM 30083(菌种)
  绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)   DSM 50071(菌种)
  口腔链球菌(Streptococcus oralis)   DSM 20627(菌种)
  轻链球菌(Streptococcus mitis)   DSM 12643(菌种)
  副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)   DSM 8978(菌种)
  Haemophilus ducreyi   DSM 8925(菌种)
  猪莫拉氏菌(Moraxella caviae)   ATCC 14659(菌种)
  Pasteurella pneumotropica   ATCC 13669(菌种)
  兔莫拉氏菌(Moraxella cuniculi)   ATCC 14688(菌种)
  肺炎衣原体(Chalmydia pneumoniae)   ATCC VR 1355(菌种)
ATCC＝美国典型培养物保藏中心
DSM＝德意志微生物保藏中心
实施例2.如本发明定义，通过克隆生成设计寡核苷酸探针需要的新序列
为了设计本发明的寡核苷酸探针，细菌的种粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、轻链球菌(Streptococcusmitis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、和副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)的GyrB序列，其是公开序列数据库中无法利用的，按照下述的常规方法得以合成。
使用QlAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen，Germany)，从细菌分离培养物分离的第一种DNA。当DNA得以分离时，使用对称(常规的)聚合酶链式反应(PCR)扩增用于克隆的所需的靶链。在扩增的第一步骤中，通过混和分离于样品的DNA、广范围细菌引物(实施例1)、以及扩增步骤中需要的其他成分来制备反应混和液。因此，用于克隆PCR的反应液(25μl)含有20pmol的引物混合物gB2R，20pmol引物混合物gB1F，各为200μM的dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Sigma，USA)，1×Hot Start Taq PCR缓冲液(Qiagen，Germany)，该缓冲液包含用于实现终浓度为2.8mM的MgCl2、7.5％的DMSO(AmershamPharmacia Biotech，USA)、2.5单位的Hot Start Taq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)、和2.5μl分离的DNA。
在GenAmp PCR系统2700热循环仪(Applied Biosystems)中，使用以下程序进行克隆PCR：变性步骤是95℃15分钟，40循环的95℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟，最后延伸步骤是72℃10分钟。完成PCR后，使用含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶，通过凝胶电泳检验成功的扩增。
PCR后，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，USA)立即进行克隆。用于克隆的混和液含有4μl的PCR产物、1μl的盐溶液(1.2MNaCl、0.06M MgCl2)、和1μl的TOPO载体(pCR 4-TOPO)，将它们在EP管中一起混匀。混和液于室温温育5分钟，此后溶液转至冰上。进行化学转化之后，2μl冷却的克隆混和液转入50μl的TOPO10E.coli感受态细胞。转化细胞冰上温育10分钟。在下一阶段中，进行热激处理。含有细胞的试管转入42℃水浴中热激30秒。该试管立即转至冰上之后，加入室温下的250μl SOC培养基(2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mMNaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)。37℃水平振荡(200rpm)试管1小时。在预热的选择LB平板(Luria-Bertani、10％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl、稀释于水的1.5％L-琼脂，pH7)上涂布20μl克隆混合物，所述平板含有50g/ml的氨苄青霉素。平板于37℃过夜温育。第二天，从平板中挑选10个克隆并进行测序PCR。
用于测序PCR的反应液(50μl)，其含有0.4pmol的M13反向(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)和M13正向(5′-GTAAACGACGGCCAG)引物(由试剂盒提供)，各为150μM的dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Sigma，USA)，1×Hot Start Taq PCR缓冲液(Qiagen，Germany)，1单位的Hot Start Taq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。为了进行扩增反应，借助于样品签(sample stick)将一小部分细菌菌落转移至PCR反应管。
依下列程序，在GenAmp PCR系统2700热循环仪(AppliedBiosystems)中进行测序PCR：变性步骤是95℃15分钟，30循环的94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟，最后延伸步骤是72℃10分钟。完成PCR后，使用含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶，通过凝胶电泳检验成功的扩增。此后，使用QlA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)通过除去多余的引物、核苷酸、缓冲液和聚合酶，纯化PCR产物。
纯化步骤之后，将插入载体的片段进行测序。用于测序步骤的12μl反应混和液含有100ng PCR产物和5pmol M13反向或M13正向引物。通过BigDye Terminator Version 3.0试剂盒和ABI-PRISM 3100遗传分析器(Applied Biosystems，USA)进行测序。使用Vector NTISuite Version 7程序(InforMax，USA)分析序列。
使用上述常规方法，生产用于下列细菌的种的gyrB序列：粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、轻链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、和副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)(SEQ.ID：NR：70至75)。
实施例3.设计细菌的种特异探针
在细菌的种特异性寡核苷酸，如探针，的设计中，使用基于序列对比的策略。将目的菌种的gyrB和parE基因，与几个参考细菌(近缘菌种)的对应基因进行序列对比。例如，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的gyrb基因，与化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、轻链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、Mycoplasma hominis、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，、和坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)的gyrB基因进行序列对比。S.oralis和S.mitis是S.pneumoniae的近缘种。因此，设计作为S.pneumoniae的寡核苷酸必须不与这些正常菌群发生反应。从EMBL公开序列数据库中获得序列，或通过实施例2中描述的克隆生成序列使用ClustalW队列算法，通过BioEdit程序进行序列对比。计算对比的共有序列，手动鉴定合适的保守区域。这些区域指在目的菌种的基因中是保守的和至少没有全部发现于来自参考细菌的基因的序列片段。具有合适长度(21-25个核苷酸)的寡核苷酸序列选自于用于比较分析的区域。使用FastA算法程序，将挑选的寡核苷酸序列与EMBL原核序列数据库进行比较。挑选出与非目的细菌的gyrB/parE序列进行比较时，有至少两处错配的寡核苷酸序列用于进一步分析。确定用于寡核苷酸的理论融解温度(Tm)，并研究二级结构信息。使用方程式81.5+16.6log[Na]+0.41(％GC)-0.61(％for)500/N计算Tm(C)，其中Na是一价阳离子的浓度(计算中使用50M)，％GC是鸟嘌呤核胞嘧啶的比例，％for是甲酰胺的浓度(计算中使用0％)和N是寡核苷酸的长度。使用Sigma-Genosys提供的程序研究二级结构信息。在网络浏览器的帮助下，在互联网地址：//www.sigma-genosys.co.uk/oligos/frameset.html(计算机/基础计算机)可使用该程序。选择不能形成明显的二级结构的和Tm温度至少是45℃的寡核苷酸，用于实验特异性测试。
合成寡核苷酸探针，同时从5’末端(NH2-修饰核苷酸)(Sigma-Genosys，England)进行修饰。如实施例4和5中描述，使用分离于不同菌种(表3)和病人样品(表5)的DNA样品，在实验室中测试探针的特异性。所测试的探针中，挑选功能性最好的和具有最高特异性的那些探针。表4A和4B显示细菌的种特异探针的序列和特异性。
表4A.GyrB寡核苷酸序列
寡核苷酸/SEQ.ID：NR：  特异性(ayrB基因)         序列(5′-3′)
1/1                    肺炎链球菌          CTCAAAAGAAGGTCTTCACCATC
2/2                    肺炎链球菌          GCCATATTCAAGTTTTTATTGAG
3/3                    肺炎链球菌          AGCCAGATGATTCGATTACTGTT
4/4                    肺炎链球菌          TTGAGACCGTCTTTACAGTCCTT
5/5                    化脓性链球菌        GTTTTGCCTCTCATATTAAAGTC
6/6            化脓性链球菌        TCTTTATTGAAGCAGATAATTCC
7/7            化脓性链球菌        CGTTGAAACAGTTTTTACAGTGT
8/8              肺炎衣原体        GGTCTTCATCATCTAGTCTATGA
9/9              肺炎衣原体        GGTTGTAGACWACAGCATTGACG
10/10            肺炎衣原体        AGCCATGGCAGSTTATTGCTCTA
11/11            肺炎衣原体        GGATTGATGTTSGCATTTTAGAG
12/12            肺炎衣原体        GGGTATTGTCWTCGTAGATAATG
13/13            肺炎衣原体        TTATTGCTCTAGGATTGATGTT
14/14            肺炎衣原体        GCATTTTAGAGSACGGGGGTATT
15/15            肺炎支原体        TCAAACTAACCCTTAAAGACAACT
16/16            肺炎支原体        TGAAACAGTGTTTACGGTACTCC
17/17          流感嗜血杆菌        ATGATAATTCTGTATCGGTGCAA
18/18          流感嗜血杆菌        AGCAGAAGTTATTATGACTGTGC
19/19          流感嗜血杆菌        GACGATAACTCTTATAAAGTATC
20/20          流感嗜血杆菌        GATACCGATGACGGTACTGGTTTG
21/21          金黄色葡萄球菌      AGTGTGGGAAATTGTCGATAATA
22/22          金黄色葡萄球菌      TGAAGTTGTTATTGAAAAAGATAAC
23/23          金黄色葡萄球菌      GGATTAAAGTAACGGATAACGGA
24/24          金黄色葡萄球菌      CTGTCGAAGTTATTTTAACTGTTT
25/25          金黄色葡萄球菌      CGACTTCAGAGAGAGGTTTGCAC
26/26            绿脓杆菌          GAAATCAGCATCACCATCCATAC
27/27            绿脓杆菌          ATACGGATGAGTCGATCACTGTC
28/28            绿脓杆菌          GACGACAACACCTACAAGGTGTC
29/29            绿脓杆菌          GACACCGACGATGGCACCGGTCTG
30/30          淋病奈瑟氏球菌      TTCGACAACAACAGCTACAAAAT
31/31          淋病奈瑟氏球菌      ATATGGTGTTTGAAGTATTGGAC
32/32          淋病奈瑟氏球菌      GACAAAATCACGGTAACGATACA
33/33          淋病奈瑟氏球菌      GACAACAACAGCTACAAAATCTC
34/34                     大肠杆菌        TATTCGAGGTGGTAGATAACGCT
35/35                     大肠杆菌        TTCACGCCGATAACTCTGTCTCT
36/36                     大肠杆菌        CGCCGATAACTCTGTCTCTGTAC
37/37                     大肠杆菌        GACGATAACTCCTATAAAGTGTC
38/38                     大肠杆菌        GACACGGATGACGGCACCGGTCTG
39/39                  粘膜炎莫拉氏菌     AGCTGCCGAGGTTATTATGACGG
40/40                  粘膜炎莫拉氏菌     GATGATAATTCATACAAAGTATC
41/41                  粘膜炎莫拉氏菌     TGTGGATATCCACCCTGAAGAAG
42/42                  粘膜炎莫拉氏菌     ATACCGATGATGGTACAGGCTTG
43/43                    嗜肺军团菌       GATGATAATTCCTACAAGGTATC
44/44                    嗜肺军团菌       AGCAGCCGAAGTCATCATGACAG
45/45                    嗜肺军团菌       TGTAGATATTCATAAAGAAGAAG
46/46                    嗜肺军团菌       ATACAGATGATGGAACCGGTTTG
47/47                    嗜肺军团菌       CAGATGATGGAACCGGTTTGCAT
48/48                    坏死梭杆菌       CAACATCAGCCAGGGGATTACAT
49/49                    坏死梭杆菌       GGAATTCCAGTAGACATACATCC
50/50                    坏死梭杆菌       TGAAAATGATAACTATAAAGTGTG
表4B.ParE寡核苷酸序列
寡核苷酸/SEQ.ID：NR，  特异性(parE基因)         序列(5′-3′)
1/51                   金黄色葡萄球菌     CGGTAACGAAATAGATGTAACAA
2/52                   金黄色葡萄球菌     AGAAGATAATGGACGTGGTATGC
3/53                   金黄色葡萄球菌     GTAAACCGACAGTCGAAGTTATC
4/54                   金黄色葡萄球菌     CAACTGATAAACGGGGATTACATC
5/55                   金黄色葡萄球菌     GGACAAGGCGGCTATAAAACTTC
6/56                    化脓性链球菌      TGGAGATGATATTAAGGTTGTTA
7/57                    化脓性链球菌      GTCAGTGTGGCAGATAGCGGACG
8/58                    化脓性链球菌      GGATTCCCACCGTTCAAGTTATT
9/59                    化脓性链球菌      CAACAGATGCTACGGGATTGCAC
10/60       化脓性链球菌         GGTCAGGGTGGCTACAAAACGTC
11/61        肺炎链球菌          TGGTGATCGTATTGATGTAACTA
12/62        肺炎链球菌          CTAACGGTTCAAGACCATGGACG
13/63        肺炎链球菌          GAATTCCAACTGTTGAGGTTATC
14/64        肺炎链球菌          CGACCGATGGCGCTGGTCTTCAT
15/65        肺炎链球菌          GGTCAAGGTGGCTATAAGACATC
16/66        肺炎支原体          TGCTAATACTATTGCCGTTGTTT
17/67        肺炎支原体          ATAACTGTTAGTGACAACGGTCG
18/68        肺炎支原体          AGATTTCTACGATTGACACCGTC
19/69        肺炎支原体          GATAACGATTGTTATAAGATTGC
实施例4.扩增分离于病人样品的DNA
使用下列所述的常规方法，对分离于细菌培养分离物或临床病人样品的DNA进行扩增。
使用QlAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen，Germany)，从样品(细菌培养物或临床病人样品)中分离用于分析的DNA。当分离了DNA时，使用不对称聚合酶链式反应(PCR)扩增需要的靶链。在扩增的第一时期中，将分离于样品的DNA、广范围gB1F和gB2R引物混合物(实施例1)和扩增中需要的其他组分一起混和，来制备反应液。
PCR反应混和液含有32pmol的gB2R引物混合物，8pmol的gB1F引物混合物，各为200μM的dATP、dGTP、和dTTP以及140μM的dCTP(Sigma，USA)，1×Hot Start Taq PCR缓冲液(Qiagen，Germany)，其中添加MgCl2直至终浓度为2.8mM，25nmol的Cy5-AP3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech，USA)，7.5％DMSO(Amersham Pharmacia Biotech，USA)，2.5单位的Hot Start Taq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)，和2.5μl分离的DNA，总体积为25μl。
使用GenAmp PCR系统2700热循环仪(Applied Biosystems，USA)进行PCR。使用下列PCR程序：变性步骤是95℃15分钟，40循环的94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟，最后延伸步骤是72℃10分钟。完成PCR后，使用含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶，通过凝胶电泳检验成功的扩增。此后，使用QlA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)通过除去多余的引物、核苷酸、缓冲液和聚合酶，纯化Cy5标记的PCR产物。
实施例5.样品微阵列的设计和功能
在5’末端氨化的寡核苷酸探针(根据实施例3设计)溶于400mM碳酸钠缓冲液(pH 9.0)，直至终浓度50μM。探针共价结合到氨基硅烷包埋的显微镜载玻片(Genorama，Asper Biotech Ltd.，Estonia)上。使用为本目的研制的自动装置(OmniGrid，GeneMachines，USA)和定位针(Telechem SMP3，USA)，将探针转移至载玻片上。印刻探针的面积的平均大小是120μm。此外，将5’末端氨化的阳性对照引物印刻到载玻片上。印刻后，为了将探针吸附于载玻片，将微阵列载玻片在氨蒸汽中保存1小时。在氨处理后，使用无菌水将载玻片洗涤三次并干燥。
其次，将Cy-5标记的靶链(根据实施例4制备)杂交到吸附探针的微阵列载玻片上。杂交反应混和液含有约200-300ng靶链、20×SSC(1μl的20×SSC含有175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，使用HCl调节pH至7.0；终浓度是3.4×)、20％十二烷基硫酸钠(SDS)(终浓度0.3％)、和无菌水，直至反应混和液体积为37μl。首先在95℃将混和液变性3分钟。此后立刻将试管置于冰上。混和液冷却后，用移液枪将混和液吸取至盖玻片上，所述盖玻片相对吸附探针的载玻片而放置。微阵列玻片放在杂交盒(Arraylt，TeleChem International，USA)中，并紧闭杂交盒。最后，杂交盒浸入水浴中。微阵列玻片于57℃杂交12-16小时。
杂交后，为了除去非杂交的DNA，在三次不同的洗液中洗涤微阵列玻片。如下列进行洗涤步骤：在0.1％SDS溶液中57℃5分钟，在0.1％SDS、0.5×SSC的洗液中室温5分钟，并在0.06×SSC中室温5分钟。
在玻片干燥后，使用微阵列扫描仪(Agilent DNA MicroarrayScanner，Agilent，USA)分析它们。如果Cy5-标记的靶链结合一个或几个探针，这些位点发出荧光信号。此外，阳性对照探针也发出荧光信号。
图2显示杂交结果的实例。分离于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的培养分离物的gyrB DNA片段(不对称Cy5标记的PCR产物)作为靶链。玻片实例包括特异于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(表4B：寡核苷酸22-25)的四条gyrB寡核苷酸。它们全部特异结合金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的靶链并且发出荧光信号。此外，五种阳性对照寡核苷酸发出荧光信号。
实施例6.病人样品的分析
从患有呼吸道感染的病人中获得的临床样品中分离DNA，并使用实施例4描述的方法进行扩增。使用附着了探针和阳性对照寡核苷酸(表4A和4B所列的)的微阵列玻片(实施例5中描述的)测试样品。如Nikkkari等(Emerging Infectious Diseases，vol 8，nro 2，2002，s.188-194)和Kotilainen等(Journal of Clinical Microbiology，vol 36，nro8，1998，s.2205-2209)以前描述，也可使用基于广范围PCR的方法分析相同的样品，
在广范围细菌PCR方法中使用起源于16SrRNA基因区的广范围引物。在先前的出版物中，它们被命名为fD1mod和16S1RR-B引物。克隆并测序PCR产物。将DNA序列与公开序列数据库(GenBank)进行比较，从而鉴定该细菌的种。表5显示该结果。
从表5可以得知，当与常规广范围PCR方法进行比较时，使用本发明的方法获得的结果完全相同。实施本发明限定的方法更加快速，因此约一天内能得到结果。另一方面，实施广范围细菌PCR，包括耗时的克隆和测序步骤，平均需要约一周。与培养测试比较，本发明的方法和广范围细菌PCR与培养法一样灵敏，甚至在一些情形中更加灵敏。
表5.在使用病人样品的不同方法中的比较
  临床图片   样品   培养结果   广范围引物PCR   本发明方法
  扁桃体炎   组织   无信息   F.N.   F.N.
  肺炎1)   唾液   未培养   无信息   S.P.
  耳炎培养基   脓液   H.I.   H.I.和M.C.   H.I.和M.C.
  耳炎培养基   脓液   S.P.   S.P.   S.P.
  耳炎培养基   脓液   阴性   H.I.   H.I.
  耳炎培养基   脓液   H.I.   H.I.   H.I.
  耳炎培养基   脓液   H.I.，S.P.   H.I.，M.C.和S.P.   H.I.，M.C.和S.P
  上颌窦炎   脓液   H.I.   H.I.   H.I.
  上颌窦炎   脓液   阴性   H.I.   H.I.
F.N.＝坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)
S.P.＝肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
H.I.＝流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
M.C.＝粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
1)分离于患有肺炎的病人的样品，未进行细菌培养和广范围PCR，只有本发明的方法得以实施。使用该方法，从样品中可发现肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。该结果与临床图片一致，因为该细菌的种是一种最普通的肺炎病原体。
实施例7.本发明的方法与基于特异寡核苷酸的已知方法的比较正常菌群的细菌会干扰多种细菌病原体的鉴定。细菌的存在对于人生物体的健康是必要的，据估计有几百种不同的细菌属于人正常菌群。因此，在一些情况中普通细菌丛能干扰细菌的诊断。
本发明方法的特异性，其中用到特异性gyrB/parE寡核苷酸探针，相对于正常菌群得以研究。同时，该方法与广范围和种特异性引物的混合物用于扩增的多重PCR方法进行比较。
从正常菌群轻链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、猪莫拉氏菌(Moraxella caviae)、和Moraxellacuniculi的培养分离物中分离DNA。此后，使用实施例4中描述的方法扩增分离的DNA，并使用附着特异性探针(表4A和4B)的微阵列玻片(实施例5中描述的)测试分离的DNA。作为对比，在Hendolin等(Journal of Clinical Microbiology，35；11，1997)的出版物中描述的特异性PCR引物得以合成，并使用该出版物中描述的方法进行多重PCR的变体。在常规多重PCR方法的变体中，起源于16SrRNA的共有基因区的广范围引物用作一个PCR引物，由四条不同细菌的种特异引物组成的引物混和物用作另一条PCR引物。用于诊断引物对的细菌的种是Alloiococcus otitidis、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。设计细菌的种特异引物以致于扩增的PCR产物长度取决于其从中分离的细菌的种不同。表6显示该结果。
结果表明使用本发明的方法，其中用到特异寡核苷酸探针，只有合意的细菌的种得以特异性鉴定。相反，已知方法和多重PCR方法定义的特异引物不能从所研究的普通细菌丛中辨别合意的细菌，因此特异性不足(图3)。
表6.本发明的方法与多重PCR方法的比较
细菌的种   *)菌种结合其上的探针(特异性)   多重PCR结果
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)   4B：10-14(Strep.pneu)4A：1-4(Strep.pneu)   使用特异引物扩增了Strep.pneu
化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)   4B：5-9(Strep.pyo)4A.5-7(Strep.pyo)   使用特异引物未扩增了Strep.pneu
口腔链球菌(Streptococcusoralis)   不结合   使用特异引物扩增了Strep.pneu
轻链球菌(Streptococcus mitis)   不结合   使用特异引物扩增了Strep.pneu
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)   4A：39-42(Morax.catarr)   使用特异引物扩增了Morax.cat
Moraxella cuniculi   不结合   使用特异引物扩增了Morax.cat
猪莫拉氏菌(Moraxella caviae)   不结合   使用特异引物扩增了Morax.cat
Neisseria gonorrhoae   4A：30-33(Neisseria gon.)   使用特异引物未扩增Morax.cat
*)4A表示表4A和4B表4B。数字(如10至14)指在前文提及的表中的寡核苷酸编号。特异性指寡核苷酸探针为何种细菌的种设计。
序列表
<110>MoBiDiag Oy
<120>来自拓扑异构酶基因区域的核酸探针和广范围引物，以及使用它们的方法
<130>2022264PC_continuation
<160>77
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>1
ctcaaaagaa ggtcttcacc atc                                  23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>2
gccatattca agtttttatt gag                                  23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>3
agccagatga ttcgattact gtt                                  23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>4
ttgagaccgt ctttacagtc ctt                              23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>5
gttttgcctc tcatattaaa gtc                              23
<210>6
<211>2
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>6
tctttattga agcagataat tcc                              23
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>7
cgttgaaaca gtttttacag tct                              23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>8
ggtcttcatc atctagtcta tga                              23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>9
ggttgtagac wacagcattg acg                          23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>10
agccatggca gsttattgct cta                          23
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>11
ggattgatgt tsgcatttta gag                          23
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>12
gggtattgtc wtcgtagata atg                          23
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>13
ttattgctct aggattgatg tt                           22
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)
<400>14
gcattttaga gsacgggggt att                           23
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>15
tcaaactaac ccttaaagac aact                          24
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>16
tgaaacagtg tttacggtac tcc                           23
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>17
atgataattc tgtatcggtg caa                           23
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>18
agcagaagtt attatgactg tgc                           23
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>19
gacgataact cttataaagt atc                            23
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>20
gataccgatg acggtactgg tttg                           24
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>21
agtgtgggaa attgtcgata ata                            23
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>22
tgaagttgtt attgaaaaag ataac                          25
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>23
ggattaaagt aacggataac gga                            23
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>24
ctgtcgaagt tattttaact gttt                            24
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>25
cgacttcaga gagaggtttg cac                             23
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400>26
gaaatcagca tcaccatcca tac                             23
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400>27
atacggatga gtcgatcact gtc                             23
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400>28
gacgacaaca cctacaaggt gtc                             23
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400>29
gacaccgacg atggcaccgg tctg                                24
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400>30
ttcgacaaca acagctacaa aat                                 23
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400>31
atatggtgtt tgaagtattg gac                                 23
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400>32
gacaaaatca cggtaacgat aca                                 23
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400>33
gacaacaaca gctacaaaat ctc                                 23
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>34
tattcgaggt ggtagataac gct                          23
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>35
ttcacgccga taactctgtc tct                          23
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>36
cgccgataac tctgtctctg tac                          23
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>37
gacgataact cctataaagt gtc                          23
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>38
gacacggatg acggcaccgg tctg                         24
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>39
agctgccgag gttattatga cgg                           23
<210>40
<211>23
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>40
gatgataatt catacaaagt atc                           23
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>41
tgtggatatc caccctgaag aag                           23
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>42
ataccgatga tggtacaggc ttg                           23
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
<400>43
gatgataatt cctacaaggt atc                           23
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
<400>44
agcagccgaa gtcatcatga cag                            23
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
<400>45
tgtagatatt cataaagaag aag                            23
<210>46
<211>23
<212>DNA
<213>嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
<400>46
atacagatga tggaaccggt ttg                            23
<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
<400>47
cagatgatgg aaccggtttg cat                            23
<210>48
<211>23
<212>DNA
<213>坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)
<400>48
caacatcagc caggggatta cat                            23
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)
<400>49
ggaattccag tagacataca tcc                            23
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)
<400>50
tgaaaatgat aactataaag tgtc                           24
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>51
cggtaacgaa atagatgtaa caa                            23
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>52
agaagataat ggacgtggta tgc                            23
<210>53
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>53
gtaaaccgac agtcgaagtt atc                            23
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>54
caactgataa acggggatta catc                         24
<210>55
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>55
ggacaaggcg gctataaaac ttc                          23
<210>56
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>56
tggagatgat attaaggttg tta                          23
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>57
gtcagtgtgg cagatagcgg acg                          23
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>58
ggattcccac cgttcaagtt att                          23
<210>59
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>59
caacagatgc tacgggattg cac                           23
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>60
ggtcagggtg gctacaaaac gtc                           23
<210>61
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>61
tggtgatcgt attgatgtaa cta                           23
<210>62
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>62
ctaacggttc aagaccatgg acg                           23
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>63
gaattccaac tgttgaggtt atc                           23
<210>64
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>64
cgaccgatgg cgctggtctt cat                               23
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>65
ggtcaaggtg gctataagac atc                               23
<210>66
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>66
tgctaatact attgccgttg ttt                               23
<210>67
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>67
ataactgtta gtgacaacgg tcg                               23
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>68
agatttctac gattgacacc gtc                               23
<210>69
<211>23
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>69
gataacgatt cttataagat tgc                                             23
<210>70
<211>294
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>70
cgaccaggga tgtatattgg tgataccgat gatggtacag gcttgcacca tatggtgttt     60
gaggtggtgg ataatgccat tgatgaggca ttggcaggtc actgtgatga gattaatatt    120
atcgtccatg acgatgaatc tgtttcggtg atggactatg ggcgtggtat tcctgtggat    180
atccaccctg aagaaggtgt atcagctgcc gaggttatta tgacggtgct tcatgcaggc    240
ggtaaatttg atgataattc atacaaagta tctgggggcc tgcacggcgt agga          294
<210>71
<211>257
<212>DNA
<213>嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
<400>71
ggggatacag atgatggaac cggtttgcat cacatggttt ttgaggttgt agataattca     60
atagatgagt ctctggcagg atattgcaag gaaatttttg ttaccatcca tagcgatgag    120
tcaattacag ttaaggacga tggccgtggt attcctgtag atattcataa agaagaaggc    180
aaatcagcag ccgaagtcat catgacagtc ctacatgctg gaggtaaatt tgatgataat    240
tcctacaagg tatctgg                                                   257
<210>72
<211>290
<212>DNA
<213>坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)
<400>72
cgcccaggga tgtacatcgg aacaacatca gccaggggat tacatcattt agtatgggaa   60
gtggtagata attctgtgga tgaagcattt gctgggtatt gtaataggat tactgtaagt  120
attttgcctg ataacattat tcaagtagag gataatggaa gaggaattcc agtagacata  180
catccaaaat atggaaaatc cgctttggaa attgtattga cggtattaca tgctggggga  240
aaatttgaaa atgataacta taaagtgtca ggtggactgc acggagttgg             290
<210>73
<211>291
<212>DNA
<213>轻链球菌(Streptococcus mitis)
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>n是a，t，c，或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(288)..(288)
<223>n是a，t，c，或g
<400>73
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<210>74
<211>288
<212>DNA
<213>口腔链球菌(Streptococcus oralis)
<400>74
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<210>75
<211>294
<212>DNA
<213>副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)
<400>75
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<210>76
<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<400>77
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Claims (30)

1.用于检测和鉴定临床样品中引起感染的细菌的种的方法，其特征在于：
a)使用DNA引物的混合物，对分离于所述临床样品的DNA进行扩增，其中所述混合物包含与来源于引起所述感染的细菌的种的拓扑异构酶编码基因的保守区的序列进行杂交的序列，所述序列包含SEQ ID NO：76和77描述的序列或其反向和/或互补序列，
b)将扩增的DNA与合意的寡核苷酸探针序列组合进行接触，所述序列在常规杂交条件下，与位于所述的引起所述感染的细菌的种的拓扑异构酶编码基因的保守区附近的超变区杂交，该序列在该杂交条件下具有细菌的种特异性，和
c)检测可能的杂交复合物的形成。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述引起感染的细菌的种是引起呼吸道感染的细菌的种。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述拓扑异构酶编码基因是gyrB/parE基因。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其特征在于所述的超变区是选自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、和坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)的细菌的种的gyrB和/或parE蛋白的编码基因的超变区。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤b)中使用的寡核苷酸探针序列的长度是15-30个核苷酸。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于步骤b)中使用的寡核苷酸探针序列的长度是20-30个核苷酸。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于步骤b)中使用的寡核苷酸探针序列的长度是21-25个核苷酸。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于所述寡核苷酸探针序列的组合包括SEQ ID NO：1至69描述的序列，和/或其反向或互补序列的全部或部分。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述寡核苷酸探针序列的组合包含SEQ ID NO：1至69描述的所有序列。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于所述寡核苷酸探针序列的组合附着于固体支持物之上。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤a)中从临床样品分离的DNA通过聚合酶链式反应进行扩增，以及步骤b)中扩增的DNA与附着于固体支持物之上的细菌的种特异性寡核苷酸探针进行接触。
12.根据权利要求10或11的方法，其特征在于所述固体支持物是处理过的玻璃。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于使用合适的标记核苷酸用于扩增步骤a)中从临床样品中分离的DNA，从而制备可检测的靶链。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于步骤b)中扩增的目的DNA与固体支持物接触，所述支持物附着有所有SEQ ID NO：1至69描述的序列和/或其反向或互补序列的细菌的种特异性寡核苷酸探针。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于所述目的DNA是被标记的。
16.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤b)中扩增的目的DNA与固体支持物接触，所述支持物附着有用于检测引起感染的一种特异细菌的种或几种特异细菌的种特异性寡核苷酸探针序列，所述序列是选自于表4A和4B显示的序列和/或其反向或互补序列。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于所述目的DNA是被标记的。
18.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤c)中使用微阵列技术。
19.DNA引物混合物，其特征在于包含与引起所述感染的细菌的种的拓扑异构酶的编码基因的保守区的序列杂交的序列，所述混合物包含SEQ ID NO：76和77描述的序列和/或其反向或互补序列。
20.根据权利要求19的DNA引物混合物，其特征在于所述引起感染的细菌的种是引起呼吸道感染的细菌的种。
21.根据权利要求19的DNA引物混合物，其特征在于所述拓扑异构酶的编码基因是gyrB和/或parE蛋白的编码基因。
22.用于诊断引起感染的细菌的种的寡核苷酸序列，其特征在于在常规杂交条件下它与超变区的序列杂交，所述超变区的序列能够用SEQ ID NO：76和77描述的引物序列和/或其反向或互补序列扩增、是细菌的种特异性的、并位于拓扑异构酶的编码基因的保守区附近，所述寡核苷酸序列是SEQ ID NO：1至69描述的一种序列和/或其反向或互补序列。
23.根据权利要求22的寡核苷酸序列，其特征在于所述拓扑异构酶的编码基因是gyrB和/或parE蛋白的编码基因。
24.用于诊断引起感染的细菌的种的寡核苷酸探针序列的组合，其特征在于包括SEQ ID NO：1至69描述的序列和/或其反向或互补序列的任意组合。
25.根据权利要求24的寡核苷酸探针的组合，其特征在于包括SEQ ID NO：1至69描述的所有序列。
26.根据权利要求24或25的寡核苷酸探针的组合用于检测、鉴定或分类引起感染的细菌的种的用途。
27.用于诊断引起感染的细菌的诊断试剂盒，其特征在于包括：
a)DNA引物混合物，其包含与引起感染的细菌的种的拓扑异构酶的编码基因的保守区的序列杂交的序列，所述混合物包含SEQ ID NO：76和77描述的序列和/或其互补序列，
b)细菌的种特异寡核苷酸探针序列的组合，任选附着于固体支持物上的，包括SEQ ID NO：1至69描述的序列和/或其反向或互补序列的任意组合，
c)阳性对照探针序列，和任选的
d)扩增、杂交、纯化洗涤、和/或检测步骤中需要的试剂。
28.根据权利要求27的诊断试剂盒，其特征在于c)中包括阴性对照探针序列。
29.根据权利要求28的诊断试剂盒，其特征在于所述引起感染的细菌的种是引起呼吸道感染的细菌的种。
30.根据权利要求28的诊断试剂盒，其特征在于所述拓扑异构酶的编码基因是gyrB和/或parE蛋白的编码基因。
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