JPH09252783A - 腸炎ビブリオ検出のためのヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
腸炎ビブリオ検出のためのヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH09252783A JPH09252783A JP8095971A JP9597196A JPH09252783A JP H09252783 A JPH09252783 A JP H09252783A JP 8095971 A JP8095971 A JP 8095971A JP 9597196 A JP9597196 A JP 9597196A JP H09252783 A JPH09252783 A JP H09252783A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
【構成】 配列ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＴ
Ｃ ＧＧＴ ＡＧＴを含むヌクレオチド。配列ＴＣＣ
ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＴＡを含
むヌクレオチド。上記二つのヌクレオチドからなるプラ
イマーセットを用いて検体中のＤＮＡジャイレースサブ
ユニットＢ遺伝子検体中に腸炎ビブリオに特異的な配列
を標的とし、当該標的核酸配列を選択的に増幅させ、検
体中に特異的なｇｙｒＢユニットが存在するか否かを決
定することで腸炎ビブリオの検出を行う方法。 【効果】 腸炎ビブリオのｇｙｒＢ遺伝子に特異的に反
応して、他のビブリオ種及びビブリオ属以外の菌株から
区別、同定できるようなプライマーを提供することがで
きた。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより、ＤＮＡの
抽出等の操作なしで、菌細胞からの腸炎ビブリオ特異的
な２８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検
出できる。
Ｃ ＧＧＴ ＡＧＴを含むヌクレオチド。配列ＴＣＣ
ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＴＡを含
むヌクレオチド。上記二つのヌクレオチドからなるプラ
イマーセットを用いて検体中のＤＮＡジャイレースサブ
ユニットＢ遺伝子検体中に腸炎ビブリオに特異的な配列
を標的とし、当該標的核酸配列を選択的に増幅させ、検
体中に特異的なｇｙｒＢユニットが存在するか否かを決
定することで腸炎ビブリオの検出を行う方法。 【効果】 腸炎ビブリオのｇｙｒＢ遺伝子に特異的に反
応して、他のビブリオ種及びビブリオ属以外の菌株から
区別、同定できるようなプライマーを提供することがで
きた。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより、ＤＮＡの
抽出等の操作なしで、菌細胞からの腸炎ビブリオ特異的
な２８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検
出できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂ
ｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に特徴的
な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーに関する。本発明は、ＤＮＡジャイレースサブユ
ニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）特異的プライマーを用いた
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）による腸
炎ビブリオの検出方法に関する。
ｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に特徴的
な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーに関する。本発明は、ＤＮＡジャイレースサブユ
ニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）特異的プライマーを用いた
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）による腸
炎ビブリオの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】腸炎ビブリオは多くの国で食中毒菌とし
て知られている。腸管以外の部位や術後傷にも認められ
る。腸炎ビブリオはグラム陰性多形性桿状菌であり、好
塩性通性嫌気性菌で炭水化物を発酵してガスを発生す
る。チオ硫酸−クエン酸塩−胆汁酸塩−蔗糖（ＴＣＢ
Ｓ）寒天培地上に緑色のコロニーを形成する。
て知られている。腸管以外の部位や術後傷にも認められ
る。腸炎ビブリオはグラム陰性多形性桿状菌であり、好
塩性通性嫌気性菌で炭水化物を発酵してガスを発生す
る。チオ硫酸−クエン酸塩−胆汁酸塩−蔗糖（ＴＣＢ
Ｓ）寒天培地上に緑色のコロニーを形成する。
【０００３】腸炎ビブリオを検出するには通常、増菌培
地を用いて培養し、選択的平板培養法により単離する方
法が用いられる。従来の検出法は１週間を要するので、
もっと迅速な方法が望まれている。トリプシン活性を測
定する蛍光アッセイ法は腸炎ビブリオを迅速に検出する
が、腸炎ビブリオをビブリオ アルジノリティカス、ビ
ブリオ ハーベイと区別できない。腸炎ビブリオとビブ
リオ アルジノリティカスの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は９
９．７％の相同性を示すので腸炎ビブリオとビブリオ
アルジノリティカスを同定するには時間のかかる方法し
か無かった。
地を用いて培養し、選択的平板培養法により単離する方
法が用いられる。従来の検出法は１週間を要するので、
もっと迅速な方法が望まれている。トリプシン活性を測
定する蛍光アッセイ法は腸炎ビブリオを迅速に検出する
が、腸炎ビブリオをビブリオ アルジノリティカス、ビ
ブリオ ハーベイと区別できない。腸炎ビブリオとビブ
リオ アルジノリティカスの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は９
９．７％の相同性を示すので腸炎ビブリオとビブリオ
アルジノリティカスを同定するには時間のかかる方法し
か無かった。
【０００４】ビブリオ属は３７の種からなる。いずれも
水性環境に由来するものである。ｒＤＮＡの系統学的デ
ータによるとＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ，Ｖ．ｏｒｄ
ａｌｌｉ，Ｖ．ｄａｍｓｅｌａとして知られている種は
新しく設立されたＬｉｓｔｏｎｅｌｌａ属、Ｐｈｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に移されている。１０種が胃腸
炎、傷の感染、ヒトの敗血症に関連しており、７種が魚
の病原菌として知られている。腸炎ビブリオは通常河口
や海といった環境に生息しており、しばしば夏期に海水
や魚介類から単離される。
水性環境に由来するものである。ｒＤＮＡの系統学的デ
ータによるとＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ，Ｖ．ｏｒｄ
ａｌｌｉ，Ｖ．ｄａｍｓｅｌａとして知られている種は
新しく設立されたＬｉｓｔｏｎｅｌｌａ属、Ｐｈｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に移されている。１０種が胃腸
炎、傷の感染、ヒトの敗血症に関連しており、７種が魚
の病原菌として知られている。腸炎ビブリオは通常河口
や海といった環境に生息しており、しばしば夏期に海水
や魚介類から単離される。
【０００５】腸炎ビブリオを単離、同定するには、検体
をｂｒｏｍｏｔｈｙｍｏｌ ｂｌｕｅ−ｔｅｅｐｏｌ寒
天培地又はＴＣＢＳ寒天培地等の選択培地に接種し、青
みがかった緑色のコロニーを単離し、そのコロニーの生
化学的性質を調べる。残念ながら、多くのビブリオの種
が同様の反応を示すので、確かな同定をするにはさらに
詳細な生化学的試験が必要になる。多数の単離菌株につ
いて広範囲な生化学的性質を調べるには多くの労力と時
間と費用を要する。腸炎ビブリオの血清学的同定法は他
のビブリオと交差反応を示す。
をｂｒｏｍｏｔｈｙｍｏｌ ｂｌｕｅ−ｔｅｅｐｏｌ寒
天培地又はＴＣＢＳ寒天培地等の選択培地に接種し、青
みがかった緑色のコロニーを単離し、そのコロニーの生
化学的性質を調べる。残念ながら、多くのビブリオの種
が同様の反応を示すので、確かな同定をするにはさらに
詳細な生化学的試験が必要になる。多数の単離菌株につ
いて広範囲な生化学的性質を調べるには多くの労力と時
間と費用を要する。腸炎ビブリオの血清学的同定法は他
のビブリオと交差反応を示す。
【０００６】先にＤＮＡを利用するビブリオの種の同定
法が開発されている。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｏ１から
のコレラ毒素オペロンを増幅させて特異的にこの菌を同
定できるＤＮＡプローブが用いられた。これらのプロー
ブはコレラ毒素を生産するコレラ菌以外のビブリオとも
交差反応する。蛍光ラベルしたオレゴヌクレオチドプロ
ーブを用いてメンブランフィルター上でハイブリダイゼ
ーションを行いＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓを同定する方
法も研究されている（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａ
ｌ.，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．５９：５４１-５４６，１９９３）。
法が開発されている。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｏ１から
のコレラ毒素オペロンを増幅させて特異的にこの菌を同
定できるＤＮＡプローブが用いられた。これらのプロー
ブはコレラ毒素を生産するコレラ菌以外のビブリオとも
交差反応する。蛍光ラベルしたオレゴヌクレオチドプロ
ーブを用いてメンブランフィルター上でハイブリダイゼ
ーションを行いＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓを同定する方
法も研究されている（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａ
ｌ.，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．５９：５４１-５４６，１９９３）。
【０００７】さらにＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓのサイト
リジン遺伝子（ｈｌｙＡ）配列の部分からの共有結合で
ラベルしたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが作製さ
れた。これらのプローブは非毒素性Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉ
ｃｕｓとは反応せず、したがって全てのＶ．ｖｕｌｎｉ
ｆｉｃｕｓを検出しない。同様に、毒性因子（ｔｄｈ、
ｔｔｈ遺伝子）をターゲットにした他の分子学的方法も
毒素を産生する腸炎ビブリオを検出することはできる。
しかし、この毒性因子を用いた場合、すべての腸炎ビブ
リオを検出することはできない。
リジン遺伝子（ｈｌｙＡ）配列の部分からの共有結合で
ラベルしたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが作製さ
れた。これらのプローブは非毒素性Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉ
ｃｕｓとは反応せず、したがって全てのＶ．ｖｕｌｎｉ
ｆｉｃｕｓを検出しない。同様に、毒性因子（ｔｄｈ、
ｔｔｈ遺伝子）をターゲットにした他の分子学的方法も
毒素を産生する腸炎ビブリオを検出することはできる。
しかし、この毒性因子を用いた場合、すべての腸炎ビブ
リオを検出することはできない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は腸炎ビブリオ
を他の３６種のビブリオ属の菌と区別できる検出法の提
供を目的とする。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより
ＤＮＡの抽出等の操作なしで、菌細胞からの腸炎ビブリ
オ特異的な２８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法
により検出する方法の提供を目的とする。
を他の３６種のビブリオ属の菌と区別できる検出法の提
供を目的とする。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより
ＤＮＡの抽出等の操作なしで、菌細胞からの腸炎ビブリ
オ特異的な２８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法
により検出する方法の提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ＰＣＲに有用なオリゴヌ
クレオチドプローブを提供するため、本発明は、腸炎ビ
ブリオに特徴的な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌ
クレオチドプライマーに関する。これらのプライマー
は、配列番号１および２を含み、そしてプライマーセッ
トとして、腸炎ビブリオに特徴的な核酸標的配列の検出
に使用される。
クレオチドプローブを提供するため、本発明は、腸炎ビ
ブリオに特徴的な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌ
クレオチドプライマーに関する。これらのプライマー
は、配列番号１および２を含み、そしてプライマーセッ
トとして、腸炎ビブリオに特徴的な核酸標的配列の検出
に使用される。
【００１０】プライマーセットは、腸炎ビブリオに特徴
的な核酸標的配列の在否の決定に関する方法に使用す
る。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽
出等の操作なしで、細胞からの腸炎ビブリオ特異的な２
８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片がＰＣＲ法により検出で
きる。
的な核酸標的配列の在否の決定に関する方法に使用す
る。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽
出等の操作なしで、細胞からの腸炎ビブリオ特異的な２
８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片がＰＣＲ法により検出で
きる。
【００１１】本発明において、「プライマー」は、標的
核酸配列のあるセクションへのハイブリダイズを許す特
異的ヌクレオチド配列をデザインまたは選択により含
む、合成によるかまたは生物学的に生産されたオリゴヌ
クレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼまたは
同様な酵素により伸長合成されて完全な標的核酸配列に
ハイブリダイズすることができる。プライマーは核酸配
列増幅法、例えばＰＣＲ法および鎖置換増幅（ＳＤＡ）
において利用される。特定のプライマーに、特にＳＤＡ
技術において有用なものは、標的核酸にハイブリダイズ
可能な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼの認識配
列、およびポリメラーゼまたはポリメラーゼ様活性を継
続する他の酵素がそれ自身その鋳型特異的オリゴヌクレ
オチド合成の開始を指示するための任意の配列を含む。
「ハイブリダイゼーション」は、予め決定された反応条
件下にて部分的または完全に相補的な核酸鎖が逆平行
（アンチパラレル）様式にて向かい合うようにして、特
異的かつ安定な水素結合により二本鎖の核酸を形成する
工程である。
核酸配列のあるセクションへのハイブリダイズを許す特
異的ヌクレオチド配列をデザインまたは選択により含
む、合成によるかまたは生物学的に生産されたオリゴヌ
クレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼまたは
同様な酵素により伸長合成されて完全な標的核酸配列に
ハイブリダイズすることができる。プライマーは核酸配
列増幅法、例えばＰＣＲ法および鎖置換増幅（ＳＤＡ）
において利用される。特定のプライマーに、特にＳＤＡ
技術において有用なものは、標的核酸にハイブリダイズ
可能な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼの認識配
列、およびポリメラーゼまたはポリメラーゼ様活性を継
続する他の酵素がそれ自身その鋳型特異的オリゴヌクレ
オチド合成の開始を指示するための任意の配列を含む。
「ハイブリダイゼーション」は、予め決定された反応条
件下にて部分的または完全に相補的な核酸鎖が逆平行
（アンチパラレル）様式にて向かい合うようにして、特
異的かつ安定な水素結合により二本鎖の核酸を形成する
工程である。
【００１２】上記のとおり、本発明は、腸炎ビブリオに
特異的な核酸標的配列の在否を決定するために有用なオ
リゴヌクレオチドプライマーに関する。そのような決定
を行うための方法は、ＰＣＲを用いた遺伝子増幅法にと
どまらず、従来技術であるサザンハイブリダイゼーショ
ン法等のプローブとしての使用も含む。本発明のプライ
マーは腸炎ビブリオのｇｙｒＢサブユニット遺伝子配列
に特異的である。プローブはプライマー増幅産物内の内
部コンセンサス配列に特異的である。
特異的な核酸標的配列の在否を決定するために有用なオ
リゴヌクレオチドプライマーに関する。そのような決定
を行うための方法は、ＰＣＲを用いた遺伝子増幅法にと
どまらず、従来技術であるサザンハイブリダイゼーショ
ン法等のプローブとしての使用も含む。本発明のプライ
マーは腸炎ビブリオのｇｙｒＢサブユニット遺伝子配列
に特異的である。プローブはプライマー増幅産物内の内
部コンセンサス配列に特異的である。
【００１３】本発明者らは従来技術の上記問題を解決す
るために高特異性プローブとしてＤＮＡジャイレース
（トポイソメラゼ▲II▼）のＢサブユニット蛋白をコー
ドするｇｙｒＢ遺伝子を用いる方法を検討した。
るために高特異性プローブとしてＤＮＡジャイレース
（トポイソメラゼ▲II▼）のＢサブユニット蛋白をコー
ドするｇｙｒＢ遺伝子を用いる方法を検討した。
【００１４】ｇｙｒＢ遺伝子を直接シークエンスしたユ
ニバーサルプライマーでＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａを検出、分類する方法が最近報告されている。
これらのユニバーサルプライマーを用いて種々のグラム
陰性菌、陽性菌のｇｙｒＢ遺伝子部分がＰＣＲ法により
増幅された。本発明者らはこれら既存のプライマーを用
いて３７種のビブリオ属のｇｙｒＢの部分１．２ｋｂを
増幅した。腸炎ビブリオ ＡＴＣＣ１７８０２株、ビブ
リオ アルジノリティカス ＡＴＣＣ１７７４９株のｇ
ｙｒＢ塩基配列を示した。
ニバーサルプライマーでＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａを検出、分類する方法が最近報告されている。
これらのユニバーサルプライマーを用いて種々のグラム
陰性菌、陽性菌のｇｙｒＢ遺伝子部分がＰＣＲ法により
増幅された。本発明者らはこれら既存のプライマーを用
いて３７種のビブリオ属のｇｙｒＢの部分１．２ｋｂを
増幅した。腸炎ビブリオ ＡＴＣＣ１７８０２株、ビブ
リオ アルジノリティカス ＡＴＣＣ１７７４９株のｇ
ｙｒＢ塩基配列を示した。
【００１５】本発明者らはさらに腸炎ビブリオのｇｙｒ
Ｂ遺伝子のみを増幅し、同定できるＰＣＲプライマーを
作製した。これら腸炎ビブリオ特異的プライマーの感度
を調ベるために１１８種の腸炎ビブリオの菌株、２０種
のビブリオ アルジノリティカスの菌株および、その他
の菌株７８種について検討した。
Ｂ遺伝子のみを増幅し、同定できるＰＣＲプライマーを
作製した。これら腸炎ビブリオ特異的プライマーの感度
を調ベるために１１８種の腸炎ビブリオの菌株、２０種
のビブリオ アルジノリティカスの菌株および、その他
の菌株７８種について検討した。
【００１６】山本，原山（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１；１１０４-１１０９，１９
９５）らはＤＮＡｇｙｒａｓｅＢサブユニット蛋白のア
ミノ酸配列の保存された部位２カ所からｇｙｒＢ遺伝子
を増幅させるＰＣＲプライマーを作製した。これらのプ
ライマーを用いて、種々の細菌からおよそ１．２ｋｂの
ｇｙｒＢ遺伝子部分が増幅された。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１；１１０４-１１０９，１９
９５）らはＤＮＡｇｙｒａｓｅＢサブユニット蛋白のア
ミノ酸配列の保存された部位２カ所からｇｙｒＢ遺伝子
を増幅させるＰＣＲプライマーを作製した。これらのプ
ライマーを用いて、種々の細菌からおよそ１．２ｋｂの
ｇｙｒＢ遺伝子部分が増幅された。
【００１７】腸炎ビブリオＡＴＣＣ１７８０２株とビブ
リオ アルジノリティカス ＡＴＣＣ１７７４９株から
増幅されたｇｙｒＢ遺伝子部分を遺伝子組み換えの常法
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ．１９８９）に従って適当なベクターによりクロー
ン化した。好ましいベクターとしてｐＧＥＭｚｆ（＋）
があげられるが、−般的なベクターであれば適宜選択し
て用いることができる。ｐＧＥＭｚｆ（＋）によリクロ
ーン化された腸炎ビブリオの１．２ｋｂのｇｙｒＢ遺伝
子部分はプラスミドｐＶＰｇｙｒＢ、ビブリオ アルジ
ノリティカスからのものはｐＶＡｇｙｒＢと呼ぶ。プロ
ーブの増殖も常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８９）によりなされる。例えば、プラスミドをベク
ターに挿入し、塩化カルシウムなどの有効な方法により
大腸菌を形質転換する。形質転換した細胞は適正条件下
で培養する。
リオ アルジノリティカス ＡＴＣＣ１７７４９株から
増幅されたｇｙｒＢ遺伝子部分を遺伝子組み換えの常法
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ．１９８９）に従って適当なベクターによりクロー
ン化した。好ましいベクターとしてｐＧＥＭｚｆ（＋）
があげられるが、−般的なベクターであれば適宜選択し
て用いることができる。ｐＧＥＭｚｆ（＋）によリクロ
ーン化された腸炎ビブリオの１．２ｋｂのｇｙｒＢ遺伝
子部分はプラスミドｐＶＰｇｙｒＢ、ビブリオ アルジ
ノリティカスからのものはｐＶＡｇｙｒＢと呼ぶ。プロ
ーブの増殖も常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８９）によりなされる。例えば、プラスミドをベク
ターに挿入し、塩化カルシウムなどの有効な方法により
大腸菌を形質転換する。形質転換した細胞は適正条件下
で培養する。
【００１８】目的とする遺伝子は菌体を溶解して回収
し、アルカリ法等により精製する。精製したプラスミド
をサンプルとして用いる。腸炎ビブリオをビブリオ ア
ルジノリティカスを含む他のビブリオから検出、区別す
るためにＰＣＲ法を試みた。この方法はプローブに相同
性のある配列を増幅するので、事実上、感度を増すこと
になる。プローブの塩基配列にしたがって、合成された
オリゴヌクレオチドプライマーは、サンプル中に目的と
する塩基配列が存在する場合のみＤＮＡを増幅する。感
度を増加するだけでなく、ＤＮＡプローブの塩基配列に
基づく特異的なオリゴヌクレオチドを使用することによ
り絶対的な特異性が得られる。
し、アルカリ法等により精製する。精製したプラスミド
をサンプルとして用いる。腸炎ビブリオをビブリオ ア
ルジノリティカスを含む他のビブリオから検出、区別す
るためにＰＣＲ法を試みた。この方法はプローブに相同
性のある配列を増幅するので、事実上、感度を増すこと
になる。プローブの塩基配列にしたがって、合成された
オリゴヌクレオチドプライマーは、サンプル中に目的と
する塩基配列が存在する場合のみＤＮＡを増幅する。感
度を増加するだけでなく、ＤＮＡプローブの塩基配列に
基づく特異的なオリゴヌクレオチドを使用することによ
り絶対的な特異性が得られる。
【００１９】有効なプライマーを作製するために、ｐＶ
ＰｇｙｒＢとｐＶＡｇｙｒＢの塩基配列をＤＮＡシーク
エンサーを用いて常法に従って決定した。ｇｙｒＢの塩
基配列を決定するために、増幅断片のＮ末端とＣ末端部
分もＵＰ−１Ｓ、ＵＰ−２Ｓｒプライマー（山本、原
山，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
６１：１１０４-１１０９，１９９５）を用いて決定し
た。さらに決定配列を伸展するためにＵＰ−１Ｓを用い
て得られた塩基配列から他のプライマーを作製した。増
幅断片の全塩基配列はおよそ１２００ｂｐであり、図
１、図２に示した。この塩基配列の情報を用いて、腸炎
ビブリオを他の細菌から検出、同定する２１ｂｐのプラ
イマーを作製した。これらのプライマーは、配列番号１
および２を含み、そしてプライマーセットとして利用可
能である。
ＰｇｙｒＢとｐＶＡｇｙｒＢの塩基配列をＤＮＡシーク
エンサーを用いて常法に従って決定した。ｇｙｒＢの塩
基配列を決定するために、増幅断片のＮ末端とＣ末端部
分もＵＰ−１Ｓ、ＵＰ−２Ｓｒプライマー（山本、原
山，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
６１：１１０４-１１０９，１９９５）を用いて決定し
た。さらに決定配列を伸展するためにＵＰ−１Ｓを用い
て得られた塩基配列から他のプライマーを作製した。増
幅断片の全塩基配列はおよそ１２００ｂｐであり、図
１、図２に示した。この塩基配列の情報を用いて、腸炎
ビブリオを他の細菌から検出、同定する２１ｂｐのプラ
イマーを作製した。これらのプライマーは、配列番号１
および２を含み、そしてプライマーセットとして利用可
能である。
【００２０】この新規のプライマーは既存のＰＣＲを用
いたアッセイ怯（Ｓａｉｋｉ ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３９：４８７-４９１，１９８８）において有
用である。このプライマーはサンプル中の目的とするＤ
ＮＡを増幅するのに用いられ、ＤＮＡ量を十分検出でき
るようにする。増幅段階に続いて、検出段階はＤＮＡ検
出に有効な方法であればどんな方法でもよい。例えば、
アガロースゲル電気泳動などが用いられる。目的とする
ＤＮＡはテンプレートとして機能する。サンプル中のテ
ンプレートＤＮＡの増幅はプライマーペアーを二重ＤＮ
Ａと処理することにより行われる。この処理により各核
酸配列に相補的な配列が伸長する。この伸長し生成した
配列はさらにプライマーのテンプレートとして機能す
る。この処理プロセスは、ＤＮＡの変性、プライマーと
相補的な配列とのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ
（例、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によるプライマ
ーの伸長からなり、目的とする配列の存在を検出するの
に必要な量のＤＮＡが生成されるまで繰り返す。ＰＣＲ
法による増幅条件は後述の実施例３にまとめた。
いたアッセイ怯（Ｓａｉｋｉ ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３９：４８７-４９１，１９８８）において有
用である。このプライマーはサンプル中の目的とするＤ
ＮＡを増幅するのに用いられ、ＤＮＡ量を十分検出でき
るようにする。増幅段階に続いて、検出段階はＤＮＡ検
出に有効な方法であればどんな方法でもよい。例えば、
アガロースゲル電気泳動などが用いられる。目的とする
ＤＮＡはテンプレートとして機能する。サンプル中のテ
ンプレートＤＮＡの増幅はプライマーペアーを二重ＤＮ
Ａと処理することにより行われる。この処理により各核
酸配列に相補的な配列が伸長する。この伸長し生成した
配列はさらにプライマーのテンプレートとして機能す
る。この処理プロセスは、ＤＮＡの変性、プライマーと
相補的な配列とのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ
（例、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によるプライマ
ーの伸長からなり、目的とする配列の存在を検出するの
に必要な量のＤＮＡが生成されるまで繰り返す。ＰＣＲ
法による増幅条件は後述の実施例３にまとめた。
【００２１】増幅に次いで増幅した配列をアガロースゲ
ル電気泳動により検出する。プライマーペア〔ＶＰ１
（配列番号１），ＶＰ２（配列番号２）〕はｇｙｒＢ遺
伝子配列を目的部分として用いた場合２８５ｂｐの配列
を増幅する。ＡＴＣＣ，ＪＣＭ，ＣＤＣ，ＮＣＩＭＢの
コレクションから得たビブリオ属の３７種の株について
２８５ｂｐの増幅を行った。これらの細菌の染色体ＤＮ
Ａは常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）にしたがって調製した。１
μｇの目的ＤＮＡを用い、ＰＣＲ法を行った。２８５ｂ
ｐの特異的なバンドは腸炎ビブリオにのみ認められ、他
の菌種ではいずれにおいても認められなかった（表
１）。しかし、山本，原山（１９９５）らによるプライ
マーセット（ＵＰ−１、ＵＰ−２ｒ）を用いたＰＣＲ増
幅では１．２ｋｂのｇｙｒＢ部分を検出したので、ＤＮ
ＡｇｙｒａｓｅＢサブユニットの存在は確かめられた。
これらの知見から本発明のプライマーは腸炎ビブリオ特
異的であり、この病原菌を検出するのに用いることがで
きる。
ル電気泳動により検出する。プライマーペア〔ＶＰ１
（配列番号１），ＶＰ２（配列番号２）〕はｇｙｒＢ遺
伝子配列を目的部分として用いた場合２８５ｂｐの配列
を増幅する。ＡＴＣＣ，ＪＣＭ，ＣＤＣ，ＮＣＩＭＢの
コレクションから得たビブリオ属の３７種の株について
２８５ｂｐの増幅を行った。これらの細菌の染色体ＤＮ
Ａは常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）にしたがって調製した。１
μｇの目的ＤＮＡを用い、ＰＣＲ法を行った。２８５ｂ
ｐの特異的なバンドは腸炎ビブリオにのみ認められ、他
の菌種ではいずれにおいても認められなかった（表
１）。しかし、山本，原山（１９９５）らによるプライ
マーセット（ＵＰ−１、ＵＰ−２ｒ）を用いたＰＣＲ増
幅では１．２ｋｂのｇｙｒＢ部分を検出したので、ＤＮ
ＡｇｙｒａｓｅＢサブユニットの存在は確かめられた。
これらの知見から本発明のプライマーは腸炎ビブリオ特
異的であり、この病原菌を検出するのに用いることがで
きる。
【００２２】
【表１】
【００２３】同様に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ，Ａｌｔｅｒ
ｏｍｏｎａｓ，Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ，Ｓｈｉｇｅｌ
ｌａ，Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの標準株についてもｇｙｒＢと
腸炎ビブリオ特異的な２８５ｂｐ配列の検出を行った。
表２に示したようにいずれの株においてもｇｙｒＢの存
在は認められたが、腸炎ビブリオ特異的２８５ｂｐ配列
は認められなかった。
ｏｍｏｎａｓ，Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ，Ｓｈｉｇｅｌ
ｌａ，Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの標準株についてもｇｙｒＢと
腸炎ビブリオ特異的な２８５ｂｐ配列の検出を行った。
表２に示したようにいずれの株においてもｇｙｒＢの存
在は認められたが、腸炎ビブリオ特異的２８５ｂｐ配列
は認められなかった。
【００２４】
【表２】
【００２５】腸炎ビブリオには種々の表現型、血清型、
毒素産生型が報告されている。腸炎ビブリオによって産
生される毒素の−つである熱安定なヘモリジンに特異的
なプローブが報告されている（Ｎｉｓｈｉｂｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．５５：２５１-２５６，１９９０）。これらの毒素
特異的プローブは臨床的には重要であるが、すべてのタ
イプの腸炎ビブリオを検出することはできない。食品の
腸炎ビブリオによる汚染を防ぐには、食品、あるいはそ
の環境中のすべてのタイプの腸炎ビブリオを検出する必
要がある。食品、水、土壌など種々のものから単離され
た腸炎ビブリオについてその表現型、血清型、毒性を調
べた。これら１１８株すベての腸炎ビブリオの株につい
てプライマーＶＰ１、ＶＰ２を用いたＰＣＲ法を行っ
た。あきらかに２８５ｂｐの配列が増幅された。結果を
表３に示す。表３の株は食品、土、水または糞便から分
離同定した株であり、一部は岡山大学篠田先生、九州大
学山本先生から譲り受けた。表３に示すように、同様に
種々のものから単離された２０株のビブリオ アルジノ
リティカスにおいては２８５ｂｐの配列の増幅は認めら
れなかった。
毒素産生型が報告されている。腸炎ビブリオによって産
生される毒素の−つである熱安定なヘモリジンに特異的
なプローブが報告されている（Ｎｉｓｈｉｂｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．５５：２５１-２５６，１９９０）。これらの毒素
特異的プローブは臨床的には重要であるが、すべてのタ
イプの腸炎ビブリオを検出することはできない。食品の
腸炎ビブリオによる汚染を防ぐには、食品、あるいはそ
の環境中のすべてのタイプの腸炎ビブリオを検出する必
要がある。食品、水、土壌など種々のものから単離され
た腸炎ビブリオについてその表現型、血清型、毒性を調
べた。これら１１８株すベての腸炎ビブリオの株につい
てプライマーＶＰ１、ＶＰ２を用いたＰＣＲ法を行っ
た。あきらかに２８５ｂｐの配列が増幅された。結果を
表３に示す。表３の株は食品、土、水または糞便から分
離同定した株であり、一部は岡山大学篠田先生、九州大
学山本先生から譲り受けた。表３に示すように、同様に
種々のものから単離された２０株のビブリオ アルジノ
リティカスにおいては２８５ｂｐの配列の増幅は認めら
れなかった。
【００２６】
【表３】
【００２７】ＰＣＲ法を用いたアッセイ系の評価を行う
ために、腸炎ビブリオＡＴＣＣ１７８０２株のゲノムＤ
ＮＡの希釈液を調製し、ＰＣＲ増幅のテンプレートとし
て用いた。１ｎｇのゲノムＤＮＡしか含有しない希釈液
からもプライマーＶＰ１、ＶＰ２を用いた増幅により検
出できた。感度をｎｇレベルからｐｇレベルにあげるた
めに、電気泳動したＤＮＡをサザンブロットにかけた。
腸炎ビブリオＡＴＣＣｌ７８Ｏ２株の培養細胞の希釈液
で上記プライマーによる増幅を行ったところ、およそ１
ｃｆｕ／ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅの検出限界であっ
た。このようにＰＣＲ法による検出限界は１ｃｆｕ／１
０μｌまたは１０3ｃｆｕ／ｍ１であった。プレーティ
ング、選択的寒天培地による検出は１生存細胞を検出す
る感度を持つが労力と時間を必要とする。
ために、腸炎ビブリオＡＴＣＣ１７８０２株のゲノムＤ
ＮＡの希釈液を調製し、ＰＣＲ増幅のテンプレートとし
て用いた。１ｎｇのゲノムＤＮＡしか含有しない希釈液
からもプライマーＶＰ１、ＶＰ２を用いた増幅により検
出できた。感度をｎｇレベルからｐｇレベルにあげるた
めに、電気泳動したＤＮＡをサザンブロットにかけた。
腸炎ビブリオＡＴＣＣｌ７８Ｏ２株の培養細胞の希釈液
で上記プライマーによる増幅を行ったところ、およそ１
ｃｆｕ／ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅの検出限界であっ
た。このようにＰＣＲ法による検出限界は１ｃｆｕ／１
０μｌまたは１０3ｃｆｕ／ｍ１であった。プレーティ
ング、選択的寒天培地による検出は１生存細胞を検出す
る感度を持つが労力と時間を必要とする。
【００２８】ＰＣＲ法によるアッセイ系は従来の検出法
に比べ、細菌の検出法に必須の速度、感度、特異性のバ
ランスにおいて優れており、有用である。
に比べ、細菌の検出法に必須の速度、感度、特異性のバ
ランスにおいて優れており、有用である。
【００２９】
【実施例】本発明を実施例によって説明する。実施例は
実施の１態様であり、本発明を限定するものではない。
実施の１態様であり、本発明を限定するものではない。
【００３０】実施例１従来法による食品中の腸炎ビブリオの単離 ２５ｇの食品サンプルにアルカリペプトン水〔日水製薬
（株）製〕を加え腸炎ビブリオＡＴＣＣ１７８Ｏ２株を
接種し、３７℃で１８時間培養した。１白金耳量の培養
液をＴＣＢＳ寒天培地に画線接種し、３７℃で２４時間
培養した。すべての緑色コロニーをさらにＴ1Ｎ1寒天培
地（Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ １％，ＮａＣｌ
１％，寒天１．５％含有蒸留水）上で単離した。よく単
離されたコロニーを生化学的試験にかけた。以下の性質
を示す菌株を典型的な腸炎ビブリオと同定した。オキシ
ダーゼ、リジンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカル
ボキシラーゼ、ゼラチナーゼ、リパーゼ、キチナーゼ陽
性；インドール産生；食塩濃度０．５〜８％、４２℃で
生育する；Ｏ／１２９（１５０μｇ）に対する感受性有
り；グルコース、マンニトール、マンノースから酸を生
成；アルギニンデヒドロゲナーゼ、アルギナーゼ陰性；
食塩濃度０％では生育しない；蔗糖、乳糖、サリシンか
ら酸を生成しない。
（株）製〕を加え腸炎ビブリオＡＴＣＣ１７８Ｏ２株を
接種し、３７℃で１８時間培養した。１白金耳量の培養
液をＴＣＢＳ寒天培地に画線接種し、３７℃で２４時間
培養した。すべての緑色コロニーをさらにＴ1Ｎ1寒天培
地（Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ １％，ＮａＣｌ
１％，寒天１．５％含有蒸留水）上で単離した。よく単
離されたコロニーを生化学的試験にかけた。以下の性質
を示す菌株を典型的な腸炎ビブリオと同定した。オキシ
ダーゼ、リジンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカル
ボキシラーゼ、ゼラチナーゼ、リパーゼ、キチナーゼ陽
性；インドール産生；食塩濃度０．５〜８％、４２℃で
生育する；Ｏ／１２９（１５０μｇ）に対する感受性有
り；グルコース、マンニトール、マンノースから酸を生
成；アルギニンデヒドロゲナーゼ、アルギナーゼ陰性；
食塩濃度０％では生育しない；蔗糖、乳糖、サリシンか
ら酸を生成しない。
【００３１】実施例２染色体ＤＮＡの単離 腸炎ビブリオの株をＴＳＢ培地（栄研製）中で３７℃、
約２４時間振とう培養した。細胞は遠心分離（トミー精
工製）して（１５，０００ｒｐｍ，１５分間、４℃）採
取し、１０ｍ１の滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁させた。細胞を
リゾチーム（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ；和光製）により溶
解し、静かに振とうしながら、３７℃に２０分間保持し
た。この溶解した細胞にＳＤＳ（最終濃度０．５％）を
加え、ゲノムＤＮＡが完全に分解するまで６５℃でイン
キュベートした。蛋白とＲＮＡを変性させるために、そ
れぞれプロテイナーゼＫ（最終濃度５００μｇ／ｍｌ）
とＲＮａｓｅ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃
でそれぞれ３０分間、６０分間インキュベートした。サ
ンプルは緩衝フェノール（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で３
回、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回、クロ
ロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽
出した。清澄な上清を得るために遠心分離を行い、ＤＮ
Ａは２倍量の氷冷エタノール：３Ｍ酢酸ナトリウム（１
０：１）で沈殿させた。この反応液を−２０℃で一晩保
存した。沈殿したＤＮＡは遠心分離で濃縮し、エタノー
ルを減圧留去した。この乾燥ＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解
し、ＤＮＡテンプレートとして用いた。ＤＮＡの純度は
アガロースゲル電気泳動により調べ、ＤＮＡ濃度は分光
光度計によって測定した。
約２４時間振とう培養した。細胞は遠心分離（トミー精
工製）して（１５，０００ｒｐｍ，１５分間、４℃）採
取し、１０ｍ１の滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁させた。細胞を
リゾチーム（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ；和光製）により溶
解し、静かに振とうしながら、３７℃に２０分間保持し
た。この溶解した細胞にＳＤＳ（最終濃度０．５％）を
加え、ゲノムＤＮＡが完全に分解するまで６５℃でイン
キュベートした。蛋白とＲＮＡを変性させるために、そ
れぞれプロテイナーゼＫ（最終濃度５００μｇ／ｍｌ）
とＲＮａｓｅ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃
でそれぞれ３０分間、６０分間インキュベートした。サ
ンプルは緩衝フェノール（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で３
回、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回、クロ
ロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽
出した。清澄な上清を得るために遠心分離を行い、ＤＮ
Ａは２倍量の氷冷エタノール：３Ｍ酢酸ナトリウム（１
０：１）で沈殿させた。この反応液を−２０℃で一晩保
存した。沈殿したＤＮＡは遠心分離で濃縮し、エタノー
ルを減圧留去した。この乾燥ＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解
し、ＤＮＡテンプレートとして用いた。ＤＮＡの純度は
アガロースゲル電気泳動により調べ、ＤＮＡ濃度は分光
光度計によって測定した。
【００３２】実施例３ＰＣＲ法によるアッセイ サンプル調製 ＤＮＡを抽出しない菌の全細胞もテンプレートとして用
いた。この場合、寒天培地で生育した新鮮な菌細胞を用
いた。液体培地で生育した細胞を用いる場合には遠心分
離により菌細胞を分離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
で１度洗浄し、適当な数の菌細胞を用いた。場合によっ
てはフェノール・クロロホルムによりＤＮＡを抽出し、
ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。
いた。この場合、寒天培地で生育した新鮮な菌細胞を用
いた。液体培地で生育した細胞を用いる場合には遠心分
離により菌細胞を分離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
で１度洗浄し、適当な数の菌細胞を用いた。場合によっ
てはフェノール・クロロホルムによりＤＮＡを抽出し、
ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。
【００３３】ＰＣＲ増幅条件 ＰＣＲアッセイはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ
ｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行った。反応液１０
０μｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ，ＭｇＣｌ2
１５ｍＭ，ＫＣｌ ５００ｍＭ、ｐＨ８．３）は、ゲノ
ムＤＮＡ１００ｎｇ、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１μＭ
のプライマーを含有する。ＤＮＡ変性は９４℃、６０秒
間、アニーリングは６０℃、６０秒間、ＤＮＡ伸長は７
２℃、１２０秒間で、３０サイクル行った。増幅に次い
で、検出はゲル電気泳動によって行った。サンプル２０
μｌはアガロースゲル電気泳動（１％アガロース、Ｓｅ
ａＫｅｍ ＭＥ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒ
ｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）にかけた。ＤＮＡバンド
はエチジウムブロマイド溶液で１０分間染色後、紫外線
照射して観察した。
ｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行った。反応液１０
０μｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ，ＭｇＣｌ2
１５ｍＭ，ＫＣｌ ５００ｍＭ、ｐＨ８．３）は、ゲノ
ムＤＮＡ１００ｎｇ、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１μＭ
のプライマーを含有する。ＤＮＡ変性は９４℃、６０秒
間、アニーリングは６０℃、６０秒間、ＤＮＡ伸長は７
２℃、１２０秒間で、３０サイクル行った。増幅に次い
で、検出はゲル電気泳動によって行った。サンプル２０
μｌはアガロースゲル電気泳動（１％アガロース、Ｓｅ
ａＫｅｍ ＭＥ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒ
ｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）にかけた。ＤＮＡバンド
はエチジウムブロマイド溶液で１０分間染色後、紫外線
照射して観察した。
【００３４】
【発明の効果】腸炎ビブリオのｇｙｒＢ遺伝子に特異的
に反応して、他のビブリオ種及びビブリオ属以外の菌株
から区別、同定できるようなプライマーを提供すること
ができた。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより、ＤＮ
Ａの抽出等の操作なしで、菌細胞からの腸炎ビブリオ特
異的な２８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法によ
り検出できる。
に反応して、他のビブリオ種及びビブリオ属以外の菌株
から区別、同定できるようなプライマーを提供すること
ができた。腸炎ビブリオ特異的プライマーにより、ＤＮ
Ａの抽出等の操作なしで、菌細胞からの腸炎ビブリオ特
異的な２８５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法によ
り検出できる。
【図１】腸炎ビブリオ ＡＴＣＣ１７８０２株のｇｙｒ
Ｂ塩基配列を示す図面である。
Ｂ塩基配列を示す図面である。
【図２】ビブリオ アルジノリティカス ＡＴＣＣ１７
７４９株のｇｙｒＢ塩基配列を示す図面である。
７４９株のｇｙｒＢ塩基配列を示す図面である。
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＧＴ 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＴＡ
【表３】
【表３】
【表３】
【表３】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】さらにＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓのサイト
リジン遺伝子（ｈｌｙＡ）配列の部分からの共有結合で
ラベルしたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが作製さ
れた。これらのプローブは非毒素性Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉ
ｃｕｓとは反応せず、したがって全てのＶ．ｖｕｌｎｉ
ｆｉｃｕｓを検出しない。同様に、毒性因子（ｔｄｈ、
ｔｒｈ遺伝子）をターゲットにした他の分子学的方法も
毒素を産生する腸炎ビブリオを検出することはできる。
しかし、この毒性因子を用いた場合、すべての腸炎ビブ
リオを検出することはできない。
リジン遺伝子（ｈｌｙＡ）配列の部分からの共有結合で
ラベルしたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが作製さ
れた。これらのプローブは非毒素性Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉ
ｃｕｓとは反応せず、したがって全てのＶ．ｖｕｌｎｉ
ｆｉｃｕｓを検出しない。同様に、毒性因子（ｔｄｈ、
ｔｒｈ遺伝子）をターゲットにした他の分子学的方法も
毒素を産生する腸炎ビブリオを検出することはできる。
しかし、この毒性因子を用いた場合、すべての腸炎ビブ
リオを検出することはできない。
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号１を含むヌクレオチド。
- 【請求項２】 配列番号２を含むヌクレオチド。
- 【請求項３】 配列番号１を含むヌクレオチドと配列番
号２を含むヌクレオチドからなるプライマーセットを用
いて検体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子
配列を標的とし、当該標的核酸配列を選択的に増幅さ
せ、検体中に腸炎ビブリオに特異的なｇｙｒＢユニット
が存在するか否かを決定することで腸炎ビブリオの検出
を行う方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8095971A JPH09252783A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | 腸炎ビブリオ検出のためのヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| CA002249183A CA2249183A1 (en) | 1996-03-26 | 1997-03-25 | Oligonucleotides used for detecting vibrio parahaemolyticus and method of detection therewith |
| EP97907459A EP0965636A4 (en) | 1996-03-26 | 1997-03-25 | OLIGONUCLEOTIDES USED FOR DETECTING VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS AND METHOD FOR DETECTING IT |
| PCT/JP1997/000991 WO1997035970A1 (fr) | 1996-03-26 | 1997-03-25 | Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection |
| US09/155,200 US6048697A (en) | 1996-03-26 | 1997-03-25 | Oligonucleotides used for detecting vibrio parahaemolyticus and method of detection therewith |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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