JP2695127B2 - ミコバクテリウムカンサシに特異的な核酸配列 - Google Patents
ミコバクテリウムカンサシに特異的な核酸配列Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチドプ
ローブおよび増幅プライマーに関し、特に、種特異性を
もってミコバクテリウム・カンサシの核酸にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドおよびプライマーに関す
る。
ローブおよび増幅プライマーに関し、特に、種特異性を
もってミコバクテリウム・カンサシの核酸にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドおよびプライマーに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ミコバクテリアは、抗酸性、非運動性の
グラム陽性杆菌属である。該属は、いくつかの種、ミコ
バクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕ
ｍ）、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌
（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結核菌ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ−ＢＣＧ）、ミコバクテリウム・ケロネエ（Ｍ．ｃ
ｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウム・フォルツイツム
（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ミコバクテリウム・ゴル
ドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテリウム・
イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ａｅ）、ミコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａ
ｓｉｉ）、ミコバクテリウム・ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒ
ｏｔｉ）、ミコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍ．
ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒ
ａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、およびヒト型結核菌
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むが、これらに
限定されない。これら生物の特定のものは病原性を有す
る。１９５３年を最初に、ミコバクテリア感染の症例が
米国で増加している。特に重要なのは結核であり、その
病因はヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
である。しかしながら、ヒト型結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）以外のミコバクテリア（ＭＯＴＴ）による
感染も増加している。これら新しい多くの症例は、ＡＩ
ＤＳの流行に関連しており、ミコバクテリアによる感染
の疑いが特に強い免疫弱体化人口を増やしている。鳥型
結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・カンサ
シ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）および他の非ヒト型結核菌
（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ミコバクテリアは、ＨＩ
Ｖ感染患者および他の免疫弱体化患者の日和見病原体と
して見いだされてきた。これらの感染は流行が素早くか
つ短期間に致命的になりうるため、これらの感染の迅速
な診断に関する要求が増加している。
グラム陽性杆菌属である。該属は、いくつかの種、ミコ
バクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕ
ｍ）、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌
（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結核菌ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ−ＢＣＧ）、ミコバクテリウム・ケロネエ（Ｍ．ｃ
ｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウム・フォルツイツム
（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ミコバクテリウム・ゴル
ドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテリウム・
イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ａｅ）、ミコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａ
ｓｉｉ）、ミコバクテリウム・ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒ
ｏｔｉ）、ミコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍ．
ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒ
ａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、およびヒト型結核菌
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むが、これらに
限定されない。これら生物の特定のものは病原性を有す
る。１９５３年を最初に、ミコバクテリア感染の症例が
米国で増加している。特に重要なのは結核であり、その
病因はヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
である。しかしながら、ヒト型結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）以外のミコバクテリア（ＭＯＴＴ）による
感染も増加している。これら新しい多くの症例は、ＡＩ
ＤＳの流行に関連しており、ミコバクテリアによる感染
の疑いが特に強い免疫弱体化人口を増やしている。鳥型
結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・カンサ
シ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）および他の非ヒト型結核菌
（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ミコバクテリアは、ＨＩ
Ｖ感染患者および他の免疫弱体化患者の日和見病原体と
して見いだされてきた。これらの感染は流行が素早くか
つ短期間に致命的になりうるため、これらの感染の迅速
な診断に関する要求が増加している。
【０００３】現在、ミコバクテリア感染の診断は抗酸性
染色および生物培養、続く生化学分析に依存する。これ
らの工程は時間を浪費し、慣用的培養法を用いる典型的
な診断は６週間を要する。自動化培養システム、例えば
ＢＡＣＴＥＣシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓ
ｐａｒｋｓ，ＭＤ）は診断時間を１から２週間に減らす
ことができた。しかしながら、ミコバクテリアの感染を
診断するための時間を１週間以下、好ましくは約１日に
減らす要求がいまだ存在する。オリゴヌクレオチドに基
づく分析、例えばサザンハイブリダイゼーションまたは
ドットブロットは迅速な結果をもたらすことができる
（即ち、１日未満）。属および種特異的オリゴヌクレオ
チドプローブも、核酸増幅による直接分析において使用
可能である。しかしながら、これらの迅速な検出法およ
び同定法は両方とも、ミコバクテリア属（ヒト型結核菌
および非ヒト型結核菌）に特異的なオリゴヌクレオチド
プローブまたは生物の特定が望まれる特定のミコバクテ
リア種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを必要と
する。
染色および生物培養、続く生化学分析に依存する。これ
らの工程は時間を浪費し、慣用的培養法を用いる典型的
な診断は６週間を要する。自動化培養システム、例えば
ＢＡＣＴＥＣシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓ
ｐａｒｋｓ，ＭＤ）は診断時間を１から２週間に減らす
ことができた。しかしながら、ミコバクテリアの感染を
診断するための時間を１週間以下、好ましくは約１日に
減らす要求がいまだ存在する。オリゴヌクレオチドに基
づく分析、例えばサザンハイブリダイゼーションまたは
ドットブロットは迅速な結果をもたらすことができる
（即ち、１日未満）。属および種特異的オリゴヌクレオ
チドプローブも、核酸増幅による直接分析において使用
可能である。しかしながら、これらの迅速な検出法およ
び同定法は両方とも、ミコバクテリア属（ヒト型結核菌
および非ヒト型結核菌）に特異的なオリゴヌクレオチド
プローブまたは生物の特定が望まれる特定のミコバクテ
リア種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを必要と
する。
【０００４】ミコバクテリウム・カンサシの実験室にお
ける慣用的な同定は、成長特性の生化学的試験および測
定に依存する。これらは、カタラーゼ生産、ウレアーゼ
活性、ツイーン（ＴＷＥＥＮ）加水分解、硝酸塩還元お
よび光に暴露した場合の生物の色素生産能力（光化学
性）を含む。他の幾つかのミコバクテリア種は類似した
生化学プロフィールを示すので、光化学性はミコバクテ
リウム・カンサシの同定のための決定的な特徴として習
慣的にあてにされた。しかしながら、光化学性の測定は
生物の純粋培養を必要とし、かつ、この表現形が可変性
で客観的であるために信頼性をもって測定することが難
しい。これらの理由から、オリゴヌクレオチドプローブ
を用いた種特異的ハイブリダイゼーションまたは核酸増
幅によるミコバクテリウム・カンサシの同定に関する企
てが存在してきた。フアング（Ｚ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ）ら
（１９９１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
９，２１２５−２１２９）は、ミコバクテリウム・カン
サシに関して一定の種特異性を有するゲノミックライブ
ラリーから得られたＤＮＡプローブを報告した。このク
ローン（ｐＫＭ１−９）は、ミコバクテリウム・ガスト
リ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）を含む他の種とある程度のクロ
スハイブリダイゼーションを示し、かつ、ミコバクテリ
ウム・カンサシとは遺伝的に異なる亜種は検出しなかっ
た。ｐＫＭ１−９のヌクレオチド配列は報告されておら
ず、その配列が由来する遺伝子も同定されていない。ロ
ス（Ｂ．Ｃ．Ｒｏｓｓ）ら（１９９２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０，２９３０−２９３３）も、
ｐＫＭ１−９プローブ、６５ｋＤａ抗原遺伝子、および
ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用い
た市販のＤＮＡプローブ試験（ＡＣＣＵ−ＰＲＯＢＥ，
Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い
た、ミコバクテリウム・カンサシとは遺伝的に異なる亜
種の同定を報告した。１６ＳのｒＲＮＡにハイブリダイ
ズする増幅プライマーを用いることにより、研究された
ミコバクテリウム・カンサシの変異体の１６ＳのｒＲＮ
Ａの配列決定および比較を行った。ヤン（Ｍ．Ｙａｎ
ｇ）ら（１９９３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．３１，２７６９−２７７２）は、臨床的分離物から
のミコバクテリウム・カンサシ特異的プローブの単離を
報告した。このプローブ（ｐ６１２３）は、ｐＫＭ１−
９に陰性の亜種を含む、試験されたすべてのミコバクテ
リウム・カンサシ株にハイブリダイズした。
ける慣用的な同定は、成長特性の生化学的試験および測
定に依存する。これらは、カタラーゼ生産、ウレアーゼ
活性、ツイーン（ＴＷＥＥＮ）加水分解、硝酸塩還元お
よび光に暴露した場合の生物の色素生産能力（光化学
性）を含む。他の幾つかのミコバクテリア種は類似した
生化学プロフィールを示すので、光化学性はミコバクテ
リウム・カンサシの同定のための決定的な特徴として習
慣的にあてにされた。しかしながら、光化学性の測定は
生物の純粋培養を必要とし、かつ、この表現形が可変性
で客観的であるために信頼性をもって測定することが難
しい。これらの理由から、オリゴヌクレオチドプローブ
を用いた種特異的ハイブリダイゼーションまたは核酸増
幅によるミコバクテリウム・カンサシの同定に関する企
てが存在してきた。フアング（Ｚ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ）ら
（１９９１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
９，２１２５−２１２９）は、ミコバクテリウム・カン
サシに関して一定の種特異性を有するゲノミックライブ
ラリーから得られたＤＮＡプローブを報告した。このク
ローン（ｐＫＭ１−９）は、ミコバクテリウム・ガスト
リ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）を含む他の種とある程度のクロ
スハイブリダイゼーションを示し、かつ、ミコバクテリ
ウム・カンサシとは遺伝的に異なる亜種は検出しなかっ
た。ｐＫＭ１−９のヌクレオチド配列は報告されておら
ず、その配列が由来する遺伝子も同定されていない。ロ
ス（Ｂ．Ｃ．Ｒｏｓｓ）ら（１９９２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０，２９３０−２９３３）も、
ｐＫＭ１−９プローブ、６５ｋＤａ抗原遺伝子、および
ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用い
た市販のＤＮＡプローブ試験（ＡＣＣＵ−ＰＲＯＢＥ，
Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い
た、ミコバクテリウム・カンサシとは遺伝的に異なる亜
種の同定を報告した。１６ＳのｒＲＮＡにハイブリダイ
ズする増幅プライマーを用いることにより、研究された
ミコバクテリウム・カンサシの変異体の１６ＳのｒＲＮ
Ａの配列決定および比較を行った。ヤン（Ｍ．Ｙａｎ
ｇ）ら（１９９３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．３１，２７６９−２７７２）は、臨床的分離物から
のミコバクテリウム・カンサシ特異的プローブの単離を
報告した。このプローブ（ｐ６１２３）は、ｐＫＭ１−
９に陰性の亜種を含む、試験されたすべてのミコバクテ
リウム・カンサシ株にハイブリダイズした。
【０００５】ロゴール（Ｔ．Ｒｏｇａｌｌ）ら（１９９
０．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６，１９１
５−１９２０）は、ミコバクテリア種の同定に関して、
ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ）に基づ
いた配列決定ストラテジーにおいて、上記の１６Ｓのｒ
ＲＮＡを用いた。しかしながら、これらのプライマーは
ミコバクテリウム・カンサシからミコバクテリウム・ガ
ストリを分類するためには用いられなかったが、それ
は、表現形の特徴が異なるにも拘わらずこれら２種から
の１６ＳのｒＲＮＡ配列が同一だからである。同様な研
究がベディングハウス（Ｂ．Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓ）
ら（１９９０．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
８，１７５１−１７５９）により報告されたが、彼は、
ヒト型結核菌グループ、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕ
ｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）およびミコバクテリウム・イントラセルラレエ
（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）に特異的な１
６ＳのｒＲＮＡの配列に由来するオリゴヌクレオチドを
報告した。１６ＳのｒＲＮＡ内の唯一の配列ストレッチ
が、ミコバクテリウム・ガストリ、ミコバクテリウム・
シミエ（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）およびミコバクテリウム・
スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）を
含むミコバクテリウム・カンサシの配列比較により同定
された。
０．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６，１９１
５−１９２０）は、ミコバクテリア種の同定に関して、
ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ）に基づ
いた配列決定ストラテジーにおいて、上記の１６Ｓのｒ
ＲＮＡを用いた。しかしながら、これらのプライマーは
ミコバクテリウム・カンサシからミコバクテリウム・ガ
ストリを分類するためには用いられなかったが、それ
は、表現形の特徴が異なるにも拘わらずこれら２種から
の１６ＳのｒＲＮＡ配列が同一だからである。同様な研
究がベディングハウス（Ｂ．Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓ）
ら（１９９０．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
８，１７５１−１７５９）により報告されたが、彼は、
ヒト型結核菌グループ、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕ
ｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）およびミコバクテリウム・イントラセルラレエ
（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）に特異的な１
６ＳのｒＲＮＡの配列に由来するオリゴヌクレオチドを
報告した。１６ＳのｒＲＮＡ内の唯一の配列ストレッチ
が、ミコバクテリウム・ガストリ、ミコバクテリウム・
シミエ（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）およびミコバクテリウム・
スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）を
含むミコバクテリウム・カンサシの配列比較により同定
された。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ミコバクテ
リウム・カンサシの種特異的検出および同定のためのオ
リゴヌクレオチドプローブおよび増幅プライマーとして
有用な核酸配列を提供する。種特異的とは、本発明のプ
ローブおよびプライマーがミコバクテリウム・カンサシ
の核酸とハイブリダイズし、ミコバクテリアの他の種の
核酸または近縁生物、例えばロドコッカス・ロドクロウ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）およびノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）の核酸とはほとんどあ
るいは全くクロスハイブリダイゼーションしないことを
意味する。これらのプローブおよびそれらが由来するミ
コバクテリウム・カンサシのゲノミックライブラリーＤ
ＮＡの断片の配列は、以前に報告されたミコバクテリウ
ム・カンサシ特異的核酸配列とは異なる。これらのプロ
ーブおよびプライマーは培養物の同定を確認するための
手段としてサンプルを培養した後に使用してよい。別法
として、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅に
基づいたバクテリアＤＮＡの検出法および同定法におい
ては培養前に用いてよい。いずれにおいても、本発明の
プローブ、プライマーおよび診断法は、ミコバクテリウ
ム・カンサシと他のミコバクテリア種との迅速な識別手
段を提供し、それにより、習慣的にあてにされてきた、
時間を浪費する表現形および生化学による方法にたよる
ことなく、実験者が迅速にこの微生物を同定することが
可能になる。微生物感染に包含される特定の病原のこの
ような迅速な同定は、短時間で適切な治療を決定するた
めに用いられうる情報を提供する。試験された臨床的お
よび環境的ミコバクテリウム・カンサシの９４％は、本
発明の増幅プライマーを用いた増幅分析において陽性で
あった。本発明のミコバクテリウム・カンサシ特異的配
列はｐ６１２３およびｐＭＫ１−９とは異なり、かつ、
以前には公知でなかったミコバクテリウム・カンサシゲ
ノムの遺伝子および部分に由来する。
リウム・カンサシの種特異的検出および同定のためのオ
リゴヌクレオチドプローブおよび増幅プライマーとして
有用な核酸配列を提供する。種特異的とは、本発明のプ
ローブおよびプライマーがミコバクテリウム・カンサシ
の核酸とハイブリダイズし、ミコバクテリアの他の種の
核酸または近縁生物、例えばロドコッカス・ロドクロウ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）およびノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）の核酸とはほとんどあ
るいは全くクロスハイブリダイゼーションしないことを
意味する。これらのプローブおよびそれらが由来するミ
コバクテリウム・カンサシのゲノミックライブラリーＤ
ＮＡの断片の配列は、以前に報告されたミコバクテリウ
ム・カンサシ特異的核酸配列とは異なる。これらのプロ
ーブおよびプライマーは培養物の同定を確認するための
手段としてサンプルを培養した後に使用してよい。別法
として、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅に
基づいたバクテリアＤＮＡの検出法および同定法におい
ては培養前に用いてよい。いずれにおいても、本発明の
プローブ、プライマーおよび診断法は、ミコバクテリウ
ム・カンサシと他のミコバクテリア種との迅速な識別手
段を提供し、それにより、習慣的にあてにされてきた、
時間を浪費する表現形および生化学による方法にたよる
ことなく、実験者が迅速にこの微生物を同定することが
可能になる。微生物感染に包含される特定の病原のこの
ような迅速な同定は、短時間で適切な治療を決定するた
めに用いられうる情報を提供する。試験された臨床的お
よび環境的ミコバクテリウム・カンサシの９４％は、本
発明の増幅プライマーを用いた増幅分析において陽性で
あった。本発明のミコバクテリウム・カンサシ特異的配
列はｐ６１２３およびｐＭＫ１−９とは異なり、かつ、
以前には公知でなかったミコバクテリウム・カンサシゲ
ノムの遺伝子および部分に由来する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸ハイブリ
ダイゼーション分析および核酸増幅反応においてミコバ
クテリウム・カンサシ特異性を示すオリゴヌクレオチド
プローブおよびプライマーを提供する。本発明において
同定された完全鎖長のミコバクテリウム・カンサシ特異
的配列は４９３塩基対の長さであり、６３％のＧＣ含有
率を示す。ＭＫ７の幾つかのミコバクテリウム・カンサ
シ特異的サブ配列も同定されて、ミコバクテリウム・カ
ンサシの種特異的検出および同定の分析において用いら
れるハイブリダイゼーションプローブおよび増幅プライ
マーのデザインに用いられた。
ダイゼーション分析および核酸増幅反応においてミコバ
クテリウム・カンサシ特異性を示すオリゴヌクレオチド
プローブおよびプライマーを提供する。本発明において
同定された完全鎖長のミコバクテリウム・カンサシ特異
的配列は４９３塩基対の長さであり、６３％のＧＣ含有
率を示す。ＭＫ７の幾つかのミコバクテリウム・カンサ
シ特異的サブ配列も同定されて、ミコバクテリウム・カ
ンサシの種特異的検出および同定の分析において用いら
れるハイブリダイゼーションプローブおよび増幅プライ
マーのデザインに用いられた。
【０００８】本発明のミコバクテリウム・カンサシ特異
的ヌクレオチド配列は、ミコバクテリウム・カンサシの
ゲノミックライブラリーに由来し、そして４９３塩基対
の長さであり、６３％のＧＣ含有率を示す（配列番号：
１）。ハイブリダイゼーションプローブおよび増幅プラ
イマーとして有用な配列番号：１のミコバクテリウム・
カンサシのサブ配列も同定された。これらのプローブお
よびプライマーはミコバクテリアＤＮＡに直接ハイブリ
ダイズして検出されるか、または核酸増幅反応において
プライマーとして用いられてミコバクテリウム・カンサ
シ特異的増幅産物を生産して検出される。即ち、実施例
として示したような、ハイブリダイゼーションプローブ
として用いられたミコバクテリウム・カンサシ特異的オ
リゴヌクレオチドも、核酸増幅プロトコルにおいてミコ
バクテリウム・カンサシ特異的増幅プライマーとして用
いてよく、また、その反対も可能であることは認識され
るべきである。本明細書において用いられる単語「プロ
ーブ」および「プライマー」は、したがって、所望の反
応におけるオリゴヌクレオチドの機能を示す。本発明に
より包含されるあらゆるミコバクテリウム・カンサシ特
異的ヌクレオチド配列は、検出法に応じてプローブまた
はプライマーのいずれかとして用いられる。
的ヌクレオチド配列は、ミコバクテリウム・カンサシの
ゲノミックライブラリーに由来し、そして４９３塩基対
の長さであり、６３％のＧＣ含有率を示す（配列番号：
１）。ハイブリダイゼーションプローブおよび増幅プラ
イマーとして有用な配列番号：１のミコバクテリウム・
カンサシのサブ配列も同定された。これらのプローブお
よびプライマーはミコバクテリアＤＮＡに直接ハイブリ
ダイズして検出されるか、または核酸増幅反応において
プライマーとして用いられてミコバクテリウム・カンサ
シ特異的増幅産物を生産して検出される。即ち、実施例
として示したような、ハイブリダイゼーションプローブ
として用いられたミコバクテリウム・カンサシ特異的オ
リゴヌクレオチドも、核酸増幅プロトコルにおいてミコ
バクテリウム・カンサシ特異的増幅プライマーとして用
いてよく、また、その反対も可能であることは認識され
るべきである。本明細書において用いられる単語「プロ
ーブ」および「プライマー」は、したがって、所望の反
応におけるオリゴヌクレオチドの機能を示す。本発明に
より包含されるあらゆるミコバクテリウム・カンサシ特
異的ヌクレオチド配列は、検出法に応じてプローブまた
はプライマーのいずれかとして用いられる。
【０００９】本明細書において特に開示されたプローブ
およびプライマーに加えて、ミコバクテリウム・カンサ
シ特異的プローブおよびプライマーも、用いられたあら
ゆる特定の分析フォーマットに関して適切な日常的方法
およびクライテリアを用いてＭＫ７配列から由来してよ
い。通常、これらのプローブおよびプライマーは少なく
とも約１０−１５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１
５−２９ヌクレオチドの長さになる。プローブおよびプ
ライマーはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸
（ＲＮＡ）のいずれでもよく、天然に存在する糖−リン
酸バックボーンであっても、当業界において公知のホス
ホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスフォネー
トまたはαヌクレオチドを含むように修飾されたバック
ボーンでもよい。プローブおよびプライマーは、オリゴ
ヌクレオチドの化学合成、形質転換宿主細胞中でのクロ
ーニングおよび増幅、または当業界において公知の他の
手段により生産してよい。
およびプライマーに加えて、ミコバクテリウム・カンサ
シ特異的プローブおよびプライマーも、用いられたあら
ゆる特定の分析フォーマットに関して適切な日常的方法
およびクライテリアを用いてＭＫ７配列から由来してよ
い。通常、これらのプローブおよびプライマーは少なく
とも約１０−１５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１
５−２９ヌクレオチドの長さになる。プローブおよびプ
ライマーはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸
（ＲＮＡ）のいずれでもよく、天然に存在する糖−リン
酸バックボーンであっても、当業界において公知のホス
ホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスフォネー
トまたはαヌクレオチドを含むように修飾されたバック
ボーンでもよい。プローブおよびプライマーは、オリゴ
ヌクレオチドの化学合成、形質転換宿主細胞中でのクロ
ーニングおよび増幅、または当業界において公知の他の
手段により生産してよい。
【００１０】本発明のプローブおよびプライマーは、ミ
コバクテリアを含む疑いのあるサンプル中の核酸にハイ
ブリダイズする。サンプルは単離された核酸、単離され
た微生物を含んでも、あるいは臨床サンプルでもよい。
典型的には、臨床サンプルは、生物学的流体または組織
の形態、例えば、痰、気管支洗浄物、胃洗浄物、血液、
乳、リンパ、皮膚および柔組織（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕ
ｅ）である。本発明のプローブおよびプライマーを用い
たハイブリダイゼーションの前に、一般的には、遊離核
酸よりむしろ完全生物体を含む疑いのあるサンプルを当
業界において公知の方法で処理することにより、存在す
るあらゆる微生物から核酸を放出させる。さらに、典型
的には、痰サンプルは分析のための核酸を放出させる前
に液状化する。ミコバクテリアはヒトにも非ヒト動物種
にも感染するので、本発明はヒトの診断法および家畜の
診断法の両方に適用可能であり、かつ、サンプルはいず
れの源から得てもよい。ヒトは、ヒト型結核菌、ミコバ
クテリウム・カンサシ、鳥型結核菌、ミコバクテリウム
・イントラセルラレエ、ミコバクテリウム・スクロフラ
セウムおよびミコバクテリウム・フォルツイツムを含む
さまざまなミコバクテリアに感染する可能性があり、本
発明のプローブ、プライマーおよび方法を用いてミコバ
クテリウム・カンサシが病原体であるために適切な治療
の選択が必要な症例を迅速に判別する。
コバクテリアを含む疑いのあるサンプル中の核酸にハイ
ブリダイズする。サンプルは単離された核酸、単離され
た微生物を含んでも、あるいは臨床サンプルでもよい。
典型的には、臨床サンプルは、生物学的流体または組織
の形態、例えば、痰、気管支洗浄物、胃洗浄物、血液、
乳、リンパ、皮膚および柔組織（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕ
ｅ）である。本発明のプローブおよびプライマーを用い
たハイブリダイゼーションの前に、一般的には、遊離核
酸よりむしろ完全生物体を含む疑いのあるサンプルを当
業界において公知の方法で処理することにより、存在す
るあらゆる微生物から核酸を放出させる。さらに、典型
的には、痰サンプルは分析のための核酸を放出させる前
に液状化する。ミコバクテリアはヒトにも非ヒト動物種
にも感染するので、本発明はヒトの診断法および家畜の
診断法の両方に適用可能であり、かつ、サンプルはいず
れの源から得てもよい。ヒトは、ヒト型結核菌、ミコバ
クテリウム・カンサシ、鳥型結核菌、ミコバクテリウム
・イントラセルラレエ、ミコバクテリウム・スクロフラ
セウムおよびミコバクテリウム・フォルツイツムを含む
さまざまなミコバクテリアに感染する可能性があり、本
発明のプローブ、プライマーおよび方法を用いてミコバ
クテリウム・カンサシが病原体であるために適切な治療
の選択が必要な症例を迅速に判別する。
【００１１】オリゴヌクレオチドプローブおよびプライ
マーを用いて、ミコバクテリア核酸へのハイブリダイズ
またはミコバクテリア核酸標的配列の増幅により、ミコ
バクテリウム・カンサシを検出および／または同定す
る。ひとつの態様において、標的ミコバクテリウム・カ
ンサシ核酸の直接検出のためのハイブリダイゼーション
法においてプローブを用いる。これらの方法は、ＤＮＡ
の検出のためのサザンブロット、ＲＮＡの検出のための
ノーザンブロットおよびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか
の検出のためのドットブロットを含む。これらの方法
は、当業界において一般的に公知であり、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版、サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ）、フリッシュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）およ
びマニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）編集、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載されている。第２の態
様において、サンプル中のミコバクテリウム・カンサシ
の存在は、標的核酸配列の種特異的増幅により検出およ
び／または同定される。この態様においては、本発明の
プローブまたはプライマーを慣用的核酸増幅プロトコル
において用いる。標的核酸へのプライマーの循環ハイブ
リダイゼーションに依存したあらゆる増幅プロトコル、
例えばＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号、第
４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第
４，９６５，１８８号）、リガーゼチェインリアクショ
ン（ＬＣＲ）（バイス（Ｗｅｉｓｓ）、１９９１，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５４，１２９２）、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）（ウオーカー（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２，
ＰＮＡＳ８９：３９２−３９６；ウオーカー（Ｇ．Ｗａ
ｌｋｅｒ）ら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）、核酸に基づく
配列増幅法（ＮＡＳＢＡ）（カンゲン（Ｃａｎｇｅｎ）
らの米国特許第５，１３０，２３８号）、転写に基づく
増幅法（コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）ら、１９８９、ＰＮＡＳ
８６：１１７３−１１７７）、自己維持配列複製法
（グアテリ（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０、Ｐ
ＮＡＳ ８７：１８７４−１８７８）またはＱβレプリ
カーゼシステム（リザルディ（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ）
ら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１
１９７−１２０２）を用いてよい。ＬＣＲにおける使用
に適切な隣接プライマーは配列番号：１から容易に選択
できる。しかしながら、本発明のプライマーと共に用い
るために好ましい増幅法は、標的配列へのプライマーの
循環ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型として用
いたプライマーの伸長合成、および標的配列からの伸長
合成プライマーの置換を利用する方法、例えばＰＣＲお
よびＳＤＡである。
マーを用いて、ミコバクテリア核酸へのハイブリダイズ
またはミコバクテリア核酸標的配列の増幅により、ミコ
バクテリウム・カンサシを検出および／または同定す
る。ひとつの態様において、標的ミコバクテリウム・カ
ンサシ核酸の直接検出のためのハイブリダイゼーション
法においてプローブを用いる。これらの方法は、ＤＮＡ
の検出のためのサザンブロット、ＲＮＡの検出のための
ノーザンブロットおよびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか
の検出のためのドットブロットを含む。これらの方法
は、当業界において一般的に公知であり、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版、サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ）、フリッシュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）およ
びマニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）編集、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載されている。第２の態
様において、サンプル中のミコバクテリウム・カンサシ
の存在は、標的核酸配列の種特異的増幅により検出およ
び／または同定される。この態様においては、本発明の
プローブまたはプライマーを慣用的核酸増幅プロトコル
において用いる。標的核酸へのプライマーの循環ハイブ
リダイゼーションに依存したあらゆる増幅プロトコル、
例えばＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号、第
４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第
４，９６５，１８８号）、リガーゼチェインリアクショ
ン（ＬＣＲ）（バイス（Ｗｅｉｓｓ）、１９９１，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５４，１２９２）、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）（ウオーカー（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２，
ＰＮＡＳ８９：３９２−３９６；ウオーカー（Ｇ．Ｗａ
ｌｋｅｒ）ら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）、核酸に基づく
配列増幅法（ＮＡＳＢＡ）（カンゲン（Ｃａｎｇｅｎ）
らの米国特許第５，１３０，２３８号）、転写に基づく
増幅法（コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）ら、１９８９、ＰＮＡＳ
８６：１１７３−１１７７）、自己維持配列複製法
（グアテリ（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０、Ｐ
ＮＡＳ ８７：１８７４−１８７８）またはＱβレプリ
カーゼシステム（リザルディ（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ）
ら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１
１９７−１２０２）を用いてよい。ＬＣＲにおける使用
に適切な隣接プライマーは配列番号：１から容易に選択
できる。しかしながら、本発明のプライマーと共に用い
るために好ましい増幅法は、標的配列へのプライマーの
循環ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型として用
いたプライマーの伸長合成、および標的配列からの伸長
合成プライマーの置換を利用する方法、例えばＰＣＲお
よびＳＤＡである。
【００１２】増幅プライマーは、プライマー伸長合成ま
たは標的配列にハイブリダイズした隣接プライマーの、
ライゲーションによる標的配列の増幅のためのプライマ
ーである。ＳＤＡによる増幅のためには、オリゴヌクレ
オチドプライマーはＧＣ含有率が低いものから選択され
るのが好ましく、プローブの総ヌクレオチド組成の７０
％未満が好ましい。同様に、ＳＤＡに関しては、標的配
列は２次構造を最小限にするために低いＧＣ含有率を有
することが好ましい。ＳＤＡ増幅プライマーの３’末端
（標的結合配列）は標的配列の３’にハイブリダイズす
る。標的結合配列は増幅プライマーに標的特異性を付与
し、本発明のミコバクテリウム・カンサシ特異的配列
は、したがってＳＤＡ増幅プライマー中の標的結合配列
として用いられる。ＳＤＡ増幅プライマーはさらにその
５’末端近傍に制限酵素の認識部位を含む。該認識部位
は、認識部位の一方の鎖が修飾されている（ｈｅｍｉｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ）場合にＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニッ
クを入れる制限エンドヌクレアーゼのためのものである
（ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２、ＰＮＡＳ
８９，３９２−３９６）。ＳＤＡ増幅プライマーは、
制限エンドヌクレアーゼが適切に認識部位に結合するよ
うに、該制限酵素認識部位の５’に付加配列を含んでよ
い。大多数のＳＤＡ反応に関しては、増幅プライマーは
標的配列の対数増幅に必須である。標的の末端への特定
の配列の付加を必要としない他の増幅法に関しては、増
幅プライマーは通常標的結合配列のみからなる。
たは標的配列にハイブリダイズした隣接プライマーの、
ライゲーションによる標的配列の増幅のためのプライマ
ーである。ＳＤＡによる増幅のためには、オリゴヌクレ
オチドプライマーはＧＣ含有率が低いものから選択され
るのが好ましく、プローブの総ヌクレオチド組成の７０
％未満が好ましい。同様に、ＳＤＡに関しては、標的配
列は２次構造を最小限にするために低いＧＣ含有率を有
することが好ましい。ＳＤＡ増幅プライマーの３’末端
（標的結合配列）は標的配列の３’にハイブリダイズす
る。標的結合配列は増幅プライマーに標的特異性を付与
し、本発明のミコバクテリウム・カンサシ特異的配列
は、したがってＳＤＡ増幅プライマー中の標的結合配列
として用いられる。ＳＤＡ増幅プライマーはさらにその
５’末端近傍に制限酵素の認識部位を含む。該認識部位
は、認識部位の一方の鎖が修飾されている（ｈｅｍｉｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ）場合にＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニッ
クを入れる制限エンドヌクレアーゼのためのものである
（ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２、ＰＮＡＳ
８９，３９２−３９６）。ＳＤＡ増幅プライマーは、
制限エンドヌクレアーゼが適切に認識部位に結合するよ
うに、該制限酵素認識部位の５’に付加配列を含んでよ
い。大多数のＳＤＡ反応に関しては、増幅プライマーは
標的配列の対数増幅に必須である。標的の末端への特定
の配列の付加を必要としない他の増幅法に関しては、増
幅プライマーは通常標的結合配列のみからなる。
【００１３】バンパープライマーはＳＤＡにおいて用い
られるプライマーであり、バンパープライマーの伸長合
成が下流のプライマーおよびその伸長合成産物を置換す
るように、増幅プライマーの上流の標的配列にアニール
する。バンパープライマーの伸長合成は増幅プライマー
の伸長合成産物を置換するための一つの方法であるが、
加熱も好ましい。
られるプライマーであり、バンパープライマーの伸長合
成が下流のプライマーおよびその伸長合成産物を置換す
るように、増幅プライマーの上流の標的配列にアニール
する。バンパープライマーの伸長合成は増幅プライマー
の伸長合成産物を置換するための一つの方法であるが、
加熱も好ましい。
【００１４】単語「標的」または「標的配列」は、増幅
プライマーにより増幅可能な核酸配列を意味する。これ
らは、増幅される起源の核酸配列、増幅される起源の核
酸配列の相補的第２鎖、および増幅反応により生産され
る起源配列コピーのいずれかの鎖を意味する。これらの
コピーは、増幅プライマーがハイブリダイズする起源標
的配列のコピーも含むという事実により、増幅可能な標
的配列としても機能する。
プライマーにより増幅可能な核酸配列を意味する。これ
らは、増幅される起源の核酸配列、増幅される起源の核
酸配列の相補的第２鎖、および増幅反応により生産され
る起源配列コピーのいずれかの鎖を意味する。これらの
コピーは、増幅プライマーがハイブリダイズする起源標
的配列のコピーも含むという事実により、増幅可能な標
的配列としても機能する。
【００１５】核酸はハイブリダイズするためには完全な
相補性を必要とはしないため、本明細書に開示されたプ
ローブおよびプライマーが、ミコバクテリウム・カンサ
シのプローブおよびプライマーとしての有用性を失わな
い範囲で修飾されてよいことは理解されるべきである。
当業界において知られているとおり、相補核酸配列およ
び部分的相補核酸配列のハイブリダイゼーションは、ハ
イブリダイゼーション条件を調節してストリンジェンシ
ーを増加または減少させることにより得ることができる
（即ち、ハイブリダイゼーション温度またはバッファー
中の塩濃度の調整）。開示された配列のそのようなマイ
ナーな修飾およびミコバクテリウム・カンサシ特異性を
維持するためのハイブリダイゼーション条件のあらゆる
必要な調整は日常的な実験のみを必要とし、そして当業
者にはよく理解されている。
相補性を必要とはしないため、本明細書に開示されたプ
ローブおよびプライマーが、ミコバクテリウム・カンサ
シのプローブおよびプライマーとしての有用性を失わな
い範囲で修飾されてよいことは理解されるべきである。
当業界において知られているとおり、相補核酸配列およ
び部分的相補核酸配列のハイブリダイゼーションは、ハ
イブリダイゼーション条件を調節してストリンジェンシ
ーを増加または減少させることにより得ることができる
（即ち、ハイブリダイゼーション温度またはバッファー
中の塩濃度の調整）。開示された配列のそのようなマイ
ナーな修飾およびミコバクテリウム・カンサシ特異性を
維持するためのハイブリダイゼーション条件のあらゆる
必要な調整は日常的な実験のみを必要とし、そして当業
者にはよく理解されている。
【００１６】本発明のプライマーを用いた増幅による核
酸生成物（即ち、増幅産物または伸長合成産物）は、特
徴的な大きさにより検出されてよく、例えばエチジウム
ブロマイドで染色したポリアクリルアミドまたはアガロ
ースゲル上で検出されてよい。別法としては、サンプル
中のミコバクテリウム・カンサシ核酸または特異的に増
幅されたミコバクテリウム・カンサシ標的配列は、本発
明のプローブおよびプライマーにハイブリダイズさせる
ことにより検出されてよい。ハイブリダイゼーションに
よる検出に関しては、オリゴヌクレオチドプローブに検
出可能な標識を付加することが典型的である。検出可能
な標識は、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーシ
ョンの指標として直接または間接に検出できるモイエテ
ィである。標識の直接検出に関しては、当業界において
公知のとおり、プローブを放射性標識で標識してオート
ラジオグラフィーにより検出するか、または蛍光モイエ
ティで標識して蛍光により検出する。別法としては、プ
ローブを検出可能にするような付加的試薬を必要とする
標識を付加することにより間接に検出してよい。間接に
検出可能な標識は、例えば化学発光剤、可視可能な反応
産物を生成する酵素および標識された特定の結合パート
ナー（例えば、抗体または抗原／ハプテン）に結合する
ことにより検出されるリガンド（例えば、ハプテン、抗
体または抗原）を含む。特に有用な標識は、ビオチン
（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンへの結
合により検出可能）および酵素、例えばホースラディッ
シュパーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ
（酵素基質を付加して発色反応産物を生成することによ
り検出可能）を包含する。そのような標識をオリゴヌク
レオチドに付加するかまたはオリゴヌクレオチド内に含
ませるための方法は当業界においてよく知られており、
それら方法のすべては本発明の使用に適している。
酸生成物（即ち、増幅産物または伸長合成産物）は、特
徴的な大きさにより検出されてよく、例えばエチジウム
ブロマイドで染色したポリアクリルアミドまたはアガロ
ースゲル上で検出されてよい。別法としては、サンプル
中のミコバクテリウム・カンサシ核酸または特異的に増
幅されたミコバクテリウム・カンサシ標的配列は、本発
明のプローブおよびプライマーにハイブリダイズさせる
ことにより検出されてよい。ハイブリダイゼーションに
よる検出に関しては、オリゴヌクレオチドプローブに検
出可能な標識を付加することが典型的である。検出可能
な標識は、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーシ
ョンの指標として直接または間接に検出できるモイエテ
ィである。標識の直接検出に関しては、当業界において
公知のとおり、プローブを放射性標識で標識してオート
ラジオグラフィーにより検出するか、または蛍光モイエ
ティで標識して蛍光により検出する。別法としては、プ
ローブを検出可能にするような付加的試薬を必要とする
標識を付加することにより間接に検出してよい。間接に
検出可能な標識は、例えば化学発光剤、可視可能な反応
産物を生成する酵素および標識された特定の結合パート
ナー（例えば、抗体または抗原／ハプテン）に結合する
ことにより検出されるリガンド（例えば、ハプテン、抗
体または抗原）を含む。特に有用な標識は、ビオチン
（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンへの結
合により検出可能）および酵素、例えばホースラディッ
シュパーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ
（酵素基質を付加して発色反応産物を生成することによ
り検出可能）を包含する。そのような標識をオリゴヌク
レオチドに付加するかまたはオリゴヌクレオチド内に含
ませるための方法は当業界においてよく知られており、
それら方法のすべては本発明の使用に適している。
【００１７】増幅された標的配列の検出に関しては、増
幅反応に使用されたプライマーを標識して検出プローブ
として用いてよいが、それは、プライマーが増幅産物中
に取り込まれるからである。別法としては、増幅プライ
マーとは異なる少なくともひとつの標識プローブを、増
幅された標的配列のハイブリダイゼーションによる検出
のためのプローブとして用いてよい。このプローブは、
増幅されたプライマーの中から、即ち内部プローブの中
から、標的中の配列にハイブリダイズするものを選択す
べきである。別法としては、該プライマーまたは内部プ
ローブは標識されて増幅産物の検出のために伸長合成さ
れてよい（前記、ウオーカーら）。
幅反応に使用されたプライマーを標識して検出プローブ
として用いてよいが、それは、プライマーが増幅産物中
に取り込まれるからである。別法としては、増幅プライ
マーとは異なる少なくともひとつの標識プローブを、増
幅された標的配列のハイブリダイゼーションによる検出
のためのプローブとして用いてよい。このプローブは、
増幅されたプライマーの中から、即ち内部プローブの中
から、標的中の配列にハイブリダイズするものを選択す
べきである。別法としては、該プライマーまたは内部プ
ローブは標識されて増幅産物の検出のために伸長合成さ
れてよい（前記、ウオーカーら）。
【００１８】便利には、ミコバクテリウム・カンサシの
種特異的検出および同定のためのプローブをキットの形
態でパッケージしてよく、該キットは検出法を実施する
ための他の成分および試薬をさらに含んでよい。例示と
して、そのようなキットは、本発明のプローブを少なく
ともひとつ、または増幅プライマーを少なくとも１対含
む。ハイブリダイゼーションによる検出に関しては、ハ
イブリダイゼーション溶液、例えば６×ＳＳＣ（０．９
Ｍ 塩化ナトリウム、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）、５×デンハルト溶液（０．１％ ｗ／ｖ ＦＩＣ
ＯＬＬ ＴＹＰＥ４００、０．１％ ｗ／ｖポリビニル
ピロリドン、０．１％ ｗ／ｖ ウシ血清アルブミン）
および１００μｇ／ｍｌ 剪断変性サケ精子ＤＮＡ、ま
たはプローブハイブリダイゼーションに有用なことが知
られている他の試薬も含めてよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（前記）を参照されたい。別法としては、公知の
核酸増幅法の一つと共に使用するのに適した試薬をミコ
バクテリウム・カンサシ特異的増幅プライマーと共に含
ませてよい。キットの成分は共通のコンテナーにパッケ
ージされて、本発明の方法の特定の態様を実施するため
の指示書を含むのが典型的である。さらに、付加的な成
分もキットに含めてよく、例えば検出プローブとして用
いるのに適切な標識第２プローブ、および標識を検出す
るための試薬または手段等である。
種特異的検出および同定のためのプローブをキットの形
態でパッケージしてよく、該キットは検出法を実施する
ための他の成分および試薬をさらに含んでよい。例示と
して、そのようなキットは、本発明のプローブを少なく
ともひとつ、または増幅プライマーを少なくとも１対含
む。ハイブリダイゼーションによる検出に関しては、ハ
イブリダイゼーション溶液、例えば６×ＳＳＣ（０．９
Ｍ 塩化ナトリウム、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）、５×デンハルト溶液（０．１％ ｗ／ｖ ＦＩＣ
ＯＬＬ ＴＹＰＥ４００、０．１％ ｗ／ｖポリビニル
ピロリドン、０．１％ ｗ／ｖ ウシ血清アルブミン）
および１００μｇ／ｍｌ 剪断変性サケ精子ＤＮＡ、ま
たはプローブハイブリダイゼーションに有用なことが知
られている他の試薬も含めてよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（前記）を参照されたい。別法としては、公知の
核酸増幅法の一つと共に使用するのに適した試薬をミコ
バクテリウム・カンサシ特異的増幅プライマーと共に含
ませてよい。キットの成分は共通のコンテナーにパッケ
ージされて、本発明の方法の特定の態様を実施するため
の指示書を含むのが典型的である。さらに、付加的な成
分もキットに含めてよく、例えば検出プローブとして用
いるのに適切な標識第２プローブ、および標識を検出す
るための試薬または手段等である。
【００１９】以下の実施例は本発明の特定の態様の例示
として示される。これらは本発明を、特許請求の範囲に
記載された発明に限定するためのものではない。
として示される。これらは本発明を、特許請求の範囲に
記載された発明に限定するためのものではない。
【００２０】
【実施例】以下の実施例において用いられたミコバクテ
リアは、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）ＡＴＣＣ２５２
９１、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＣＤＣ４、ミコ
バクテリウム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）ＴＭ
Ｃ１５４３、ミコバクテリウム・フラベシエンス（Ｍ．
ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＬＣＤＣ２６０１、ミコバクテ
リウム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）Ｔ
ＭＣ１５２９、ミコバクテリウム・ガストリ（Ｍ．ｇａ
ｓｔｒｉ）ＬＣＤＣ１３０１、ミコバクテリウム・ゴル
ドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）ＴＭＣ１３１８、ミコ
バクテリウム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒａｅ）ＡＴＣＣ１３９５０、ミコバクテ
リウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）ＴＭＣ１２
０１、ミコバクテリウム・カンサシＬＣＤＣ７１１１、
ミコバクテリウム・カンサシＬＣＤＣ７１４、ミコバク
テリウム・カンサシＬＣＤＣ７１５、ミコバクテリウム
・カンサシＬＣＤＣ７２４、ミコバクテリウム・カンサ
シＬＣＤＣ７２５、ミコバクテリウム・マロメンス
（Ｍ．ｍａｌｏｍｅｎｓｅ）ＣＤＣ９３、ミコバクテリ
ウム・マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）ＬＣＤＣ８０
１、ミコバクテリウム・ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ
ｉ）ＬＣＤＣ２０３、ミコバクテリウム・ノンクロモジ
ェニカス（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｓ）Ｌ
ＣＤＣ１４０１、ミコバクテリウム・スクロフラセウム
（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）ＴＭＣ１３０２、ミ
コバクテリウム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）Ｔ
ＭＣ１３２８、ミコバクテリウム・テレ（Ｍ．ｔｅｒｒ
ａｅ）ＴＭＣ１４５０、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）ＡＴＣＣ２７２９４、およびミコバク
テリウム・ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）ＬＣＤＣ１９０
１であった。用いられた非ミコバクテリアは、ボルデテ
ラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）ＡＴＣＣ８４６７、コリネバクテリウム・ジフ
テリエ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔ
ｈｅｒｉａｅ）ＡＴＣＣ１１９１３、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１
７７５、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ３３０８、ロド
コッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１３８０８であった。
ミコバクテリア株はＢＡＣＴＥＣバイアル中でＭｉｄｄ
ｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９培地で培養し、そして７０℃に
て４時間加熱して死滅させた。ゲノミックＤＮＡは前に
記載されたように単離した（ビスバナサン（Ｓ．Ｖｉｓ
ｕｖａｎａｔｈａｎ）ら、１９８９、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｍｔｄｓ．１０，５９−６４）。非ミコバクテ
リア株はＬｕｒｉａ培地または他の適切な培地で培養し
た。ゲノミックＤＮＡはＣＴＡＢミニプレップ法により
単離した（アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ）ら、１
９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）。
リアは、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）ＡＴＣＣ２５２
９１、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＣＤＣ４、ミコ
バクテリウム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）ＴＭ
Ｃ１５４３、ミコバクテリウム・フラベシエンス（Ｍ．
ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＬＣＤＣ２６０１、ミコバクテ
リウム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）Ｔ
ＭＣ１５２９、ミコバクテリウム・ガストリ（Ｍ．ｇａ
ｓｔｒｉ）ＬＣＤＣ１３０１、ミコバクテリウム・ゴル
ドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）ＴＭＣ１３１８、ミコ
バクテリウム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒａｅ）ＡＴＣＣ１３９５０、ミコバクテ
リウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）ＴＭＣ１２
０１、ミコバクテリウム・カンサシＬＣＤＣ７１１１、
ミコバクテリウム・カンサシＬＣＤＣ７１４、ミコバク
テリウム・カンサシＬＣＤＣ７１５、ミコバクテリウム
・カンサシＬＣＤＣ７２４、ミコバクテリウム・カンサ
シＬＣＤＣ７２５、ミコバクテリウム・マロメンス
（Ｍ．ｍａｌｏｍｅｎｓｅ）ＣＤＣ９３、ミコバクテリ
ウム・マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）ＬＣＤＣ８０
１、ミコバクテリウム・ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ
ｉ）ＬＣＤＣ２０３、ミコバクテリウム・ノンクロモジ
ェニカス（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｓ）Ｌ
ＣＤＣ１４０１、ミコバクテリウム・スクロフラセウム
（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）ＴＭＣ１３０２、ミ
コバクテリウム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）Ｔ
ＭＣ１３２８、ミコバクテリウム・テレ（Ｍ．ｔｅｒｒ
ａｅ）ＴＭＣ１４５０、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）ＡＴＣＣ２７２９４、およびミコバク
テリウム・ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）ＬＣＤＣ１９０
１であった。用いられた非ミコバクテリアは、ボルデテ
ラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）ＡＴＣＣ８４６７、コリネバクテリウム・ジフ
テリエ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔ
ｈｅｒｉａｅ）ＡＴＣＣ１１９１３、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１
７７５、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ３３０８、ロド
コッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１３８０８であった。
ミコバクテリア株はＢＡＣＴＥＣバイアル中でＭｉｄｄ
ｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９培地で培養し、そして７０℃に
て４時間加熱して死滅させた。ゲノミックＤＮＡは前に
記載されたように単離した（ビスバナサン（Ｓ．Ｖｉｓ
ｕｖａｎａｔｈａｎ）ら、１９８９、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｍｔｄｓ．１０，５９−６４）。非ミコバクテ
リア株はＬｕｒｉａ培地または他の適切な培地で培養し
た。ゲノミックＤＮＡはＣＴＡＢミニプレップ法により
単離した（アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ）ら、１
９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）。
【００２１】実施例１ ＭＫ７のクローニング ミコバクテリウム・カンサシのＤＮＡのプラスミドライ
ブラリーを構築して、属特異的または種特異的クローン
に関してスクリーニングした。ライブラリーを構築する
ために、ミコバクテリウム・カンサシのゲノミックＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で消化した。
生じた断片の大きさは約１．４ｋｂから２００塩基対の
範囲であった。クローニングベクターＢＬＵＥＳＣＲＩ
ＰＴ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＢａｍＨＩ
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で消化して、ウシ大腸のアルカ
リホスファターゼ（ＣＩＡＰ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用い
てリン酸化した。ゲノミックの断片（７５０ｎｇ）は、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭＭ
ｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰおよび１ユ
ニット／１０μｌＴ４ライゲース（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）中にて、２０ｎｇの調製されたベクターと連結し
た。連結は一晩１５℃において行い、そしてこれを用い
てＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を形質転換した。１０００の形質転換体が単離され
た。これら１０００クローンのうち、さまざまなミコバ
クテリアおよび非ミコバクテリアＤＮＡのゲノミックブ
ロットのスクリーニングにより１５を選択した。
ブラリーを構築して、属特異的または種特異的クローン
に関してスクリーニングした。ライブラリーを構築する
ために、ミコバクテリウム・カンサシのゲノミックＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で消化した。
生じた断片の大きさは約１．４ｋｂから２００塩基対の
範囲であった。クローニングベクターＢＬＵＥＳＣＲＩ
ＰＴ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＢａｍＨＩ
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で消化して、ウシ大腸のアルカ
リホスファターゼ（ＣＩＡＰ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用い
てリン酸化した。ゲノミックの断片（７５０ｎｇ）は、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭＭ
ｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰおよび１ユ
ニット／１０μｌＴ４ライゲース（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）中にて、２０ｎｇの調製されたベクターと連結し
た。連結は一晩１５℃において行い、そしてこれを用い
てＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を形質転換した。１０００の形質転換体が単離され
た。これら１０００クローンのうち、さまざまなミコバ
クテリアおよび非ミコバクテリアＤＮＡのゲノミックブ
ロットのスクリーニングにより１５を選択した。
【００２２】サザンブロットは以下のとおりに実施し
た。各ミコバクテリア種および非ミコバクテリア種から
のゲノミックＤＮＡをＰｓｔＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
により消化し、０．８％アガロースゲルにより分離し
て、ナイロン膜に転写した（マニアティス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、前記）。マニアティス（前記）により、膜
をＵＶ架橋（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）し、32Ｐ標識
プローブ（即ち、１５の選択されたクローンから単離さ
れたインサート）をハイブリダイズした。プローブは、
［α−32Ｐ］−デオキシアデノシン３リン酸および［α
−32Ｐ］−デオキシシチジン３リン酸（ＮＥＮ−ＤｕＰ
ｏｎｔ）を用いてランダムプライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）により標識した。ハイブリダイズした膜を高いスト
リンジェンシーにて洗浄し、ＸＡＲ−５フィルムに対し
て１−７日間暴露した（マニアティス、前記）。１５の
クローンのうち、ＭＫ７が特異的にミコバクテリウム・
カンサシのＤＮＡにハイブリダイズすることが見いださ
れた。このクローンはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーにより、ＴＡ
Ｑ ＤＹＥ ＰＲＩＭＥＲまたはＴＡＱ ＤＹＥ ＴＥ
ＲＭＩＮＡＴＯＲ ＣＹＣＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ
ＫＩＴ（ＡＢＩ）およびＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用
いて販売者の指示書どおりに配列決定した。ＭＫ７のヌ
クレオチド配列は４９３塩基対の長さであり、ＧＣ含有
率は６３％であった。この配列を本明細書にて配列番
号：１とする。
た。各ミコバクテリア種および非ミコバクテリア種から
のゲノミックＤＮＡをＰｓｔＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
により消化し、０．８％アガロースゲルにより分離し
て、ナイロン膜に転写した（マニアティス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、前記）。マニアティス（前記）により、膜
をＵＶ架橋（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）し、32Ｐ標識
プローブ（即ち、１５の選択されたクローンから単離さ
れたインサート）をハイブリダイズした。プローブは、
［α−32Ｐ］−デオキシアデノシン３リン酸および［α
−32Ｐ］−デオキシシチジン３リン酸（ＮＥＮ−ＤｕＰ
ｏｎｔ）を用いてランダムプライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）により標識した。ハイブリダイズした膜を高いスト
リンジェンシーにて洗浄し、ＸＡＲ−５フィルムに対し
て１−７日間暴露した（マニアティス、前記）。１５の
クローンのうち、ＭＫ７が特異的にミコバクテリウム・
カンサシのＤＮＡにハイブリダイズすることが見いださ
れた。このクローンはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーにより、ＴＡ
Ｑ ＤＹＥ ＰＲＩＭＥＲまたはＴＡＱ ＤＹＥ ＴＥ
ＲＭＩＮＡＴＯＲ ＣＹＣＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ
ＫＩＴ（ＡＢＩ）およびＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用
いて販売者の指示書どおりに配列決定した。ＭＫ７のヌ
クレオチド配列は４９３塩基対の長さであり、ＧＣ含有
率は６３％であった。この配列を本明細書にて配列番
号：１とする。
【００２３】ＭＫ７は内部に３つのＳａｕ３ＡＩ部位
（ＧＡＴＣ）を含む。これらはＳａｕ３ＡＩの部分消化
によるか、またはゲノム中では連続していないＳａｕ３
ＡＩ断片の連結の結果らしい。ＭＫ７がミコバクテリウ
ム・カンサシのゲノムの不連続セグメントからなる可能
性は、このクローンをハイブリダイゼーションプローブ
として用いる場合には関係ないが、核酸の増幅のために
は標的配列が連続していなければならない。ＭＫ７の２
つのＳａｕ３ＡＩ部位の間の２８１塩基対のセグメント
は、したがってミコバクテリウム・カンサシ特異的増幅
プライマーのさらなる分析およびデザインのために選択
された。この全２８１ｂｐの断片（ＭＫ７のヌクレオチ
ド番号２１３−４９３）はサザンブロットにおけるハイ
ブリダイゼーション分析から、種特異的であった。即
ち、該断片はミコバクテリウム・カンサシの核酸にハイ
ブリダイズするが、試験された他のミコバクテリアおよ
び非ミコバクテリア生物の核酸とはハイブリダイズしな
かった。これらは、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ミコバ
クテリウム・フォルツイツム、ミコバクテリウム・ガス
トリ、ミコバクテリウム・イントラセルラレエ、ヒト型
結核菌、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフ
テリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔ
ｈｅｒｉａｅ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ノカルディア・アステロイデ
ス、ロドコッカス・ロドクロウスを含んだ。次に、上記
２８１ｂｐ断片を２つのより小さいサブ断片に分割して
それらをＡおよびＢとした。断片ＡはＭＫ７のヌクレオ
チド番号２２１−３７０からなり、そして断片ＢはＭＫ
７のヌクレオチド番号３５１−４９０からなる。両断片
ＡおよびＢはサザンブロットによるハイブリダイゼーシ
ョン分析において種特異性を維持しており、かつミコバ
クテリウム・カンサシのゲノミックＤＮＡの２．７５ｋ
ｂのＰｓｔＩ断片とハイブリダイズする。
（ＧＡＴＣ）を含む。これらはＳａｕ３ＡＩの部分消化
によるか、またはゲノム中では連続していないＳａｕ３
ＡＩ断片の連結の結果らしい。ＭＫ７がミコバクテリウ
ム・カンサシのゲノムの不連続セグメントからなる可能
性は、このクローンをハイブリダイゼーションプローブ
として用いる場合には関係ないが、核酸の増幅のために
は標的配列が連続していなければならない。ＭＫ７の２
つのＳａｕ３ＡＩ部位の間の２８１塩基対のセグメント
は、したがってミコバクテリウム・カンサシ特異的増幅
プライマーのさらなる分析およびデザインのために選択
された。この全２８１ｂｐの断片（ＭＫ７のヌクレオチ
ド番号２１３−４９３）はサザンブロットにおけるハイ
ブリダイゼーション分析から、種特異的であった。即
ち、該断片はミコバクテリウム・カンサシの核酸にハイ
ブリダイズするが、試験された他のミコバクテリアおよ
び非ミコバクテリア生物の核酸とはハイブリダイズしな
かった。これらは、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ミコバ
クテリウム・フォルツイツム、ミコバクテリウム・ガス
トリ、ミコバクテリウム・イントラセルラレエ、ヒト型
結核菌、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフ
テリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔ
ｈｅｒｉａｅ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ノカルディア・アステロイデ
ス、ロドコッカス・ロドクロウスを含んだ。次に、上記
２８１ｂｐ断片を２つのより小さいサブ断片に分割して
それらをＡおよびＢとした。断片ＡはＭＫ７のヌクレオ
チド番号２２１−３７０からなり、そして断片ＢはＭＫ
７のヌクレオチド番号３５１−４９０からなる。両断片
ＡおよびＢはサザンブロットによるハイブリダイゼーシ
ョン分析において種特異性を維持しており、かつミコバ
クテリウム・カンサシのゲノミックＤＮＡの２．７５ｋ
ｂのＰｓｔＩ断片とハイブリダイズする。
【００２４】上記２８１ｂｐの断片を、ＧＥＮＢＡＮＫ
７５，ＵＥＭＢＬ ３３−７５およびＮ−ＧＥＮＥＳ
ＥＱ ９により公知配列との間で比較したが、類似配列
は見いだされなかった。
７５，ＵＥＭＢＬ ３３−７５およびＮ−ＧＥＮＥＳ
ＥＱ ９により公知配列との間で比較したが、類似配列
は見いだされなかった。
【００２５】実施例２ 鎖置換増幅 増幅プライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチ
ドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ
合成機を用いて指示書にしたがって合成した。オリゴヌ
クレオチドを５０℃において脱保護し、前記（アウスベ
ル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら）のとおりにゲルから精製し
た。鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応はウオーカーら（前記）
にしたがい、６−８ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ 各
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびαチオｄＡＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＵＴＰ、１００μｇ／ｍｌアセチル化ウシ血清アル
ブミン、１ｎｇ／μｌ ヒト血小板ＤＮＡ、５０ｍＭＫ
iＰＯ4（ｐＨ７．６）、０．５μＭ Ｓ1およびＳ2プラ
イマー、０．０５μＭＢ1およびＢ2プライマー、３ユニ
ットμｌ ＨｉｎｃＩＩ、０．１ユニット／μｌ ｅｘ
ｏ-クレノーＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔ
ａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）およびさまざまな
量の標的ＤＮＡからなる５０μｌ体積中で実施した。該
反応物は、１５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルフォキシド
（ＤＭＳＯ）または２０−２５％（ｖ／ｖ）グリセロー
ルのいずれかを含んだ。ＨｉｎｃＩＩ、ｅｘｏ-クレノ
ーおよびＭｇＣｌ2の添加前に、反応物を９５℃におい
て２分間加熱して標的ＤＮＡを変成し、２分間３７−４
０℃においてプライマーをアニールさせた。酵素とＭｇ
Ｃｌ2の添加後、反応物を３７−４０℃にて２時間イン
キュベートして増幅した。増幅は２分間９５℃にて加熱
することにより停止した。増幅産物は32Ｐ−標識プロー
ブのプライマー伸長合成により検出し、そして前記ウオ
ーカーらのとおりに変成ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分析した。
ドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ
合成機を用いて指示書にしたがって合成した。オリゴヌ
クレオチドを５０℃において脱保護し、前記（アウスベ
ル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら）のとおりにゲルから精製し
た。鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応はウオーカーら（前記）
にしたがい、６−８ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ 各
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびαチオｄＡＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＵＴＰ、１００μｇ／ｍｌアセチル化ウシ血清アル
ブミン、１ｎｇ／μｌ ヒト血小板ＤＮＡ、５０ｍＭＫ
iＰＯ4（ｐＨ７．６）、０．５μＭ Ｓ1およびＳ2プラ
イマー、０．０５μＭＢ1およびＢ2プライマー、３ユニ
ットμｌ ＨｉｎｃＩＩ、０．１ユニット／μｌ ｅｘ
ｏ-クレノーＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔ
ａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）およびさまざまな
量の標的ＤＮＡからなる５０μｌ体積中で実施した。該
反応物は、１５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルフォキシド
（ＤＭＳＯ）または２０−２５％（ｖ／ｖ）グリセロー
ルのいずれかを含んだ。ＨｉｎｃＩＩ、ｅｘｏ-クレノ
ーおよびＭｇＣｌ2の添加前に、反応物を９５℃におい
て２分間加熱して標的ＤＮＡを変成し、２分間３７−４
０℃においてプライマーをアニールさせた。酵素とＭｇ
Ｃｌ2の添加後、反応物を３７−４０℃にて２時間イン
キュベートして増幅した。増幅は２分間９５℃にて加熱
することにより停止した。増幅産物は32Ｐ−標識プロー
ブのプライマー伸長合成により検出し、そして前記ウオ
ーカーらのとおりに変成ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分析した。
【００２６】増幅プライマーは上記２８１ｂｐの断片の
配列の中から選択した。ひとつのＳＤＡ反応において
は、配列番号：２および３を増幅プライマーとして用い
（即ち、Ｓ1およびＳ2）、そして配列番号：４および５
をバンパープライマーとして用いた（即ち、Ｂ1および
Ｂ2）。このプライマーセットはプライマーセット＃１
であり、そして２８１ｂｐ断片内のハイブリダイゼーシ
ョンの位置を図１において示す。このプライマーセット
を用いた増幅はミコバクテリウム・カンサシ特異的であ
り、かつ、増幅産物はミコバクテリウム・カンサシの核
酸を標的として用いた場合にのみ検出された。鳥型結核
菌、ウシ型結核菌、ミコバクテリウム・ケロネエ、ミコ
バクテリウム・フォルツイツム、ミコバクテリウム・ガ
ストリ、ミコバクテリウム・ゴルドネエ、ミコバクテリ
ウム・イントラセルラレエ、ミコバクテリウム・マロメ
ンス、ミコバクテリウム・マリナム、ミコバクテリウム
・ミクロチ、ミコバクテリウム・ノンクロモジェニカ
ム、ヒト型結核菌またはミコバクテリウム・ゼノピの核
酸を増幅用標的として用いた場合には増幅産物は検出さ
れなかった。感度は２０ゲノム分子のミコバクテリウム
・カンサシＤＮＡであった。
配列の中から選択した。ひとつのＳＤＡ反応において
は、配列番号：２および３を増幅プライマーとして用い
（即ち、Ｓ1およびＳ2）、そして配列番号：４および５
をバンパープライマーとして用いた（即ち、Ｂ1および
Ｂ2）。このプライマーセットはプライマーセット＃１
であり、そして２８１ｂｐ断片内のハイブリダイゼーシ
ョンの位置を図１において示す。このプライマーセット
を用いた増幅はミコバクテリウム・カンサシ特異的であ
り、かつ、増幅産物はミコバクテリウム・カンサシの核
酸を標的として用いた場合にのみ検出された。鳥型結核
菌、ウシ型結核菌、ミコバクテリウム・ケロネエ、ミコ
バクテリウム・フォルツイツム、ミコバクテリウム・ガ
ストリ、ミコバクテリウム・ゴルドネエ、ミコバクテリ
ウム・イントラセルラレエ、ミコバクテリウム・マロメ
ンス、ミコバクテリウム・マリナム、ミコバクテリウム
・ミクロチ、ミコバクテリウム・ノンクロモジェニカ
ム、ヒト型結核菌またはミコバクテリウム・ゼノピの核
酸を増幅用標的として用いた場合には増幅産物は検出さ
れなかった。感度は２０ゲノム分子のミコバクテリウム
・カンサシＤＮＡであった。
【００２７】この同じプライマーセットを用いてミコバ
クテリウム・カンサシの他の株を標的として増幅特異性
を試験した。増幅産物はミコバクテリウム・カンサシＴ
ＭＣ１２０１，ＬＣＤＣ７１１，ＬＣＤＣ７１４，Ｌｃ
ｄｃ７１５およびＬＣＤＣ７２５から検出された。しか
しながら、ミコバクテリウム・カンサシＬＣＤＣ７２４
はこのプライマーセットでは増幅されなかった。したが
って、ＬＣＤＣ７２４からのｒＤＮＡの５’末端をＰＣ
Ｒにより増幅し、そして配列決定した（ベディングハウ
ス（Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓ）ら；マイヤー（Ｍｅｉｅ
ｒ）ら；ロゴール（Ｒｏｇａｌｌ）ら）。得られた配列
を、ＧＥＮＥＢＡＮＫにより報告されているミコバクテ
リウム・カンサシＤＳＭ４３２２４のｒＤＮＡ遺伝子配
列と比較したところ異なっていた。対応する大腸菌遺伝
子のヌクレオチド番号７５−８７に対応する１３塩基対
内に２つの欠失および３つのミスマッチが存在した。Ｌ
ＣＤＣ７２４株の生化学試験は、典型的なミコバクテリ
ウム・カンサシと同一であったが、しかし、ロス（Ｒｏ
ｓｓ）らはＬＣＤＣ７２４がことなる亜種であることい
示唆している。これらのｒＤＮＡ中の５ｂｐの違いは、
ＬＣＤＣ７２４がミコバクテリウム・カンサシの異なる
亜種であるか、またはミコバクテリアとは異なる種であ
ることを示唆し得る。したがって、プライマー＃１は試
験された典型的なすべてのミコバクテリウム・カンサシ
を増幅するが、ＬＣＤＣ７２４として同定された異型性
（ａｔｙｐｉｃａｌ）の遺伝的に異なるミコバクテリウ
ム・カンサシの亜種は増幅しない。
クテリウム・カンサシの他の株を標的として増幅特異性
を試験した。増幅産物はミコバクテリウム・カンサシＴ
ＭＣ１２０１，ＬＣＤＣ７１１，ＬＣＤＣ７１４，Ｌｃ
ｄｃ７１５およびＬＣＤＣ７２５から検出された。しか
しながら、ミコバクテリウム・カンサシＬＣＤＣ７２４
はこのプライマーセットでは増幅されなかった。したが
って、ＬＣＤＣ７２４からのｒＤＮＡの５’末端をＰＣ
Ｒにより増幅し、そして配列決定した（ベディングハウ
ス（Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓ）ら；マイヤー（Ｍｅｉｅ
ｒ）ら；ロゴール（Ｒｏｇａｌｌ）ら）。得られた配列
を、ＧＥＮＥＢＡＮＫにより報告されているミコバクテ
リウム・カンサシＤＳＭ４３２２４のｒＤＮＡ遺伝子配
列と比較したところ異なっていた。対応する大腸菌遺伝
子のヌクレオチド番号７５−８７に対応する１３塩基対
内に２つの欠失および３つのミスマッチが存在した。Ｌ
ＣＤＣ７２４株の生化学試験は、典型的なミコバクテリ
ウム・カンサシと同一であったが、しかし、ロス（Ｒｏ
ｓｓ）らはＬＣＤＣ７２４がことなる亜種であることい
示唆している。これらのｒＤＮＡ中の５ｂｐの違いは、
ＬＣＤＣ７２４がミコバクテリウム・カンサシの異なる
亜種であるか、またはミコバクテリアとは異なる種であ
ることを示唆し得る。したがって、プライマー＃１は試
験された典型的なすべてのミコバクテリウム・カンサシ
を増幅するが、ＬＣＤＣ７２４として同定された異型性
（ａｔｙｐｉｃａｌ）の遺伝的に異なるミコバクテリウ
ム・カンサシの亜種は増幅しない。
【００２８】付加的なプライマーセットを増幅分析の感
度の増加のためにデザインした。最初に、ＭＫ７に基づ
く２つの付加的Ｓ1プライマーをデザインした。図１に
示すとおり、配列番号：６を配列番号：２の下流（即ち
３’）に４ヌクレオチドシフトさせた。配列番号：２の
下流に６ヌクレオチドシフトさせた配列番号：７も図１
に示す。新たなＢ2プライマー（配列番号：８）も増幅
された領域近辺にハイブリダイズするようにデザインし
た。プライマーセット＃２は、配列番号：６、３、４お
よび８からなる。このプライマーセットはプライマーセ
ット＃１と同じ感度（２０ゲノム分子のミコバクテリウ
ム・カンサシＤＮＡ）および特異性を示した。
度の増加のためにデザインした。最初に、ＭＫ７に基づ
く２つの付加的Ｓ1プライマーをデザインした。図１に
示すとおり、配列番号：６を配列番号：２の下流（即ち
３’）に４ヌクレオチドシフトさせた。配列番号：２の
下流に６ヌクレオチドシフトさせた配列番号：７も図１
に示す。新たなＢ2プライマー（配列番号：８）も増幅
された領域近辺にハイブリダイズするようにデザインし
た。プライマーセット＃２は、配列番号：６、３、４お
よび８からなる。このプライマーセットはプライマーセ
ット＃１と同じ感度（２０ゲノム分子のミコバクテリウ
ム・カンサシＤＮＡ）および特異性を示した。
【００２９】プライマーセット＃３は配列番号：７、
３、４および８からなる。ＳＤＡ反応において、このプ
ライマーセットは感度に関して１０倍の増加を示したが
（２ゲノム分子のミコバクテリウム・カンサシＤＮ
Ａ）、ミコバクテリウム・カンサシの種特異性は維持し
ていた。ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、鳥型結核菌、ミ
コバクテリウム・イントラセルラレエ、ミコバクテリウ
ム・ガストリ、ミコバクテリウム・フォルツイツム、ミ
コバクテリウム・ケロネエ、ミコバクテリウム・スズグ
リア（Ｍ．ｓｚｕｇｌｉａ）、ミコバクテリウム・マロ
メンス、ミコバクテリウム・スクロフラセウム、ミコバ
クテリウム・フラベンス、ミコバクテリウム・ゼノピ、
ミコバクテリウム・テレ、ミコバクテリウム・マリナム
またはミコバクテリウム・ゴルドネエとの交差反応性は
検出されなかった。プライマーセット＃３は、典型的ミ
コバクテリウム・カンサシＤＮＡ、例えば株ＴＭＣ１２
０１，ＬＣＤＣ７１１，ＬＣＤＣ７１４，ＬＣＤＣ７１
５およびＬＣＤＣ７２５中の評定配列を増幅する。しか
しながら、該セットは、ミコバクテリウム・カンサシと
は遺伝的に異なる亜種であると提案されたミコバクテリ
ウム・カンサシＬＣＤＣ７２４は増幅しない。
３、４および８からなる。ＳＤＡ反応において、このプ
ライマーセットは感度に関して１０倍の増加を示したが
（２ゲノム分子のミコバクテリウム・カンサシＤＮ
Ａ）、ミコバクテリウム・カンサシの種特異性は維持し
ていた。ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、鳥型結核菌、ミ
コバクテリウム・イントラセルラレエ、ミコバクテリウ
ム・ガストリ、ミコバクテリウム・フォルツイツム、ミ
コバクテリウム・ケロネエ、ミコバクテリウム・スズグ
リア（Ｍ．ｓｚｕｇｌｉａ）、ミコバクテリウム・マロ
メンス、ミコバクテリウム・スクロフラセウム、ミコバ
クテリウム・フラベンス、ミコバクテリウム・ゼノピ、
ミコバクテリウム・テレ、ミコバクテリウム・マリナム
またはミコバクテリウム・ゴルドネエとの交差反応性は
検出されなかった。プライマーセット＃３は、典型的ミ
コバクテリウム・カンサシＤＮＡ、例えば株ＴＭＣ１２
０１，ＬＣＤＣ７１１，ＬＣＤＣ７１４，ＬＣＤＣ７１
５およびＬＣＤＣ７２５中の評定配列を増幅する。しか
しながら、該セットは、ミコバクテリウム・カンサシと
は遺伝的に異なる亜種であると提案されたミコバクテリ
ウム・カンサシＬＣＤＣ７２４は増幅しない。
【００３０】この実施例ではＳＤＡを増幅法として用い
たが、この実施例の増幅法プライマーの標的結合配列
は、標的配列への特定の配列の付加を必要としない他の
増幅法（例えばＰＣＲ）において増幅プライマーとして
単独で用いてよい。即ち、ＰＣＲのような増幅法におけ
る使用のためには、適切な増幅反応における増幅プライ
マーとして、配列番号：９を配列番号：２に代えても、
配列番号：１０を配列番号：３に代えても、配列番号：
１１を配列番号６に代えても、また配列番号：１２を配
列番号７に代えてもよい。同様に、あらゆる他の所望の
配列を増幅プライマーの標的結合配列に付加することに
より、所望の機能、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識
部位またはホモポリマーテイル（クローニングを促進す
るため）、蛋白質結合部位等を提供してよい。
たが、この実施例の増幅法プライマーの標的結合配列
は、標的配列への特定の配列の付加を必要としない他の
増幅法（例えばＰＣＲ）において増幅プライマーとして
単独で用いてよい。即ち、ＰＣＲのような増幅法におけ
る使用のためには、適切な増幅反応における増幅プライ
マーとして、配列番号：９を配列番号：２に代えても、
配列番号：１０を配列番号：３に代えても、配列番号：
１１を配列番号６に代えても、また配列番号：１２を配
列番号７に代えてもよい。同様に、あらゆる他の所望の
配列を増幅プライマーの標的結合配列に付加することに
より、所望の機能、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識
部位またはホモポリマーテイル（クローニングを促進す
るため）、蛋白質結合部位等を提供してよい。
【００３１】図１に示すとおり、ヌクレオチド番号３４
４に始まりヌクレオチド番号４９３のクローン末端まで
続く潜在オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存
在する。開始コドンＡＴＧは、２８１ｂｐ断片の上流に
おいて開始する別のＯＲＦの終止コドン（ＴＧＡ）とし
て機能しうるＡに続く。ＡＴＧの上流の−７は、潜在的
なリボソーム結合部位ＡＧＡＡＡＡＧＧＡ（シャイン−
ダルガーノ配列）である。−２６（ＴＡＴＡ）、−３８
（ＴＣＧＡＣＣ）および−４８（ＴＣＣＡＣＡ）には、
プロモーター候補も存在する。これらの潜在的プロモー
ター配列は大腸菌の標準的なものとは異なるが、しか
し、他のミコバクテリアのプロモーターとはよく似てい
る（マックファーデン（ＭｃＦａｄｄｅｎ））。また、
別のリーディングフレームとの潜在的オーバーラップを
考慮すれば、この場合にプロモーター配列である必要は
ないかもしれない。ヌクレオチド番号３４４から４９３
のＯＲＦによりコードされている仮想蛋白質配列は５０
アミノ酸の長さである。この仮想配列をＳＷＩＳＳＰＲ
ＯＴ２４データベースと比較しても、類似の蛋白質配列
は見いだされなかった。
４に始まりヌクレオチド番号４９３のクローン末端まで
続く潜在オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存
在する。開始コドンＡＴＧは、２８１ｂｐ断片の上流に
おいて開始する別のＯＲＦの終止コドン（ＴＧＡ）とし
て機能しうるＡに続く。ＡＴＧの上流の−７は、潜在的
なリボソーム結合部位ＡＧＡＡＡＡＧＧＡ（シャイン−
ダルガーノ配列）である。−２６（ＴＡＴＡ）、−３８
（ＴＣＧＡＣＣ）および−４８（ＴＣＣＡＣＡ）には、
プロモーター候補も存在する。これらの潜在的プロモー
ター配列は大腸菌の標準的なものとは異なるが、しか
し、他のミコバクテリアのプロモーターとはよく似てい
る（マックファーデン（ＭｃＦａｄｄｅｎ））。また、
別のリーディングフレームとの潜在的オーバーラップを
考慮すれば、この場合にプロモーター配列である必要は
ないかもしれない。ヌクレオチド番号３４４から４９３
のＯＲＦによりコードされている仮想蛋白質配列は５０
アミノ酸の長さである。この仮想配列をＳＷＩＳＳＰＲ
ＯＴ２４データベースと比較しても、類似の蛋白質配列
は見いだされなかった。
【００３２】本発明のプローブおよびプライマーがさま
ざまなミコバクテリア・カンサシ株の検出に有用である
か否かを確認するために、８つの異なる国を起源とする
６６の臨床および環境単離物を用いて鎖置換増幅を上記
のとおりに実施した。サンプルはヤンら（１９９３、前
記）により記載された選択を表す。プライマーセット＃
３（配列番号：７、３、４、８）を増幅に用い、結果を
以下の表１に示す。
ざまなミコバクテリア・カンサシ株の検出に有用である
か否かを確認するために、８つの異なる国を起源とする
６６の臨床および環境単離物を用いて鎖置換増幅を上記
のとおりに実施した。サンプルはヤンら（１９９３、前
記）により記載された選択を表す。プライマーセット＃
３（配列番号：７、３、４、８）を増幅に用い、結果を
以下の表１に示す。
【００３３】
【表１】 ヤンら（前記）は、市販のミコバクテリア・カンサシの
ためのＡＣＣＵ−ＰＲＯＢＥを用いてこれら株の８８％
が陽性であり、そして１００％はｐ６１２３プローブへ
のハイブリダイゼーションに陽性であったことを報告し
ている。本発明のプローブおよびプライマーは、ヤンら
のミコバクテリア・カンサシ株の約９４％を検出した。
本明細書における配列番号：１および該配列に由来する
プローブおよびプライマーは、ｐ６１２３およびＡＣＣ
Ｕ−ＰＲＯＢＥとは異なり、そして以前に報告されてい
ないヌクレオチド配列を含む。配列番号：１はまたｐ６
１２３よりもミコバクテリア・カンサシ間でより高度に
保存されているという利点を有し、したがって、分析結
果は陽性サンプルと陰性サンプルの明確な区別を提供す
る。即ち、配列番号：１に由来するプライマーおよびプ
ローブを用いた分析は、明確な陽性であるかまたは明確
な陰性の何れかであり、これにより分析結果の解釈がよ
り容易になる。対照的に、ｐ６１２３を用いた場合１０
０％のミコバクテリア・カンサシ株は陽性であるが、こ
の配列の多大な可変性が、陽性と陰性の間の解釈を複雑
にし且つ区別を不明確にするかもしれない、広い範囲の
陽性の程度をもたらす。
ためのＡＣＣＵ−ＰＲＯＢＥを用いてこれら株の８８％
が陽性であり、そして１００％はｐ６１２３プローブへ
のハイブリダイゼーションに陽性であったことを報告し
ている。本発明のプローブおよびプライマーは、ヤンら
のミコバクテリア・カンサシ株の約９４％を検出した。
本明細書における配列番号：１および該配列に由来する
プローブおよびプライマーは、ｐ６１２３およびＡＣＣ
Ｕ−ＰＲＯＢＥとは異なり、そして以前に報告されてい
ないヌクレオチド配列を含む。配列番号：１はまたｐ６
１２３よりもミコバクテリア・カンサシ間でより高度に
保存されているという利点を有し、したがって、分析結
果は陽性サンプルと陰性サンプルの明確な区別を提供す
る。即ち、配列番号：１に由来するプライマーおよびプ
ローブを用いた分析は、明確な陽性であるかまたは明確
な陰性の何れかであり、これにより分析結果の解釈がよ
り容易になる。対照的に、ｐ６１２３を用いた場合１０
０％のミコバクテリア・カンサシ株は陽性であるが、こ
の配列の多大な可変性が、陽性と陰性の間の解釈を複雑
にし且つ区別を不明確にするかもしれない、広い範囲の
陽性の程度をもたらす。
【００３４】
配列番号：１ 配列の長さ：４９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 GATCGTCACC CCAGCAGTTG GTGGTCGGCA GCATACTGGC CGCCTGCGTG CGATNNGCCG 60 CCCCGGTCTT GATCACCGAG AGTCTCAACT TGCCCCCGGA GCCTTGAGCT GACCTGGCGC 120 TCGTTGGGAG AGATCGTTGC CGGCGTCGGA TTCCTGGCGG TGTTTGTCTA CTGGCAGTCG 180 GTCAACACCC GCGAACCACT GATTCCCCTG AAGATCCGCC GCCGCACAAC TGCTGGCCGG 240 GCATGACACC GACCCATCAG TCAGCGAATC CTCCGCTGCA TCAAATGAAT CCACAGTCAT 300 CGACCTGTCC GTCTATAGCG GGCAGCCCAG AAAAGGACCT TAAATGACCG CTACCCACGC 360 ACGCCGAAGA CCAGCCGGGC CGCGAGTACC GAGTCGCCGG CTCAGTCGGC CAGTCGCTAT 420 CAGCACGTGC GCTCGCATCT GGCCGAACTC AAACTGCACG CCGCCGCTGA AGCCCTGCCC 480 GCCGTCCTGG ATC 493 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１９．．２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACTCAGCG AATCCTC 37 配列番号：３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１９．．２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACTAGACG GACAGGT 37 配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 CACAACTGCT GGC 13 配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 TGATAGCGAC TGG 13 配列番号：６ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１９．．２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACCGAATC CTCCGCT 37 配列番号：７ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置：１９．．２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACAATCCT CCGCTGC 37 配列番号：８ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 GGGTAGCGGT CAT 13 配列番号：９ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 TCAGCGAATC CTC 13 配列番号：１０ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 TAGACGGACA GGT 13 配列番号：１１ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 CGAATCCTCC GCT 13 配列番号：１２ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム カンサシ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列 AATCCTCCGC TGC 13
【図１】図１は、ＭＫ７の２８１ｂｐの断片および該断
片への代表的プライマーのハイブリダイゼーションを示
す。
片への代表的プライマーのハイブリダイゼーションを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 ダリル・ディー・シャンク アメリカ合衆国メリーランド州21014, ベル・エアー，バゼル・コート 1213
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号：１またはその相補配列からな
るオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列番号：１のヌクレオチド番号２１３
−４９３またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 配列番号：１のヌクレオチド番号２２１
−３７０またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項４】 配列番号：１のヌクレオチド番号３５１
−４９０またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項５】 配列番号：１、２、３、４、５、６、７
または８からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号：９、１０、１１または１２か
らなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 以下の工程： （ａ）ミコバクテリウム・カンサシの核酸が存在する場
合に、該核酸を、配列番号：１、配列番号：１のヌクレ
オチド番号２１３−４９３、配列番号：１のヌクレオチ
ド番号２２１−３７０および配列番号：１のヌクレオチ
ド番号３５１−４９０からなる群から選択されるオリゴ
ヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ；そして （ｂ）サンプル中のミコバクテリウム・カンサシの核酸
の存在の指標として上記プローブのハイブリダイゼーシ
ョンを検出する；ことからなる、サンプル中のミコバク
テリウム・カンサシの核酸の検出法。 - 【請求項８】 以下の工程： （ａ）配列番号：２、６、７、９、１１および１２から
なる群から選択される第１プライマーを、ミコバクテリ
ウム・カンサシの標的配列が存在する場合に、該配列に
ハイブリダイズさせ； （ｂ）配列番号：３および１０からなる群から選択され
る第２プライマーを、上記ミコバクテリウム・カンサシ
の標的配列が存在する場合に、該配列にハイブリダイズ
させ； （ｃ）ハイブリダイズした上記第１および第２プライマ
ーを伸長合成して第１および第２プライマー伸長合成産
物をそれぞれ生成し、そして上記標的配列から上記第１
および第２プライマー伸長合成産物を置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように上記工程（ｂ）およ
び（ｃ）を繰り返し；そして、 （ｅ）増幅された標的配列を検出する；ことからなる、
サンプル中のミコバクテリウム・カンサシの標的配列の
検出法。 - 【請求項９】 以下の工程： （ａ）ミコバクテリウム・カンサシの標的配列が存在す
る場合に、該配列に第１増幅プライマーをハイブリダイ
ズさせるが、その際上記第１プライマーは、第１標的結
合配列、該第１標的結合配列の５’上流の制限酵素認識
部位および制限酵素が結合するのに十分な数の該制限酵
素認識部位の５’上流のヌクレオチドからなり、その際
上記第１標的結合配列は配列番号：９、１１および１２
からなる群から選択され； （ｂ）ミコバクテリウム・カンサシの標的配列が存在す
る場合に、該配列に第２増幅プライマーをハイブリダイ
ズさせるが、その際上記第２プライマーは、第２標的結
合配列、該第２標的結合配列の５’上流の制限酵素認識
部位および制限酵素が結合するのに十分な数の該制限酵
素認識部位の５’上流のヌクレオチドからなり、その際
上記第２標的結合配列は配列番号：１０からなり； （ｃ）ハイブリダイズした第１および第２増幅プライマ
ーを伸長合成し、制限酵素認識部位にニックを入れ、そ
して伸長合成した第１および第２増幅プライマーを置換
する工程からなる増幅法により標的配列を増幅し；そし
て （ｄ）増幅された標的配列を検出する；ことからなる、
サンプル中のミコバクテリウム・カンサシの標的配列の
検出法。 - 【請求項１０】 以下の工程： （ａ）ミコバクテリウム・カンサシの標的配列が存在す
る場合に、該配列に、配列番号：２、６および７からな
る群から選択される第１増幅プライマーをハイブリダイ
ズさせ； （ｂ）ミコバクテリウム・カンサシの標的配列が存在す
る場合に、該配列に、配列番号：３からなる第２増幅プ
ライマーをハイブリダイズさせ； （ｃ）鎖置換増幅法（ＳＤＡ）により標的配列を増幅
し；そして （ｄ）増幅された標的配列を検出する；ことからなる、
サンプル中のミコバクテリウム・カンサシの標的配列の
検出法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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