CN103243168A - 一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括：反应混合液，所述反应混合液包含：浓度均为0.2μM的外引物F3和外引物B3；浓度均为1.6μM的内引物FIP和内引物BIP；浓度均为0.8μM的环引物LoopF和环引物LoopB；20mM pH8.8 Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；DNA提取试剂A；DNA提取试剂B；阳性对照。本发明还涉及该试剂盒的使用方法。与传统检测方法相比，本发明所述的方法检测用时短、成本低，结果可直接判定，不需仪器。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体的说，本发明涉及一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型核酸扩增方法，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增，LAMP反应需要特异性设计2条内引物(FIP和BIP)和2条外引物(F3和B3)，靶DNA在60℃～65℃恒温条件下(如水浴箱内)保温约60min，即可完成LAMP核酸扩增反应。LAMP最终产物包括大量茎环状DNA混合物，由于LAMP扩增产生了巨大数量的DNA产物及焦磷酸根离子，因此焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子反应会生成焦磷酸镁沉淀，故可通过反应管内副产物的浊度或荧光来对产物进行检测。
钙黄绿素染色原理是：反应之初钙黄绿素与荧光猝灭剂锰离子结合而不发生荧光，反应管呈橙色；反应开始后，生成的焦磷酸根离子更易于与锰离子结合形成沉淀而释放出游离的钙黄绿素，钙黄绿素与镁离子结合发出绿色荧光，反应管呈绿色。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，发病率呈世界性分布。主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，重症者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。因此，副溶血弧菌是进出口水产品检测的重要项目。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒。
本发明目的还在于提供该试剂盒的使用方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶；
DNA提取试剂A，所述DNA提取试剂A为25mM NaOH；
DNA提取试剂B，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl；
阳性对照：副溶血弧菌DNA。
具体而言，本发明中使用的引物序列如下：
外引物
F3：5’-AGCTACTCGAAAGATGATCC-3’
B3：5’-GGTTGTATGAGAAGCGATTG-3’
内引物
FIP：5'-ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT-3’
BIP：5'-ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG-3’
环引物
LoopF：ACCAGTAGCCGTCAATG
LoopB：TTAGATTTGGCGAACGAGA
上述引物例如可以由上海生工生物工程有限公司合成。
优选地，本发明所述的试剂盒还包括保护液，所述保护液为液体石蜡。
更优选地，所述MgSO4的浓度为8mM。
更优选地，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
更优选地，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
本发明还提供一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤：
1)待测样品的DNA模版提取：当所述待测样品为食品时，将所述待测样品加入用于副溶血弧菌增菌培养的APW培养基中进行增菌培养，从而得到增菌液；将200μL的所述增菌液加入1.5mL的离心管中，在7000g下离心2min，吸弃上清液；然后加入100μL的DNA提取试剂A，混匀，在98℃下加热10min；接着加入20μL的DNA提取试剂B，混匀，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版，其中所述DNA提取试剂A为25mM NaOH，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0Tris-HCl；当所述待测样品为细菌纯培养物时，挑取纯培养加入到含200μL无菌去离子水的1.5mL离心管中，在98℃下加热10min，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版；
2)提供23μL的反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Tris buffer、10mMKCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶；
3)使2μL的所述待检DNA模版、阳性对照、阴性对照分别和23μL的所述反应混合液在64℃恒温反应60min，其中所述阳性对照为副溶血弧菌DNA，阴性对照为制备DNA模版的空白试剂；以及
4)分析判断反应产物结果：绿色浑浊表示结果为阳性，橙色澄清表示结果为阴性。
优选地，在所述步骤3)的恒温反应之前加入保护液，所述保护液为液体石蜡。液体石蜡浮在反应液的上面，从而避免反应产物从反应容器中溢出以造成相互干扰。
更优选地，所述MgSO4的浓度为8mM。
更优选地，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
更优选地，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入1000×SYBRGreen I荧光染料或Gene Finder染料来显色，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境，容易污染环境而造成假阳性，同时SYBR Green I荧光染料或Gene Finder染料还会因为引物二聚体而引起假阳性。因此本发明使用钙黄绿素染色技术替代了SYBR Green I荧光染料和GeneFinder这些染料，在配置LAMP反应液时就可以加入反应液中，无需LAMP反应后开盖，并且钙黄绿素仅在发生LAMP反应时才显色，避免了SYBR Green I荧光染料和Gene Finder染料造成的假阳性问题，具有更好的特异性。与传统检测方法相比，本发明所述的方法检测用时短、成本低，结果可直接判定，不需仪器。本发明的试剂盒将所有反应试剂都合并到同一反应液中，使得反应步骤更加简便，试剂盒的结构更为简单。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，除非特别指明，否则使用的菌株如下：
副溶血弧菌(ATCC5421，源自中国CDC营养与食品安全所)
实施例1 本发明的试剂盒
所述试剂盒：包括24个反应管，每管中含有23μL的反应混合液和30μL的液体石蜡；1管阳性对照(50μL)；2管DNA提取试剂A(1300μL/管)；1管DNA提取试剂B(600μL)。所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Trisbuffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、8mMMgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.08mM的钙黄绿素、0.4mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶。所述DNA提取试剂A为25mMNaOH。所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl。阳性对照：副溶血弧菌DNA。
实施例2 本发明的方法的灵敏度测试
APW培养基配制：称取CM401B 3重量％氯化钠碱性蛋白胨水培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司的增菌培养基)9.0g，配置225mL增菌培养基。pH值8.5±0.2，121℃灭菌10min，备用。
将副溶血弧菌接种到4mL的APW培养基中，37℃过夜培养。将40μL的过夜培养菌液接种到另外的新的4mL的APW培养基中，在35℃ 150rpm下培养4h，获得中期细胞。然后用生理盐水10倍梯度稀释法进行稀释，每个浓度的处理都进行三次。选取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76个稀释度的溶液100μL，涂布在补充2.5重量％氯化钠的TSA平板(购自北京陆桥技术有限责任公司)上，在37℃孵化过夜。菌落计数结果下表1，10-5菌液中副溶血性弧菌浓度平均值为203cfu/100μL。
表1
分别选取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76个稀释度的溶液100μL，至1.5mL的离心管，98℃加热10min，8000rpm离心1min，分别取50μL的上清液加入到含有50μL灭菌去离子水的新离心管中，作为LAMP反应DNA模版溶液。
分别选取上述2μL的6个稀释度的DNA模版溶液(每个稀释度重复三次)、2μL的阴性对照依次加入含有23μL的实施例1中所述的反应液及30μL的液体石蜡的反应管中，64℃反应60min，反应管呈绿色为阳性，橙色为阴性。LAMP检测结果以3次全部检出为最高灵敏度，结果见下表2。即10-5可全部检出，灵敏度为2cfu。
表2
注：“+”代表阳性“-”代表阴性
实施例3 本发明的方法的特异性测试
分别挑取沙门氏菌(50041)、大肠埃希氏菌(EK274)、副溶血性弧菌(5421)、志贺氏菌(51060和51573)、单增李斯特氏菌(54004)以及金黄色葡萄球菌(29213)加入200μL灭菌去离子水中，98℃加热10min，7000g离心2min，取上清液作为LAMP检测DNA模版。
将上述制备的DNA模版2μL加入含有23μL的实施例1中所述的反应液及30μL的液体石蜡的反应管中，64℃反应60min，阳性为绿色，阴性为橙色。
结果显示只有副溶血弧菌检测管为阳性，其他菌株检测管为阴性。
实施例4 海鲜虾中副溶血性弧菌的检测
APW培养基配制：称取CM401B 3重量％氯化钠碱性蛋白胨水培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司的增菌培养基)9.0g，配置225mL增菌培养基。pH值8.5±0.2，121℃灭菌10min，备用。
样品制备：将海鲜虾的冷冻样品在45℃以下不超过15min或2℃～5℃不超过18h解冻。在无菌操作条件下取检样品25g，加入APW培养基225mL，用旋转刀片式均质器以8,000r/min均质1min。分为两份，一份作为待检样品，另一份再加入1mL过夜活化培养的副溶血弧菌菌液。使用实施例1中所述的试剂盒来检测其中是否存在副溶血弧菌。
增菌：将上述样品的1∶10的稀释液在36℃±1℃下培养12h，以获得增菌液。
增菌液DNA模版制备：取增菌液200μL加到1.5mL离心管中，7000g离心2min，尽量吸弃上清液，加入100μL的DNA提取试剂A，98℃加热10min，加入20μL的DNA提取试剂B，混匀，7000g离心2min，上清液即为DNA模版，-20℃可保存6个月备用。
LAMP检测：将2μL的上述DNA模版、阳性对照、阴性对照分别加入含有23μL的反应液及30μL保护液的反应管中，64℃反应60min，反应管呈绿色为阳性，橙色为阴性。
LAMP检测结果：待检样品管为橙色，加入1mL过夜活化培养的副溶血弧菌菌液的样品管为绿色，说明此次检测的海鲜虾中无副溶血弧菌污染。
对比例1
按照和实施例1相同的方式制备试剂盒，并且按照和实施例3相同的方式进行检测(使用同一副溶血性弧菌DNA模板)，以考察钙黄绿素和氯化锰浓度对于染色效果的影响，不同之处在于，钙黄绿素和氯化锰浓度以及染色结果如下：
(1)钙黄绿素0.04mM，氯化锰0.8mM，阳性对照为橙色沉淀，阴性为橙色澄清，染色失败。
(2)钙黄绿素0.08mM，氯化锰0.8mM，阳性对照为橙绿色浑浊，阴性为橙色澄清，可以染色，但效果稍差。
(3)钙黄绿素0.08mM，氯化锰1.6mM，阳性对照为橙色澄清，阴性为橙色澄清，抑制LAMP反应。
(4)钙黄绿素0.08mM，氯化锰0.4mM，阳性对照为绿色浑浊，阴性为橙色澄清，染色效果好。
本发明人吃惊地发现，钙黄绿素和氯化锰不同的浓度配比会产生不同的染色效果。例如，在钙黄绿素为0.08mM的情况下，氯化锰为0.8mM时可以染色，但效果稍差；提高氯化锰为1.6mM时，会抑制LAMP反应。降低氯化锰为0.4mM时反而染色效果较好；由此可见，钙黄绿素和氯化锰的浓度配比直接影响染色效果。
对比例2
按照和实施例1相同的方式制备试剂盒，并且按照和实施例3相同的方式进行检测(使用同一副溶血性弧菌DNA模板)，来考察不同浓度的硫酸镁对于LAMP效果的影响，不同之处在于，硫酸镁的浓度分别为4mM和6mM。结果发现，在硫酸镁的浓度分别为4mM、6mM、8mM，LAMP反应正常进行，但是4mM、6mM、8mM开始出现颜色的时间分为60min、50min、40min。本发明人吃惊地发现，在硫酸镁的浓度为8mM时，LAMP反应时间大大缩短，只要40分钟即可以观察到染色结果，该染色效果和硫酸镁浓度为4mM、6mM的染色效果相比具有十分显著的优势。
对比例3
按照和实施例4相同的方式来检测海鲜虾，不同之处在于，在制备DNA模版时，不使用DNA提取试剂A和DNA提取试剂B，而是采用CN102643919A中公开的DNA快速提取法(即煮沸10分钟的方法)来提取。结果发现，对于加入活化培养的副溶血弧菌的样品，DNA快速提取法得到的DNA模板与使用DNA提取试剂A和DNA提取试剂B的提取法得到的DNA模板检测结果相比，灵敏度大大降低，本发明人吃惊地发现，在使用钙黄绿素来进行染色时，CN102643919A中公开的DNA快速提取法居然会导致检测方法的灵敏度下降一个数量级，效果如此之差是出乎意料的。
Claims (10)
1.一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Tris buffer、10mMKCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；
DNA提取试剂A，所述DNA提取试剂A为25mM NaOH；
DNA提取试剂B，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl；
阳性对照：副溶血弧菌DNA。
2.根据权利要求1所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，还包括保护液，所述保护液为液体石蜡。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述MgSO4的浓度为8mM。
4.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
5.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
6.一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤：
1)待测样品的DNA模版提取：当所述待测样品为食品时，将所述待测样品加入用于副溶血弧菌增菌培养的APW培养基中进行增菌培养，从而得到增菌液；将200μL的所述增菌液加入1.5mL的离心管中，在7000g下离心2min，吸弃上清液；然后加入100μL的DNA提取试剂A，混匀，在98℃下加热10min；接着加入20μL的DNA提取试剂B，混匀，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版，其中所述DNA提取试剂A为25mM NaOH，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl；当所述待测样品为细菌纯培养物时，挑取纯培养加入到含200μL无菌去离子水的1.5mL离心管中，在98℃下加热10min，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版；
2)提供23μL的反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；
3)使2μL的所述待检DNA模版、阳性对照、阴性对照分别和23μL的所述反应混合液在64℃恒温反应60min，其中所述阳性对照为副溶血弧菌DNA，阴性对照为制备DNA模版的空白试剂；以及
4)分析判断反应产物结果：绿色浑浊表示结果为阳性，橙色澄清表示结果为阴性。
7.根据权利要求6所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，在所述步骤3)的恒温反应之前加入保护液，所述保护液为液体石蜡。
8.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述MgSO4的浓度为8mM。
9.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
10.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
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