CN103923977A - 温和气单胞菌的lamp检测引物组及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温和气单胞菌LAMP检测引物组及检测试剂盒。包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，所述试剂盒包括检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。还公开了利用上述温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测温和气单胞菌的方法；本发明的试剂盒操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到320fg/mL；准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。

Description

温和气单胞菌的LAMP检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于温和气单胞菌检测技术领域，具体涉及一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组及试剂盒。
背景技术
温和气单胞菌（Aeromonas sobria，AS）隶属于弧菌科，气单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌。广泛分布于淡水、污水、土壤以及人的食物链，是水产养殖中危害较大的致病菌之一，此病常暴发流行，死亡率高，能引起出血性败血症，主要危害中华鳖、巴西龟、罗非鱼、鲤鱼、黄鳝、鳗鲡、泥鳅、蟹。同时也可以通过被污染的水产品、畜禽肉类和水源等途径感染人，引发患者出现急性腹泻，也可能引起脑膜炎、脓毒性关节炎和败血症。不仅给养殖业造成严重的经济损失，同时给人类健康带来危害，是一种重要的人-畜-鱼共患病的病原体。国内外学者普遍认为，早发现疾病并采取诸多措施阻止细菌传播，是综合预防有效的方法。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的温和气单胞菌检测方法是减少温和气单胞菌发生和危害的重要途径。
目前温和气单胞菌的检测方法主要有生化检验法和分子生物学方法等。由于气单胞菌的生化性状上极为相似，在常规诊断上需通过生化检验排除其它种，检验方法步骤繁琐、需要鉴定的生化反应数目多，耗时长，且易造成结果不准确，特别是鉴定到种的水平，尤为困难，其特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。PCR技术自问世以来，凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验人员和环境的要求高，仪器设备复杂、操作步骤多。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR的仪器设备昂贵，使用成本较高，无法满足现场检测需要。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、定量化、费用低廉化的方向发展。因此，建立检测温和气单胞菌快速准确的方法，对促进中国水产养殖、水产品安全及口岸检疫有重要作用。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一种新的核酸扩增技术，其特点是针对靶基因的6（或8）个区域设计4（或6）种特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在60～65℃的恒温条件下，历时几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、电泳等过程，基因的扩增及产物检测可一步完成。LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。但是迄今为止，市场上还未见用于检测温和气单胞菌的LAMP检测引物及试剂盒问世。
发明内容
本发明的目的在于提供一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，该引物组特异性强，灵敏度高。
本发明的目的还在于提供一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，快速，简便，成本低。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6中所示。
各引物具体的核苷酸序列分别如下所示：
AS-F3：CGGACGAATGGACTCGAA（SEQ ID NO:1）。
AS-B3：AAGCTCTGGCAGAGGCTC（SEQ ID NO:2）。
AS-FIP：AACGCAGGAGTGGCACGATTTGACAGCGATGGCATC（SEQ IDNO:3）。
AS-BIP:GAAGACGAGGAAGAGGATCTGCAATTCGTCTTCCTGATAGACAG（SEQ ID NO:4）。
AS-LF：AGCGAGTTCCGGCTCTTC（SEQ ID NO:5）。
AS-LB：CACTTCGCAAGCCTGCTG（SEQ ID NO:6）。
本发明还提供一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括上述三对检测引物组。
本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括上述三对检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。
作为本发明的一种较佳的实施方式，本发明所述的检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比为8:4:1。
本发明所述的LAMP反应液优选含10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液，作为一种较佳的实施方案，其中10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液的体积比为8:5:2。
本发明所述的阳性对照优选为含有温和气单胞菌zipA序列（Genbank登录号为JN830311.1）的重组质粒，所述的阴性对照为无菌去离子水。
作为本发明的更进一步改进：本发明所述试剂盒还包括显色剂SYBRGreen Ⅰ。
本发明利用上述温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测温和气单胞菌的方法，可以含以下步骤：
（1）提取待检样品DNA，用DNA提取试剂盒提取待检样品细菌的DNA，获得待检样品的DNA提取液；
（2）恒温基因扩增LAMP反应：选取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液和封闭液矿物油，置于反应容器中，并设置阳性对照和阴性对照，调节反应温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持5min；
（3）结果判断：通过观察反应容器内白色沉淀的产生来判断扩增结果，如有沉淀，则表示待检样品中存在温和气单胞菌，如无沉淀，则表示待检样品中不存在温和气单胞菌；或在LAMP反应产物中加入6×Buffer以及琼脂凝胶进行电泳，电泳结束后将凝胶采用EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察梯形条带，如发现有阶梯状的扩增条带，则待检样品中存在温和气单胞菌，如无阶梯状的扩增条带，则待检样品中不存在温和气单胞菌。
在该检测温和气单胞菌的方法中：
本发明步骤（2）中所述LAMP检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比优选为8:4:1。
本发明步骤（2）中所述LAMP反应液含10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液，其中10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液的体积比优选为8:5:2。
作为该检测方法的一种优选的实施方案，其中步骤（2）的恒温基因扩增LAMP反应中，LAMP反应体系可以为25μL，25μL的LAMP反应体系具体包括：8U Bst DNA聚合酶，AS-FIP1.6μM，AS-BIP1.6μM，AS-LF0.8μM，AS-LB0.8μM，AS-F30.2μM，AS-B30.2μM，2μL待检样品的DNA提取液，无菌去离子水补足至25μL，并加入两滴矿物油，振荡离心，以及阳性对照和阴性对照。
本发明利用上述温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测温和气单胞菌的方法，还可以含以下步骤：
（1）提取待检样品DNA，用DNA提取试剂盒提取待检样品细菌的DNA，获得待检样品的DNA提取液；
（2）恒温基因扩增LAMP反应：取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液和封闭液矿物油，置于反应容器中，并设置阳性对照和阴性对照，调节反应温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持5min，其中显色剂SYBR Green Ⅰ在LAMP反应前加入反应容器中或待LAMP反应结束后加入反应容器中；
（3）结果判断：通过观察反应容器内颜色的变化来判断扩增结果，如显色橙色，则表示待检样品中不存在温和气单胞菌，如显示绿色，则表示待检样品中存在温和气单胞菌。
在该检测温和气单胞菌的方法中：
步骤（2）中所述LAMP检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比优选为8:4:1。
步骤（2）中所述LAMP反应液含10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液，其中10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液的体积比优选为8:5:2。
作为该检测方法的一种优选的实施方案，其中步骤（2）的恒温基因扩增LAMP反应中，LAMP反应体系可以为25μL，25μL的LAMP反应体系具体包括：8U Bst DNA聚合酶，AS-FIP1.6μM，AS-BIP1.6μM，AS-LF0.8μM，AS-LB0.8μM，AS-F30.2μM，AS-B30.2μM，2μL待检样品的DNA提取液，无菌去离子水补足至25μL，并加入两滴矿物油，振荡离心，显色剂10×SYBR Green Ⅰ，以及阳性对照和阴性对照。
实际上，本发明中对于恒温基因扩增LAMP反应的反应产物，结果判断可采用如下三种方法之一：
①通过观察反应管内沉淀的产生来判断扩增结果，有沉淀为存在温和气单胞菌，无沉淀为不存在温和气单胞菌，也可采用实时浊度仪（LA-320C）检测。
②在试剂盒中含有显色剂的情况下，于反应管内盖加10×SYBRGreen Ⅰ1μL，小心盖上盖子，于温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持5min，在1000转/分钟下离心8秒，观察反应结果，或在反应结束后将反应管冷却，打开盖加入加10×SYBR Green Ⅰ1μL，盖好盖子，在1000/分钟下离心8秒后观察反应结果。通过观察反应管内颜色的变化来判断扩增结果，橙色为不存在温和气单胞菌，绿色为存在温和气单胞菌。
③电泳检测：取5μL LAMP产物与1μL6×Buffer混合，加至2%的琼脂凝胶进行电泳，凝胶置于EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察梯形条带，以判断是否有扩增。
本发明的有益效果是：
1）快速高效：整个扩增只用65min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测；
3）高特异性：本发明根据温和气单胞菌的细胞分裂蛋白基因（zipA基因，Genbank登录号为JN830311.1）设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，能特异性识别靶序列8个位点，保证了核酸扩增高度特异性；
4）高灵敏度：本发明的最低检出限达320fg/mL，是普通PCR的100倍；
5）鉴定简便：本发明可肉眼观察白色沉淀或者通过加入SYBR Green Ⅰ观察颜色变化来判断是否有特异性扩增与否，无需电泳等其它方法判断是否扩增，省时简便，适合现场检测。
附图说明
图1为实施例3中LAMP检测方法对温和气单胞菌的特异性试验图，其中A、B、C:LAMP特异性实时浊度仪图；D:LAMP特异性的核酸染料法图，A图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:嗜水气单胞菌，4:维氏气单胞菌，5:豚鼠气单胞菌，6:大肠杆菌，7:迟钝爱德华氏菌，8:无乳链球菌；B图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:海豚链球菌，4:金黄色葡萄球菌，5:霍乱弧菌，6:蜡样芽胞杆菌，7:志贺氏菌，8:肺炎克雷伯杆菌；C图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:绿脓杆菌，4:弗氏柠檬酸胞杆菌，5:摩氏摩根菌，D图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:嗜水气单胞菌，4:维氏气单菌5、维氏气单菌，6:大肠杆菌，7:迟钝爱德华氏菌，8:无乳链球菌，9:海豚链球菌，10:金黄色葡萄球菌，11:霍乱弧菌，12:蜡样芽胞杆菌13:志贺氏菌14:肺炎克雷伯杆菌15:绿脓杆菌16:弗氏柠檬酸杆菌17:摩氏摩根菌，D图中2为绿色；
图2为实施例4中LAMP检测方法对温和气单胞菌的灵敏度试验图，其中A和B LAMP灵敏度实时浊度仪图；C:LAMP灵敏度的凝胶电泳图；D:PCR灵敏度的凝胶电泳图，A图中，1:阴性对照2:1003:10-14:10-25:10-36:10-47:10-5，8:10-6，B图中1:10-72:10-83:10-94:10-10，C图和D图中(M:Marker1:阴性对照，2:100，3:10-1，4:10-2，5:10-3，6:10-4，7:10-5，8:10-6，9:10-7，10:10-8，11:10-9，12:10-10。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1温和气单胞菌LAMP检测引物组和检测试剂盒的建立
温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、矿物油、Bst DNA聚合酶、阳性对照和阴性对照，产品使用说明书，该试剂盒中还可以含有显色剂SYBR Green Ⅰ。
1）LAMP引物设计：根据从美国基因数据库检索获得温和气单胞菌（AS）zipA基因序列（Genbank登录号为JN830311.1）为靶基因，选取保守序列，利用在线设计软件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)设计用于检测温和气单胞菌的特异性引物，其序列见下表1：
表1引物序列表
2）LAMP反应液：将10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液三者按体积比8：5：2混合。
3）阳性对照为含有温和气单胞菌把序列的重组质粒，其制备方法为：以温和气单胞菌标准株的核酸为模板，利用表1中的外引物（SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2）对其进行扩增，所得基因片段长度为256bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
4）阴性对照为无菌去离子水。
实施例2温和气单胞菌LAMP检测
利用本发明试剂盒检测温和气单胞菌，包括如下步骤：
1）细菌DNA提取：细菌样品按照细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN)进行提取。
2）LAMP反应体系的建立：25μL反应体系含有：12.5μL的反应液，1μL BstDNA聚合酶，AS-FIP1.6μM，AS-BIP1.6μM，AS-LF0.8μM，AS-LB0.8μM，AS-F30.2μM，AS-B30.2μM，2μL待检DNA提取液，无菌去离子水补足至25μL，设置阳性对照和阴性对照；加入两滴矿物油，振荡离心，浊度仪设置反应温度为63℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持5min。
3）结果判断可以采用下面三种方法中的任意一种：
①浊度仪检测：将实时浊度仪（LA-320C）设置为每6S自动对反应管内产物的浊度进行扫描，随着产物的增加，浊度也会相应增加，实时监控扩增反应产物量。
②显色剂检测：往LAMP产物中加入1μL稀释10倍的SYBR Green I染料，通过肉眼来观察其颜色，如果显示橙色，则表示没有扩增，如果颜色变绿则表示有扩增。
③电泳检测：取5μL LAMP产物与1μL6×Buffer混合，加至2%的琼脂凝胶进行电泳，凝胶置于EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察梯形条带，以判断是否有扩增，如有，则表示有扩增，即表明待测DNA样品中含有温和气单胞菌的zipA基因，判断为阳性，如没有，则表示没有扩增，即表明待测DNA样品中没有含有温和气单胞菌的zipA基因，判断为阴性。
实施例3本发明温和气单胞菌的LAMP检测方法的特异性试验
为了检测本发明试剂盒的特异性，采用上述实施例2中的LAMP检测方法，分别以温和气单胞菌（ATCC43979）、嗜水气单胞菌（ATCC7966）、维氏气单胞菌（ATCC35624）、豚鼠气单胞菌（ATCC15468）、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌的核酸为模板，并设置以无菌去离子水为模板的阴性对照，进行特异性试验。
检测结果如图1所示：嗜水气单胞菌特异性扩增，温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌以及阴性对照均未出现扩增。上述结果说明，本发明LAMP检测试剂盒能特异性扩增出温和气单胞菌的靶序列，而不与其它细菌核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。
实施例4本发明温和气单胞菌的LAMP检测方法的灵敏度试验
提取重组质粒，重组质粒浓度用超微量分光光度仪测定，提取质粒的过程同实施例1的3），对重组质粒进行10倍倍比稀释，充分振荡混匀稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共10个梯度，采用上述实施例2中的LAMP检测方法，分别以上述梯度稀释的质粒为模板，并设置无菌去离子水为模板的阴性对照，进行扩增。
检测结果如图2所示，从左到右的曲线依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10重组质粒的扩增结果，从中2中可以看出本发明的LAMP试剂盒检测的灵敏度可达320fg/mL，为普通PCR的100倍，优于普通PCR检测方法，表明本发明的LAMP试剂盒和检测方法对嗜水气单胞菌的诊断具有高度的灵敏性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，其特征是：包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6中所示。
2.一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述试剂盒包括权利要求1中所述的检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述的检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比为8:4:1。
4.根据权利要求2所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述的LAMP反应液含10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mMMgSO4水溶液。
5.根据权利要求4所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述的10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液的体积比为8:5:2。
6.根据权利要求2所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述的阳性对照为含有温和气单胞菌zipA序列的重组质粒，所述的阴性对照为无菌去离子水。
7.根据权利要求2-6任一项所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括显色剂SYBR Green Ⅰ。
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