CN102424861A

CN102424861A - 检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102424861A
Application number: CN2012100036748A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 张磊; 潘志明; 耿士忠; 陈祥; 黄金林; 孙林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou Liangde Antibody Biotechnology Co ltd
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2032-01-06
Also published as: CN102424861B

Abstract

本发明涉及一种食品中病原菌的快速检测方法，特别是一种以HisJ为靶基因的环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法及试剂盒。所述的检测方法是以沙门菌HisJ基因为靶基因，使用四条环介导等温扩增特异性引物检测沙门菌，所述四条环介导等温扩增特异性引物序列如SEQIDNO1-4所示。本发明具有操作简单，检测时间短，特异性强，灵敏度高；适用范围广等优点，可替代传统的食品中沙门菌的检测方法。

Description

检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种食品中病原菌的快速检测方法，特别是一种以HisJ为靶基因的环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法及试剂盒，属于食品检测生物技术领域，适用于食品中沙门菌属的检测。

技术背景

沙门菌是最常见的食源性疾病病原菌，不仅能导致动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙门菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济的意义。传统的沙门菌检测常用分离培养和血清学方法，确诊检验结果至少需5～7天，检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷。因此，快速、准确、简便的沙门菌检测方法将是发展的方向。建立一种能快速检测沙门菌的检测方法具有重要的意义。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是建立于链替换自动循环反应基础之上。模板上的六个位点在恒温条件下被四条基础引物所识别并扩增，这赋予了此技术高度的特异性。与其他方法相比，环介导等温扩增只需要一个可以保持60-65℃恒温的简单加热装置如水浴锅。而且，环介导等温扩增反应在合成大量DNA的同时伴有大量的白色硫酸镁副产物，所以结果的判定只需肉眼简单观察浊度或通过加入DNA染料SYBR GreenI后观察颜色变化。HisJ基因被报道可以成功检测沙门菌分离株并被证明是一个可靠的靶基因(G.G.Stone，R.D.Oberst，M.P.Hays，S.McVey，and M.M.Chengappa，″Detection of Salmonella serovars from clinicalsamples by enrichment broth cultivation-PCR procedure，″Journal ofClinical Microbiology，vol.32，no.7，pp.1742-1749，1994；C.Gentry-Weeks，H.J.Hutcheson，L.M.Kim，D.Bolte，J.Traub-Dargatz，P.Morley，B.Powers，and M.Jessen，″Identification of twophylogenetically related organisms from feces by PCR for detection ofSalmonella spp，″Journal of Clinical Microbiology，vol.40，no.4，pp.1487-1492，2002)。

发明内容

本发明的目的是提供一种环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法，该方法能够快速、准确、高灵敏地检测食品中的沙门菌。

本发明通过以沙门菌种属特异性基因HisJ为靶基因，设计了一组四条引物特异性扩增HisJ基因以达到检测沙门菌的目的。为了使检测具有好的灵敏度与特异性，我们使用了BPW(蛋白胨水)进行预增菌，使用了孔雀绿培养基进行选择性增菌。获得了高特异性高灵敏度的结果。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法，采用GenBank登录号为CP001363.1的沙门菌HisJ基因序列，设计一组四条引物SALFIP、SALBIP、SALF3和SALB3C，以常规水煮裂解法提取的鼠伤寒沙门菌基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，其步骤如下：

A、所述的引物序列为：

SALFIP：ttgcctttcagcgacgcgacttttctgattcccgtctggtggt；(SEQ ID NO.1)

SALBIP：tgctacaggggacgacgcagttttacgatctcaatccctttcgg；(SEQ ID NO.2)

SALF3：aggaaatcgcgtttaccgac；(SEQ ID NO.3)

SALB3C：gttgtcctgcccctggta.(SEQ ID NO.4)

B、所述的水煮裂解法步骤为：取细菌悬液1ml 8,000×g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤；接着再用8,000×g离心获取沉淀并使用100μl超纯水重悬细菌；使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100℃煮沸10min，12,000×g离心3分钟，吸取上清作为模板；

C、反应体系设为25μL，体系组成：引物SALFIP和SALBIP各1.6μM，引物SALF3和SALB3C各0.4μM，dNTPs为1.6mM，硫酸镁为6mM，甜菜碱为1M，8U的Bst DNA聚合酶大片段，1×thermopol缓冲液，和2μl的样品基因组DNA；

D、环介导等温扩增反应程序为：混合液在63℃孵育60分钟后，反应液在80℃加热3分钟终止；可通过在PCR管中加入1.0μl 1/10稀释的SYBR green I(绿色荧光核酸染料)原液(黄色)后溶液的颜色变化来确定是否含有沙门菌。当含有沙门菌扩增DNA产物时，溶液呈现绿色；当无沙门菌扩增产物时，颜色仍为黄色。也可用肉眼观察PCR管中是否存在白色沉淀来判断样品中是否含有沙门菌。有白色沉淀，样品为沙门菌阳性；无白色沉淀，样品为沙门菌阴性。

本发明还公开了一种沙门菌检测试剂盒，包括试剂A：2×预混反应缓冲液12.5×20μL；试剂B：反应酶液1×20μL；试剂C：预混引物干粉，在使用前加入40μL超纯水，2×20μL；试剂D为阴性对照1mL；试剂E为阳性对照1mL；试剂F为SYBER Green I 1×20μL。

或者试剂A：10×ThermoPol缓冲液(New England Biolabs，USA)50μL，10mM dNTPs(Promega，USA)80μL，1M硫酸镁(Promega，USA)3μL，5M甜菜碱(Sigma，USA)100μL，超纯水17μL；

试剂B：8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs，USA)20μL；

试剂C：引物SALFIP和SALBIP干粉各0.8nmol，引物SALF3和SALB3C干粉各0.2nmol；

试剂D：超纯水1mL；

试剂E：高纯鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s基因组模板1mL(10ng/μL)；

试剂F：10000×SYBER Green I(invitrogen)2μL，DMSO 18μL。

试剂贮藏条件：-20℃。

本发明中总反应体系设为25μL，体系组成：引物SALFIP和SALBIP各1.6μM，引物SALF3和SALB3C各0.4μM，dNTPs为1.6mM，硫酸镁为6mM，甜菜碱为1M，8U的Bst DNA聚合酶大片段，1×ThermoPol缓冲液，和2μl的样品基因组DNA。

本发明所述的样品，待检时，采用水煮裂解法提取基因组DNA，具体步骤如下：吸取摇匀的培养细菌悬液1ml于1.5ml微量离心管中8,000×g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤。接着再用8,000×g离心获取沉淀并使用100μl超纯水重悬细菌。使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100℃煮沸10min，12,000×g离心3分钟，吸取上清作为模板。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1、操作简单，检测时间短，从样品DNA的提取到检测出结果仅需约1.5小时(不包括样品处理与预增菌)；

2、特异性强，灵敏度高；

3、适用范围广，可用于食品样品如鸡肉、猪肉、蔬菜等中沙门菌的检测，其最低检测限为增菌液中含沙门菌8×10²CFU/ml；

4、本方法可替代传统的食品中沙门菌的检测方法。

附图说明

图1.LAMP引物设计

箭头和方框表示引物在靶基因上的延伸方向。限制性酶切位点HinfI用加粗字体显示。

图2.限制性酶切分析沙门菌ATCC 14028s株LAMP扩增产物

泳道1.未酶切LAMP产物；泳道2.HinfI酶切后的LAMP产物；泳道3.阴性对照；泳道M.DL2000(宝生物)

图3-6是LAMP方法与PCR方法间的灵敏度比较

泳道M.DL2000；泳道1-8.分别对应于10倍稀释沙门菌ATCC14028s菌液即8.0×10⁶-8.0×10^-1CFU/ml；泳道9.模板为大肠杆菌的阴性对照；泳道10.模板为水的阴性对照。

图3.琼脂糖(1.5％w/v)电泳使用EB染色显示LAMP反应灵敏度。

图4琼脂糖(1.5％w/v)电泳使用EB染色显示PCR反应灵敏度。

图5肉眼检测LAMP产物的浊度。

图6肉眼检测SYBER Green I染色后的LAMP反应产物。

具体实施方式

实施例1

1、设计、合成引物

在GenBank中搜索沙门菌属的HisJ基因序列，对其同源性进行比较，其同源性在99％以上。参照GenBank中鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s(accession CP001363.1)设计引物。使用日本荣研化学有限公司的PrimerExplorer V4软件按照默认设定进行设计(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)。环介导等温扩增的引物设计区域位于沙门菌基因组HisJ基因2，516，325-2，516，524nt内(图1)。一组四条引物SALFIP、SALBIP、SALF3和SALB3C在大连宝生物公司按照PAGE纯度级别合成。

2、环介导等温扩增反应程序和反应体系建立

通过对引物浓度、硫酸镁浓度、甜菜碱浓度等的选择，确定最佳反应体系和反应程序。优化后的引物SALFIP和SALBIP最佳浓度为1.6μM，引物SALF3和SALB3C最佳浓度为0.4μM，硫酸镁最佳浓度为6mM，甜菜碱最佳浓度为1M。

3、方法特异性和酶切鉴定

将甘油低温保存的鼠伤寒沙门标准菌ATCC 14028s置于冰上解冻，接种到BPW内培养复苏24小时，细菌悬液按10倍递增稀释至8.0×10⁶-8.0×10^-1CFU/ml，分别提取核酸DNA，用本发明的环介导等温扩增检测体系进行检测，考察检测下限，同时以HisJ基因为模板的常规PCR做参照，对灵敏度进行评价。应用103株已知沙门菌或非沙门菌(表1和表2)测试基于HisJ为靶基因的环介导等温扩增技术检测沙门菌的特异性。

表1实验中使用的沙门菌

^aCMCC，中国医学微生物菌种保藏管理中心；

^bATCC，美国标准菌株保藏中心；

^c由斯坦福大学的Stocker博士馈赠；

^dC500，一种在中国大陆使用的猪霍乱沙门菌疫苗株；

^eNICPBP，中国药品生物制品检定所。

表2实验中使用的非沙门菌

^aNCTC，英国标准菌株保藏中心；

^bCCTCC，中国标准菌株保藏中心；

^cATCC，美国标准菌株保藏中心；

^d1996年分离自堪萨斯国际机场的一位腹泻病人。

结果显示，环介导等温扩增技术和常规PCR灵敏度检测限分别为增菌液中含沙门菌8×10²CFU/ml和8×10³CFU/ml(图3与图4)。用浊度和SYBR Green I染色分别来检测沙门菌环介导等温扩增技术灵敏度在图5和图6中显示。通过浊度观察和加入染料SYBR GreenI后的颜色变化，全部80株72个血清型的沙门菌被检测为阳性，23株非沙门菌判定为阴性。在引物SALFIP上我们设计了Hinf I酶切位点，可以通过对扩增产物进行酶切来鉴定反应的特异性。在对参考株ATCC 14028s扩增产物使用内切酶Hinf I进行酶切后，酶切产物有三段，分别为167bp、204bp和241bp(图2)。结果表明，以HisJ为靶基因的环介导等温扩增检测沙门菌技术具有高度的特异性。

4、灵敏度检测

应用鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s来检测环介导等温扩增的灵敏度，同时以HisJ基因为模板的常规PCR做对照。

所述的引物序列为SALFIP、SALBIP、SALF3、SALB3C。

反应程序为：混合液在63℃孵育60分钟后，反应液在80℃加热3分钟终止。可通过在PCR管中加入1.0μl 1/10稀释的SYBR green I原液(黄色)后溶液的颜色变化来确定是否含有沙门菌。当含有沙门菌扩增DNA产物时，溶液呈现绿色；当无沙门菌扩增产物时，颜色仍为黄色。也可用肉眼观察PCR管中是否存在白色沉淀来判断样品中是否含有沙门菌。有白色沉淀，样品为沙门菌阳性；无白色沉淀，样品为沙门菌阴性。

总反应体系设为25μL，体系组成：引物SALFIP和SALBIP各1.6μM，引物SALF3和SALB3C各0.4μM，dNTPs为1.6mM，硫酸镁为6mM，甜菜碱为1M，8U的Bst DNA聚合酶大片段，1×thermopol缓冲液，和2μl的样品基因组DNA。

所述的样品，待检时，采用水煮裂解法提取基因组DNA，具体步骤如下：吸取摇匀的培养细菌悬液1ml于1.5ml微量离心管中8,000×g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤。接着再用8,000×g离心获取沉淀并使用100μl超纯水重悬细菌。使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100℃煮沸10min，12,000×g离心3分钟，吸取上清作为模板。

实施例2

以His J为靶基因的环介导等温扩增技术检测食品中沙门菌

1.样品处理与细菌增菌

采集200份超市食品样品(鸡肉、猪肉和蔬菜)，首先使用100ml 0.1％BPW对样品在灭菌样品袋中进行洗涤。在样品经过充分的洗涤后，洗涤液倒入250ml锥形瓶，在37℃摇床中150rpm恒温震荡培养24小时。接着把1ml BPW培养物转入9ml孔雀绿培养基中并在42℃180rpm恒温培养24小时。

2.DNA的提取

首先细菌培养物在8,000×g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤。接着再用8,000×g离心获取沉淀并使用100μl超纯水重悬细菌。使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100℃煮沸10min，12,000×g离心3分钟，吸取上清作为模板。

3.食品样品中沙门菌检测

参照《食品安全国家标准(食品微生物学检验沙门氏菌检验)》(GB 4789.4-2010)，对200份食品样品作沙门菌分离鉴定，共检测出沙门菌阳性食品样品29份。应用本发明技术对200份样品进行沙门菌检测，结果显示，本发明技术检测出29份食品样品沙门氏菌阳性，符合率达100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgcctttca gcgacgcgac ttttctgatt cccgtctggt ggt 43

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgctacaggg gacgacgcag ttttacgatc tcaatccctt tcgg 44

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggaaatcgc gtttaccgac 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttgtcctgc ccctggta 18

Claims

1.一种检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法，其特征在于以沙门菌HisJ基因为靶基因，使用四条环介导等温扩增特异性引物检测沙门菌，所述四条环介导等温扩增特异性引物序列如SEQ ID NO1-4所示。

2.根据权利要求1 所述检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法，其步骤如下：

A、以水煮裂解法提取鼠伤寒沙门菌基因组DNA：取细菌悬液1ml 8,000 × g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤；接着再用8,000 × g离心获取沉淀并使用100 μl超纯水重悬细菌；使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100 ℃ 煮沸 10 min，12,000 × g离心3分钟，吸取上清作为模板；

B、将序列分别如SEQ ID NO1-4所示的一组4条引物SALFIP﹑SALBIP﹑SALF3和SALB3C与反应试剂组合，进行环介导等温扩增检测；

其反应体系为 25 μL，体系组成：引物SALFIP 和 SALBIP 各1.6 μM，引物SALF3和SALB3C 各0.4 μM，dNTPs 为1.6 mM，硫酸镁为6 mM，甜菜碱为1 M，8 U的Bst DNA 聚合酶大片段，1×ThermoPol 缓冲液，和2 μl的样品基因组DNA；

其反应程序：混合液在63 ℃ 孵育 60分钟后，反应液在80 ℃加热3分钟终止，观察。

3.一种沙门菌检测试剂盒，其特征在于包括：

试剂A: 2×预混反应缓冲液12.5×20 μL；

试剂 B: 反应酶液1×20 μL；

试剂 C: 预混引物干粉，在使用前加入40 μL超纯水，2×20 μL；

试剂D为阴性对照1 mL；

试剂E为阳性对照1 mL；

试剂F 为SYBER Green I 1×20 μL。

4.一种沙门菌检测试剂盒，其特征在于包括：

试剂A：10×ThermoPol 缓冲液50 μL，10 mM dNTPs 80 μL，1 M 硫酸镁3 μL，5 M甜菜碱100 μL，超纯水17 μL；

试剂 B：8 U Bst DNA 聚合酶大片段20μL；

试剂 C：引物SALFIP 和 SALBIP 干粉各0.8 nmol，引物SALF3和SALB3C干粉各0.2 nmol；

试剂 D：超纯水1 mL；

试剂 E：高纯鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s基因组模板1 mL (10 ng/μL)；

试剂F：10000×SYBER Green I 2 μL， DMSO 18 μL。