CN104651487B - 检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明新型公开了一种检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法；该检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：HRM反应预混液；dNTPs混合液；Taq聚合酶；上游引物；下游引物；荧光染料；DNA模版；水。本发明一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：提取样品DNA；对样品DNA进行多重荧光PCR扩增，扩增后对产物进行HRM分析后判定结果。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，成本低的检测食源性致病菌的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒的多重荧光PCR检测主要食源性致病菌的方法，而且检测结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法；该检测方法结核高分辨率熔解曲线HRM分析和荧光PCR技术，本方法可检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌及大肠杆菌O157:H7五种主要食源性致病菌中的一种或两种以上至五种食源性致病菌，属于微生物检测领域。
背景技术
2014年7月1日，国家卫计委发布的强制性食品安全标准“GB29921-2013《食品中致病菌限量》”正式实施，该标准涉及五种食源性致病菌，即本专利所述沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌以及大肠杆菌O157:H7。
其中，沙门氏菌(Salmonella)属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，已发现的近一千种。沙门氏菌病除可感染人外，还可感染很多动物，包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，该病受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，从而有效预防沙门氏菌病。
副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)，是一种嗜盐性细菌，系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性。进食含有该菌的食物可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒，主要来自海产品。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83％，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。
单增李斯特菌是是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。也是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
荧光PCR检测技术大致分为两大类：荧光探针法(标记荧光PCR)和非标记荧光染料法。前者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模板，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测，不过检测成本高。后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，无需另外合成探针，简便易行，成本较低。相对以往普通非探针标记荧光PCR所用非饱和染料，新型饱和燃料(如LC Green等)具有以下优点：①新型饱和染料对PCR反应没有任何抑制作用。②DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，在DNA双链高温熔解时，饱和荧光染料结合核酸更稳定。
目前，食源性致病菌的检测方法主要有传统的培养方法和分子检测方法。其中传统的培养分离检测方法，依赖于生化和形态学特点，我国以GB 4789系列国家食品安全标准作为经典方法，规范了食源性致病菌传统培养检测方法，分子检测方法则主要为SN/T1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》。但传统培养法存在操作繁琐、耗时长、易漏检等缺点。分子检测方法包括了常规PCR方法和探针法荧光PCR方法，常规PCR需要扩增后进行电泳，操作复杂且易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短等缺点。
研究人员对此已开展了许多方法研究，但是同时针对这五种食源性致病菌开展多重荧光PCR检测的研究尚未见报道
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，成本低的检测食源性致病菌的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒的多重荧光PCR检测主要食源性致病菌的方法，而且检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：
如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。
如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’。
如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。
如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。
如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE上游引物O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，所述下游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE下游引物O157R：‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。
本发明一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、对样品DNA进行多重荧光PCR扩增，其中在所述荧光定量PCR反应中所采用的反应液，包含下列成分：
C、扩增后对产物进行HRM分析后判定结果。
如上所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于步骤B中对所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性10～30s，55℃-63℃退火10～30s，72℃10～30s，共进行40～50个循环；
(3)72℃延伸10～30s。
如上所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
如上所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于所述荧光染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO 9染料中的一种或者两者以上的混合物。所述dNTP混合液为由各2.5mM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP组成。
本发明中根据食源性致病菌设计引物对：沙门氏菌设计引物对SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；针对金黄色葡萄球菌基因设计引物对SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’；针对单增李斯特菌基因设计引物对LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’；针对副溶血性弧菌O157设计引物对VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；VPR 5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’；针对大肠杆菌O157设计引物对O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，O157R：5‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。
本发明中标准品模板的制备：
以常规PCR方法扩增各食源性致病菌目的基因。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选但菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
本发明中PCR扩增和HRM分析
提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物的Tm值和基因。
在所述荧光定量PCR反应中所采用的反应液，包含下列成分：
所述荧光染料选自DNA饱和性染料，所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO 9染料中的一种或者两者以上的混合物。所述非标记荧光PCR结合HRM技术对五种食源性致病菌检测的反应程序如下：
本发明中敏感性和特异性试验
将10倍稀释的阳性模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实验。同时采用其他常见病原菌进行特异性验证，具体菌株名称和编号如下，同时设置阴阳性对照，验证方法的特异性。
| 参考菌株 | 编号 | 结果 |
| Salmonella.choleraesuis(猪霍乱沙门氏菌) | ATCC 10708 | + |
| Vibrio.parahaemolyticus(副溶血性弧菌) | ATCC 17802 | + |
| Salmonella.Enteritidis(肠炎沙门氏菌) | ATCC 13076 | + |
| Salmonella.Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌) | ATCC 13311 | + |
| staphylococcus.aureus(金黄色葡萄球菌) | ATCC 25923 | + |
| staphylococcus.aureus(金黄色葡萄球菌) | ATCC 49444 | + |
| Vibrio Parahemolyticus(副溶血性弧菌) | ATCC 17802 | + |
| Listeria.monocytogenes(单核细胞增生李斯特氏菌) | ATCC 19114 | + |
| Escherchia coli(大肠埃希氏菌O157:H7) | ATCC 43895 | + |
| Enterobacter.aerogenes(产气肠杆菌) | ATCC 13048 | - |
| Proteus.vulgaris(普通变形菌) | ATCC 6380 | - |
| Listeria.grayi(格氏利斯特氏菌) | ATCC 25401 | - |
| Listeria.ivanovii(伊氏利斯特氏菌) | ATCC 19615 | - |
| Listeria.welshimeri(威氏利斯特氏菌) | ATCC 35897 | - |
| Listeria.innocua(英诺克李斯特氏菌) | ATCC 33090 | - |
| Listeria.Seeligeri(斯氏利斯特氏菌) | ATCC 35967 | - |
| Enterococcus.faecalis(粪肠球菌) | ATCC 29212 | - |
| Citrobacter.freundii(弗氏柠檬酸杆菌) | ATCC 8090 | - |
| staphylococcus.epidermidis(表皮葡萄球菌) | ATCC 12228 | - |
| Klebsiella.pneumoniae(肺炎克雷伯氏菌) | ATCC 4352 | - |
| Yersinia.enterocolitica(小肠结肠炎耶尔森氏菌) | ATCC 27729 | - |
| Yersinia.Kristensenii(克氏耶尔森氏菌) | ATCC 33639 | - |
| Shigella boydii(鲍氏志贺氏菌) | AB 200052 | - |
| Campylobacter jejuni(弯曲肠杆菌) | ATCC 33291 | - |
| Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌菌) | ATCC 27853 | - |
| Pseudomonas putida(恶臭假单胞菌) | ATCC 49128 | - |
| Clostridium perfringens(产气荚膜梭菌) | ATCC 13124 | - |
本发明方法中只有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157:H7有光滑扩增曲线，其它病原菌均无明显扩增曲线，且检测灵敏度均达到10fg，且具有很好重复性。各食源性致病菌稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0.95，说明该方法具有很好的精确度和良好的稳定性。
本发明的检测方法相比其他方法，具有以下优点:
1)简化了检测流程，大大缩短了检测周期和检测成本，一次最多可检测384样本。检测时间只是传统培养分析方法的1/3；
2)样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，整个实验过程，PCR产物无需再转入其它装置，实现闭管操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
3)HRM无需特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限；相比传统的探针法荧光PCR，大大降低了使用成本；
4)HRM只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，不损伤PCR扩增产物，PCR产物可以进行下游分析。
附图说明
图1为五种食源性致病菌荧光PCR特异性实验图；
图2-6分别为五种食源性致病菌Tm calling分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
本发明非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测五种食源性致病菌的方法包括以下步骤：
A、根据五种食源性致病菌设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值。
其中步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中的反应液由以下组分组成：
其中所述的荧光染料为DNA饱和性染料，所述的DNA饱和性染料为Eva Green或LCPLUS等。所述dNTP混合液为由各2.5mM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP组成。
实施例1
使用本发明所述荧光PCR结合HRM分析技术检测食源性致病菌
DNA提取
采用无菌操作称取样品25g，加入到225mL规定培养基中培养，36±1℃培养18～24h。取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4min～5min,将上清转入新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
荧光PCR反应
反应体系如下：
反应条件参照下列程序：
PCR扩增产物循环次数分析和熔解曲线分析
采用HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行循环次数曲线分析，如果样品非标记荧光PCR有明显扩增曲线，且Cp值<38,判为阳性，Cp值>38而<45，重复一次，如果仍有明显上升曲线，则判为阳性，Cp值>45或无上升曲线判为阴性。
采用Tm calling软件对扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值并综合扩增曲线判定结果。其中各致病菌扩增产物判定参考Tm值分别为沙门氏菌：81.45±0.10℃、金黄色葡萄球菌：78.93±0.10℃、副溶血性弧菌：79.25±0.10℃、单增李斯特菌：84.07±0.10℃、大肠杆菌O157：H7:76.39±0.10℃。有明显扩增曲线，而Tm值超过判定参考值范围，可能为目的基因个别序列差异所致，建议直接将扩增产物测序，并根据序列同源性进行最终判定(超过95％可判定阳性)。
实施例2
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
其中所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。
实施例3
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’。
实施例4
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’；所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。
实施例5
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’；所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。
实施例6
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’；所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。
实施例7
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’。所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。
实施例8
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。所述上游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE上游引物O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，所述下游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE下游引物O157R：‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。
实施例9
本发明一种检测食源性致病菌的试剂盒，由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’。
所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。
所述上游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE上游引物O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，所述下游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE下游引物O157R：‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。
实施例10
本发明一种多重荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
A、根据食源性致病菌设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值；
其中步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中的反应液由以下组分组成：
其中步骤B中对所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性10～30s，55℃-63℃退火10～30s，72℃10～30s，共进行40～50个循环；
(3)72℃延伸10～30s。
其中步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
其中所述荧光染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO 9染料中的一种或者两者以上的混合物；所述dNTP混合液为由各2.5mM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP组成。
Claims (4)
1.一种食源性致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、根据食源性致病菌设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；其中所述样本为食物样品；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值；
其中步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中的反应液由以下组分组成：
所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物
SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；
所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA下游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；
所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，
所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’；
所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’；
所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR：
5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’；
所述上游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE上游引物O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，
所述下游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE下游引物O157R：5‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。
2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌的检测方法，其特征在于步骤B中对所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性10～30s，55℃-63℃退火10～30s，72℃10～30s，共进行40～50个循环；
(3)72℃延伸10～30s。
3.根据权利要求1或2所述的一种食源性致病菌的检测方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
4.根据权利要求3所述的一种食源性致病菌的检测方法，其特征在于所述荧光染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO9染料中的一种或者两者以上的混合物；所述dNTPs混合液为由各2.5mM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP组成。
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