CN107190079B - 五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品卫生安全快速检测领域；本发明通过提供五种针对大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌进行检测；本方案提供的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。
Description
技术领域
本发明属于食品卫生安全快速检测领域。涉及微流控芯片快速检测技术和环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术；涉及大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种食源性致病菌特定基因保守序列具有的特异性引物和引物组；还涉及将引物和引物组用于等温扩增法检测大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种食源性致病菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
近年来我国食品安全频频出现问题，由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。常见细菌性食物中毒的病原微生物有：致病性大肠杆菌（特别是出血性大肠杆菌O157:H7）；沙门氏菌属；志贺氏菌；致病性弧菌（包括：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）；金黄色葡萄球菌及其肠毒素；近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李斯特菌、空肠弯曲菌等。
食源性致病菌检测执行标准中主要检测方法为培养法、ELLISA法和PCR法。其中培养法是采用最广泛的方法，结果准确。但耗时多，操作复杂，人员需要专业训练。ELLISA法操作步骤较多，敏感性不佳，容易出现假阴性。
PCR技术从诞生至今已经30多年，期间不断发展和突破。本发明使用的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification）技术(国际专利号W0 00/28082)是2000年由Notomi等开发的核酸扩增技术。该技术使用一种在65℃恒温条件具有链置换活性的DNA聚合酶，催化针对靶基因6个区域设计的6条特异性引物以靶基因为模板进行扩增。扩增副产物焦磷酸与HNB（羟基萘酚蓝）发生显色反应。该方法特异性和敏感性都优于传统PCR技术，并且恒温扩增，对仪器无特殊要求。检测速度快，结果易读。
微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统，将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上，加载生物样品和反应液后，采用微机械泵、电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动，形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应。激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片中，对样品进行快速、准确和高通量分析。微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。它的目标是把整个化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上。具有检测通量高、样品量和试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种五种食源性病原菌微流控芯片快速检测试剂盒，用来克服现在没有类似相同功能产品的问题。
本发明是这样实现的，一种五种食源性病原菌微流控芯片快速检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增反应液、微流控芯片阵列、阴性对照物和阳性对照物，其中所述微流控芯片阵列设有大肠杆菌O157:H7检测芯片、金黄色葡萄球菌检测芯片、沙门氏菌检测芯片、单增李斯特菌检测芯片、副溶血弧菌检测芯片、阳性对照检测芯片、阴性对照检测芯片；所述大肠杆菌O157:H7检测芯片上设有大肠杆菌O157:H7引物组，所述金黄色葡萄球菌检测芯片上设有金黄色葡萄球菌引物组，所述沙门氏菌检测芯片上设有沙门氏菌引物组，所述单增李斯特菌检测芯片上设有单增李斯特菌引物组，所述副溶血弧菌检测芯片上设有副溶血弧菌引物组；所述阳性对照检测芯片和所述阴性对照检测芯片上同时设有大肠杆菌O157:H7引物组、金黄色葡萄球菌引物组、沙门氏菌引物组、单增李斯特菌引物组、副溶血弧菌引物组。通过一个试剂盒可以同时快速的对5种肠道菌进行检测。
本发明的进一步技术方案是：所述大肠杆菌O157:H7引物组由下列引物成：
正向外引物 F3 GCTATACCACGTTACATTTTG
反向外引物 B3 ACTACTCAACCTTCCCACCTTC
正向内引物 FIP GCTCTTTAAACAGACTGCACATTCGTTGACTAAATCTTATCTGG
反向内引物 BIP CTACTACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTTACAATTTGCC
正向环引物 LF AGGTTCCGCTATTCAGCATTAAAT。
本发明的进一步技术方案是：所述金黄色葡萄球菌引物组由下列引物成：
正向外引物 F3 GTACGGTTACAGATAGCATG
反向外引物 B3 GAAAGGCATTACGAGTTCTTGA
正向内引物 FIP GTTTCATAACCTTCAGCAAGCTTTCCATACAGTCATTTTCAAGA
反向内引物 BIP AAAGTCATTGCAGCTTGCTTACTTCGATCACTGGACGACG
正向环引物 LF AACTCATAGTTTACAACA
反向环引物 LB GTAAATTTAATGAAAGTGTTCA 。
本发明的进一步技术方案是：所述单增李斯特菌引物组由下列引物构成：
正向外引物 F3 ACGTTTCCCCGGTTACTGT
反向外引物 B3 ATTCCTTCTGAACCTTTGG
正向内引物 FIP CATAATAATCGGCTTCAATCACGCTCTTTAATCTGGCATT
反向内引物 BIP GCCACGTTCGGGCAATTCGTTAAAACTGGATTACCTTGACA
正向环引物 LF AGACGGCTCCAACTGATCG
反向环引物 LB ATAGCCTTTATTTGGGTT。
本发明的进一步技术方案是：所述副溶血弧菌引物组由下列引物构成：
正向外引物 F3 AGCTAACCCAAAGATGATCC
反向外引物 B3 GGTTGTATGAGAACCTAATTG
正向内引物 FIP ATGGACCTAAATGAAACGGAGCTCCTTTAAAAAACGAAGATGGT
反向内引物 BIP ACGTCGCACGGCGTTATCCGTTTAAGAACGTAATGTCTG
正向环引物 LF ACCAGTAGAAATCAATG
反向环引物 LB TTAGATTTTACGAACGAGA。
本发明的进一步技术方案是：所述沙门氏菌引物组由下列引物构成：
正向外引物 F3 ACGTTTCCCCGGTTACTGT
反向外引物 B3 ATTCCTTCTGAACCTTTGG
正向内引物 FIP CATAATAATCGGCTTCAATCACGCTCTTTAATCTGGCATT
反向内引物 BIP GCCACGTTCGGGCAATTCGTTAAAACTGGATTACCTTGACA
正向环引物 LF AGACGGCTCCAACTGATCG
反向环引物 LB ATAGCCTTTATTTGGGTT。
本发明的进一步技术方案是：所述扩增反应液中包含以下成份：20 mM Tris-HCl缓冲液，10 mM KCL，10 mM (NH4)2SO4，0.8 M Betaine，0.001 Tween 20、150μM HNB、2-6mMMgSO4、1-1.6mM dNTPs、0.16-0.64U/μL 链取代DNA聚合酶、ddH2O。
Betaine，俗称甜菜碱。无色柱状结晶。熔点293℃（分解）。能溶于水和醇。微溶于乙醚。易潮解，有甜味。在浓氢氧化钾中生成三甲胺。饲料级无水甜菜碱可用作饲料添加剂，是天然高效甲基供体，能部分代替蛋氨酸和氯化胆碱，降低饲料成本，减少猪背膘，提高瘦肉率和胴体品质。它的另外一个重要的功能是渗透压调节剂。在医药保健方面，甜菜碱具有保护肾脏、抗脂肪肝、明目和治疗动脉粥样硬化等心血管疾病的作用。来源是从甜菜制糖母液中回收，也可用合成法生产。
Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃），中文别名：三（羟甲基）氨基甲烷，Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH。此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。Tris也被用作滴定标准物。作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。
KCL是指氯化钾；式量74.560。无色立方晶体，常为长柱状。密度1.984克/厘米3。熔点770℃，于1500℃升华。溶于水，溶解度为34.7g（20℃）。易溶于甘油及碱类，微溶于乙醇，但不溶于无水乙醇、乙醚。有吸湿性，易结块。在水中的溶解度随温度的升高而迅速地增加，与钠盐常起复分解作用而生成新的钾盐。
(NH4)2SO4是指硫酸铵，它是一种无色结晶或白色颗粒。无气味。280℃以上分解。水中溶解度：0℃时70.6g，100℃时103.8g。不溶于乙醇和丙酮。0.1mol/L水溶液的pH为5.5。相对密度1.77。折光率1.521。硫酸铵主要用作肥料，适用于各种土壤和作物。还可用于纺织、皮革、医药等方面。
Tween 20是指吐温20，它是山梨醇及其一失水、双失水化合物与月桂酸酯按每摩尔山梨醇及其脱水化合物与约20摩尔的环氧乙烷在碱性条件下缩合而制得。酯化用的月桂酸中可能含有其它脂肪酸。
dNTPs是指脱氧核苷酸的意思，n是指a,t,g,c四中的任意。一般是做pcr的时候加的合成链的原料，是核酸链的单元。
DNA聚合酶（DNA Polymeras，EC编号2.7.7.7）是一种参与DNA复制的酶。它主要是以模板的形式，催化去氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子将会组成模板链并再进一步参与配对。DNA聚合酶以去氧核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、或dTTP，四者统称dNTPs）为底物，沿模板的3'→5'方向，将对应的去氧核苷酸连接到新生DNA链的3'端，使新生链沿5'→3'方向延长。新链与原有的模板链序列互补，亦与模板链的原配对链序列一致。
本方案中DNA聚合酶优选采用Bst DNA聚合酶，其乃是將Bacillusstearothermophilus中的聚合酶基因，保留了5’至3’聚合酶(pol)的片段，但是去除5’至’外切酶(exo)基因片段而成的Large Fragment。本酵素最主要的特性是具有超強的股取代能力（strand displacement）。因此在不具有5’- 3’外切酶活性的情況下，因阻礙到前端聚合反應而被取代釋出的一股並不會被水解。這種被釋出的單股DNA具有可被專一性引子(primer)辨識與做為模板的功能，因此許多恆溫增幅的反應，包含LAMP （Loop-mediatedisothermal amplification）與RCA (Rolling Circle Amplification)反應，都是利用這種原理而設計，也因此Bst DNA聚合酶自然就成為這類型反應中酵素的首選。
本发明的另一目的在于提供一种基于前述试剂盒的检测方法，该方法包括以下步骤：
步骤A：模版提取步骤，所述模版提取步骤系将食品样品标本分份使用相应肠道增菌液培养8-12小时后离心，弃上清液后用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加三蒸水煮沸后取上清液做待检模板DNA；
步骤B：样品制备步骤，所述样品制备步骤系按比例将扩增反应液与待测模版DNA混合；
步骤C：测试步骤，所述测试步骤系将步骤B配制好的各样品分别放入对应微流控芯片中，并将阳性对照物和阴性对照物放入对照物微流控芯片中。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤B中样品总体积为20-100μL，其中步骤A中获得的待测模版DNA体积为1-10 μL，其余为扩增反应液。
本发明的进一步技术方案是：步骤C中每个微流控芯片含有对应引物组，引物组中FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM。
本发明通过提供五种针对大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌进行检测。
本发明的有益效果是：本方案提供的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测试剂盒的示意图。
图2 为用图1所示的基因芯片对大肠杆菌O157:H7进行实际检测结果；阳性对照和大肠杆菌O157:H7检测孔出现扩增，软件判定为大肠杆菌O157:H7阳性。
图3 为用图1所示的基因芯片对金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；阳性对照和金黄色葡萄球菌检测孔出现扩增，软件判定为金黄色葡萄球菌阳性。
图4 为用图1所示的基因芯片对沙门氏菌进行实际检测结果；阳性对照和沙门氏菌检测孔出现扩增，软件判定为沙门氏菌阳性。
图5 为用图1所示的基因芯片对单增李斯特菌进行实际检测结果；阳性对照和单增李斯特菌检测孔出现扩增，软件判定为单增李斯特菌阳性。
图6 为用图1所示的基因芯片对副溶血弧菌进行实际检测结果；阳性对照和副溶血弧菌检测孔出现扩增，软件判定为副溶血弧菌阳性。
具体实施方式
本发明提供一种五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒。以下结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
本发明的第一个目的在于，提供大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种致病菌特异性片段检测用引物组。
所述引物组包括大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种病原菌检测用引物组，利用这些引物组能实现扩增靶基因特异碱基序列，所述靶基因分别为：大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌，为所述引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。
所述引物组包含：
一种大肠杆菌O157:H7检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GCTATACCACGTTACATTTTG
反向外引物 B3 ACTACTCAACCTTCCCACCTTC
正向内引物 FIP GCTCTTTAAACAGACTGCACATTCGTTGACTAAATCTTATCTGG
反向内引物 BIP CTACTACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTTACAATTTGCC
正向环引物 LF AGGTTCCGCTATTCAGCATTAAAT
可以扩增大肠杆菌O157:H7特异性序列。
一种金黄色葡萄球菌检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTACGGTTACAGATAGCATG
反向外引物 B3 GAAAGGCATTACGAGTTCTTGA
正向内引物 FIP GTTTCATAACCTTCAGCAAGCTTTCCATACAGTCATTTTCAAGA
反向内引物 BIP AAAGTCATTGCAGCTTGCTTACTTCGATCACTGGACGACG
正向环引物 LF AACTCATAGTTTACAACA
反向环引物 LB GTAAATTTAATGAAAGTGTTCA
可以扩增金黄色葡萄球菌特异性序列。
一种沙门氏菌检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 ACGTTTCCCCGGTTACTGT
反向外引物 B3 ATTCCTTCTGAACCTTTGG
正向内引物 FIP CATAATAATCGGCTTCAATCACGCTCTTTAATCTGGCATT
反向内引物 BIP GCCACGTTCGGGCAATTCGTTAAAACTGGATTACCTTGACA
正向环引物 LF AGACGGCTCCAACTGATCG
反向环引物 LB ATAGCCTTTATTTGGGTT
可以扩增沙门氏菌特异性序列。
一种单增李斯特菌检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 AAGCTGCTTTTGATGAAGA
反向外引物 B3 CGATTAAAAGTAACTACTT
正向内引物 FIP CGAATTTGAAGGAAGAATTTTTGATCGTAAGCTTAAAATCTGTCT
反向内引物 BIP TACGACTTTTCCGCAAAAGATTTTCAAAATATAACCTAAGTCTC
反向环引物 LB TGAAGTTCAAATCATCGATTAA
可以扩增单增李斯特菌特异性序列。
一种副溶血弧菌检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 AGCTAACCCAAAGATGATCC
反向外引物 B3 GGTTGTATGAGAACCTAATTG
正向内引物 FIP ATGGACCTAAATGAAACGGAGCTCCTTTAAAAAACGAAGATGGT
反向内引物 BIP ACGTCGCACGGCGTTATCCGTTTAAGAACGTAATGTCTG
正向环引物 LF ACCAGTAGAAATCAATG
反向环引物 LB TTAGATTTTACGAACGAGA
可以扩增副溶血弧菌特异性序列。
本发明的另一个目的在于，提供针对大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种食源性致病菌特异性基因片段的专用微流控芯片。该微流控芯片上固定有上述五种引物组及阳性质控品和阴性质控品组成的阵列。图1显示了基因芯片的排布示意图。
本发明的另一个目的在于，提供利用上述不同引物组基于环介导等温扩增法检测大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌的检测试剂盒。所述试剂盒至少包括含有扩增反应液及上述固定有上述引物组的基因芯片。该试剂盒的结构如图1所示。
所述扩增反应液中包括如下试剂：
表1 扩增反应液具体组分及浓度
所述Bst DNA Polymerase酶的原始浓度为为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为普通大肠杆菌基因组DNA(1〜100nM)。
本发明同时请求保护所述五种食源性致病菌的检测试剂盒的检测方法，该方法具体步骤为：
1）样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品标本；食品细菌待检标本分别用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0mL增菌10000 rpm下离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20〜30μL三蒸水煮沸5分钟，再取2μL上清液做待检模板DNA。
2）将内引物FIP/BIP稀释到40μM，外引物F3/B3稀释到5μM, 环引物LF/LB稀释到20μM,三对引物等比例混合，取1.2μL混合引物和0.8μL 0.05%-5%琼脂糖混合，将混合后的引物固定在芯片上。这一步操作在试剂盒出厂之前即已经完成。
3）阳性质控品，用1×105 copy/μL的大肠杆菌基因组稀释阳性质控品的所有引物，FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置。
4）大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌的环介导等温扩增（LAMP)。向扩增反应液中加入待检模板，形成如下总体积为20μL〜100μL的反应体系。
表2 反应体系中具体组分及浓度（反应总体积20μL -100μL）
振荡混匀后离心，将离心后的上清液注入芯片，转至等温显色检测系统，温度65℃进行反应，时间60min。
5）LAMP反应产物的检测
检测：与阴性对照孔比较，检测孔在等温显色检测系统上有S形曲线判定为阳性。在等温显色检测系统上未见S形曲线为阴性。
下面通过具体的大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一
1 引物制备
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌特异性基因的核酸片段设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物：
大肠杆菌O157:H7
序列编号1
正向外引物 F3 GCTATACCACGTTACATTTTG
序列编号2
反向外引物 B3 ACTACTCAACCTTCCCACCTTC
序列编号3
正向内引物 FIP GCTCTTTAAACAGACTGCACATTCGTTGACTAAATCTTATCTGG
序列编号4
反向内引物 BIP CTACTACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTTACAATTTGCC
序列编号5
正向环引物 LF AGGTTCCGCTATTCAGCATTAAAT
金黄色葡萄球菌
序列编号6
正向外引物 F3 GTACGGTTACAGATAGCATG
序列编号7
反向外引物 B3 GAAAGGCATTACGAGTTCTTGA
序列编号8
正向内引物 FIP GTTTCATAACCTTCAGCAAGCTTTCCATACAGTCATTTTCAAGA
序列编号9
反向内引物 BIP AAAGTCATTGCAGCTTGCTTACTTCGATCACTGGACGACG
序列编号10
正向环引物 LF AACTCATAGTTTACAACA
序列编号11
反向环引物 LB GTAAATTTAATGAAAGTGTTCA
沙门氏菌
序列编号12
正向外引物 F3 ACGTTTCCCCGGTTACTGT
序列编号13
反向外引物 B3 ATTCCTTCTGAACCTTTGG
序列编号14
正向内引物 FIP CATAATAATCGGCTTCAATCACGCTCTTTAATCTGGCATT
序列编号15
反向内引物 BIP GCCACGTTCGGGCAATTCGTTAAAACTGGATTACCTTGACA
序列编号16
正向环引物 LF AGACGGCTCCAACTGATCG
序列编号17
反向环引物 LB ATAGCCTTTATTTGGGTT
单增李斯特菌
序列编号18
正向外引物 F3 AAGCTGCTTTTGATGAAGA
序列编号19
反向外引物 B3 CGATTAAAAGTAACTACTT
序列编号20
正向内引物 FIP CGAATTTGAAGGAAGAATTTTTGATCGTAAGCTTAAAATCTGTCT
序列编号21
反向内引物 BIP TACGACTTTTCCGCAAAAGATTTTCAAAATATAACCTAAGTCTC
序列编号22
反向环引物 LB TGAAGTTCAAATCATCGATTAA
副溶血弧菌
序列编号23
正向外引物 F3 AGCTAACCCAAAGATGATCC
序列编号24
反向外引物 B3 GGTTGTATGAGAACCTAATTG
序列编号25
正向内引物 FIP ATGGACCTAAATGAAACGGAGCTCCTTTAAAAAACGAAGATGGT
序列编号26
反向内引物 BIP ACGTCGCACGGCGTTATCCGTTTAAGAACGTAATGTCTG
序列编号27
正向环引物 LF ACCAGTAGAAATCAATG
序列编号28
反向环引物 LB TTAGATTTTACGAACGAGA
2 基因芯片制备
芯片是由大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌所对应五组引物，PC（阳性质控品）、NC（阴性质控品）组成的阵列。
大肠杆菌O157:H7，FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置，自然晾干。
金黄色葡萄球菌，FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置，自然晾干。
沙门氏菌，FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置，自然晾干。
单增李斯特菌，FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置，自然晾干。
副溶血弧菌，FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置，自然晾干。
阳性质控品，用1×105 copy/μL的大肠杆菌基因组稀释所有引物，其中FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM，各取0.2μL，0.05%-5%琼脂糖0.8μL混合之后，点在相应位置，自然晾干。
3 核酸模版制备
在本具体实施例中，为了确定每种细菌的荧光曲线，我们先培养上述五种菌株的DNA进行测试。具体方法为大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌用相应增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0mL增菌液10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加100μL ddH2O煮沸10分钟，直接取2μL上清液作模板DNA。图2-6分别显示了使用纯细菌模版得到的曲线图谱。
但是在真正的测试中并不需要此步骤，而是样品将食品细菌待检标本分别用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0mL增菌10000 rpm下离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20〜30μL三蒸水煮沸5分钟，再取2μL上清液做待检模板DNA。
4 基于LAMP法的基因扩增
取扩增反应液72μL，加入3μL待检模板，形成如下表总体积为75μL的反应体系，反应体系如下：（反应总体积为75μL）
表3 反应体系中各组分及浓度
在温度为65℃的等温显色检测系统上反应60分钟。
6扩增产物的检测
与阴性对照孔比较，检测孔在等温显色检测系统上有S形曲线判定为阳性。在等温显色检测系统上未见S形曲线为阴性。
本发明通过提供五种针对大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌进行检测。
本发明提供的检测试剂和检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 北京百康芯生物科技有限公司
<120> 五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒
<130> 2017
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
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ttagatttta cgaacgaga 19
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Claims (4)
1.一种五种食源性病原菌微流控芯片快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括扩增反应液、微流控芯片阵列、阴性对照物和阳性对照物，其中所述微流控芯片阵列设有大肠杆菌O157:H7检测芯片、金黄色葡萄球菌检测芯片、沙门氏菌检测芯片、单增李斯特菌检测芯片、副溶血弧菌检测芯片、阳性对照检测芯片、阴性对照检测芯片；所述大肠杆菌O157:H7检测芯片上设有大肠杆菌O157:H7引物组，所述金黄色葡萄球菌检测芯片上设有金黄色葡萄球菌引物组，所述沙门氏菌检测芯片上设有沙门氏菌引物组，所述单增李斯特菌检测芯片上设有单增李斯特菌引物组，所述副溶血弧菌检测芯片上设有副溶血弧菌引物组；所述阳性对照检测芯片和所述阴性对照检测芯片上同时设有大肠杆菌O157:H7引物组、金黄色葡萄球菌引物组、沙门氏菌引物组、单增李斯特菌引物组、副溶血弧菌引物组；
所述大肠杆菌O157:H7引物组由下列引物成：
正向外引物F3 GCTATACCACGTTACATTTTG
反向外引物B3 ACTACTCAACCTTCCCACCTTC
正向内引物FIP GCTCTTTAAACAGACTGCACATTCGTTGACTAAATCTTATCTGG
反向内引物BIP CTACTACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTTACAATTTGCC
正向环引物LF AGGTTCCGCTATTCAGCATTAAAT；
所述金黄色葡萄球菌引物组由下列引物成：
正向外引物F3 GTACGGTTACAGATAGCATG
反向外引物B3 GAAAGGCATTACGAGTTCTTGA
正向内引物FIP GTTTCATAACCTTCAGCAAGCTTTCCATACAGTCATTTTCAAGA
反向内引物BIP AAAGTCATTGCAGCTTGCTTACTTCGATCACTGGACGACG
正向环引物LF AACTCATAGTTTACAACA
反向环引物LB GTAAATTTAATGAAAGTGTTCA；
所述单增李斯特菌引物组由下列引物构成：
正向外引物F3 ACGTTTCCCCGGTTACTGT
反向外引物B3 ATTCCTTCTGAACCTTTGG
正向内引物FIP CATAATAATCGGCTTCAATCACGCTCTTTAATCTGGCATT
反向内引物BIP GCCACGTTCGGGCAATTCGTTAAAACTGGATTACCTTGACA
正向环引物LF AGACGGCTCCAACTGATCG
反向环引物LB ATAGCCTTTATTTGGGTT
所述副溶血弧菌引物组由下列引物构成：
正向外引物F3 AGCTAACCCAAAGATGATCC
反向外引物B3 GGTTGTATGAGAACCTAATTG
正向内引物
FIP ATGGACCTAAATGAAACGGAGCTCCTTTAAAAAACGAAGATGGT
反向内引物BIP ACGTCGCACGGCGTTATCCGTTTAAGAACGTAATGTCTG
正向环引物LF ACCAGTAGAAATCAATG
反向环引物LB TTAGATTTTACGAACGAGA；
所述沙门氏菌引物组由下列引物构成：
正向外引物F3 ACGTTTCCCCGGTTACTGT
反向外引物B3 ATTCCTTCTGAACCTTTGG
正向内引物FIP CATAATAATCGGCTTCAATCACGCTCTTTAATCTGGCATT
反向内引物BIP GCCACGTTCGGGCAATTCGTTAAAACTGGATTACCTTGACA
正向环引物LF AGACGGCTCCAACTGATCG
反向环引物LB ATAGCCTTTATTTGGGTT；
所述扩增反应液中包含以下成份：20mM Tris-HCl缓冲液，10mM KCL，10mM(NH4)2SO4，0.8M Betaine，0.001Tween 20、150μM HNB、2-6mM MgSO4、1-1.6mM dNTPs、0.16-0.64U/μL链取代DNA聚合酶、ddH2O。
2.一种基于权利要求1所述的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：模版提取步骤，所述模版提取步骤系将食品样品标本分份使用相应肠道增菌液培养8-12小时后离心，弃上清液后用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加三蒸水煮沸后取上清液做待检模板DNA；
步骤B：样品制备步骤，所述样品制备步骤系按比例将扩增反应液与待测模版DNA混合；
步骤C：测试步骤，所述测试步骤系将步骤B配制好的各样品分别放入对应微流控芯片中，并将阳性对照物和阴性对照物放入对照物微流控芯片中。
3.根据权利要求2所述的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测方法，其特征在于：所述步骤B中样品总体积为20-100μL，其中步骤A中获得的待测模版DNA体积为1-10μL，其余为扩增反应液。
4.根据权利要求2所述的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测方法，其特征在于：步骤C中每个微流控芯片含有对应引物组，引物组中FIP和BIP引物浓度为40μM，F3和B3引物浓度5μM，LF和LB引物浓度20μM。
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| CN104651487A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-05-27 | 蔡先全 | 检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光pcr检测方法 |
| CN105177170A (zh) * | 2015-10-29 | 2015-12-23 | 大连民族大学 | 五种食源性致病菌的检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Denomination of invention: Microfluidic chip rapid detection technology and kit for five food borne pathogens Effective date of registration: 20221107 Granted publication date: 20200417 Pledgee: Zhongguancun Beijing technology financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING BAICARE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2022990000786 |
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