WO2020098474A1 - 用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用 - Google Patents

用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用。本发明用于核酸扩增比色反应的缓冲液包括如下浓度的组分组成：弱酸性物质0.5～10mM；二价阳离子盐0.5～10mM。本发缓冲液应用于制备核酸扩增比色反应体系和/或核酸扩增荧光检测中。本发明核酸扩增比色反应体系，包括一对或多对用于扩增的靶标核酸的寡核苷酸引物、一种或多种DNA聚合酶、所述用于比色反应的缓冲液和dNTPs。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用 技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用。
背景技术
许多对核酸序列和核酸生物信号的检测方法发展起来，其中就包含荧光技术。通过设计DNA引物来扩增样本中的核酸序列，例如聚合酶链式反应(PCR)、环介导的等温扩增技术(LAMP)等。这些方法扩增得到的扩增产物都是通过分子探针或者嵌入式荧光分子等荧光技术被定性和定量的。然而，这些技术都需要复杂的仪器设备，包括光学组件，一个激发源，还有一个或多个用于荧光发射检测的传感器。这种设备通常都很大，笨重并且昂贵。经过后续发展，侧向层析技术和凝胶电泳可以实现扩增产物的可视化检测。然而这些技术仍然需要额外的步骤，这也增加了反应时间，通常也需要其他的装置，比如说一个胶框。
基于pH敏感染料的比色法彻底摆脱了对大型仪器的依赖，使扩增反应结果肉眼可视化，更加适用于现场快速检测的需求。其原理是利用核酸扩增反应过程中伴随着焦磷酸的产生，造成反应液初始pH向酸性变化，从而引起反应体系中pH敏感染料颜色的变化。因此，当反应体系中有靶标存在并且引发扩增反应后，体系颜色会与初始状态形成鲜明的对比，从而指示靶标的存在。
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种利用聚合酶进行DNA体外扩增的技术，虽然PCR技术已经发展了几十年，成为应用最广泛的核酸检测方法之一，但是其仍面临着诸多问题，如反应过程需要反复升降温，过于依赖昂贵的热循环仪。因此，虽然结合pH敏感染料的PCR扩增技术可以实现结果的肉眼可视化检测，但是其仍然无法摆脱扩增过程对精密温度控制仪器的依赖。核酸等温扩增由于其扩增反应可以在恒定温度下进行，仅需要一个简单的温控装置(如水浴锅)即可完成反应，因此结合pH敏感染料的等温核酸扩增技术对于现场化检测核酸靶标的实现具有重要的意义。而目前的许多研究中应用于比色技术的缓冲液多依赖于Tris缓冲液，实际操作过程中的变色结果并不明显，因此，一种适合于扩增和比色技术的反应体系研究亟待开展。
发明公开
本发明的目的是提供一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用，本发明缓冲液在应用时能够促进扩增反应进行，能在更短的时间内更高效的实现核酸扩增的可视化检测，既能用于实现荧光检测，也能用于实现比色检测。
本发明提供的用于核酸扩增的缓冲液，该缓冲液在核酸扩增的反应体系中，有两个阶段：第一阶段，起缓冲体系的作用；第二阶段，失去缓冲能力之后，有一个pH值快速改变的跃迁的变化。
上述的用于核酸扩增的缓冲液中包括一种弱酸性物质。
本发明还提供了一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液，它包括如下浓度的组分组成：
弱酸性物质0.5～10mM；
二价阳离子盐0.5～10mM。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述弱酸性物质包括硼酸和/或氨基酸。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述的缓冲液在pH值可为9.74～7.50具有缓冲能力，具体可为8.8；在上述范围内，每滴加5×10 -6mol的H +，pH值降低不高于0.1个单位。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述缓冲液的滴定突跃范围pH值可为8.86～6.0；且在上述滴定突跃范围内，每滴加5×10 - 6mol的酸，pH降低1～3个单位。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述缓冲液的起始滴定突跃范围pH值可为8.86～7.50。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述氨基酸包括甘氨酸；
所述二价阳离子包括Mg 2+。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述的缓冲液包括如下浓度的组分组成：
氯化钾10～100mM；
硫酸铵1～20mM；
所述二价阳离子盐0.5～10mM；
非离子型表面活性剂0.05～1％，以体积分数计；
所述弱酸性物质0.5～10mM。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述的缓冲液具体包括如下浓度的组分组成：
氯化钾10～60mM；
硫酸铵1～10mM；
所述二价阳离子盐0.5～10mM；
非离子型表面活性剂0.05～1％，以体积分数计；
所述弱酸性物质0.5～4mM。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述非离子型表面活性剂包括吐温20。
上述的用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述的缓冲液中甘氨酸浓度为1.0～4mM。
本发明用于核酸扩增的缓冲液或用于核酸扩增比色反应缓冲液中，所述的缓冲液具体包括如下浓度的组分组成：氯化钾50mM；
硫酸铵10mM；
七水硫酸镁2mM；
Tween-20 0.1％，以体积分数计；
甘氨酸2mM。
上述的缓冲液初始pH值可为9.74。
上述的缓冲液中还包括PH敏感荧光染料；
所述PH敏感荧光染料选自中性红、酚红、甲酚红、酚酞、甲基红和百里酚蓝中的至少一种。
本发明还提供了所述的缓冲液在制备核酸扩增比色反应体系和/或核酸扩增荧光检测中的应用。
上述的应用中，所述扩增为等温扩增。
本发明进一步提供了一种核酸扩增比色反应体系，该体系包括核酸扩增体系以及所述用于核酸扩增的缓冲液和/或所述用于核酸扩增比色反应缓冲液。
本发明中，所述扩增体系包括本领域常规的体系，如引物对或多对用于扩增的靶标核酸的寡核苷酸引物、一种或多种DNA聚合酶和dNTPs。
本发明中，所述核酸扩增比色反应体系用于核酸扩增且通过检测颜色变化进 而判断扩增效果的体系，其中的核酸扩增方法可以是SEA技术。
上述的体系中，在所述核酸扩增比色反应体系中，所述缓冲液的起始pH值为8.0～8.80；优选地，pH值为8.6～8.8；更优选地，pH值为8.8。
上述的体系中，所述的体系中还包括PH敏感荧光染料；
所述PH敏感荧光染料选自中性红、酚红、甲酚红、酚酞、甲基红和百里酚蓝中的至少一种。
附图说明
图1为本发明的缓冲液的滴定曲线。其中代表每滴加50μL浓度为1M的酸时pH的变化。
图2为验证缓冲液可行性的比色图。其中，图A为10μL反应体系中含有终浓度为2mM的甘氨酸缓冲液且含有1μL靶标时的比色结果图；图B为10μL反应体系含有终浓度为1×的Tris缓冲液且含以水为空白对照的比色结果图。
图3为本缓冲液起始pH优化的比色图。其中A代表10μL反应体系中含有初始PH 8.80且含有1μL单增李斯特基因组靶标时的扩增曲线，B代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.80时且含有1μL单增李斯特基因组靶标时的比色结果图，C代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.60时且含有1μL单增李斯特基因组靶标时的比色结果图，D代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.40时且含有1μL单增李斯特基因组靶标时的比色结果图，E代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.20时且含有1μL单增李斯特基因组靶标时的比色结果图，F代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.00时且含有1μL单增李斯特基因组靶标时的比色结果图，G代表10μL反应体系含有初始PH 8.80、终浓度为1×的Tris缓冲液且含以水为空白对照时的比色结果图，H代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.80时且以水为空白对照时的比色结果图，I代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.60时且以水为空白对照时的比色结果图，J代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.40时且以水为空白对照时的比色结果图，K代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.20时且含以水为空白对照时的比色结果图，L代表10μL反应体系中反应液初始pH值为8.00时且含以水为空白对照时的比色结果图。
图4为本缓冲液和传统Tris缓冲液比较的荧光图。其中－▆－代表10μL反应体系中含有终浓度为2mM的甘氨酸缓冲液且含有1μL Anas platyrhynchos靶 标时的扩增曲线，－●－代表10μL反应体系中含有终浓度为1×的Tris缓冲液且含有1μL Anas platyrhynchos靶标时的扩增曲线，－▲－代表10μL反应体系中含有终浓度为2mM的甘氨酸缓冲液且以水为空白对照时的扩增曲线，－▼－代表10μL反应体系含有终浓度为1×的Tris缓冲液且含以水为空白对照时的扩增曲线。
图5为本发明的缓冲液与传统Tris缓冲液比较的比色图。其中A代表10μL反应体系中含有终浓度为1×的Tris缓冲液且含有1μL Anas platyrhynchos靶标时的比色结果图，B代表的是10μL反应体系中含有终浓度为2mM的甘氨酸缓冲液且含有1μL Anas platyrhynchos靶标时的比色结果图，C代表10μL反应体系含有终浓度为1×的Tris缓冲液且含以水为空白对照时的比色结果图，D代表10μL反应体系中含有终浓度为2mM的甘氨酸缓冲液且以水为空白对照时的比色结果图。
图6为验证方法对PCR产物检测限的比色图。其中A代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -9M的单增李斯特菌PCR产物作为靶标的比色结果图，B代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -10M的单增李斯特菌PCR产物作为靶标的比色结果图，C代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -11M的单增李斯特菌PCR产物作为靶标的比色结果图，D代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -12M的单增李斯特菌PCR产物作为靶标的比色结果图，E代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -13M的单增李斯特菌PCR产物作为靶标的比色结果图，F代表的是10μL反应体系中以水作为空白对照的比色结果图。
图7为验证方法对基因组DNA和RNA的检测限的比色图。其中A代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -11M的绿头鸭基因组DNA和RNA作为靶标的比色结果图，B代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -12M的绿头鸭基因组DNA和RNA作为靶标的比色结果图，C代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -13M的绿头鸭基因组DNA和RNA作为靶标的比色结果图，D代表的是10μL反应体系中含有终浓度为10 -14M的绿头鸭基因组DNA和RNA作为靶标的比色结果图，E代表的是10μL反应体系中以水作为空白对照的比色结果图。
实施发明的最佳方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法
实施例一、缓冲液及氨基酸滴定曲线
缓冲液由以下试剂配制成：
氯化钾50mM
硫酸铵10mM
七水硫酸镁2mM
Tween-20 0.1％(体积分数计)
甘氨酸2mM。
向初始pH值为9.74的缓冲液中，每次滴加1M的盐酸50μL，观测每次缓冲液的pH变化，绘制滴定曲线。从图1中可以看出，在pH 8.86～3.26范围内，滴加少量的酸能够引起pH的剧烈变化。
实施例二、SEA反应的比色检测
将本发明的缓冲液与SEA扩增技术结合，验证能否实现SEA技术对靶标的比色检测。
1、比色反应体系：
缓冲液：根据本发明实施例1中的缓冲液(反应体系中pH值为8.80)；
dNTPs：(10mM)：0.8μL；
引物P1(序列为5'-GTCATTGGAAACTGGAAGACTG-3'(SEQ ID No.2)):10 -6M
引物P2(序列为5'-CCACTCTCCTCTTCTGCAC-3'(SEQ ID No.3)):10 -6M
Bst 2.0WarmStart TM DNA polymerase(8U/μL):0.1μL；
中性红染料:100μM；
反应体系中阳性对照含有1μL单增李斯特菌基因组DNA(5'-GTCATTGGAAACTGGAGACTGGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGG-3'(SEQ ID No.1))和RNA靶标，同时以水作为靶标核酸(NTC)作为空白对照。最后用水补齐10μL反应体系。
2、比色反应条件：反应体系初始pH为8.80，扩增反应在恒定温度61℃下进行，反应结果肉眼可见。
从图2中可以看出，阳性结果由原先的黄色变为红色，空白对照仍然保持黄色。两种结果之间的对照明显，易于分辨。证明该发明的新型缓冲液能够有效的 实现SEA扩增的比色检测。
实施例三、缓冲液pH的优化
由于缓冲液的性质，扩增反应过程中产生的微量H +可以使反应液的pH发生突变，从而影响酸性指示剂颜色的变化。因此，初始反应体系的pH值对反应前后结果的判断具有很大的影响。为了得到最佳的结果，将本发明的缓冲液设置不同的初始pH，分别为：8.80、8.60、8.40、8.20、8.00。与dNTPs(0.8mM)、引物P1(SEQ ID No.2)，P2(SEQ ID No.3)(10 -6M)、Bst 2.0 WarmStart TM DNA polymerase(0.8U)、中性红染料(100μM)混合，以单增李斯特菌基因组DNA和RNA为靶标。同时以水作为靶标核酸(NTC)作为空白对照。最后用水补齐10μL反应体系。
从图3中可以看出，当本发明缓冲液初始pH值在8.80，8.60时，反应结束后的阳性与空白对照的结果对比明显。初始pH值在8.40，8.20，8.00时，阳性结果与空白对照相比有颜色变化，但是对比结果不明显。因此，相对选择pH8.80最为本发明缓冲液最优的初始pH值。
实施例四、本发明缓冲液与Tris缓冲液的比较
为比较本发明的缓冲液相比于传统的Tris缓冲液的优势，分别将本发明的缓冲液、Tris缓冲液(NEB)添加到SEA反应体系中。
1、荧光的比较：
荧光读数能够更加直观的表现出本发明的缓冲液对反应的促进作用。
将本发明的缓冲液与dNTPs(0.8mM)、引物P1(引物序列如下：5'-CGCATAACCCTCCTAGTCCAAG-3'(SEQ ID No.8))、P2(5'-CCCTCTGCTCAGGCAGGC-3'(SEQ ID No.9))(10 -6M)、Bst 2.0 WarmStart TM DNA polymerase(0.8U)、Evagreen(20×，0.25μL)混合，以绿头鸭基因组DNA(5'-CGCATAACCCTCCTAGTCCAAGCCGGACGGACTCGTATCCC-3')和RNA为靶标。同时以水作为靶标核酸(NTC)作为空白对照。最后用水补齐10μL反应体系。
从图4中可以看出，本发明的缓冲液存在的SEA反应体系相比于传统的Tris缓冲液，荧光起峰时间更加短，荧光值更高，反应效率更高，更加有利于比色反应的进行。
2、比色的比较
将本发明的缓冲液与dNTPs(0.8mM)、引物P1(引物序列如下：5'-CGCATAACCCTCCTAGTCCAAG-3'(SEQ ID No.8))、P2(5'-CCCTCTGCTCAGGCAGGC-3'(SEQ ID No.9))(10 -6M)、Bst 2.0 WarmStart TM DNA polymerase(0.8U)、中性红染料(100μM)混合，以绿头鸭基因组DNA(5'-CGCATAACCCTCCTAGTCCAAGCCGGACGGACTCGTATCCC-3')和RNA为靶标。同时以水作为靶标核酸(NTC)作为空白对照。最后用水补齐10μL反应体系。
从图5中可以看出，含有本发明的缓冲液下的SEA比色反应结束后，阳性结果由黄色变为红色，空白对照保持反应前的黄色，两种结果之间的对比效果明显。而Tris缓冲液存在的SEA比色反应结束后，阳性结果与阴性结果之间的对比差异不明显。
因此，相对于Tris缓冲液，本发明的缓冲液更加有利于SEA比色反应进行。
实施例五、比色反应的检测限
本实施例以不同浓度的靶标核酸为模板进行等温扩增，具体步骤如下：
1、以不同浓度的单增李斯特PCR产物(单增李斯特PCR产物是以单增李斯特的基因组DNA(SEQ ID No.4)为模板，采用引物P1(5'-GCCACACTGGGACTGAGACACG-3'(SEQ ID No.5))和引物P2(5'-CATCTCACGACACGAGCTGACGAC-3'(SEQ ID No.6))进行PCR扩增得到的PCR产物)模板。利用初始pH值为8.80的缓冲液与dNTPs(0.8mM)、引物P1(SEQ ID No.2)、P2(SEQ ID No.3)(10 -6M)、Bst 2.0 WarmStart TM DNA polymerase(0.8U)、中性红染料(100μM)混合，分别向每个反应管中加入同等体积不同浓度的单增李斯特PCR产物进行等温扩增。根据单增李斯特PCR产物在反应体系中的终浓度不同分为如下各组：单增李斯特PCR产物终浓度为10 -9M；单增李斯特PCR产物终浓度为10 -10M；单增李斯特PCR产物终浓度为10 -11M；单增李斯特PCR产物终浓度为10 -12M；单增李斯特PCR产物终浓度为10 -13M。同时以水作为靶标核酸(NTC)作为空白对照。最后用水补齐10μL反应体系。实验结果肉眼可见。
从图6中可以看出，当终反应体系中含有PCR产物浓度为10 -9M、10 -10M、10 -11M、10 -12M时，结果由黄色变为明显的红色，与空白对照的结果之间有 明显的区别。而PCR产物终浓度为10 -13M时，与空白对照之间没有区别。因此，本发明的缓冲液能够实现10 -12M及更高浓度PCR产物的检出。
2、以绿头鸭(Anas platyrhynchos)基因组DNA(序列为5'-CGCATAACCCTCCTAGTCCAAGCCGGACGGACTCGTATCCC-3'(SEQ ID No.7))和RNA为靶标，对比色反应的检测限进行检测。(引物序列如下：5'-CGCATAACCCTCCTAGTCCAAG-3'(SEQ ID No.8)和5'-CCCTCTGCTCAGGCAGGC-3'(SEQ ID No.9))。利用初始pH值为8.80的缓冲液与dNTPs(0.8mM)、引物P1(SEQ ID No.8)、P2(SEQ ID No.9)(10 -6M)、Bst 2.0 WarmStart TM DNA polymerase(0.8U)、中性红染料(100μM)混合，分别向每个反应管中加入同等体积不同浓度的绿头鸭基因组DNA和RNA进行等温扩增。根据绿头鸭基因组DNA和RNA在终反应体系中的浓度的不同，分为以下几组：绿头鸭基因组DNA和RNA终浓度为10 -11M；绿头鸭基因组DNA和RNA终浓度为10 -12M；绿头鸭基因组DNA和RNA终浓度为10 -13M；绿头鸭基因组DNA和RNA终浓度为10 -14M。同时以水作为靶标核酸(NTC)作为空白对照。最后用水补齐10μL反应体系。实验结果肉眼可见。
从图7中可以看出，当终反应体系中含有绿头鸭基因组DNA和RNA浓度为10 -11M、10 -12M时，结果由黄色变为明显的红色，与空白对照的结果之间有明显的区别。而基因组DNA和RNA终浓度为10 -13M，10 -14M时，与空白对照之间没有区别。因此，本发明的缓冲液能够实现10 -12M及更高浓度基因组DNA和RNA的检出。
工业应用
本发明缓冲液在应用时能够促进扩增反应进行，能在更短的时间内更高效的实现核酸扩增的可视化检测，既能用于实现荧光检测，也能用于实现比色检测。

Claims (16)

  1. 一种用于核酸扩增的缓冲液，其特征在于：该缓冲液在核酸扩增的反应体系中，有两个阶段：第一阶段，起缓冲体系的作用；第二阶段，失去缓冲能力之后，有一个pH值快速改变的跃迁的变化。
  2. 一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液，其特征在于：它包括如下浓度的组分组成：
    弱酸性物质0.5～10mM；
    二价阳离子盐0.5～10mM。
  3. 根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于：该缓冲溶液中包括一种弱酸性物质。
  4. 根据权利要求2或3所述的缓冲液，其特征在于：所述弱酸性物质包括硼酸和/或氨基酸。
  5. 根据权利要求4所述的缓冲液，其特征在于：所述的缓冲液在pH值为9.74～7.50具有缓冲能力；在上述范围内，每滴加5×10 -6mol的H +，pH值降低不高于0.1个单位。
  6. 根据权利要求5所述的缓冲液，其特征在于：所述缓冲液的滴定突跃范围pH值为8.86～6.0；且在上述滴定突跃范围内，每滴加5×10 -6mol的酸，pH降低1～3个单位。
  7. 根据权利要求4所述的缓冲液，其特征在于：所述缓冲液的起始滴定突跃范围pH值为8.86～7.50。
  8. 根据权利要求4所述的缓冲液，其特征在于：所述氨基酸包括甘氨酸；
    所述二价阳离子包括Mg 2+。
  9. 根据权利要求1或2或6所述的缓冲液，其特征在于：所述的缓冲液包括如下浓度的组分组成：
    氯化钾10～100mM；
    硫酸铵1～20mM；
    所述二价阳离子盐0.5～10mM；
    非离子型表面活性剂0.05～1％，以体积分数计；
    所述弱酸性物质0.5～10mM。
  10. 根据权利要求9所述的缓冲液，其特征在于：所述非离子型表面活性剂 包括吐温20。
  11. 根据权利要求1或2或10所述的缓冲液，其特征在于：所述的缓冲液中还包括PH敏感荧光染料；
    所述PH敏感荧光染料选自中性红、酚红、甲酚红、酚酞、甲基红和百里酚蓝中的至少一种。
  12. 权利要求1、2、3、5、6、7、8或10所述的缓冲液在制备核酸扩增比色反应体系和/或核酸扩增荧光检测中的应用。
  13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述扩增为等温扩增。
  14. 一种核酸扩增比色反应体系，其特征在于：该体系包括核酸扩增体系以及权利要求1、2、3、5、6、7、8或10所述的缓冲液。
  15. 根据权利要求15所述的体系，其特征在于：在所述核酸扩增比色反应体系中，所述缓冲液的起始pH值为8.0～8.80；优选地，pH值为8.6～8.8；更优选地，pH值为8.8。
  16. 根据权利要求15或16所述的体系，其特征在于：所述的体系中还包括PH敏感荧光染料；
    所述PH敏感荧光染料选自中性红、酚红、甲酚红、酚酞、甲基红和百里酚蓝中的至少一种。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003043402A2 (en) * 2001-10-19 2003-05-30 Proligo Llc Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes
CN103820541A (zh) * 2014-01-25 2014-05-28 青岛科技大学 一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的方法
US20150240293A1 (en) * 2012-08-23 2015-08-27 New England Biolabs, Inc. Detection of an Amplification Reaction Product Using pH-sensitive Dyes
WO2017209920A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 New England Biolabs, Inc. Detection of an amplification reaction product using ph-sensitive dyes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10253357B2 (en) * 2014-04-24 2019-04-09 Diassess Inc. Colorimetric detection of nucleic acid amplification
US20160289752A1 (en) * 2015-03-31 2016-10-06 Transponics Method for the Isothermic Amplification of Nucleic Acid and SNP Detection

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003043402A2 (en) * 2001-10-19 2003-05-30 Proligo Llc Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes
US20150240293A1 (en) * 2012-08-23 2015-08-27 New England Biolabs, Inc. Detection of an Amplification Reaction Product Using pH-sensitive Dyes
CN103820541A (zh) * 2014-01-25 2014-05-28 青岛科技大学 一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的方法
WO2017209920A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 New England Biolabs, Inc. Detection of an amplification reaction product using ph-sensitive dyes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TANNER NATHAN ET AL: "Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes", BIOTECHNIQUES, vol. 58, no. 2, 28 February 2015 (2015-02-28), pages 59 - 68, XP055245831, DOI: 10.2144/000114253 *

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