JP6884846B2 - 核酸増幅の比色検出方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、2014年4月24日に出願された米国特許仮出願第61/983,687号の恩典を主張する。
本出願は、ASCIIフォーマットにおいて電子出願され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2015年4月14日に作成された前記ASCIIコピーは、28770PCT_CRF_sequencelisting.txtという名称であり、サイズが5,524バイトである。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所のSmall Business Innovation Research Program(助成金番号1R41AI114068-01)により授与された政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
本発明は、核酸増幅反応産物の比色検出のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、1種または複数種の造塩発色剤を含む反応ミックスを用いた、核酸増幅反応産物の加速された比色検出に関する。
関連技術の説明
特定の核酸配列および核酸バイオマーカーの検出のためのいくつかの現在の方法は、蛍光法を含む。PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)およびLAMP(ループ介在増幅)などの核酸増幅スキームを用いて試料から核酸配列を増幅するために、DNAプライマーを設計する。典型的に、結果として生じたアンプリコンを、インターカレートする蛍光体または分子プローブを用いて、蛍光技術を通して検出および定量する。しかし、これらの技術には、光学部品、励起源、および蛍光放射の検出のための1つまたは複数のセンサーを含む、高性能の計器装備が必要である。これらの計器は、潜在的に、大きく、扱いにくく、かつ高価である。あるいは、アンプリコンを、アガロースゲルまたはラテラルフローアッセイを用いて比色法で視覚化することができる。しかし、これらの技術には、追加の工程が必要であって、結果までの時間を増大させ、いくつかの場合には、ゲルボックスなどの計器装備が必要である。
[本発明1001]
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液;
増幅反応を触媒するための酵素;および
造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
[本発明1002]
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、本発明1001の方法。
[本発明1007]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
増幅反応が熱サイクル反応である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
増幅反応が等温反応である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
造塩発色剤が比色剤または蛍光剤である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1001の方法。
[本発明1016]
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
酵素がDNAポリメラーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1018]
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1001の方法。
[本発明1021]
反応ミックスが塩基をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
反応ミックスが酸をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
反応ミックスが、dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1025の方法。
[本発明1027]
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、本発明1001の方法。
[本発明1028]
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、本発明1028の方法。
[本発明1031]
検出可能な比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、本発明1001の方法。
[本発明1032]
第2の造塩発色剤をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1033]
造塩発色剤がフェノールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
造塩発色剤がクレゾールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1032の方法。
[本発明1035]
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、本発明1001の方法。
[本発明1036]
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、本発明1001の方法。
[本発明1037]
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10 -9 〜4.8×10 -18 のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、本発明1001の方法。
[本発明1038]
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40%に希釈される、本発明1001の方法。
[本発明1039]
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、本発明1001の方法。
[本発明1040]
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、本発明1001の方法。
[本発明1041]
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、本発明1040の方法。
[本発明1043]
増幅反応産物の比色検出のためのキットであって、
8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液;
増幅反応を触媒するための酵素;
造塩発色剤;ならびに
試料が標的核酸鋳型分子、反応ミックスを含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生する条件下で、該緩衝液および該酵素および該造塩発色剤を含む反応ミックスと試料を接触させることについての説明を含む、使用説明書であって、標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、使用説明書
を含む、キット。
[本発明1044]
酸または塩基をさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1045]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1044のキット。
[本発明1046]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1044のキット。
[本発明1047]
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1048]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1047のキット。
[本発明1049]
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1043のキット。
[本発明1050]
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1043のキット。
[本発明1051]
酵素が、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1043のキット。
[本発明1052]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1043のキット。
[本発明1053]
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
増幅反応を触媒するための酵素;および
造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、検出可能な比色変化を50μmのセル光路長で定量することができ、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
[本発明1054]
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、本発明1053の方法。
[本発明1055]
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、本発明1053の方法。
[本発明1057]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、本発明1053の方法。
[本発明1058]
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、本発明1053の方法。
[本発明1059]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、本発明1053の方法。
[本発明1060]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、本発明1053の方法。
[本発明1061]
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、本発明1053の方法。
[本発明1062]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、本発明1053の方法。
[本発明1063]
増幅反応が熱サイクル反応である、本発明1053の方法。
[本発明1064]
増幅反応が等温反応である、本発明1053の方法。
[本発明1065]
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、本発明1064の方法。
[本発明1066]
造塩発色剤が比色剤または蛍光剤である、本発明1053の方法。
[本発明1067]
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1053の方法。
[本発明1068]
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1053の方法。
[本発明1069]
酵素がDNAポリメラーゼである、本発明1053の方法。
[本発明1070]
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、本発明1069の方法。
[本発明1071]
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1053の方法。
[本発明1072]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1053の方法。
[本発明1073]
反応ミックスが塩基をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1074]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1073の方法。
[本発明1075]
反応ミックスが酸をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1076]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1078]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1077の方法。
[本発明1079]
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、本発明1053の方法。
[本発明1080]
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、本発明1053の方法。
[本発明1081]
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、本発明1080の方法。
[本発明1083]
第2の造塩発色剤をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1084]
造塩発色剤がフェノールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1083の方法。
[本発明1085]
造塩発色剤がクレゾールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1083の方法。
[本発明1086]
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、本発明1053の方法。
[本発明1087]
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、本発明1053の方法。
[本発明1088]
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10 -9 〜4.8×10 -18 のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、本発明1053の方法。
[本発明1089]
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40%に希釈される、本発明1053の方法。
[本発明1090]
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、本発明1053の方法。
[本発明1091]
反応ミックスが、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1092]
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、本発明1053の方法。
[本発明1093]
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、本発明1092の方法。
[本発明1095]
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
増幅反応を触媒するための酵素;および
少なくとも2種の造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
[本発明1096]
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、本発明1095の方法。
[本発明1097]
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、または紫外-可視による増幅反応産物の検出を含む、本発明1096の方法。
[本発明1098]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、本発明1095の方法。
[本発明1099]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、本発明1095の方法。
[本発明1100]
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、本発明1095の方法。
[本発明1101]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、本発明1095の方法。
[本発明1102]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、本発明1095の方法。
[本発明1103]
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、本発明1095の方法。
[本発明1104]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、本発明1095の方法。
[本発明1105]
増幅反応が熱サイクル反応である、本発明1095の方法。
[本発明1106]
増幅反応が等温反応である、本発明1095の方法。
[本発明1107]
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、本発明1106の方法。
[本発明1108]
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、比色剤または蛍光剤である、本発明1095の方法。
[本発明1109]
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1095の方法。
[本発明1110]
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1095の方法。
[本発明1111]
酵素がDNAポリメラーゼである、本発明1095の方法。
[本発明1112]
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、本発明1111の方法。
[本発明1113]
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1111の方法。
[本発明1114]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1095の方法。
[本発明1115]
反応ミックスが塩基をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1116]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1115の方法。
[本発明1117]
反応ミックスが酸をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1118]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1117の方法。
[本発明1119]
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1120]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1119の方法。
[本発明1121]
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、本発明1095の方法。
[本発明1122]
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、本発明1095の方法。
[本発明1123]
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、本発明1122の方法。
[本発明1124]
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、本発明1122の方法。
[本発明1125]
検出可能な比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、本発明1095の方法。
[本発明1126]
1種の造塩発色剤がフェノールレッドであり、もう1種の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1095の方法。
[本発明1127]
1種の造塩発色剤がクレゾールレッドであり、もう1種の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1095の方法。
[本発明1128]
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、本発明1095の方法。
[本発明1129]
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、本発明1095の方法。
[本発明1130]
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10 -9 〜4.8×10 -18 のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、本発明1095の方法。
[本発明1131]
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40%に希釈される、本発明1095の方法。
[本発明1132]
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、本発明1095の方法。
[本発明1133]
反応ミックスが、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1134]
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、本発明1095の方法。
[本発明1135]
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、本発明1134の方法。
[本発明1136]
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、本発明1134の方法。
核酸増幅反応産物の比色検出のための組成物および方法を、本明細書において開示する。いくつかの態様において、増幅された反応産物を、視覚的な色変化の観察によって、または増幅反応ミックスにおける造塩発色剤の色変化の吸光度もしくは蛍光を測定することによって検出する。
特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、別段の指定がない限り、下記に示すように定義される。
核酸増幅反応産物の加速されたかつ効率的な比色検出のための組成物および方法を、本明細書において開示する。ある態様において、比色アッセイを、増幅された核酸産物の存在を視覚的に検出するために使用し、これは、高価なかつ高性能の計器装備の必要性を排除する。
・マイクロリットルあたり少なくとも0.8単位のBstまたはBst 2.0ポリメラーゼ;
・0.8 Mのベタイン;
・合計で3.6μMのプライマー;
○1.6μMのFIPおよびBIPプライマー
○0.2μMのF3およびB3
・8 mMの硫酸マグネシウム;
・10 mMの硫酸アンモニウム;
・10 mMの塩化カリウム;
・反応ミックスの開始pHを調整するための水酸化ナトリウム;
・0.1%のTween20;
・各々1.4 mMのdNTP
・50μMのフェノールレッド
さらなる態様において、キットは、各々0.8μMのループFおよびループBプライマーを含む。
増幅反応は、核酸鋳型からヌクレオチドを増幅する。いくつかの態様において、増幅反応は、鎖置換反応などの等温増幅反応である。さらなる態様において、鎖置換反応は、鎖置換が可能であるような反応条件下で、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって提供される。鎖置換反応の例は、鎖置換増幅(SDA)、多置換増幅(MDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、またはループ介在等温増幅(LAMP)を含む。他の態様において、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの他の非等温増幅反応を含む。
核酸増幅反応産物の比色検出のためのアッセイにおいて、以下の試薬を一緒に混合して2×試薬ミックスを作製した。
・16 mMの硫酸マグネシウム(Sigma Aldrich)
・20 mMの硫酸アンモニウム(Sigma Aldrich)
・20 mMの塩化カリウム(Sigma Aldrich)
・試薬ミックスの開始pHを8.8のpHに調整する濃度の水酸化ナトリウム(Sigma Aldrich)
・0.1%(v/v)のTween20(Sigma Aldrich)
・各々1.4 mMのdNTP(NEB)
・50μMのフェノールレッド(Sigma Aldrich)
・マイクロリットルあたり0.8単位のBstポリメラーゼ(NEB)(酵素保存緩衝液は、反応ミックスに対して1 mMトリス緩衝液、5 mM KCl、0.01 mM EDTA、0.1 mM DTT、0.01% Triton X-100(v/v)、および5%グリセロール(w/v)をもたらす)
・0.8 Mのベタイン(Sigma Aldrich)
を有し;プライマーB3は配列:
を有し;プライマーFIPは配列:
を有し;およびプライマーBIPは配列:
を有する。核酸鋳型分子を、マンソン住血吸虫から精製した。図1は、核酸鋳型分子のSM1-7標的領域を示す(Hamburger et al, Detection of Schistosoma mansoni and Schistosoma haematobium DNA by Loop-Mediated Isothermal Amplification: Identification of infected Snails from Early Prepatency, Am J Trop Med Hyg, 2010を参照されたい)。陽性試験反応物は鋳型DNAを含有し、陰性対照反応物は水を含有した。反応ミックスは、7.5〜8.5の範囲の開始pHを有した。反応ミックスを、マイクロチューブ中で63℃までサーマルサイクラー上で加熱して、鋳型増幅を可能にした。45分のあらかじめ決められた反応期間の間に十分な鋳型増幅が起こり、該反応期間後に、結果として生じた反応ミックスの色を視覚的に観察した。
LAMP反応を、以下を含む反応ミックスで行った:10 mM (NH4)2SO4、15 mM KCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM DTT、0.01% Triton X-100(v/v)、5%グリセロール、8 mM MgSO4、各々1.4 mMのdNTP、0.1% v/v Tween-20、0.8 Mベタイン。異なる標的に特異的な3つのプライマーペアを、FIP/BIPについては各々1.6μM、F3/B3については各々0.2μM、ループB/Fについては各々0.4μMの最終濃度になるように添加した。最終反応物体積は10μLであり、63℃で様々なインキュベーション時間の間保持した。
LAMP反応を、実施例1のように、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度(pH 8.8に配合した緩衝液)、0.8 U/μlのBst 2.0 DNAポリメラーゼ、5 ngラムダDNA鋳型、および、0.2 mMニュートラルレッドまたは160μMブロモチモールブルーで行った。陽性反応物および鋳型を含まない陰性反応物の両方を、増幅後に、様々なチャネル深さを有するフローチャンバーに添加した(ニュートラルレッドについては図9A、およびブロモチモールブルーについては図9B)。これらのフローチャンバーは、50μm〜400μmの範囲にわたるチャネル深さを有し、アクリル樹脂に機械加工されていた。陽性反応物と陰性反応物との間の高い色対比差(視覚的検出閾値;点線を上回る)が、50μmおよびそれを上回るチャネル深さについて観察された。これにより、この視覚的検出ケミストリーが、ミリメートルに満たない光路長(深さ)およびそれを上回るものを有する反応チャンバーにおける使用に適用可能であることが示される。そのような反応チャンバーを、使用する試薬の量を低減させるため、および複数の反応がある一定の占有面積において(例えば、マイクロ流体カートリッジにおいて)起こるのを可能にするために使用することができる。
SDA反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った:1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度(pH 8.8に配合した緩衝液)、10 mM (NH4)2SO4、50 mM KCl(pH 8.5に調節)、8 mM MgSO4、各々4.4 mMのdATP、dGTP、dTTP、0.8 mM dCTP-αS(TriLink Biotechnologies)、0.1% v/v Tween-20、0.8 Mベタイン、0.32 U/μl Bst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、0.2U/uL BSoBI(New England Biolabs)、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。ヒトBRCA1用に設計したプライマー(SDAf: SEQ ID NO: 17; SDAr: SEQ ID NO: 18; BF: SEQ ID NO: 19; BR: SEQ ID NO: 20)を、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。5 ngのHeLa gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、65℃で様々なインキュベーション時間の間保持した。経時的な正規化された色相値における変化(図10)により、この視覚的検出ケミストリーがSDAで機能することが示される。
PCR反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った:50 mM KClおよび2 mM MgCl2(8.5に調節したpH)、各々0.5 mMのdNTP、5U Taq DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。酵素保存緩衝液およびプライマー(フォワード:SEQ ID NO: 21;リバース:SEQ ID NO: 22)からの持ち越し総トリス-HCl濃度は、最終反応ミックスにおいて1.15 mMであった。プライマーを、大腸菌(Escherichia coli)16s rRNA遺伝子用に設計し、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。10 ngの大腸菌gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、最初に95℃ホールドで2分間保持し、その後、95℃で10秒間、55℃で30秒間、68℃で30秒間の50サイクルを行った。経時的な正規化された色相値における変化(図11)により、この視覚的検出ケミストリーがPCRで機能することが示される。
LAMP反応を、実施例1のように、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度(pH 8.8に配合した緩衝液)、0.8 U/μlのBst 2.0 DNAポリメラーゼ、および5 ngラムダDNA鋳型で行った。色対比変化を、50μM濃度のフェノールレッド、ならびに、それぞれ50μMおよび160μM濃度のフェノールレッドおよびブロモチモールブルーの組み合わせについて評価した(図12A)。色対比変化をまた、260μM濃度のクレゾールレッド、ならびに、それぞれ260μMおよび160μM濃度のクレゾールレッドおよびブロモチモールブルーの組み合わせについても評価した(図12B)。対比値を、式:0.299R+0.587G+0.114Bを用いて、反応ミックスの画像のRGB値から算出した。正規化された対比変化を、バックラウンドに対して正規化した、陽性反応物対比値と陰性反応物対比値との間の差として定義した。造塩発色剤の組み合わせの使用による正規化された対比変化における増大により、そのような組み合わせの有用性が示される。
LAMP反応を、実施例1のように、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度(pH 8.8に配合した緩衝液)、0.8 U/μlのBst 2.0 DNAポリメラーゼ、それぞれ50μMおよび160μM濃度のフェノールレッドおよびブロモチモールブルー、ならびに様々なラムダDNA鋳型濃度で行った。色対比変化を、0.5 fg/μl、0.05 pg/μl、および0.5 pg/μlの最終濃度のラムダDNA標的について評価した。対比値を、実施例5に記載したように、反応ミックスの画像のRGB値から算出した。結果(図13)によって、より高いDNA濃度は、より低いDNA濃度よりも早く、視覚的対比における検出可能な変化をもたらすことが示される。したがって、本発明者らは、このケミストリーのリアルタイム色モニタリングにより様々な標的濃度を識別できることを示す。
Claims (19)
- 試料における増幅反応産物の比色検出のための組成物であって、該組成物が、
1または複数の緩衝剤を含む緩衝液であって、該緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中1.5 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、緩衝液と、
増幅反応を触媒するための酵素と、
反応ミックスの開始pHと反応ミックスの期待される終了pHとの間の移行pH範囲を有する比色剤であって、該反応ミックスの期待される終了pHが、前記増幅反応によって影響を受ける、比色剤と、
を含む反応ミックスを含む、組成物。 - 前記増幅反応によって引き起こされる比色剤の比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、請求項1に記載の組成物。
- 前記反応ミックスが、少なくとも2種の比色剤を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記増幅反応産物の検出が、比色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されており、かつ、該比色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記増幅反応が、等温反応である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、請求項5に記載の組成物。
- 前記比色剤または少なくとも2種の比色剤が、50μM〜260μMの濃度である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記試料の核酸鋳型分子を含む溶液が、0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補うことができ、かつ、該溶液が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 酸または塩基をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 酵素が、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記比色剤または少なくとも2種の比色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、およびフェノールフタレインのうちの1つまたは複数を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記比色剤または少なくとも2種の比色剤の移行pHが、pH5〜10である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中2 mM〜19 mMの濃度を有するトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中3 mM〜19 mMの濃度を有するトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中4 mM〜19 mMの濃度を有するトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中5 mM〜19 mMの濃度を有するトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中6 mM〜19 mMの濃度を有するトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中7 mM〜19 mMの濃度を有するトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する、、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
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