ITMI20112177A1 - Metodo per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di un acido nucleico - Google Patents

Metodo per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di un acido nucleico Download PDF

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ITMI20112177A1
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nucleic acid
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amplification
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mycoplasma
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Elisa Zambon
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Description

DESCRIZIONE
"METODO PER RILEVARE LA SINTESI E/O L'AMPLIFICAZIONE DI
UN ACIDO NUCLEICO"
La presente invenzione riguarda un metodo per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di acidi nucleici.
La tecnica più nota per amplificare gli acidi nucleici si basa su una reazione enzimatica definita reazione a catena della polimerasi, nota comunemente con 1'acronimo di PCR (derivante dall'espressione inglese Polymerase Chain Reaction).
La PCR ricostruisce in vitro la fase di sintesi del ciclo cellulare durante la quale il materiale genetico viene duplicato allo scopo di essere ugualmente distribuito alle cellule figlie.
In particolare, un classico protocollo di PCR prevede una fase di denaturazione dell'<'>acido nucleico (realizzata ad una temperatura variabile da 95 a 99°C) prima dei vari cicli di amplificazione. Questo step à ̈ necessario perché la polimerasi, cioà ̈ l'enzima responsabile dell'amplificazione dell'acido nucleico, utilizza un acido nucleico a singolo filamento come stampo per la sintesi della sequenza complementare. In particolare, la polimerasi sintetizza il nuovo filamento di acido nucleico inserendo, in maniera sequenziale, i nucleotidi complementari a quelli presenti sul filamento stampo a partire da piccoli frammenti di acido nucleico che fungono da inneschi (detti primer).
Ad ogni ciclo l'acido nucleico viene denaturato ad alta temperatura (fase di denaturazione), successivamente la temperatura viene abbassata ad un valore tale da consentire ai primer (gli inneschi) di legarsi alle regioni complementari dell'acido nucleico stampo (fase di "annealing"). Infine, si verifica la fase di polimerizzazione, cioà ̈ la polimerasi sintetizza la neocatena di acido nucleico a partire dall'innesco come prima descritto. Questo ciclo denaturazione-"annealing"-polimerizzazione viene reiterato per un certo numero di volte allo scopo di amplificare anche bassissime quantità di acido nucleico stampo. La polimerasi scelta à ̈ termoresistente dal momento che deve essere sottoposta per un lungo periodo ad alte temperature.
L'esigenza di denaturare l'acido nucleico per consentire l'amplificazione dello stesso vincola la realizzazione della PCR all'uso di un dispositivo termociclatore che consente di lavorare a diverse temperature durante le diverse fasi della metodica e di passare rapidamente da una temperatura all'altra.
Questo vincolo rende la PCR una tecnica difficilmente utilizzabile per le indagini estemporanee, cioà ̈ quei test che devono essere realizzati in maniera semplice e rapida sul campo allo scopo di prendere le decisioni più opportune in maniera tempestiva.
Una tecnica molto valida che svincola i protocolli di amplificazione di acidi nucleici dall'uso di un termociclatore à ̈ l'amplificazione isotermica mediata da loop o LAMP che à ̈ l'acronimo di "loop-mediated isothermal amplification".
La LAMP consente l'amplificazione isotermica degli acidi nucleici; in altre parole, durante l'intera reazione LAMP la temperatura viene mantenuta costantemente tra 60 e 65°C. Le condizioni costanti di temperatura consentono la realizzazione dell'intero protocollo di amplificazione LAMP in un bagno termostatato, in una stufa o in un termoblocco. In questo modo si ha a disposizione un protocollo di amplificazione di acidi nucleici completamente svincolato dall'uso del sofisticato e costoso termociclatore necessario per realizzare la PCR.
Da questo punto di vista la LAMP si propone come metodica d'elezione per i processi di amplificazione di acidi nucleici realizzati in campo ed in maniera completamente svincolata dal laboratorio. Ovvero la LAMP sembra essere una metodica particolarmente adeguata per le analisi note come "point~of-care testing". Infatti, questo tipo di analisi, essendo fatte su campo in maniera estemporanea da personale non necessariamente qualificato, richiedono tecniche molto versatili e semplici da realizzare.
Un aspetto delle tecniche di amplificazione di acidi nucleici come la PCR e la LAMP che ad oggi risulta essere ancora problematico, e quindi limitante, soprattutto per la realizzazione di test point-of-care, riguarda la fase di rilevazione dell'acido nucleico eventualmente amplificato.
Solitamente un acido nucleico amplificato mediante PCR oppure mediante LAMP può essere visualizzato mediante gel-elettroforesi condotta in presenza di agenti intercalanti. Gli intercalanti sono molecole in grado di emettere fluorescenza quando vengono eccitati dalla radiazione UV. Gli agenti intercalanti, per esempio il bromuro di etidio, agiscono inserendosi nella doppia elica dell'acido nucleico amplificato che può quindi essere visualizzato utilizzando la radiazione UV.
Alternativamente, si può monitorare l'amplificazione dell'acido nucleico in tempo reale (analisi "real-time") realizzando la reazione di amplificazione in presenza di precursori fluorescenti e misurando la fluorescenza emessa dal campione in esame mediante l'utilizzo di apposite apparecchiature. Infine, recentemente, la turbidimetria ha trovato larga diffusione come metodo di rilevazione dell'amplificazione di acidi nucleici (in particolare acidi nucleici amplificati mediante LAMP). Il turbidimetro misura l'incremento della torbidità della miscela di reazione che si verifica con il procedere della reazione di amplificazione dell'acido nucleico. L'aumento della torbidità della miscela di reazione, che si verifica a seguito dell'amplificazione di acidi nucleici, à ̈ correlato alla liberazione di ioni fosfato (provenienti dai nucleotidi) che, in presenza di magnesio, precipitano come magnesio pirofosfato e causano l'intorbidamento della soluzione.
Tuttavia, sia la visualizzazione dell'acido nucleico amplificato mediante agenti intercalanti, sia la visualizzazione "real-time" con molecole fluorescenti o la visualizzazione con il turbidimetro vincolano l'esecuzione della reazione di amplificazione di acidi nucleici ad una struttura equipaggiata ad hoc (un laboratorio od una facility) e dotata di personale qualificato che sia in grado di gestire la strumentistica e che sappia maneggiare sostanze pericolose per la salute pubblica ed ambientale come gli agenti intercalanti.
Inoltre, un ulteriore aspetto molto limitante dell'uso degli agenti intercalanti riguarda il fatto che essi vengono aggiunti alla miscela al termine della reazione di amplificazione o nel gel di agarosio qualora lo si usi come metodo di rilevazione. Ciò comporta l'apertura dei tubi in cui viene realizzata la reazione e, conseguentemente, il rischio elevato di contaminare l'ambiente con l'acido nucleico amplificato (sia esso contenuto nei campioni test, sia esso contenuto nei campioni di controllo positivo).
Le contaminazioni ambientali da parte di acidi nucleici possono permanere per periodi molto prolungati nonostante vengano attuate le dovute procedure di decontaminazione. Inoltre, le contaminazioni causano spesso falsi positivi che possono palesarsi ad intervalli, anche irregolari, magari quando il problema sembrava risolto. In questa situazione, allo scopo di garantire l'eradicazione della contaminazione, l'unica soluzione resta quella di ridisegnare il test e quindi riformulare ex novo i suoi componenti (per esempio i primer utilizzati per l'amplificazione).
E' chiaro che questo scenario, cioà ̈ la contaminazione ambientale, à ̈ assolutamente da evitare, in particolare, durante la messa a punto di kit diagnostici dal momento che la fase di validazione di un kit à ̈ una procedura estremamente costosa.
Recentemente, allo scopo di determinare un DNA amplificato mediante LAMP, Goto et. al hanno trovato che aggiungendo il blu di idrossi-naftolo (HNB) alla miscela di reazione à ̈ possibile seguire colorimetricamente l'amplificazione dell'acido nucleico (Goto et al. BioTechniques (2009) Voi. 46: 167-172).
Il blu di idrossinaftolo (HNB) à ̈ un indicatore di ioni metallici. Come abbiamo prima descritto, durante la reazione di amplificazione LAMP la concentrazione del magnesio diminuisce perché esso forma dei complessi col pirofosfato e precipita. La diminuzione della concentrazione del magnesio che accompagna l'amplificazione di un acido nucleico, provoca la variazione della colorazione di una miscela di reazione a cui à ̈ stato aggiunto HNB. In particolare, la colorazione della miscela passa da una tonalità di blu intenso ad una blu chiaro.
Tuttavia, nelle condizioni standard di reazione LAMP queste variazioni di tonalità sono difficilmente apprezzabili, soprattutto quando l'amplificazione à ̈ minima (cioà ̈ il campione à ̈ debolmente positivo) e quando l'occhio che valuta non à ̈ esperto.
La rilevazione dell'amplificazione di un acido nucleico resta quindi un problema ancora irrisolto.
In questo contesto, il problema tecnico alla base della presente invenzione à ̈ quello di mettere a disposizione un metodo per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di acidi nucleici migliorato in termini di sensibilità e quindi affidabilità del risultato rispetto ai sistemi noti nell'arte.
La Richiedente ha trovato una risposta al problema tecnico sopra esposto in un metodo colorimetrico per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di un acido nucleico in cui almeno un indicatore colorimetrico di metalli ed almeno un chelante del magnesio (preferibilmente un chelante blando del magnesio) vengono addizionati ad una miscela di reazione per l'amplificazione di acidi nucleici. Successivamente la miscela di reazione così ottenuta viene messa a contatto con un campione da analizzare allo scopo di sintetizzare e/o amplificare l'eventuale acido nucleico presente nel campione. Infine, verosimilmente al termine del processo di amplificazione, si verifica se la miscela di reazione ha subito una variazione della colorazione di partenza. Alla fine della fase di amplificazione una variazione netta del colore della miscela di reazione da un colore che rientra nella gamma del viola (per esempio, viola, lilla o magenta) ad un colore che rientra nella gamma del blu (ad esempio blu cielo), à ̈ significativa della presenza dell'acido nucleico target nel campione preso in esame.
Applicando il metodo della presente invenzione, la Richiedente ha sorprendentemente constatato un miglioramento significativo della rilevazione colorimetrica di acidi nucleici amplificati rispetto a guella che si ottiene applicando i metodi proposti dall'arte nota. In particolare, la Richiedente ha trovato che applicando il metodo dell'invenzione la rilevazione dell'amplificazione di acidi nucleici à ̈ più sensibile, cioà ̈ consente di rilevare minori concentrazioni di acido nucleico target, robusta, cioà ̈ non à ̈ influenzata da piccole variazioni nei parametri del metodo, e quindi à ̈ più affidabile rispetto ai metodi che la letteratura attualmente propone a tale scopo.
La maggiore sensibilità del metodo dell'invenzione rispetto ai metodi noti à ̈ dovuta al fatto che la differenza tra un campione negativo ed un campione debolmente positivo à ̈ visualizzabile ad occhio nudo come un netto viraggio di colore, mentre applicando i metodi noti si ottiene una lieve variazione di tonalità dello stesso colore (da blu intenso a blu chiaro). Infatti, quando un acido nucleico viene amplificato con il metodo dell'invenzione, se c'à ̈ stata amplificazione dell'acido nucleico il colore della reazione di amplificazione passa da un colore che rientra nella gamma del viola (per esempio, viola, lilla o magenta) ad un colore che rientra nella gamma del blu (ad esempio blu cielo). La differenza di colorazione à ̈ così evidente da essere facilmente apprezzata anche da un occhio non esperto. Questo miglioramento nella visualizzazione dell'acido nucleico amplificato à ̈ possibile solo se alla miscela di reazione per l'amplificazione vengono aggiunti in combinazione almeno un indicatore colorimetrico di metalli ed almeno un chelante blando del magnesio.
Il metodo della presente invenzione si à ̈ rivelato anche più vantaggioso da un punto di vista economico rispetto ai metodi noti. Infatti, esso funziona a concentrazioni di nucleotidi più basse rispetto alla norma (à ̈ noto che i nucleotidi costituiscono un materiale di partenza molto costoso ma necessario per realizzare queste metodiche) . Ciò consente di abbassare in maniera non trascurabile i costi associati all'applicazione della metodica, soprattutto negli screening massivi.
Infine, la Richiedente ha trovato che l'aggiunta dell'almeno un chelante blando del magnesio ad una miscela di reazione per l'amplificazione di acidi nucleici, in taluni casi può agevolare, la reazione di amplificazione.
Di seguito la presente invenzione verrà descritta in maniera dettagliata anche con l'ausilio delle figure in allegato in cui:
- la Figura 1A mostra la differenza di colorazione tra un campione biologico positivo (contenente un acido nucleico amplificato) ed un campione biologico negativo (non contenente l'acido nucleico) ottenuta con un metodo di rivelazione dell'arte nota in assenza di sodio citrato;
- la Figura 1B mostra la differenza di colorazione tra un campione biologico positivo (contenente un acido nucleico amplificato) ed un campione biologico negativo (non contenente l'acido nucleico) ottenuta con il metodo dell'invenzione; - la Figura 2A mostra evidenziata in grigio l'andamento (crescente) di una classica curva di amplificazione di un DNA target mediante reazione LAMP condotta in presenza di SYBR GREEN (che à ̈ il canale di lettura del segnale) mediante termociclatore reai time;
- la Figura 2B mostra evidenziato in nero l'andamento (decrescente) della curva di amplificazione di un DNA target mediante reazione LAMP condotta in presenza di blu di idrossinaftolo (il canale di lettura del segnale utilizzato corrisponde a quello del SYBR GREEN) mediante termociclatore reai time; - le Figure 3 A-C mostrano l'effetto del sodio citrato sull'andamento della curva di amplificazione di un DNA target mediante reazione LAMP condotta in presenza di SYBR SAFE e letto nel canale SYBR GREEN in termociclatore reai time. Le concentrazioni di sodio citrato analizzate sono: 0,5 mM (Figura 3-A), 1 mM (Figura 3-B) e 1,5 mM (Figura 3-C).
La presente invenzione ha per oggetto un metodo per rilevare colorimetricamente la sintesi e/o l'amplificazione di acidi nucleici caratterizzato dal fatto che detto metodo prevede di aggiungere ad una miscela di reazione per l'amplificazione di acidi nucleici almeno un indicatore colorimetrico di metalli ed almeno un chelante blando del magnesio.
In particolare, il metodo per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di un acido nucleico secondo la presente invenzione comprende le fasi di:
(i) fornire almeno un set di primer disegnati per sintetizzare e/o amplificare almeno una regione della sequenza di un acido nucleico target;
(ii) combinare il set di primer secondo la fase (i) con una miscela di reazione per l'amplificazione di un acido nucleico target, comprendente almeno un indicatore metallico e almeno un chelante (blando) del magnesio;
(iii) mettere a contatto la miscela di reazione ottenuta dalla fase (ii) con un campione biologico in modo da amplificare almeno una regione della sequenza dell'acido nucleico target eventualmente presente nel campione; e
(iv) verificare l'eventuale variazione della colorazione della miscela di reazione.
L'aggiunta della combinazione di almeno un indicatore colorimetrico di metalli e di almeno un chelante blando del magnesio rende la miscela di reazione colorimetricamente sensibile a minime quantità di acido nucleico amplificato. Infatti, applicando il metodo della presente invenzione, anche piccole quantità di acido nucleico amplificato sono in grado di provocare un netto viraggio del colore della miscela di reazione. Nel metodo secondo la presente invenzione la colorazione della miscela vira da un colore che rientra nella gamma del viola (per esempio, viola, lilla o magenta) ad un colore che rientra nella gamma del blu (ad esempio blu cielo). Mentre, applicando i metodi proposti dall'arte nota, l'amplificazione di un acido nucleico provoca la variazione della colorazione della miscela di reazione da un blu intenso ad un blu cielo. Il metodo della presente invenzione consente di esaltare notevolmente le differenze di colorazione tra un campione positivo (cioà ̈ un campione in cui à ̈ stato amplificato un acido nucleico) ed un campione negativo (cioà ̈ un campione in cui non c'à ̈ stata amplificazione di acido nucleico). Infatti anche un campione solo debolmente positivo (piccole quantità di acido nucleico amplificato) risulta rilevabile col metodo della presente invenzione. Fondamentale per questo tipo di risultato à ̈ la combinazione di almeno un chelante blando del magnesio e di almeno un indicatore colorimetrico di metalli.
Un primo aspetto del metodo della presente invenzione riguarda l'indicatore colorimetrico di metalli che, preferibilmente à ̈ scelto tra: blu idrossinaftolo, nero eriocromo T, 8-idrossichinolino butilammide, giallo titanio, xylidyl blu, calmagite, magon, blu timolo, cianina eriocromo R, alizarina S, o-cresolftaleina, 1,2,3-triidrossiantrachinone, leuco-quinizarina, quinalizarina, p-nitrobenzene-azo-ap-nitrobenzeneresorcinolo, butilammide, cromotropo 2B, ammoniaca fenolftaleina, ipoioditi alcalini, acido pentametinedibarbiturico, e difenilcarbazide.
Detto indicatore à ̈ utilizzato, preferibilmente, ad una concentrazione che varia da 0,05 a 0,2 mM, più preferibilmente varia da 0,1 a 0,15 mM.
L'indicatore colorimetrico di metalli particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ il blu di idrossinaftolo.
Un secondo aspetto del metodo della presente invenzione riguarda il chelante blando del magnesio che, preferibilmente, à ̈ scelto tra: sodio citrato, acido acetico, ADP, acido aspartico, ADP, ATP, acido n-Butirrico, acido citrico, cisteina, , acido 3,4-diidrtossibenzoico, 0,O-dimetilpurpurogallìn, EDTA, EGTA, acido gluconico, acido glutamico, acido glutarico, acido glicerico, glieina, acido glicolico, glicilglicina, guanosina, acido B-idrossibutirrico, inosina trifosfato, acido lattico, acido malico, NTA, acido, ossalico, polifosfato, acido propionico, purina, salicilaldeide, acido salicilico, acido succinico, acido tartarico, tetrametafosfato, trimetafosfato, trifosfato e uridina difosfato.
Preferibilmente detto chelante blando del magnesio à ̈ utilizzato ad una concentrazione che varia da 0,5 a 2 mM, preferibilmente da 0,8 a 1,2 mM.
Il chelante blando del magnesio particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ il sodio citrato .
In una forma di realizzazione preferita il blu di idrossinaftolo à ̈ impiegato in combinazione con il sodio citrato. L'acido nucleico sintetizzato e/o amplificato con il metodo secondo la presente invenzione à ̈ DNA e/o RNA. Nel caso in cui l'acido nucleico da amplificare sia una molecola di RNA, essa viene preferibilmente prima retro-trascritta da un enzima come la trascrittasi inversa. L'acido nucleico retrotrascritto o cDNA à ̈ quindi amplificato secondo il metodo secondo la presente invenzione .
Nel contesto della presente invenzione per metodo di sintesi e/o di amplificazione di acidi nucleici si intende una metodica che consente la moltiplicazione di un determinato frammento di acido nucleico di interesse. Il metodo di sintesi e/o di amplificazione di acidi nucleici preferito ai fini della presente invenzione à ̈ la LAMP, la PCR oppure le sue varianti. Particolarmente preferita à ̈ l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP).
La tecnica LAMP Ã ̈ una metodica di amplificazione di acidi nucleici di recente sviluppo (Notomi T. et al., 2000).
I principi del metodo LAMP sono brevemente descritti a seguire allo scopo di favorire la comprensione di alcuni aspetti preferiti della presente invenzione.
II metodo LAMP si basa sull'uso di un set di 4 primer (altrimenti detti oligonucleotidi od inneschi) disegnati in maniera specifica per una certa sequenza di acido nucleico, per esempio una molecola di DNA. Inoltre, la LAMP usa una polimerasi termofilica in grado di sintetizzare ed amplificare l'acido nucleico target in condizioni isotermiche mediante "strand displacement". Il set di primer comprende una coppia di primer esterni F3 e B3, ed una coppia di primer interni FIP e BIP. Essi sono specifici e quindi sono in grado di riconoscere e legare 6 distinte regioni fiancheggianti della sequenza di DNA target che si vuole amplificare. A partire dal 5' del DNA target, le regioni fiancheggianti sono: F3, F2, Fi, Blc, B2c e B3c ("c" sta per complementare).
I primer sono disegnati in modo da promuovere la formazione di strutture "hairpin-loop" durante gli step iniziali della reazione, e di consegnenza la sintesi di elevate quantità di "self-primed" DNA a partire da queste strutture mano a mano che la reazione procede. In particolare, i primer esterni F3 e B3 sono ordinari primer a singolo dominio e consentono di amplificare l'intera sequenza di DNA target. I primer interni (FIP e BIP) sono primer ibridi (a doppio dominio) e sono costituiti rispettivamente dalle regioni Flc ed F2 (FIP) e dalle regioni Blc e B2 (BIP) . Ogni primer della coppia interna à ̈ in grado di riconoscere 2 delle 6 regioni del DNA target e la coppia di primer interni (FIP e BIP) svolge il ruolo principale nella reazione LAMP (infatti essi sono utilizzati ad una concentrazione molto più alta (in eccesso) rispetto alla coppia di primer esterni).
La reazione LAMP consiste essenzialmente in 2 fasi: una prima fase à ̈ consente la generazione della struttura di partenza della fase di amplificazione vera e propria, che à ̈ la seconda fase.
Nella prima fase i primer interni sono i primi a reagire. In particolare, la regione F2 di FIP si lega alla regione complementare (F2c) del DNA target e comincia l'allungamento del neo-filamento di DNA ad opera della polimerasi.
A questo punto il primer esterno F3 si lega alla regione del DNA target complementare (F3c) e, scalzando il filamento di DNA sintetizzato a partire da FIP, libera il neo-filamento di DNA. Al 3' di questo filamento di DNA si forma una struttura a cappio ("loop") perché la regione Flc (derivante da FIP) ibridizza con la regione Fi del neo-filamento.
I primer BIP e B3 reagiscono sull'altra estremità in maniera analoga.
Alla fine di questa fase si ottiene un DNA target caratterizzato da una struttura (definita "selfstructure") che sia auto-ibrida alle estremità formando dei "loop". Questo DNA darà inizio alla fase di amplificazione vera e propria.
La "self-structure " Ã ̈ il nuovo DNA target che durante la fase di amplificazione della LAMP viene amplificata a partire dai primer FIP e BIP.
La fase di amplificazione comincia con l'allungamento a partire dall'estremità 3' libera della "self-structure " e con l'allungamento a partire da FIP che si lega alla regione F2c del "loop". In questo modo si forma nuovamente la "self-structure " prodotta nella prima fase ed una struttura ad essa complementare. Le reazioni di allungamento continuano sempre a partire da FIP e BIP fino a produrre strutture altamente allungate. Alla miscela di reazione LAMP possono essere aggiunti anche una ulteriore coppia di primer definiti "loop forward" (LF) e "loop backward" (LB). Lo scopo di questi primer à ̈ quello di accelerare significativamente la reazione, permettendo di ridurre i tempi anche del 50%.
Nella forma realizzativa in cui la sintesi e/o l'amplificazione dell'acido nucleico à ̈ realizzata mediante LAMP il metodo secondo la presente invenzione comprende le fasi di:
(i) fornire almeno un set di primer disegnati per amplificare mediante LAMP almeno una regione della sequenza di un acido nucleico target;
(ii) combinare detto set di primer con una miscela di reazione per l'amplificazione di detto acido nucleico target mediante LAMP, comprendente almeno un indicatore colorimetrico di metalli e almeno un chelante (blando) del magnesio;
(iii) mettere a contatto un campione biologico con la combinazione ottenuta dal passaggio (ii) in modo da amplificare almeno una regione della sequenza dell'acido nucleico target eventualmente presente all'interno di detto campione; e
(iv) verificare l'eventuale variazione di colorazione della miscela di reazione.
Le fasi i-iv appena descritte possono essere opzionalmente precedute da una fase di denaturazione dell'acido nucleico. Preferibilmente detta fase di denaturazione à ̈ realizzata ad una temperatura di 90-100°C, per un tempo che preferibilmente varia da 1 a 10 minuti, più preferibilmente varia da 4 a 8 minuti.
Anche secondo questa forma realizzativa, l'aggiunta della combinazione di almeno un indicatore colorimetrico di metalli e di almeno un chelante blando del magnesio rende la miscela di reazione colorimetricamente sensibile a minime quantità di acido nucleico amplificato che sono in grado di provocare un netto viraggio del colore della miscela di reazione.
La reazione di sintesi e/o amplificazione mediante LAMP à ̈ effettuata ad una temperatura che varia preferibilmente da 50 a 80°C, più preferibilmente varia da 55 a 70°C.
La reazione di amplificazione può essere realizzata in un bagno termostatato e/o una stufa e/o termoblocco.
La reazione di amplificazione viene fatta proseguire per un periodo di tempo che varia, preferibilmente, da 30 a 90 minuti, più preferibilmente varia da 40 a 75 minuti. Un aspetto del metodo della presente invenzione riguarda la miscela di reazione per l'amplificazione di acidi nucleici. Essa preferibilmente comprende: almeno una polimerasi, una soluzione tampone comprendente un sale di magnesio, una miscela di nucleotidi trifosfato, e/o almeno un regolatore della temperatura di melting.
Nel contesto della presente invenzione per temperatura di melting si intende la temperatura alla quale un acido nucleico si trova per metà nello stato a doppia elica (o doppio filamento) e per metà in quello denaturato (o a singolo filamento).
In generale, la polimerasi utilizzata nel metodo della presente invenzione à ̈ in grado di amplificare l'acido nucleico bersaglio (preferibilmente un DNA), preferibilmente, in condizioni isotermiche mediante un'attività di "strand displacement".
Nel contesto della presente invenzione con l'espressione "attività di strand displacement" si intende la capacità di una polimerasi di scalzare un filamento di un acido nucleico, per esempio una molecola di DNA incontrato a valle durante la reazione di sintesi lasciandolo integro (cioà ̈ l'incapacità di idrolizzare il filamento di acido nucleico) .
In particolare, la polimerasi à ̈ una DNA polimerasi, preferibilmente una DNA polimerasi termofilica. Particolarmente preferita ai fini della presente invenzione à ̈ il frammento grande della DNA polimerasi termofilica di Bacillus stearothermophìlus.
Per quanto riguarda la soluzione tampone, essa comprende preferibilmente un sale di magnesio, KC1, Tris-HCl, NH4SO4, triton X-100 e/o tween 20; preferibilmente il sale di magnesio à ̈ MgS04. Detto sale di magnesio à ̈, preferibilmente, impiegato ad una concentrazione che varia da 1 a 8 mM, preferibilmente varia da 1,5 e 7 mM. In particolari forme di realizzazione dell'invenzione, à ̈ possibile introdurre ulteriore magnesio nella miscela di reazione, per esempio sotto forma di ione magnesio (Mg<2+>), preferibilmente mediante l'aggiunta di MgCl2· A tale riguardo, la Richiedente ha osservato che l'utilizzo di magnesio, salificato come cloruro, incrementa la colorazione violacea della miscela di reazione di partenza prima che avvenga la reazione di amplificazione.
Per quanto riguarda la miscela di deossinucleotidi trifosfato essa comprende una miscela di dATP, dGTP, dCTP, dTTP, preferibilmente, ad una concentrazione che varia tra 1000 mcM e 3000 mcM.
Per quanto riguarda il regolatore della temperatura di melting esso à ̈ scelto tra: betaina, N-ossido di trimetilammina, prolina, dimetilsolfossido e formammide. II regolatore della temperatura di melting particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ la betaina utilizzata, preferibilmente, ad una concentrazione che varia da 0,6 a 1,6 M.
Per quanto riguarda il set di primer esso comprende almeno una coppia di primer in grado di riconoscere e legare la sequenza di acido nucleico target. Preferibilmente la coppia di primer comprende un primer forward complementare ad una sequenza della regione 5' dell'acido nucleico target ed un primer reverse complementare ad una sequenza della regione 3' dell'acido nucleico target.
Nella forma realizzativa in cui la sintesi e/o l'amplificazione dell'acido nucleico à ̈ realizzata mediante LAMP, il set di primer secondo la fase (i) comprende almeno una coppia di primer interni ed almeno una coppia di primer esterni. Opzionalmente à ̈ prevedibile anche l'uso di una coppia ulteriore di primer definita primer loop. Ogni coppia di primer interni comprende almeno un primer interno forward (FIP) ed almeno un primer interno reverse (BIP); ogni coppia di primer esterni comprende almeno un primer esterno forward (F3) ed almeno un primer esterno reverse (B3); ogni coppia di primer loop comprende almeno un primer loop interno LF ed almeno un primer loop esterno (LB). Ciascun primer del set à ̈ disegnato in modo da formare, preferibilmente, strutture definite "haìrpin loop" durante le prime fasi della reazione LAMP.
Ciascun primer interno à ̈ una gualsiasi sequenza di acido nucleico arbitrariamente scelta. Per il design di detta sequenza à ̈ preferibile considerare che:
· la lunghezza di detta sequenza varia preferibilmente tra 35-60 nucleotidi, più preferibilmente tra 40-60 nucleotidi;
• la temperatura di melting di detta sequenza varia preferibilmente tra 55-70°C, più preferibilmente tra 52-63°C;
• la % in GC (cioà ̈ il contenuto percentuale in (guanina+citosina) di detta sequenza rispetto al contenuto totale di nucleotidi) varia preferibilmente tra 30-65%, preferibilmente tra 35-55%;
• la concentrazione di utilizzo di detta sequenza (cioà ̈ di ciascun primer interno) varia preferibilmente tra 0,2-2 mM, più preferibilmente tra 0,6-1,6 mM.
Ciascun primer esterno à ̈ una qualsiasi sequenza di acido nucleico arbitrariamente scelta. Per il design di detta sequenza à ̈ preferibile considerare che:
• la lunghezza di FlC o BlC varia preferibilmente tra 20-30 nucleotidi, più preferibilmente tra 17-22 nucleotidi; la lunghezza di F2 o B2, varia preferibilmente tra 20-30 nucleotidi, più preferibilmente tra 17-22 nucleotidi;
• la temperatura di melting di FlC o BlC varia preferibilmente tra 63-68 °C, più preferibilmente tra 52-63°C; la temperatura di melting di F2 o B2 varia preferibilmente tra 56-64°C, più preferibilmente tra 58-63°C;
• la % in GC (cioà ̈ il contenuto percentuale in (guanina citosina) di detta sequenza rispetto al contenuto totale di nucleotidi) varia preferibilmente tra 30-65%, preferibilmente tra 35-55%; e
• la concentrazione di utilizzo di ciascun primer esterno varia preferibilmente tra 0,1-2 mM, più preferibilmente tra 0,1-1 mM.
Ciascun primer loop à ̈ una qualsiasi sequenza di acido nucleico arbitrariamente scelta tra le sequenze complementari alle sequenze tra F2 e Flc e B2 e Blc. Per il design di detta sequenza à ̈ preferibile considerare che:
· la lunghezza di detta sequenza varia preferibilmente tra 12-36 nucleotidi, più preferibilmente tra 17-22 nucleotidi;
• la temperatura di melting di detta sequenza varia preferibilmente tra 55-70°C, più preferibilmente tra 52-63<0>C;
• la % in GC (cioà ̈ il contenuto percentuale in (guanina citosina) di detta sequenza rispetto al contenuto totale di nucleotìdi) varia preferibilmente tra 30-65%, preferibilmente tra 35-55%; e
• la concentrazione di utilizzo di detta sequenza (cioà ̈ di ciascun primer loop) varia da 0,2 a 2 mM, preferibilmente da 0,3 a 1 mM.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione fa riferimento all'uso del metodo secondo la presente invenzione nel settore sanitario, in particolare per la salute umana. Inoltre, il metodo dell'invenzione può essere applicato nel settore agro-alimentare e/o nel settore veterinario.
Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ l'uso del metodo descritto allo scopo di rilevare la presenza di patogeni in un campione. In questa forma realizzativa quello che viene sintetizzato e/o amplificato à ̈ un acido nucleico (DNA e/o RNA) appartenente (specifico) al patogeno.
In particolare, almeno un patogeno à ̈ scelto tra: Mycoplasma, Listeria, Leptospira, Pseudomonas o Parvovirus .
Il patogeno appartenente al genere micoplasma à ̈, preferibilmente, un micoplasma emotropo, più preferibilmente detto micoplasma emotropo à ̈ scelto tra: Candidatus Mycoplasma haemominutum, Candidatus Mycoplasma turicensis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemocanis e Mycoplasma haematoparvum.
Il patogeno appartenente al genere listeria à ̈, preferibilmente, Listeria monocitogenes.
Il patogeno appartenente al genere Leptospira à ̈, preferibilmente, à ̈ Leptospira interrogans.
Il patogeno appartenente al genere pseudomonas à ̈, preferibilmente, Pseudomonas fluorescens.
II patogeno di origine virale à ̈, preferibilmente, scelto tra: il Parvovirus canino (CPV) e il virus della panleucopenia felina (FPV).
Come precedentemente precisato, determinare la presenza di almeno un patogeno significa, nel contesto di questa forma realizzativa, sintetizzare e/o amplificare almeno un frammento di acido nucleico specifico del patogeno di interesse; in altre parole il metodo della presente invenzione in questo caso prevede la sintesi e/o l'amplificazione di una regione del genoma del patogeno di interesse mediante l'uso di primer specifici.
Detta sintesi e/o amplificazione può essere realizzata mediante LAMP, PCR o sue varianti come precedentemente descritto. Preferibilmente la sintesi e/o l'amplificazione à ̈ realizzata mediante LAMP.
Anche in questa forma di realizzazione come precedentemente descritto, la reazione di sintesi e/o amplificazione mediante LAMP à ̈ effettuata ad una temperatura che varia preferibilmente da 50 a 80°C, più preferibilmente varia da 55 a 70°C. La reazione di amplificazione può essere realizzata in un bagno termostatato e/o una stufa e/o termoblocco.
La reazione di amplificazione viene fatta proseguire per un periodo di tempo che varia, preferibilmente, da 30 a 90 minuti, più preferibilmente varia da 40 a 75 minuti Nel caso in cui la sintesi e/o l'amplificazione di almeno un frammento di acido nucleico del patogeno di interesse sia realizzata mediante LAMP, il design di ciascun primer secondo lo step (i) à ̈ realizzato alla luce di quanto prima à ̈ stato descritto per la sintesi e/o l'amplificazione dell'acido nucleico realizzata mediante LAMP.
In particolare, nel contesto della presente forma realizzativa:
• l'almeno un primer interno forward à ̈, preferibilmente, scelto tra SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33 e 39;
• 1'almeno un primer interno reverse à ̈, preferibilmente, scelto tra SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28, 34 e 40;
• 1'almeno un primer esterno forward à ̈, preferibilmente, scelto tra SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31 e 37; e
• l'almeno un primer esterno reverse à ̈, preferibilmente, scelto tra SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20, 26, 32 e 38.
Preferibilmente, la coppia di primer interni comprende SEQ ID NO: 3 e 4 o SEQ ID NO: 9 e 10 o SEQ ID NO: 15 e 16 ed à ̈ specifica per la rilevazione dei micoplasmi emotropi del cane e del gatto.
Preferibilmente, la coppia di primer interni comprende SEQ ID NO: 3 e 4 per la rilevazione di Candidatus Mycoplasma haemominutum; SEQ ID NO: 9 e 10 per la rilevazione di Candidatus Mycoplasma turicensis; SEQ ID NO: 15 e 16 per la rilevazione di Mycoplasma haemofelis. Preferibilmente la coppia di primer interni comprende SEQ ID NO: 21 e 22 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere listeria, preferibilmente per la rilevazione della specie Listeria monocitogenes.
Preferibilmente, la coppia di primer interni comprende SEQ ID NO: 39 e 40 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere Leptospira, preferibilmente per la rilevazione della specie Leptospira interrogans.
Preferibilmente, la coppia di primer interni comprende SEQ ID NO: 33 e 34 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere pseudomonas, preferibilmente per la rilevazione della specie Pseudomonas fluorescens.
Preferibilmente, la coppia di primer interni comprende SEQ ID NO: 27 e 28 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere parvovirus, preferibilmente per la rilevazione del Parvovirus canino (CPV) e/o per la rilevazione del virus della panleucopenia felina (FPV).
Preferibilmente, la coppia di primer esterni comprende SEQ ID NO: 1 e 2 o SEQ ID NO: 7 e 8 o SEQ ID NO: 13 e 14 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere micoplasma. Preferibilmente la coppia di primer esterni comprende SEQ ID NO: 1 e 2 per la rilevazione di Candidatus Mycoplasma haemominutum; SEQ ID NO: 7 e 8 per rilevazione di Candidatus Mycoplasma turicensis; SEQ ID NO: 13 e 14 per rilevazione di Mycoplasma haemofelis. Preferibilmente, la coppia di primer esterni comprende SEQ ID NO: 19 e 20 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere listeria, preferibilmente per la rilevazione della specie Listeria monocitogenes.
Preferibilmente, la coppia di primer esterni comprende SEQ ID NO: 37 e 38 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere Leptospira, preferibilmente per la rilevazione della specie Leptospira interrogans.
Preferibilmente, la coppia di primer esterni comprende SEQ ID NO: 31 e 32 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere pseudomonas, preferibilmente per la rilevazione della specie Pseudomonas fluorescens.
Preferibilmente, la coppia di primer esterni comprende SEQ ID NO: 25 e 26 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere parvovirus, preferibilmente per la rilevazione del Parvovirus canino (CPV) e/o per la rilevazione del virus della panleucopenia felina (FPV).
In particolari forme di realizzazione il set di primer a cui la presente invenzione fa riferimento comprende ulteriormente una coppia di primer loop.
Preferibilmente, la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 5 e 6; SEQ ID NO: 11 e 12; SEQ ID NO: 17 e 18; SEQ ID NO: 23 e 24; SEQ ID NO: 29 e 30; SEQ ID NO: 35 e 36 o SEQ ID NO: 41 e 42.
In una forma di realizzazione preferita la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 5 e 6; SEQ ID NO: 11 e 12 o SEQ ID NO: 17 e 18 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere micoplasma.
Preferibilmente la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 5 e 6 per la rilevazione di Candidatus Mycoplasma haemominutum,· SEQ ID NO: 11 e 12 per la rilevazione di Candidatus Mycoplasma turicensis; SEQ ID NO: 17 e 18 per la rilevazione di Mycoplasma haemofelis.
In una forma di realizzazione preferita la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 23 e 24 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere listeria, preferibilmente per la rilevazione della specie Listeria monocitogenes. In una forma di realizzazione preferita la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 41 e 42 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere Leptospira, preferibilmente per la rilevazione della specie Leptospira interrogans .
In una forma di realizzazione preferita la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 35 e 36 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere pseudomonas, preferibilmente per la rilevazione della specie Pseudomonas fluorescens .
In una forma di realizzazione preferita la coppia di primer loop comprende SEQ ID NO: 29 e 30 ed à ̈ specifica per la rilevazione del genere parvovirus, preferibilmente per la rilevazione del Parvovirus canino (CPV) e/o per la rilevazione del virus della panleucopenia felina (FPV).
Le sequenze a cui le forme di realizzazioni preferite della presente intenzione fanno riferimento sono riassunte nella Tabella I.
Tabella I:
Specie Nome Sequenza SEQ ID NO Candidatus F3 5'-TTACCGAGGCTTGTAATCTTTTGC- SEQ ID NO: 1 Mycoplasma 3'
haemominutum
Candidatus B3 5'- SEQ ID NO: 2 ycoplasma TGAGATAGGTTTTCGGTGATTAGCT-3'
aemominutum
andidatus FIP 5'- SEQ ID NO: 3 ycoplasma CGCTCGTTACGGGACTTAACCAAACTGG aemominutum AGGTTATCAGAATGACAGGTG-3'
andidatus BIP 5'- SEQ ID NO: 4 ycoplasma TCGTAAGATATAGGAAGGCTGGGGCCAT aemominutum TATGCCTACCATTGTAGCACG-3'
andidatus LF 5'-AGCTGACGACAGCCATGCA-3<1>SEQ ID NO: 5 ycoplasma
aemominutum
Candidatus LB 5'-CAAGTCATCATGCCCCTTATGCC- SEQ ID NO: 6 Mycoplasma 3'
haemominutum
Candidatus F3 5'-AGGCGAAAACTTAGGCCATT-3’ SEQ ID NO: 7 Mycoplasma
turicensis
Candidatus B3 5'-TGTTCCACCACTTGTTCAGG-3' SEQ ID NO: 8 Mycoplasma
turicensis
Candidatus FIP 5'- SEQ ID NO: 9 Mycoplasma ACGGTGTGGACTACTGGGGTATTTTACG
turicensis CTTAGGCTTGAAAGTGTG-3<1>
Candidatus BIP 5'- SEQ ID NO: 10 Mycoplasma TCGGCGTTGTAGCTTACGTGTTTTTTTC
turicensis CCCGTCAATTCCTTTGAGT-3<1>
Candidatus LF 5'-TCTAATCCCATTTGCTACC-3' SEQ ID NO: 11 Mycoplasma
turicensis
Candidatus LB 5'-CGCCTGGGTAGTACATATGC-3’ SEQ ID NO: 12 Mycoplasma
turicensis
Mycoplasma F3 5'-ATGAATGTATTTTTAAATGCCCAC- SEQ ID NO: 13 haemofelis 3’
Mycoplasma B3 5 -AAGGATGGGATCACGTCAAG-3' SEQ ID NO: 14 haemofelis
Mycoplasma FIP 5'- SEQ ID NO: 15 haemofelis ACCATCGCTGGTTTGCAACACATTTTGT
CATCATGCCCCTTATGCC-3 '
Mycoplasma BIP 5'- SEQ ID NO: 16 haemofelis TCGGATAGGAGGCTGCAATTCGCCCCCG
ATATAGCTGACACGG-3 '
Mycoplasma LF 5'-GCACGTTTGCAGCCCAA-3<1>SEQ ID NO: 17 haemofelis
Mycoplasma LB 5'-CTCCTTGAAGTTGGAATCACTAG- SEQ ID NO: 18 haemofelis 3'
Listeria F3 5'-AGCCGTGGATGTTATCGT-3 ' SEQ ID NO: 19 monocytogenes
Listeria B3 5'-GAAAAGCTTATTCATGGGG-3’ SEQ ID NO: 20 monocytogenes
Listeria FIP 5'- SEQ ID NO: 21 monocytogenes GTACGTGGAAGGGAGATACCCTTTTTTG
ATTGCTCTGGTTACACT-3<1>
Listeria BIP 5'- SEQ ID NO: 22 monocytogenes TGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCA
ACGTGAGAAATTCCGCTA-3 ’
Listeria LF 5'-GCTTTAGCAAATACATATTT-3' SEQ ID NO: 23 monocytogenes
Listeria LB 5' -GATTTAGTATTCTTCGACTATGG- SEQ ID NO: 24 monocytogenes 3'
CPV/FPV F3 5 '-CAGGTGATGAATTTGCTACAG-3' SEQ ID NO: 25 CPV/FPV B3 5 '-TCCTGCTGCAATAGGTGTT-3' SEQ ID NO: 26 CPV/FPV FIP 5'- SEQ ID NO: 27
CCAAAGTTAGTACCTCCTTCAGCTTTTT
ACAAATAGAGCATTGGGCTT-3 '
CPV/FPV BIP 5'- SEQ ID NO: 28
GACGTGGTGTAACTCAAATGGGAATTTT
GTGCACTATAACCAACCTCAG-3 '
CPV/FPV LF 5'- SEQ ID NO: 29
GAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGG-3 '
CPV/FPV LB 5'- SEQ ID NO: 30
ACTGAAGCTACTATTATGAGACCAG-3 '
Pseudomonas F3 5'-AAGCACTTTAAGTTGGGAGGA-3 ’ SEQ ID NO: 31 fluorescens
Pseudomonas B3 5'-ACGCATTTCACCGCTACAC-3 ' SEQ ID NO: 32 fluorescens
Pseudomonas FIP 5'- SEQ ID NO: 33 fluorescens TTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGTTT
TGACAGAATAAGCACCGGCTAA-3<1>
Pseudomonas BIP 5'- SEQ ID NO: 34 fluorescens CTCAACCTGGGAACTGCATTCAATTTTA
GGAAATTCCACCACCCTCTA-3'
Pseudomonas LF 5'-CTGTATTACCGCGGCTGCTG-3' SEQ ID NO: 35 fluorescens
Pseudomonas LB 5'-AACTGTCGAGCTAGAGTATGG-3<1>SEQ ID NO: 36 fluorescens
Leptospira F3 5'-GTGGAATTCCAGGTGTAGC-3' SEQ ID NO: 37 interrogans
Leptospira B3 5'-GGTTTTTCGCGTATCATCGA-3' SEQ ID NO: 38 interrogans
Leptospira FIP 5'- SEQ ID NO: 39 interrogans ACCGGGGTATCTAATCCCGTTTTTTTTG
CTGGCCTAAAACTGAC-3'
Leptospira BIP 5'- SEQ ID NO: 40 interrogans AGTTGTTGGGGGTTTTAACCCTTTTTTT
TCACTCTTGCGAGCATAG-3'
Leptospira LF 5'-ACTACCCACGCTTTCGTGC-3* SEQ ID NO: 41 interrogans
Leptospira LB 5'-ACGGATTAAGTAGACCGCCTG-3<1>SEQ ID NO: 42 interrogans
Sequenze nucleotidiche caratterizzate da 80-85% di omologia rispetto alle sequenze sopra descritte sono da considerarsi utilizzabili nel metodo della presente invenzione .
Il campione che à ̈ sottoposto al metodo della presente invenzione à ̈ una qualsiasi fonte di acido nucleico (DNA e/o RNA) . In forme preferite di realizzazione il campione à ̈ una qualsiasi fonte di almeno un patogeno o del genoma di almeno un patogeno, per esempio un alimento, acqua o terreno.
Preferibilmente il campione à ̈ un campione biologico, per esempio sangue e suoi derivati (plasma, siero, ecc), urina o qualsiasi fluido biologico, un frammento di tessuto, peli, feci o cellule.
Il campione può essere utilizzato tal quale, oppure può essere sottoposto a lisi.
Il campione conterrà l'acido nucleico di interesse.
Il U sato può essere ulteriormente purificato allo scopo di separare la molecola di acido nucleico dagli altri componenti del campione.
Come precedentemente discusso, la fase di mettere a contatto la miscela di reazione per l'amplificazione dell'acido nucleico prima descritta con il campione à ̈ necessaria per innescare l'inizio della reazione di sintesi e/o amplificazione della sequenza di acido nucleico target eventualmente presente nel campione.
Alla fine della reazione di amplificazione dell'eventuale sequenza di acido nucleico target presente nel campione si può osservare il viraggio del colore della miscela di reazione solo se c'à ̈ stata la sintesi e/o l'amplificazione di detta sequenza. Il viraggio della colorazione della miscela di reazione à ̈ più netto ed evidente quando viene applicato il metodo della presente invenzione rispetto ai metodi noti nell'arte. Infatti, la colorazione della miscela di reazione vira da un colore che rientra nella gamma del viola (per esempio, viola, lilla o magenta) ad un colore che rientra nella gamma del blu (ad esempio blu cielo), mentre applicando i metodi noti nell'arte la colorazione della miscela di reazione passa da un colore blu intenso (prima dell'amplificazione) ad un colore blu cielo (dopo l'amplificazione) oppure da viola magenta a viola. La variazione netta della colorazione della miscela di reazione che si osserva amplificando un acido nucleico in accordo con il presente metodo, à ̈ correlata all'aggiunta nella miscela di reazione di almeno un indicatore colorimetrico di metalli ed almeno un chelante blando del magnesio come prima descritto. L'utilizzo combinato di almeno un indicatore colorimentrico di metalli ed almeno un chelante blando del magnesio ha anche il vantaggio di consentire, eventualmente, l'impiego di concentrazioni dei nucleotidi trifosfato inferiori rispetto a quelle normalmente usate nei metodi dell'arte nota. Per esempio, le concentrazioni dei nucleotidi possono essere comprese tra 500 e 3000mcM, più preferibilmente tra 1500 e 2000 mcM. Il metodo della presente invenzione consente quindi di visualizzare e/o monitorare l'amplificazione di un acido nucleico ad occhio nudo (visivamente) come variazione della colorazione della miscela di reazione. Anche un occhio poco allenato o non esperto à ̈ in grado di stabilire se al termine della reazione c'à ̈ stata o meno l'amplificazione della sequenza di acido nucleico di interesse dal momento che la variazione della colorazione della miscela di reazione à ̈ netta ed evidente anche quando solo minime quantità della sequenza sono state amplificate.
Come precedentemente descritto, la possibilità di impiegare concentrazioni di nucleotidi inferiori a quelle normalmente impiegate nei metodi noti consente un notevole abbassamento dei costi di realizzazione del metodo stesso, dal momento che i nucleotidi trifosfato sono molto costosi. Quindi il metodo della presente invenzione si presenta anche molto vantaggioso da un punto di vista economico.
Solitamente, allo scopo di monitorare la qualità della reazione, cioà ̈ per esempio per verificare se la reazione à ̈ avvenuta correttamente, o se i reagenti utilizzati funzionano o meno, se c'à ̈ una contaminazione dei reagenti vengono utilizzati uno o più controlli positivi e/o uno o più controlli negativi.
Nel contesto del presente metodo, quindi, un campione può essere un controllo positivo o un controllo negativo.
Un controllo positivo à ̈ per esempio almeno una regione della sequenza dell'acido nucleico di interesse (target). Questa regione può essere la sequenza della regione di acido nucleico di interesse in quanto tale (da sola), per esempio la sequenza di DNA a doppio filamento della regione. Alternativamente questa sequenza può essere inserita in un qualsiasi vettore di clonaggio. Il vettore di clonaggio contenente la sequenza di almeno una regione dell'acido nucleico di interesse può essere utilizzato come controllo positivo del metodo secondo la presente invenzione. In particolari forme di realizzazione la regione presa in considerazione, sia nella forma di sequenza nucleotidica in quanto tale, sia nella forma in cui la sequenza nucleotidica della regione à ̈ inserita in un vettore di clonaggio, può essere una regione del genoma di un patogeno, in particolare una regione della sequenza di acido nucleico del patogeno bersaglio del metodo della presente invenzione.
Un campione di controllo positivo, sottoposto al metodo secondo la presente invenzione, assumerà al termine della reazione di amplificazione (sia essa una PCR sia essa una LAMP) una colorazione blu cielo. Quindi esso passerà da una colorazione da un colore che rientra nella gamma del viola (pre-amplificazione) ad un colore che rientra nella gamma del blu (ad esempio blu cielo), (post-amplificazione) che sarà indicativa della buona riuscita del metodo, ovvero della qualità dei reagenti, delle condizioni sperimentali.
Un controllo negativo à ̈ un campione in cui sono presenti tutti i reagenti necessari per la realizzazione del metodo ma non c'à ̈ alcun acido nucleico da amplificare. Esso quindi avrà la stessa colorazione prima e dopo l'amplificazione cioà ̈ avrà una colorazione violacea solo se il metodo à ̈ avvenuto correttamente (per esempio se non ci sono contaminazioni).
In altre parole utilizzando almeno un controllo positivo e/o almeno un controllo negativo si à ̈ in grado di monitorare l'attendibilità del metodo.
Allo scopo di avvalorare e/o confermare il risultato ottenuto in maniera rapida e semplice applicando il metodo dell'invenzione, à ̈ possibile utilizzare le comuni tecniche per visualizzare acidi nucleici a disposizione di ogni esperto del settore. Per esempio, aumento della torbidità, corsa su gel ed UV, aumento della fluorescenza per legami di agenti intercalanti o sostanze fluorofore eccitate da UV o luce di opportune lunghezze d'onda.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un kit per la realizzazione del metodo come descritto nella presente domanda di brevetto.
Detto kit comprende, preferibilmente, i seguenti reagenti :
· almeno un set di primer in accordo con la presente invenzione ;
• almeno una soluzione tampone comprendente un sale di magnesio;
• una miscela di nucleotidi trifosfato;
• almeno una polimerasi;
· almeno un regolatore della temperatura di melting; • almeno un indicatore colorimetrico di metalli;
• almeno un chelante blando del magnesio;
• almeno un controllo positivo;
• almeno un controllo negativo.
I componenti del kit sopra elencati sono come descritti nella descrizione del metodo secondo la presente invenzione. Inoltre il kit della presente invenzione, può comprendere diversi tubi di reazione, preferibilmente tubi in materiale plastico, tipo Eppendorf, più preferibilmente la capacità di detti tubi à ̈ 0,2-0,5 mi.
I tubi di reazione contengono i reagenti, preferibilmente, liofilizzati, in modo da poter essere conservati a temperatura ambiente.
In particolare, il kit secondo la presente invenzione à ̈ utilizzato per la rilevazione, in un campione biologico, di un micoplasma emotropo, preferibilmente scelto tra: Candidatus Mycoplasma haemominutum, Candidatus Mycoplasma turicensis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemocanis e Mycoplasma haematoparvum.
II kit dell'invenzione à ̈ anche impiegato per la rilevazione, in un campione biologico, di un patogeno appartenente al genere listeria, preferibilmente Listeria monocitogenes.
Il kit dell'invenzione à ̈ anche impiegato per la rilevazione, in un campione biologico, di un patogeno appartenente al genere Leptospira, preferibilmente Leptospira interrogans.
Il kit dell'invenzione à ̈ anche impiegato per la rilevazione, in un campione biologico, di un patogeno appartenente al genere pseudomonas, preferibilmente Pseudomonas fluorescens.
Il kit dell'invenzione à ̈ anche impiegato per la rilevazione, in un campione biologico, di un patogeno di origine virale, preferibilmente scelto tra: il Parvovirus canino (CPV) e il virus della panleucopenia felina (FPV).
Nei casi preferiti sopra riportati, il kit secondo l'invenzione comprende i set di primer come riportati nella descrizione del metodo.
ESEMPIO 1.
Il blu di idrossinaftolo viene utilizzato nei metodi LAMP allo scopo di seguire la reazione di amplificazione secondo i metodi noti nell'arte (Goto M, et al. Biotechniques, 2009; Ma XJ, et al. J Virol Methods, 2010; Cardoso TC, et al. Mol Celi Probes, 2010). La Richiedente, applicando i metodi proposti dall'arte nota, ha ottenuto una colorazione della miscela di reazione pre-amplificazione LAMP di colore blu che non sempre ha consentito di seguire colorimetricamente la reazione di amplificazione dell'acido nucleico di interesse. Ciò perché, applicando i metodi noti, la miscela di reazione prima dell'amplificazione dell'acido nucleico assume un colore blu intenso, ed al termine di un eventuale amplificazione dell'acido nucleico di interesse essa assume un colore blu chiaro raramente distinguibile in maniera certa dalla colorazione della miscela di partenza. In Figura 1 A sono riportati un campione positivo ed un campione negativo guando si applica il metodo di Goto et al. Ricordiamo che un campione positivo ci dà informazioni in merito ad un campione in cui à ̈ stato amplificato l'acido nucleico, quindi ci dà un'idea della colorazione della miscela di reazione a fine amplificazione quando c'à ̈ stata l'amplificazione di un acido nucleico. Un campione negativo ci dà informazioni in merito ad un campione in cui non à ̈ stato amplificato l'acido nucleico, quindi ci dà un'idea della colorazione iniziale della miscela di reazione cioà ̈ pre-amplificazione.
Allo scopo di esaltare la differenza colorimetrica della miscela di reazione prima e dopo l'amplificazione dell'eventuale acido nucleico, così da consentire un monitoraggio semplice e rapido dell'amplificazione stessa anche da parte di personale non esperto, à ̈ stato addizionato alla miscela di reazione un chelante blando del magnesio. Il chelante blando del magnesio utilizzato à ̈ sodio citrato. Esso à ̈ stato testato alle seguenti concentrazioni: 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.50, 1.75, 2, 2.5, 3, 4,5 mM.
L'aggiunta del sodio citrato e del blu di idrossinaftolo alla miscela di reazione per l'amplificazione LAMP ha colorato la miscela, prima della reazione di amplificazione, di colore viola.
Al termine dell'eventuale amplificazione dell'acido nucleico, la miscela ha assunto un colore blu cielo molto distinguibile rispetto al colore iniziale della miscela di reazione (pre-amplificazione).
In Figura 1 B sono riportati un campione positivo ed un campione negativo quando si applica il metodo della presente. I risultati indicano che il metodo secondo la presente invenzione consente di aumentare notevolmente la differenza di colore tra inizio e fine reazione rispetto ai metodi noti in letteratura.
Allo scopo di verificare l'effettiva funzionalità del sodio citrato nell'aumentare il contrasto tra il violadei campioni positivi e il blu cielo dei campioni negativi à ̈ stato utilizzato un termociclatore reai time. Come canale di lettura à ̈ stato utilizzato il SYBR GREEN. Infatti la Richiedente ha sorprendentemente trovato che, in queste condizioni sperimentali, il termociclatore à ̈ in grado di leggere sia i risultati di una classica amplificazione LAMP, sia i risultati della LAMP alla cui miscela di reazione à ̈ stato aggiunto il blu di idrossinaftolo .
In presenza di blu di idrossinaftolo, la curva corrispondente all'amplificazione del DNA target invece di avere un andamento crescente come nella LAMP classica (vedi Figura 2 A), ha un andamento decrescente a mano a mano che il colorante nella miscela di reazione vira da un colore viola ad un colore blu cielo(vedi Figura 2 B). Il lavoro sperimentale à ̈ stato diviso in due fasi, la prima fase di validazione del metodo di lettura sopra descritto, e la seconda fase di valutazione dell'effetto dell'aggiunta del sodio citrato alla miscela di reazione LAMP.
Per quanto riguarda la prima fase di validazione del metodo di lettura dei risultati con termociclatore realtime sono stati allestiti 10 campioni contenenti le miscele di reazioni LAMP con blu di idrossinaftolo (in 10 tubini diversi) e 10 campioni con le miscele di reazione LAMP contenenti SYBR SAFE.
Ai campioni à ̈ stata aggiunta la stessa quantità di controllo positivo (5 mcL pari a 90000 target circa) alla medesima diluizione.
I campioni sono stati incubati per un'ora a 65°C.
Sono state messe a confronto le curve dei due diversi pool di campioni (cioà ̈ la miscela di reazione con e senza blu di idrossinaftolo).
I due tipi di campioni hanno evidenziato una crescita (nel caso della curva della LAMP con SYBR SAFE) ed una decrescita (nel caso della curva della LAMP blu di idrossinaftolo) della curva di amplificazione allo stesso numero di cicli (Figura 2 A-B). Anche l'andamento della curva tra i due tipi di campioni à ̈ risultata identica (esse raggiungono il plateau allo stesso numero di cicli).
Questo risultato ha permesso di stabilire di poter utilizzare il termociclatore reai time come strumento "non standard" di lettura della variazione della colorazione di una miscela di reazione LAMP a cui à ̈ stato aggiunto il blu di idrossinaftolo.
La seconda fase ha previsto la verifica dell'effetto del sodio citrato sul viraggio del colore della miscela di reazione LAMP. In particolare, sono state preparate tre miscele di reazione LAMP a cui à ̈ stato aggiunto il blu di idrossinaftolo e il sodio citrato in concentrazioni crescenti. Le concentrazioni di sodio citrato analizzate sono: 0,5 mM (Figura 3-A), 1 mM (Figura 3-B) e 1,5 mM (Figura 3-C).
A ciascuna delle tre miscele à ̈ stata aggiunta la stessa quantità di controllo positivo (90000 target).
I campioni sono stati incubati a 65° per 1 h. L'andamento delle curve di amplificazione alle 3 diverse concentrazioni di sodio citrato (vedi Figura 3 A-B-C), evidenzia che la differenza fra il segnale misurato all'inizio della reazione di amplificazione rispetto a quello finale à ̈ tanto maggiore quanto più alta à ̈ la concentrazione del sodio citrato nella miscela di reazione. La reazione à ̈ stata inibita da concentrazioni pari a 5mM
Questi risultati hanno dimostrato che il sodio citrato, nei campioni positivi (cioà ̈ nei tubi in cui l'acido nucleico à ̈ stato amplificato), à ̈ efficace nel rendere il colore finale della miscela di reazione tendente al blu cielo. Inoltre, l'aggiunta di sodio citrato alla miscela di reazione per la LAMP contenente il blu di idrossinaftolo si à ̈ dimostrata in grado di aumentare il contrasto tra i campioni negativi (cioà ̈ quelli in cui la colorazione resta viola perché l'acido nucleico non à ̈ stato amplificato) ed i campioni positivi (cioà ̈ quelli in cui la colorazione diventa blu cielo perché l'acido nucleico à ̈ stato amplificato). Infatti, la differenza di colorazione tra un campione positivo ed uno negativo con il metodo della presente invenzione (viola (positivo) blu (negativo) à ̈ molto più netta e distinguibile rispetto al metodo di Goto et al che non prevede l'aggiunta di sodio citrato (blu intenso (positivo), blu chiaro (negativo)). I risultati visivi sono riportati nella Figura 1 dove in A sono visualizzabili i campioni in cui à ̈ stato applicato il metodo colorimetrico noto che non prevede uno step di addizionare ad una miscela di reazione LAMP il blu di idrossinaftolo in combinazione con il sodio citrato, mentre in B sono visualizzabili i campioni su cui à ̈ stato applicato il metodo secondo la presente invenzione.
Applicando il metodo di Goto et al. (Figura 1 A) à ̈ evidente che la differenza di colorazione tra un campione positivo ed uno negativo à ̈ meno distinguibile rispetto a quando viene applicato il metodo della presente invenzione (Figura 1 B).
ESEMPIO 2.
Allo scopo di dimostrare che il sodio citrato non inibisce la reazione di amplificazione LAMP, la Richiedente ha sottoposto dei campioni contenenti un controllo positivo (sono stati testati Micoplasma haemofelis, candidatus Micoplasma haemominutum, candidatus Mycoplasma turicensis, Listeria monocytogenes , Leptospira interrogano, Pseudomonas fluorescens, Parvovirus di controllo) a reazione di amplificazione mediante LAMP con e senza sodio citrato. In particolare sono stati allestiti 4 campioni contenenti 4mM e 6mM di magnesio con e senza sodio citrato 1,5 mM.
I campioni nello specifico sono:
CAMPIONE 1: miscela di reazione LAMP contenente magnesio 4mM;
CAMPIONE 2: miscela di reazione LAMP contenente magnesio 4mM, sodio citrato l,5mM;
CAMPIONE 3: miscela di reazione LAMP contenente magnesio 6mM;
CAMPIONE 4: miscela di reazione LAMP contenente magnesio 6mM, sodio citrato l,5mM.
La LAMP Ã ̈ stata condotta per 70 minuti a 65°C ed i risultati ottenuti (espressi in minuti) sono riassunti nella seguente tabella:
Campione non Campione Campione diluito diluito 1:10 diluito 1:20 Campione 1 23.8 26.3 41.04 Campione 2 21.49 24.09 25.92 Campione 3 25.82 26.09 50.56 Campione 4 22.64 25.67 34.39
Ciascun campione à ̈ stato testato tal quale, diluito 1:10 e 1:20.
Come si può notare dai valori dei tempi ottenuti, i campioni contenenti sodio citrato hanno valori inferiori, cioà ̈ sviluppano la reazione più velocemente ; quindi si deduce che l'aggiunta del citrato non inibisce la reazione di amplificazione, anzi in taluni casi la può agevolare.
ESEMPIO 3.
Rilevazione della contaminazione da Mycoplasma.
Allo scopo di testare la validità del metodo sono stati amplificati col metodo della presente invenzione dei campioni di DNA estratto da sangue intero di gatto allo scopo di verificare se gli stessi erano contaminati con i seguenti patogeni: Mycoplasma haemofelis, candidatus Mycoplasma turicensis e candidatus Mycoplasma haemominutum.
II DNA Ã ̈ stato estratto dai campioni di sangue utilizzando il kit commerciale NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel).
La rilevazione della eventuale contaminazione dei campioni à ̈ stata verificata applicando il metodo della presente invenzione ed applicando la PCR.
Sono stati testati 20 campioni ed i risultati ottenuti sono i seguenti:
Risultati ottenuti applicando la PCR:
• candidatus Mycoplasma haemominutum: 9 positivi (di cui 2 positivi anche per Mycoplasma Haemofelis e 2 positivi anche per Candidatus Mycoplasma turicensis;
• candidatus Mycoplasma turicensis: 2 positivi (di cui 2 positivi anche per Candidatus Mycoplasma haemominutum;
· Mycoplasma haemofelis: 3 positivi (di cui 2 positivi anche per candidatus Mycoplasma haemominutum) • Campioni negativi: 10
Risultati ottenuti applicando il metodo dell'invenzione: • candidatus Mycoplasma haemominutum: 9 positivi (di cui 2 positivi anche per Mycoplasma Haemofelis e 2 positivi anche per Candidatus Mycoplasma turicensis) • candidatus Mycoplasma turicensis: 2 positivi (di cui 2 positivi anche per candidatus Mycoplasma haemominutum)
· Mycoplasma haemofelis: 3 positivi (di cui 2 positivi anche per candidatus Mycoplasma haemominutum) • Campioni negativi: 10
Per la rilevazione dei risultati ottenuti col metodo dell'invenzione sono stati messi a confronto i seguenti metodi:
a) monitoraggio real-time su termociclatore b) viraggio di colore con idrossinaftolo con e senza sodio citrato.
In totale, sono state condotte 20 prove comparative.
Le due modalità di rilevazione hanno evidenziato una congruenza del 100% dei risultati solo quando secondo il metodo della presente invenzione si aggiunge la combinazione di blu di idrossinaftolo e sodio citrato alla miscela di reazione.
Rilevazione_ della_ contaminazione_ da Listeria monocytogenes .
Per la determinazione della Listeria monocytogenes sono stati testati 19 campioni di DNA estratto da colture batteriche di Listeria monocytogenes. Il DNA Ã ̈ stato estratto utilizzando il kit commerciale NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel).
Per la rilevazione dei risultati con il metodo della presente invenzione sono stati messi a confronto 2 metodi rappresentati da:
a) monitoraggio real-time su termociclatore
b) viraggio di colore con idrossinaftolo con e senza sodio citrato.
In totale, sono state condotte 20 prove comparative.
Le due modalità di rilevazione hanno evidenziato una congruenza del 100% dei risultati solo quando secondo il metodo della presente invenzione si aggiunge la combinazione di blu di idrossinaftolo e sodio citrato alla miscela di reazione.
Inoltre, sono state effettuate delle prove su un plasmide (in particolare à ̈ stato utilizzato come plasmide il vettore pCRâ„¢4-TOPO®), in cui à ̈ stato inserito un frammento di DNA corrispondente alla stessa regione del genoma di listeria che viene amplificata. Sono state eseguite prove mediante reazione LAMP con delle diluizioni seriali (in base 10) del plasmide, rilevando una sensibilità del kit LAMP pari a 2 target/Î1⁄4Î (corrispondente alla nona diluizione in base 10 del plasmide iniziale).
Rilevazione della contaminazione da Pseudomonas f luorescens.
Per la determinazione della contaminazione da Pseudomonas fluorescens sono stati testati 18 campioni di DNA estratti con il kit commerciale NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel) da colture batteriche di Pseudomonas fluorescens.
I campioni sono stati sottoposti al metodo dell'invenzione ed à ̈ stata verificata l'avvenuta amplificazione sia con monitoraggio real-time sia con il viraggio di colore.
I risultati dimostrano chiaramente che solo il metodo dell'invenzione à ̈ stato in grado di rilevare la presenza di Pseudomonas in tutti i campioni di DNA.
Rilevazione della contaminazione da Leptospira,
Per la determinazione della Leptospira sono stati testati 11 campioni di DNA estratti da urine (noti per essere positivi) mediante l'uso del kit commerciale NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel).
I campioni sono stati testati in doppio con il metodo della presente invenzione e con la PCR.
I risultati hanno dimostrato che il metodo della presente invenzione à ̈ in grado di rilevare 11/11 positivi. La metodica di riferimento PCR ha rilevato 11/11 positivi.
Il metodo della presente invenzione à ̈ stato condotto visualizzando i risultati sia con monitoraggio realtime, sia utilizzando il viraggio della colorazione della miscela di reazione.
Le due modalità di visualizzazione hanno evidenziato una congruenza del 100% dei risultati.
Rilevazione della contaminazione da Parvovirus.
Per la determinazione del parvovirus sono stati analizzati 9 campioni di DNA estratto da tamponi fecali (noti per essere positivi), attraverso l'utilizzo del kit commerciale NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel).
I campioni sono stati analizzati mediante PCR e con il metodo della presente invenzione ed à ̈ stata verificata la sovrapponibilità dei risultati.
Infine, la fase di rilevazione dell'amplificato secondo il metodo della presente invenzione à ̈ stato condotto sia con il monitoraggio real-time, sia utilizzando il viraggio della colorazione della miscela di reazione. I risultati hanno dimostrato una congruenza del 100% dei risultati ottenuti con i due diversi metodi.

Claims (14)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per rilevare la sintesi e/o l'amplificazione di una sequenza di acido nucleico target comprendente le fasi di: (i) fornire almeno un set di primer disegnati per sintetizzare e/o amplificare almeno una regione di detta sequenza di acido nucleico target; (ii) combinare il set di primer secondo la fase (i) con una miscela di reazione per l'amplificazione di detta almeno una regione della sequenza di acido nucleico target, detta miscela di reazione comprendente almeno un indicatore colorimetrico di metalli e almeno un chelante del magnesio; (iii) mettere a contatto la miscela di reazione ottenuta dalla fase (ii) con un campione biologico in modo da amplificare detta almeno una regione della sequenza di acido nucleico target eventualmente presente in detto campione; e (iv) verificare l'eventuale variazione della colorazione della miscela di reazione.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto indicatore colorimetrico di metalli à ̈ scelto tra: blu idrossinaftolo, nero eriocromo T, 8-idrossichinolino butilammide, giallo titanio, xylidyl blu, calmagite, magon, blu timolo, cianina eriocromo R, alizarina S, ocresolftaleina, 1,2,3-triidrossiantrachinone, leucoquinizarina, quinalizarina, p-nitrobenzene-azo-apnitrobenzene-resorcinolo, butilammide, cromotropo 2B, ammoniaca fenolftaleina, ipoioditi alcalini, acido pentametinedibarbiturico, difenilcarbazide e loro combinazioni; preferibilmente detto indicatore colorimetrico di metalli à ̈ blu idrossinaftolo.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto chelante blando del magnesio à ̈ scelto tra: sodio citrato, acido acetico, ADP, acido aspartico, ADP, ATP, acido n-Butirrico, acido citrico, cisteina, acido 3,4-diidrtossibenzoico, 0,O-dimetilpurpurogallin, EDTA, EGTA, acido gluconico, acido glutamico, acido glutarico, acido glicerico, glieina, acido glicolico, glicilglicina, guanosina, acido beta-idrossibutirrico, inosina trifosfato, acido lattico, acido malico, NTA, acido ossalico, polifosfato, acido propionico, purina, salicilaldeide, acido salicilico, acido succinico, acido tartarico, tetrametafosfato, trimetafosfato, trifosfato, uridina difosfato e loro combinazioni; preferibilmente detto chelante blando del magnesio à ̈ sodio citrato.
  4. 4 . Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 3, in cui detto indicatore colorimetrico di metalli e detto chelante blando del magnesio sono, rispettivamente, blu idrossinaftolo e sodio citrato.
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 4, in cui detta eventuale variazione di colore della miscela di reazione à ̈ da un colore che rientra nella gamma del viola, preferibilmente viola, lilla o magenta, ad un colore che rientra nella gamma del blu, preferibilmente blu cielo.
  6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5. in cui detto metodo di sintesi e/o amplificazione di una sequenza di acido nucleico à ̈ la LAMP.
  7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui la fase (i) comprende le fasi di: (a) selezionare arbitrariamente nella regione 3' della sequenza di acido nucleico target a partire dall'estremità 3' una sequenza F3c, una sequenza F2c ed una sequenza Flc; (b) selezionare arbitrariamente nella regione 5' della sequenza di acido nucleico a partire dall'estremità 5' una sequenza B3, una sequenza B2 ed una sequenza Bl; (c) fornire almeno un set di primer per amplificare mediante LAMP detta sequenza di acido nucleico target, detto set comprendente: (cl) almeno una coppia di primer interni comprendente un primer interno forward (FIP) ed un primer interno reverse (BIP), detto FIP comprendente una sequenza F2 complementare a F2c e la sequenza Flc complementare a FI, detto BIP comprendente la sequenza B2 complementare a B2c ed una sequenza Blc complementare a Bl; (c2) almeno una coppia di primer esterni comprendente un primer esterno forward (F3) complementare a F3c ed un primer esterno reverse (B3) corrispondente alla regione B3c di detta sequenza di acido nucleico target.
  8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui il set di primer secondo la fase (c) comprende ulteriormente almeno una coppia di primer loop comprendente un primer loop esterno (LB) ed un primer loop interno (FB).
  9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui la miscela di reazione di detta fase (ii) comprende una miscela di deossinucleotidi trifosfato ad una concentrazione variabile tra 1000 e 3000mcM.
  10. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 9, per la rilevazione della presenza di almeno un patogeno scelto tra: Mycoplasma, Listeria, Leptospira, Pseudomonas, Parvovirus canino (CPV) e il virus della panleucopenia felina (FPV) in un campione biologico.
  11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detto mycoplasma à ̈ scelto tra: Candidatus Mycoplasma haemominutum, Candidatus Mycoplasma turicensis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemocanis e Mycoplasma haematoparvum; detta Listeria à ̈ Listeria monocitogenes ; detta Leptospira à ̈ Leptospira interrogans; detto pseudomonas à ̈ Pseudomonas fluorescens.
  12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 7 e 10 o 11, in cui per Candidatus Mycoplasma haemominutum detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6; per Candidatus Mycoplasma turicensis detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 e 12; per Mycoplasma haemofelis detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18; per Listeria monocitogenes detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 e 24; per Parvovirus canino (CPV) e il virus della panleucopenia felina (FPV) detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 e 30; per Pseudomonas fluorescens detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 e 36; per Leptospira interrogans detto set di primer comprende i primer F3, B3, FIP, BIP, LF e LB aventi le sequenze rispettivamente corrispondenti a SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42.13.
  13. 13. Kit per la realizzazione del metodo in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12 comprendente: un set di primer disegnati per sintetizzare e/o amplificare almeno una regione della sequenza di un acido nucleico target; almeno una soluzione tampone comprendente un sale di magnesio; una miscela di nucleotidi trifosfato; almeno una polimerasi; almeno un regolatore della temperatura di melting; almeno un indicatore colorimetrico di metalli; almeno un chelante blando del magnesio; almeno un controllo positivo; ed almeno un controllo negativo.
  14. 14. Kit secondo la rivendicazione 13 per la rilevazione della presenza di almeno un patogeno scelto tra: Mycoplasma, Listeria, Leptospira, Pseudomonas, Parvovirus canino (CPV) e il virus della panleucopenia felina (FPV) in un campione biologico.
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