CN106367535A - 检测ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，包括第一外引物、第二外引物、第一内引物以及第二内引物。本发明还提供了一种采用所述环介导等温扩增引物检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法。本发明的环介导等温扩增引物可实现对Ⅱ型猪圆环病毒的检测，并且检测灵敏度高、特异性好、检测率高，反应时间短、操作简单、结果便于观察，可实现Ⅱ型猪圆环病毒的快速检测。

Description

检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其方法
技术领域
本发明属于兽医学生物分子检测领域，具体涉及一种检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其方法。
背景技术
猪圆环病毒（Porcine Circovirus, PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一。现已知PCV有PCV1和PCV2两个血清型，其中，PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,PMWS）、皮炎与肾病综合征（PNDS）的主要病原。自1997年Clark首次分离得到Ⅱ型猪圆环病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）以来，该病毒已经给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。在2008年第20届国际猪病大会上，人们更将其列为当前养猪业的头号疫病，因此建立Ⅱ型猪圆环病毒现场快速检测方法就很有必要。
目前，临床检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法主要有病毒分离、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、原位核酸杂交、免疫组织化学法（IHC）、PCR检测等方法，其中，病毒分离、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、间接免疫荧光（IFA）等检测方法均需在PCV2感染PK15细胞后进行鉴定，因此检测的敏感度不高；酶联免疫吸附测定（ELISA）、原位核酸杂交、免疫组织化学法（IHC）等检测方法特异性及敏感性不理想，且操作过程比较繁琐；常规PCR检测容易因交叉污染出现假阳性，对于低拷贝数的PCV2检测率不高。
因此，目前亟待提出一种检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法以克服上述各类方法中存在的检测敏感度不高、特异性及敏感性不理想、操作过程繁琐、易出现假阳性现象、检测率不高的问题。
环介导等温扩增技术是众多核苷酸扩增技术中的一种，其特征是利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应。该技术需要多条引物对靶基因上的多处特定区域进行识别扩增，因此引物是实现环介导等温扩增技术的核心。目前尚未有检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其相应的方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物。
本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法存在检测敏感度不高、特异性及敏感性不理想、操作过程繁琐、易出现假阳性现象、检测率不高的问题，进而提供一种检测灵敏度高、特异性及敏感性好、操作简单、检测率高的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法。
本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，包括第一外引物、第二外引物、第一内引物以及第二内引物；其中，所述第一外引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述SEQ ID No.1为：5’- GTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGT-3’；所述第二外引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，所述SEQ ID No.2为：5’- CACTATTGATTACTTCCAACCAA-3’；所述第一内引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构，所述SEQ ID No.3为：5’-CCAGGAATACAATATCCGTGTAACCGGTTAAGTGGGGGGTCTT -3’；所述第二内引物具有如SEQ IDNo.4所示的序列结构，所述SEQ ID No.4为：5’-TCGTATATACTGTTTTCGAACGCAAATCAGCTGTGGCTGAGA-3’。
进一步地，所述第一外引物、第二外引物、第一内引物以及第二内引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）。
进一步地，所述环介导等温扩增引物还包括环引物，所述环引物具有如SEQ IDNo.5所示的序列结构，所述SEQ ID No.5为5’-GCCGAGGCCTACGTGGTCTA-3’。
优选地，所述第一外引物、第二外引物、第一内引物、第二内引物以及环引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）。
本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，利用本发明所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物进行检测。
优选地，所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，包括以下步骤：将权利要求1-4中任一所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物与待测溶液混合，将混合液置于55-65℃下培育10min以上，观察或检测所述混合液的变色情况。
进一步地，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸。
进一步地，所述混合液中还包括金属指示剂；所述金属指示剂为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐。
进一步地，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、MnCl2、甜菜碱、去离子水中的一种或多种。
优选地，所述环介导等温扩增引物与待测溶液混合后，将所述混合液置于水下，进行恒温水浴。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
（1）本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，可实现对Ⅱ型猪圆环病毒的检测，并且检测灵敏度高、特异性好、检测率高；
（2）本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物还包括环引物，环引物的设计加快了反应进程，缩短了反应时间，能够在50min内检测10个拷贝的病毒核酸；
（3）本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，利用所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物进行检测，操作简单，仅需将所述环介导等温扩增引物与待测溶液混合，再55-65℃下培育10min以上即可通过观察或检测变色情况，结果便于观察，可实现Ⅱ型猪圆环病毒的快速检测；
（4）本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，采用4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐作为金属指示剂，由于环介导等温扩增反应的灵敏度高，极易造成污染，这也是环介导等温扩增容易产生假阳性的原因，本发明采用的所述金属指示剂能够在反应液配制时加入，反应结束后，不需开盖，直接通过反应液颜色变化即可判断结果，减少了气溶胶污染的可能性，避免了假阳性的产生；
（5）本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，除将环介导等温扩增引物与待测溶液混合外，还在混合液中加入了Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸，保证了环介导等温扩增的顺利进行，并且还加入了Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、Mncl2、甜菜碱、去离子水，多重试剂协同作用，使得其检测的灵敏度提高、特异性增强、检测率提高、检测速度加快，具有良好的应用前景；
（6）本发明的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，将所述混合液置于水下，进行恒温水浴，偶尔泄露的气体将经过水洗将扩增产物溶解在水中，可防止核酸扩增产物引起的气溶胶污染，极大的减少了假阳性的产生。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为实施例4中的特异性试验结果图，其中，1为PCV2组、2为PRRSV组、3为PPV组；4为CSFV组；5为 PRV组；
图2为实施例5中的灵敏度试验结果图，其中，1为1×104质粒；2为 1×103质粒；3为1×102质粒；4为1×101质粒；5为 1×100质粒；6为TE缓冲液。
具体实施方式
实施例1 检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物的设计
本实施例中，检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物包括第一外引物、第二外引物、第一内引物、第二内引物；其中，所述第一外引物（以下简称F3），具有如SEQ ID No.1所示的序列结构；所述第二外引物（以下简称B3），具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述第一内引物（以下简称FIP），具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述第二内引物（以下简称BIP）, 具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。其具体序列结构以及在检测Ⅱ型猪圆环病毒的ORF1基因上的位置如下表所示：
表1检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物的名称、序列、位置
实施例2 检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物的设计
本实施例中，检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物包括第一外引物、第二外引物、第一内引物、第二内引物、环引物；其中，所述第一外引物（以下简称F3），具有如SEQ IDNo.1所示的序列结构；所述第二外引物（以下简称B3），具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述第一内引物（以下简称FIP），具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述第二内引物（以下简称BIP）, 具有如SEQ ID No.4所示的序列结构；所述环引物（以下简称LB）具有如SEQ ID No.5所示的序列结构。其具体序列结构以及在检测Ⅱ型猪圆环病毒的ORF1基因上的位置如下表所示：
表1检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物的名称、序列、位置
实施例3 环介导等温扩增引物的对Ⅱ型猪圆环病毒的检测
本实施例中使用的PK15细胞由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存； PCV2-ZM毒株为河南省农业科学院动物免疫学重点实验室临床分离；DNA提取试剂盒购买于生物工程（上海）有限公司。需要说明的是，PK15细胞、PCV2-ZM毒株、DNA提取试剂盒均为现有技术公开，其获取途径包括但不限于本实施例中公开的方式，不同原料、来源以及制备方法得到的上述产品并不影响本发明的实施及其效果。
分别采用实施例1、2中所述的环介导等温扩增引物进行Ⅱ型猪圆环病毒的检测，具体步骤如下：
（1） Ⅱ型猪圆环病毒DNA的制备：
将临床分离到的PCV2-ZM毒株接种到PK15细胞，待病毒增殖48代后，反复冻融3次，收集病毒液，将其在12 000 r/min的转速下离心10 min，取上清，再采用DNA提取试剂盒提取PCV2的DNA，即得Ⅱ型猪圆环病毒DNA；
需要说明的是，Ⅱ型猪圆环病毒DNA的制备方法包括但不限于本实施例中使用的方法，本领域技术人员可采用其他常用方法对Ⅱ型猪圆环病毒DNA进行提取，不同原料、来源以及制备方法得到的Ⅱ型猪圆环病毒DNA并不影响本发明的实施及其效果；
（2） Ⅱ型猪圆环病毒的检测：
将实施例1中所述的第一外引物F3、第二外引物B3、第一内引物FIP、第二内引物BIP、环引物LB与步骤（1）中制备得到所述Ⅱ型猪圆环病毒DNA混合，将混合液置于63℃下培育50min，观察所述混合液的变色情况；
观察结果：在两次检测中，混合溶液均由橘红色变为浅黄色。由此可以说明，本发明的环介导等温扩增引物可实现对Ⅱ型猪圆环病毒的检测。
实施例4 环介导等温扩增引物检测Ⅱ型猪圆环病毒的特异性测试
本实施例中使用的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV) 由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室分离保存。需要说明的是，上述病毒均为现有技术公开，其获取途径、制备方法包括但不限于本实施例中公开的方式，不同原料、来源以及制备方法得到的上述病毒并不影响本发明的实施及其效果。
采用实施例2中所述的环介导等温扩增引物对待测溶液进行检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述第一外引物F3、1µl浓度为10µM的所述第二外引物B3、1µl浓度为40µM的所述第一内引物FIP、1µl浓度为40µM的所述第二内引物BIP、1µl浓度为20µM的所述环引物LB、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、1µl浓度为10mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、1µl浓度为10mM的MnCl2、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名BstDNA Polymerase Buffer）、1µl 浓度为8U/µl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNAPolymerase）、5µl的去离子水，分别与1µl的含Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）溶液、含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)溶液、含猪细小病毒(PPV)溶液、含猪瘟病毒(CSFV)溶液、含伪狂犬病毒(PRV)溶液混合，并依次编号为PCV2组、PRRSV组、PPV组、CSFV组、PRV组，将各组混合液置于63℃下培育50min，观察所述混合液的变色情况；上述实验重复做三次。
其中，所述Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为：200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C),100 mMKCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100。需要说明的是，所述BstDNA聚合酶缓冲液的成分并不唯一，只要能在反应过程中起到缓冲作用的溶液即可，本实施例只是提供一种具体的实现方式，本领域技术人员可根据实际情况替换为其他成分的缓冲液（下同，后文不再冗述）。
如图1所示为第一次特异性试验的结果图，图中从左至右分别为PCV2组、PRRSV组、PPV组、CSFV组、PRV组的实验结果，三次实验结果一致，重复性良好。实验结果表明，本发明所建立的检测方法不与PRRSV、PPV、CSFV、PRV的病毒DNA发生非特异性反应，说明本发明的方法具有较好的特异性。
实施例5 环介导等温扩增引物检测Ⅱ型猪圆环病毒的灵敏度测试
本实施例中使用的pMD18-T载体购买自通用生物系统（安徽）有限公司。需要说明的是，采用不同厂家的pMD18-T载体不影响本发明目的的实现。
采用实施例2中所述的环介导等温扩增引物对待测溶液进行检测，具体步骤如下：
（1）阳性质粒标准品的制备：
利用所述引物第一外引物F3和所述第二外引物B3扩增Ⅱ型猪圆环病毒DNA，获得233bp的目的片段，所述目的片段具有如SEQ ID No.6所示的序列结构，所述SEQ ID No.6为GTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTACACGGATATTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGCAGTGCCGAGGCCTACGTGGTCTACATTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGCCACAGCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTG，采用TA克隆法将所述目的片段插入至pMD18-T载体，即得阳性质粒标准品，在-20℃下保存备用；
需要说明的是，所述阳性质粒标准品的制备方法包括但不限于本实施例中使用的方法，本领域技术人员可采用其他常用方法进行阳性质粒标准品的制备，不同原料、来源以及制备方法得到的阳性质粒并不影响本发明的实施及其效果；
（2）检测Ⅱ型猪圆环病毒的灵敏度测试：
将步骤（1）中制备得到的阳性质粒标准品，用紫外分光光度计测其OD260，换成摩尔浓度后，得出其浓度为10000拷贝/µl，进行10倍稀释，分别取1×104、1×103、1×102、1×101、1×100五个梯度的样品1µl，并分别编号1、2、3、4、5号，再取1µl的TE缓冲液，编号为6号，其中，所述TE缓冲液的成分为：pH8.0，10mMTris，1mMEDTA；将上述六组溶液与1µl浓度为10µM的所述第一外引物F3、1µl浓度为10µM的所述第二外引物B3、1µl浓度为40µM的所述第一内引物FIP、1µl浓度为40µM的所述第二内引物BIP、1µl浓度为20µM的所述环引物LB、、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、1µl浓度为10mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、1µl浓度为10mM的MnCl2、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1µl 浓度为8U/µl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、5µl的去离子水混合，将各组混合液置于63℃下培育50min，观察所述混合液的变色情况。
其中，所述Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为：200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C),100 mMKCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100。
如图2所示为的检测Ⅱ型猪圆环病毒的灵敏度测试结果图，图中从左至右分别为1、2、3、4、5、6组实验的结果。实验结果表明，以10倍稀释的PCV2-ZM阳性质粒标准品为模板，确定所建立的检测方法在50分钟内的最低检出限为10个拷贝的病毒核酸，即本发明的检测方法可以检测出浓度为10拷贝/µl的检测Ⅱ型猪圆环病毒，由此可以说明本发明的检测方法具有较好的灵敏度。
综上所述，本发明的环介导等温扩增引物检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，可满足Ⅱ型猪圆环病毒的检测要求，并具有良好的特异性和灵敏度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 许昌学院
<120> 检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其方法
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 第一外引物
<400> 1
gtctttttta tcacttcgta atggt 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 第二外引物
<400> 2
cactattgat tacttccaac caa 23
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 第一内引物
<400> 3
ccaggaatac aatatccgtg taaccggtta agtggggggt ctt 43
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 第二内引物
<400> 4
tcgtatatac tgttttcgaa cgcaaatcag ctgtggctga ga 42

Claims (10)

1.检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述环介导等温扩增引物包括第一外引物、第二外引物、第一内引物以及第二内引物；其中，所述第一外引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构；所述第二外引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述第一内引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述第二内引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。
2.根据权利要求1所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述第一外引物、第二外引物、第一内引物以及第二内引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）。
3.根据权利要求1或2所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述环介导等温扩增引物还包括环引物，所述环引物具有如SEQ ID No.5所示的序列结构。
4.根据权利要求3所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述第一外引物、第二外引物、第一内引物、第二内引物以及环引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）。
5.检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1-4中任一所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4中任一所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物与待测溶液混合，将混合液置于55-65℃下培育10min以上，观察或检测所述混合液的变色情况。
7.根据权利要求6所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸。
8.根据权利要求7所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述混合液中还包括金属指示剂；所述金属指示剂为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐。
9.根据权利要求8所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、MnCl2、甜菜碱、去离子水中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的检测Ⅱ型猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增引物与待测溶液混合后，将所述混合液置于水下，进行恒温水浴。
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