CN106435016B

CN106435016B - 一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的lamp试剂盒

Info

Publication number: CN106435016B
Application number: CN201610760228.XA
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 刘永生; 丁耀忠; 陈豪泰; 张永光; 马丽娜; 潘丽; 王永录; 常慧芸; 邵军军; 张中旺; 吕建亮; 林彤; 刘新生
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106435016A

Abstract

本发明提供一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的LAMP试剂盒，该试剂盒包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明的试剂盒在不延长原有1小时反应时间的条件下，实现了将荧光染料直接加入反应管的一步操作，不仅简化了操作程序，解决了含有钙黄素的预混染料对Bst DNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，还有效避免了由于反应结束后二次开盖导致的释放产物形成气溶胶的污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性。

Description

一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的LAMP试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的LAMP试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒2型（PCV2）是导致断奶仔猪衰竭综合征（post weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要致病原，此外，PCV2感染还导致皮炎与肾病综合征、繁殖障碍、呼吸疾病和腹泻等症状，给养猪业带来了巨大的经济损失（McIntosh etal.2006;Gagnon et al.2007)。美国对在实施免疫计划前对来自16个州185个猪场的6234份血清（20-32周龄猪）的检测结果表明，PCV2感染的阳性率高达82%（Puvanendiran S，2011）。PCV2也在我国各猪场广泛流行。为了防控PCV2感染的发生，各大猪场基本采用了灭活疫苗免疫，这给该疫病的诊断带来了弊端。因为采用ELISA等血清学方法基本无法区分感染和免疫。所以，依赖于检测核酸存在的各种PCR方法成为诊断的常规方法。这些方法都需要特殊的仪器和专业技术人员，所以，不适合在猪场现场使用。所以，探寻和发展一种适合在猪场使用的简便的核酸检测方法势在必行。

LAMP方法由于能够实现等温扩增，在短时间内产生大量的扩增产物，所以，不仅不需要特殊的仪器，常规的水浴锅和热块即可，而且可以通过荧光染料在反应管内的变化，用肉眼观察颜色的改变就可以做出诊断。

本申请人在2008年建立了针对PCV2型的LAMP诊断方法（CN200810082209.1），该方法针对复制酶Rep编码基因6个靶区段设计了2对特异性引物，经过对86份临床样品的检测以及与其它相关病毒交叉反应性分析，结果表明，与常规PCR方法比较，PCV2 LAMP方法具有敏感性高、特异性强，易于操作，可以肉眼观察判断等优势。尽管该方法具有上述优点，但是无法实现在反应管中直接加入含有钙黄素预混荧光染料，从而直接根据反应管颜色变化做出判断的要求。只能在反应结束后，打开盖子加入荧光染料，让反应管呈色。操作复杂，且反应结束后二次开盖会导致释放产物形成气溶胶，造成污染。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，进一步简化操作，避免二次开盖造成的气溶胶污染，本申请人在LAMP原有2对引物基础上，又增加了一对环引物，提高了扩增效率，使得在反应管中直接加入荧光染料就能够直接呈色，解决了上述问题，并保障了高敏感性和强特异性的优势，建立了猪圆环病毒2型快速显色一步法环介导等温扩增，为猪场和基层防疫站检查PCV2感染状况，有效防控疫病感染提供了便捷的诊断方法。

本发明提供用于检测猪圆环病毒2型的特异性LAMP引物组，包括以下六条引物：

F3：5'-ATGGGCTGCTAATTTTGCAGAC-3'，

B3：5'-TCAATAGGAAATTCAGGGCATG-3'；

FIP：5'-GTACAGTTCCACCTTTAGTCTC-TTTT-GGTTACCATGGTGAAGAAGTGG-3'，

BIP：5'-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAGA-TTTT-TCCTCCGTGGATTGTTCTGTAG-3'；

FLoop：5'-GCATTCTTCCAAAATACCAAGG-3'，

BLoop：5'- TTGATGACTTTTATGGCTGGC-3'。

本发明提供一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的六条引物。

作为优选，还包括含有钙黄素和锰离子的荧光染料。

作为优选，所述荧光染料的用量为在25μL检测体系中含有0.4-0.5μL。

作为进一步优选，所述试剂盒构成LAMP检测体系；25μL检测体系的具体配置为：

F3/B3 0.2μL

FIP/BIP 0.4μL

FLoop/BLoop 0.4μL

模板DNA 1.0μL

Bst DNA聚合酶 1.5μL

2xU-loadmix buffer 12.5μL

荣研Loopamp 荧光染料(含有钙黄素和锰离子) 0.4μL

DEPC-treated ddH₂O 补充至25.0μL。

作为优选，所述试剂盒的检测反应条件为：63℃，45-90分钟；终止反应。

作为进一步优选，所述试剂盒的检测反应条件为：63℃，45-60分钟；终止反应。

为了实现PCV2快速显色一步法LAMP，本申请人在CN200810082209.1中的PCV2LAMP检测方法的基础上，又引入了内环和外环一对环引物，即采用了3对针对Rep蛋白编码基因8个靶区的引物，大大提高了产物量；解决了含有钙黄素的预混染料对Bst DNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，满足了肉眼直接直观判断的基层操作人员的需求，建立了PCV2快速显色一步法LAMP，实现了一步法60分钟内快速呈色的目标。

本发明的方法在保存原有LAMP方法敏感性和特异性的情况下，在不延长原有1小时反应时间的条件下，实现了将荧光染料直接加入反应管的一步操作，不仅简化了操作程序，解决了含有钙黄素的预混染料对Bst DNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，还有效避免了由于反应结束后二次开盖导致的释放产物形成气溶胶的污染发生。该方法由于设备需求简单（普通的水浴锅或者热块），操作便捷（一步操作），能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，所以，本发明的方法和应用本发明的方法建立的猪圆环病毒2型快速显色一步法环介导等温扩增试剂盒适于在基础养殖场和防疫站推广使用，市场开发前景看好。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为以5倍系列稀释的PCV2-pMD18T质粒为模板，用本发明的方法检测结果；其中，A图：LAMP扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱；B图：LAMP扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的黑白模式下拍照图谱；C图：LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；

图2为以5倍系列稀释的PCV2-pMD18T质粒为模板，进行PCV2常规PCR(P125/P126引物对)检测结果；

图3为本发明方法的特异性检测结果；图A为LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；图B为LAMP扩增产物在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱；）图C为LAMP扩增产物在凝胶成像仪紫外光的黑白模式下拍照图谱；在图A、B和C中，从左至右依次为1-9；

其中，M为DL200 Marker；1为ddH₂O；2为PCV2 CAU0673毒株；3为PCV2 GSQY毒株；4为PCV1 CAU0672毒株；5为PPV AV30 CVCCAV30毒株；6为RRV CVCC AV250毒株；7为CSFVCVCCAV65 毒株；8为HP-PRRSV QH08毒株；9为北京美莱博医学科技有限公司的U-LAMP试剂盒提供的阳性对照。

图4为采用CN200810082209.1专利的LAMP反应体系和反应程序，对比在反应管直接加入荧光染料 (含有钙黄素和锰离子)和在反应结束后再加入荧光染料PCV2阴性和阳性反应管颜色变化，在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

材料和设备

1. 毒株和细胞系

1.1 毒株：

建立PCV2快速显色一步法LAMP的PCV2毒株（CAU0673)（购自中国兽医药品监察所）和实验室从田间样品分离保存的PCV2 GSQY毒株。

对PCV2 GSQY毒株进行测序分析，结果表明：该毒株的基因组全长与PCV2毒株（CAU0673)一致，均为1767bp，彼此间核苷酸序列同源性为99%。将实验室从田间分离的PCV2GSQY毒株在Genebank注册，序列号为KU193767。

用于分析特异性检测实验的其它与猪繁殖障碍性疫病有关的毒株包括猪圆环病毒1型PCV1（CAU0672）、猪伪狂犬病毒PRV（CVCC AV250）、古典猪瘟病毒CSF（CVCCAV65，猪瘟弱毒株）和猪细小病毒PPV1型AV30毒株（CVCCAV30）均来自中国兽医药品监察所，在PK-15细胞传代后保存的细胞毒。美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NA-HP-PRRSV（QH08毒株）（由实验室从田间分离保存的Marc-145细胞毒，全基因组测序Genebank登录号：KU201579）和美洲型非高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NA-Non-HP-PRRSV(CH-1R毒株）（源自海利疫苗公司生产的蓝耳净猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，由实验室在Marc-145细胞传代的细胞毒）。

1.2 细胞系：用于分离和传代PPV1、PRV、CSF、PCV1和PCV2的是猪肾细胞PK-15，用于传NA-HP-PRRSV QH08毒株和NA-Non-HP-PRRSV CH-1R毒株的是非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞，均源自中国协和医科大学细胞中心。

2.临床样品

用于临床检测的田间样品共有598份，其中猪血清169份，组织样品429份。这些田间样品经过ELISA、PK-15细胞接毒后间接免疫荧光IFA以及PCR检测和测序分析等综合方法确定是否为PCV2感染。169份猪血清中125份为阳性，44份为阴性。组织样品包括肺脏组织76份（43份阳性，33份阴性），肝脏组织67份（37份阳性，30份阴性），心脏组织63份（32份阳性，31份阴性），肾脏组织75份（阳性40份，阴性35份），脾脏组织68份（35份阳性，33份阴性），淋巴结80份（48份阳性，32份阴性）。提取这些样品的核酸后，分别进行PCV2快速显色一步法LAMP和常规PCR检测，用于检测本发明方法的临床特异性和敏感性。

3.核酸扩增和提取相关试剂盒

用于建立PCV2 LAMP方法的扩增试剂盒为北京美莱博医学科技有限公司的U-LAMP试剂盒以及日本荣研公司Loopamp 荧光目视检测试剂盒（含有钙黄素和锰离子）。核酸提取采用Takara宝生物工程（大连）有限公司生产的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0。用于常规PCR扩增的试剂盒源自Takara宝生物工程（大连）有限公司Premix Taq Version 2.0 plus dye。

实施例1

一、样品DNA的提取

采用Takara宝生物工程（大连）有限公司生产的MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit提取细胞毒、血清和研磨后的组织样品中核酸，具体操作按照说明书进行。

二、常规PCR反应实验测定PCV2

1、PCV2 PCR反应引物

P125/P126引物对源自参考文献Yue F et al（2009），是针对PCV2的衣壳蛋白Cap编码基因设计，扩增片段大小为353bp。

表1 针对PCV2衣壳蛋白Cap编码基因的PCR引物

2、PCR扩增反应体系

20μl PCR扩增体系为：Premix Taq Version 2.0 plus dye (货号RR902)预混酶10μl,上游引物和下游引物各1μL（引物母液浓度为20μM），模板1μL和ddH₂O 7μL。

3. PCR扩增条件为：

94℃ 3min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 45s；36个循环；72℃ 10min。得到的扩增产物大小为353bp。

4、RT-PCR扩增产物电泳检测

RT-PCR扩增产物采用常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为1%，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5-6伏特/厘米（即电压降）。

三、本发明的PCV2快速显色一步法LAMP测定PCV2

（1）引物序列

本发明的方法是在2008年建立的PCV2 LAMP方法基础上提高的。在原有针对编码复制酶Rep的基因ORF1的2对引物基础上，又增加一对环引物，引物序列如下：

外侧引物对：

P220-F：5'-ATGGGCTGCTAATTTTGCAGAC-3'，

P221-B：5'-TCATATGGAAATTCAGGGCATG-3'；

内侧引物对：

P222-FIP：5'-GTACAGTTCCACCTTTAGTCTC +TTTT+GGTTACCATGGTGAAGAAGTGG-3'，

P223-BIP：5'- CAACTGCTGTCCCAGCTGTAGA+TTTT+TCCTCCGTGGATTGTTCTGTAG-3'；

环引物对：

P316-FLoop：5'-GCATTCTTCCAAAATACCAAGG-3'，

P317-BLoop：5'- TTGATGACTTTTATGGCTGGC-3'。

（2）LAMP反应体系：

PCV2 LAMP的反应体系为25μL/管，采用北京美莱博医学科技有限公司的U-LAMP试剂盒,加样量如下：

PM预混引物: 内侧引物 (50UM） 0.4μL

环引物 (50UM） 0.4μL

外侧引物 (10UM） 0.2μL

提取DNA 1.0μL

Bst DNA聚合酶 1.5μL

2×U-loadmix buffer 12.5μL

荣研Loopamp 荧光染料(含有钙黄素和锰离子) 0.4μL

DEPC-treated ddH₂O 补充至25.0μL

总体积 25.0μL。

一步法LAMP反应涉及6条引物，在实验前，先将6条引物按量预混，制备成预混引物，操作时，按着（1μL预混引物）/管计算。先准备不含有模版的总反应管，然后按着24μL/管分装。标记后，再对应加入模板，准备扩增。

经过实验，在每管25μL反应体系中加入0.4-0.5μL含有钙黄素的荧光染料即可达到实验效果（实验后，肉眼清楚看到颜色变化），这样一方面降低成本，另外一方面降低钙黄素抑制扩增反应。

（3）LAMP扩增反应流程

扩增程序：63℃，反应45-90分钟，终止反应。一般情况60分钟就可以（事前先调整好水浴锅和热块的温度）。在普通的恒温水浴锅或者热块进行恒温扩增即可。

（4）LAMP扩增产物电泳检测

A、琼脂糖凝胶电泳检测法

LAMP扩增产物可以采用常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为2-2.5%，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5-6伏特/厘米（即电压降）。电泳结束后凝胶放入含有EB的染色中染色30分钟，然后在紫外灯下观察，电脑拍照。

B、荧光目测法

快速显色一步法LAMP由于在反应管内加入了含有钙黄素和锰离子的染料，所以，在反应结束后，阳性样品管就会出现明亮的绿色荧光，而对照管和阴性样品管仅是有微弱的本底荧光。这样通过与系统设置的阴性和阳性对照的比较，在自然光下，通过肉眼观察即可以做出判断。再有，阳性样品由于扩增产生了大量产物，所以，与阴性对照相比较，阳性管溶液更为浑浊。在实验室，还可以通过在紫外灯下观察颜色变化，较自然光观察，更为明显。

实施例2 本发明的方法的性能实验

1、本发明的PCV2 快速显色一步法LAMP分析敏感性检测

本实验以质粒为模板，计算其拷贝数之后，进行5倍的系列稀释，以这些系列稀释的质粒作为扩增模板，进行PCV2快速显色一步法LAMP和常规PCR(P125/P126引物)检测，并比较两种的敏感性。

结果表明：PCV2快速显色一步法LAMP的检出限为5个拷贝数/μL（图1），常规PCR方法检出限为25个拷贝数/μL左右（图2）。这表明，本发明的PCV2快速显色一步法LAMP的灵敏度高于常规PCR方法。

计算拷贝数的方法如下：提取PCV2毒株（CAU0673）细胞毒DNA，采用P123/P124引物对扩增其全序列，然后与pMD-18T载体连接，化学转化法转入大肠杆菌JM109克隆菌感受态细胞中，挑取单菌落，扩大培养后，提取其质粒，送公司测序。

P123-F(PCV2-fullgenome)：5'-TTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT，

P124-R(PCV2-fullgenome)：5'-AGCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA。

拷贝数计算公式:

(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/(MWg/mol)=拷贝数/ml

其中，平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660 道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330 道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340 道尔顿/碱基)。

PCV2毒株（CAU0673）全长为1767bp，pMD18-T载体为2692bp，所以，构建的含有PCV2全基因序列的pMD18-T重组质粒大小为4459bp。质粒为双链DNA，所以，每个碱基的平均分子量为660道尔顿。PCV2-pMD18-T重组质粒的分子量为660×4459=2942940道尔顿。

浓度为1ng/μl的PCV2-pMD18-T重组质粒的拷贝数为：

(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度1ng/μl)x10^-6/2942940 =2.05x10¹¹拷贝数/mL=2.05x10⁸拷贝数/μl。

2、本发明的PCV2 快速显色一步法LAMP分析特异性实验

除了PCV2病毒以外，猪细小病毒1型PPV1、猪伪狂犬病毒PRV、猪瘟病毒CSF和猪蓝耳病病毒PRRSV都是导致猪繁殖障碍性疾病发生的常见病毒。由于这些病毒导致的猪繁殖障碍性疾病临床症状相似，所以，要区分PCV2病毒感染与这些病毒的感染。而PCV1尽管不是致病原，但是PCV2和PCV1基因组的相似度达80%左右，所以在进行PCV2病毒快速显色一步法LAMP的分析特异性检测时，要分别检测其与PCV1、PPV1、PRV、CSF、HP-PRRSV和Non-HP-PRRSV病毒的交叉反应性分析。采用Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 分别提取PCV1（CAU0672）、PPV1型AV30毒株（CVCCAV30）、PRV（CVCC AV250）、CSF（CVCCAV65）、HP-PRRSV（QH08毒株）和非高致病性PRRSV(CH-1R毒株）的细胞毒核酸，然后采用建立的PCV2快速显色一步法LAMP检测这些核酸样品，评估该方法与这些病毒的交叉反应性。

结果参见图3，由图3可以看出，本发明的PCV2快速显色一步法LAMP不与上述毒株发生交叉反应，琼脂糖凝胶电泳不形成条带，肉眼和紫外灯下观察未产生明亮的颜色变化。以PCV2毒株（CAU0673)和PCV2 GSQY毒株为阳性对照实验出现典型的阳性改变，以ddH₂O为阴性对照的反应管仍应呈阴性反应，试剂盒提供的阳性对照成立。综上所述，本发明的PCV2快速显色一步法LAMP分析特异性强，不与其它有关猪病病毒发生交叉反应。

3、本发明的PCV2 快速显色一步法LAMP临床敏感性实验

用于PCV2快速显示一步法LAMP临床灵敏度分析的PCV2阳性样品共有360份。其中血清125份，肺脏组织43份，肝脏组织37份，心脏组织32份，肾脏组织40份，脾脏组织35份；淋巴结48份。提取这些经过鉴定为PCV2阳性的样品核酸后，分别进行PCV2快速显示一步法LAMP和常规PCR检测。

结果参见表2，由表2可以看出：本发明的PCV2快速显色一步法LAMP的阳性检出率为97.8%。以P125/P126引物对扩增的常规PCR总检出率为93.6%。LAMP方法对猪血清的检出率为98.4%,常规PCR方法的检出率为93.6%。对比两种方法对上述阳性样品的检出率，结果显示PCV2快速显色一步法LAMP的临床敏感性明显高于常规PCR方法。

表2 360份阳性临床样品的PCV2快速显色一步法LAMP和常规PCR检出敏感性比较

4、本发明的PCV2快速显色一步法LAMP临床特异性实验

用于PCV2快速显色一步法LAMP临床特异性分析的阴性样品共有238份样品，其中血清44份，肺脏组织33份，肝脏组织30份，心脏组织31份，肾脏组织35份，脾脏组织33份；淋巴结32份。提取这些样品核酸后，分别进行PCV2快速显色一步法LAMP和常规PCR检测，评估本发明的PCV2快速显色一步法LAMP临床特异性。

结果参见表3，由表3可以看出：PCV2快速显色一步法LAMP的阴性样品检出率为96.6%，略高于常规PCR方法的阴性样品检出率93.3%。这表明本发明的PCV2快速显色一步法LAMP特异性强，适于在临床推广使用。

表3 238份阴性临床样品的PCV2快速显色一步法LAMP和常规PCR方法的特异性比较

实施例3 对比实验

采用CN200810082209.1专利权利要求书引物，即是本专利权利要求书F3、B3、FIP和BIP引物，按CN200810082209.1专利所述如下LAMP反应体系加入反应所需试剂：终浓度分别为2.0 uM的FIP和BIP引物，0.2 uM的F3和B3引物，1.0 mM dNTP，8U的 Bst DNA聚合酶（New England Biolabs), 10×buffer (containing 2mM of MgSO₄, 0.8 M betaine) 和1 ul 提取的模板DNA，反应终体积为 50 ul，反应在0.2 ml PCR管中进行。

LAMP反应程序为：恒温水浴锅 64℃条件下反应60 min，然后在80℃加热10min终止反应。

在反应结束后，打开反应管盖子，加入荣研Loopamp 荧光染料 (含有钙黄素和锰离子)，1ul/管，然后在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱。结果表明，在等温扩展反应结束后，打开盖子，加入荧光染料，在紫外光下可见阳性反应管呈亮绿色，而阴性对照反应管仅是呈暗淡的本底颜色变化。（见图4A）

同时按着上述操作程序，在阴性和阳性反应管中直接按着1ul/管加入荣研Loopamp 荧光染料 (含有钙黄素和锰离子)，混合均匀后，在恒温水浴锅 64℃条件下反应60 min，取出反应管，同样在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱。结果表明，这种一步法直接加入荧光染料的反应，阳性对照管在紫外光下没有出现预期的亮绿色变化，阴性对照反应管仍然仅是呈暗淡的本底颜色（见图4B）。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于检测猪圆环病毒2型的特异性LAMP引物组，包括以下六条引物：

F3：5'-ATGGGCTGCTAATTTTGCAGAC-3'，

B3：5'-TCAATAGGAAATTCAGGGCATG-3'；

FIP：5'-GTACAGTTCCACCTTTAGTCTC-TTTT-GGTTACCATGGTGAAGAAGTGG-3'，

BIP：5'-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAGA-TTTT-TCCTCCGTGGATTGTTCTGTAG-3'；

FLoop：5'-GCATTCTTCCAAAATACCAAGG-3'，

BLoop：5'- TTGATGACTTTTATGGCTGGC-3'。

2.一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的六条引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括含有钙黄素和锰离子的荧光染料。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料的用量为在25μL检测体系中含有0.4-0.5μL。

5.根据权利要求2-4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构成LAMP检测体系；25μL检测体系的具体配置为：

F3/B3 0.2μL

FIP/BIP 0.4μL

FLoop/BLoop 0.4μL

模板DNA 1.0μL

Bst DNA聚合酶 1.5μL

2×U-loadmix buffer 12.5μL

荣研Loopamp 荧光染料(含有钙黄素和锰离子) 0.4μL

DEPC-treated ddH₂O 补充至25.0μL。

6.根据权利要求2-5任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应条件为：63℃，45-90分钟；终止反应。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应条件为：63℃，45-60分钟；终止反应。