CN113774166A - 猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents

猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 Download PDF

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于颖
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Abstract

本发明公开了猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，包括多个扩增检测管，所述扩增检测管预装检测试剂和冻干保护剂，所述扩增检测管的管盖采用熔点56～58℃石蜡预包埋pH指示剂；以具有致病性的PCV2型、3型和4型为研究对象，开发出一种针对不同基因型PCV的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，实现PCV 2型、3型和4型的快速鉴别诊断。

Description

猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及 其使用方法
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒检测技术领域，具体为猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circoviruses,PCVs)是一种环状、无囊膜的DNA病毒，属于圆环病毒科，圆环病毒属的成员。目前已鉴定出四种PCV，包括PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。PCV1无致病性，PCV2被认为是猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirus-associateddiseases,PCVAD)的病原体。PCV3与生殖障碍、猪皮炎和肾病综合征(porcine dermatitisand nephropathy syndrome,PDNS)以及多系统炎症有关。PCV4检自出现PDNS、呼吸道和肠道症状的病猪。目前，我国猪群中PCV的感染状况十分复杂，同一猪体内可能存在不同类型的PCV混合感染。因此，PCV的快速鉴别检测对相关疾病的临床治疗至关重要。
由于PCV3和PCV4在体外很难分离，目前检测PCV感染主要采用分子生物学方法，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术和实时荧光定量PCR(quantitative real-timePCR)技术。如，“申请号202010008953.8”一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法、“申请号201711324169.2”用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒等，但此类方法耗时费力，需要专业人员和昂贵的仪器，且不能实现对不同亚型PCV的现场快速鉴别诊断。
核酸恒温扩增技术(Nucleic acid isothermal amplification technology，NAIAT)可以在恒温条件下实现对靶序列的高效扩增，且结果可通过肉眼直接观察。该方法具有简单、特异性强、结果便于观察、不需要精密仪器等优势，目前已用于多种病原检测。
发明内容
本发明的目的在于提供猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，以具有致病性的PCV2型、3型、4型为研究对象，开发一种针对不同基因型PCV的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，实现PCV2型、3型、4型的快速鉴别诊断。
本申请基于现场即时检测技术(Point-of-care testing，POCT)生产的核酸现场快速提取试剂盒，通过核酸吸附材料吸附，仅1-3分钟便可实现对动物口鼻肛拭子、血液、组织等多种样本的核酸快速提取，且无需任何设备。在检测阶段，可通过直接从核酸吸附材料中扩增核酸，实现对结果的可视化判定。该方法在病原微生物检测方面具有简便、特异性强、结果便于观察、只需要一个恒温设备(或数显保温杯)以及不受检测环境限制等优势，具有巨大的市场前景。基于该方法建立的针对PCV不同基因型的快速鉴别诊断方法，对临床PCVAD的诊断和治疗有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，包括如表1所示的组分：
表1 PCV2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分
编号 名称 数量 备注
1 核酸吸附材料 18个 常温避光保存
2 阳性对照膜片 3个 常温避光保存
3 阴性对照膜片 3个 常温避光保存
4 样品采集管 18个 常温避光保存
5 漂洗管A 18个 常温保存
6 漂洗管B 18个 常温保存
7 扩增检测管 24个 常温保存
8 复溶液 1管 常温保存
9 20μL定量吸管 3个 常温保存
10 采样拭子 18个 常温保存
11 镊子 3支 常温保存
12 滤纸条 18条 常温保存
13 说明书 1份 常温保存
所述扩增检测管预装检测试剂和冻干保护剂，其中，检测试剂为：Bst 2.0 DNA聚合酶、UDG、10×Bst buffer、10mM dNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4和100mM dUTP以及表2所示的检测PCV2、PCV3和PCV4的特异性引物；冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.10-0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为0.01-0.02g/mL；所述扩增检测管的管盖采用熔点56～58℃石蜡预包埋pH指示剂；所述pH指示剂为甲酚红或酚磺酞的一种。
表2 PCV2型、3型、4型的特异性引物序列
Figure BDA0003258434360000031
具体地，扩增检测管的管盖预包埋pH指示剂，既延长了保存时间，又降低了由指示剂本身引起的非特异性扩增；同时，检测过程中反应体系由石蜡油包埋，检测结束后离开反应温度后石蜡迅速凝固，与检测管形成“双保险”，防止任何气溶胶的产生。
优选的，表1中所述样品采集管内预装50～100μL样品裂解液，样品裂解液为平衡酚、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和TRIzol的混合液，体积比为4:1:4:2，pH为8.0。
优选的，表1中漂洗管A中预装100～500μL95％～100％乙醇；漂洗管B中预装100～500μL70％～80％乙醇。
优选的，所述复溶液为ddH2O。
优选的，PCV2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为18N个样本使用量，其中N为正整数。
猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：
S1样品裂解：取深咽拭子置于样品采集管中，搅动至白色浆状；
S2一次漂洗：取核酸吸附材料加入至上述样品采集管中，用镊子搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，用镊子夹至漂洗管A中，上下颠倒漂洗管A6～8次；
S3二次漂洗：将步骤S2中处理后的核酸吸附材料转移至漂洗管B中，搅动核酸吸附材料10～30秒，镊子夹至滤纸条吸干后，晾置5～10秒；
S4扩增检测：将步骤S3中晾干的核酸吸附材料和阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内；然后，采用20μL定量吸管向扩增检测管中依次滴加复溶液，盖盖后用手指轻弹管底3～5下，将检测管盖置于63～65℃条件下，2分钟后迅速用力向下甩动扩增检测管3～5下，再迅速放回恒温器内保温30分钟；
S5结果判读：用眼睛观察反应液颜色；阳性对照显示为粉红色或红色，阴性对照显示为黄色，则阴阳性对照成立；样品检测结果的判断比对阳性和阴性对照进行；如果样品的反应液显示粉红色或红色则表示该样品的该病原检测结果为阳性，如果样品的反应液显示黄色则表示该样品的该病原检测结果为阴性。
优选的，所述核酸吸附材料购自美国GEHealthcare公司，牌号为FTACards，Whatman，所述核酸吸附材料的直径为2～3mm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明从核酸提取、扩增检测到结果判读全过程不超过40分钟，且该试剂盒对PCV2型、3型、4型的诊断特异性(DSp)均为100％，诊断灵敏性(DSe)分别为100.0％、90.0％、100.0％，kappa值分别为1.00、0.92、1.00；与基于TaqMan探针的qPCR检测方法相比，本发明的试剂盒的Kappa＞0.75，即具有极好的可重复性。
(2)创新“三部曲”实现高特异性扩增：一是通过序列比对，选择高特异性和保守性的区域作为引物设计靶基因区，极大地提高了等温扩增反应的特异性；二是体系内引入南极热敏UDG以及dUTP溶液可有效减少反应间的残留污染；三是扩增检测管的管盖采用石蜡预包埋pH指示剂；三种设计“立体式”解决检测的非特异性扩增。
(3)从核酸提取、扩增检测到结果可视化判读既不需要复杂的转液操作，也不需要离心，只需要一个保温设备；而且试剂盒中的所有试管均预装试剂，极大简化了操作复杂性，非常适用于非专业人士的核酸现场快速检测，有形成本(试剂盒成本、人员成本和设备成本)和无形成本(时间成本)都明显低于现有的提取方法。
附图说明
图1是实施例1中的试剂盒对猪圆环病毒不同亚型进行鉴别诊断的可行性分析。
其中编号①～③分别为PCV2、PCV3和PCV4检测管，均加入了pMD18-PCV2、pMD18-PCV3和pMD18-PCV4重组质粒的混合液1μL，拷贝数为100copies/μL；④为PCV2检测管加入了pMD18-PCV3和pMD18-PCV4重组质粒的混合液1μL，拷贝数为100copies/μL；⑤为PCV3检测管加入了pMD18-PCV2和pMD18-PCV4重组质粒的混合液1μL，拷贝数为100copies/μL；⑥为PCV4检测管加入了pMD18-PCV2和pMD18-PCV3重组质粒的混合液1μL，拷贝数为100copies/μL；⑦和⑧分别为阳性和阴性对照。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配制。
PCV2型、3型、4型的基因阳性质粒构建：选取各自的F3和B3引物分别从保存于青岛农业大学动物医学院预防兽医学实验室的PCV2型、3型和4型阳性病料中扩增出特异性片段，并克隆到pMD18-T载体上，分别构建pMD18-PCV2、pMD18-PCV3和pMD18-PCV4重组质粒，所构建质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确定为阳性克隆。相关特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。
Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶、10×Bst buffer、100mM dNTPs、100mM MgSO4、pH指示剂、南极热敏UDG以及dUTP溶液，购自NEB。
5M Betaine(非盐酸盐)：购买甜菜碱，分子式C5H11NO2，分子量117.15，分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g，用100mL无RNase水溶解后，在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2，加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。
核酸吸附材料：FTA Cards，Whatman购自美国GE Healthcare公司，经打孔器制作成直径2～3mm。
平衡酚：将苯酚重蒸馏，冷却后加入双蒸水至饱和并形成等体积水相，加入1/100总体积的1MTris·HCl，pH为8.0，用浓盐酸调节混合物的pH至8.0；分装后，在-20℃保存。
样品裂解液配制：分别取平衡酚、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol，按体积比为4:1:4:2配制核酸提取试剂，调pH到8.0。
猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的组装：包括盒体、盒体内的试剂和耗材以及说明书。盒体内的试剂分别为预装500μL复溶液的ep管、预装50～100μL样品裂解液的样品采集管、预装100～500μL95％乙醇的漂洗管A、预装100～500μL70％～80％乙醇的漂洗管B以及经冻干处理的扩增检测管；盒体内的耗材分别为核酸吸附材料、采样拭子、20μL定量吸管、镊子、滤纸条以及阳性对照膜片、阴性对照膜片。
实施例1
试剂盒对PCV2、PCV3和PCV4目标基因检测的可行性分析
方法步骤如下：
步骤(1)：分别将100copies/μL的pMD18-PCV2、pMD18-PCV3和pMD18-PCV4重组质粒混合，各取混合液1μL分别加至3份核酸吸附材料中，使其充分吸收，依次编号①～③；④～⑥组核酸吸附材料分别吸附1μL拷贝数为100copies/μL的pMD18-PCV3和pMD18-PCV4重组质粒混合液、pMD18-PCV2和pMD18-PCV4重组质粒的混合液、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3重组质粒混合液。
步骤(2)：将上述核酸吸附材料和阴阳性对照膜片转移到相应编号的检测管内，采用20μL定量吸管向扩增检测管依次滴加复溶液，盖盖后用手指轻弹管底3～5下，将检测管盖置于63～65℃条件下，2分钟后迅速用力向下甩动扩增检测管3～5下，再迅速放回恒温器内保温30分钟后观察检测管内反应液颜色。
结果如图1所示，①～③检测管反应液颜色为红色，④～⑥检测管反应液颜色为黄色，阴阳性对照成立，表明试剂盒对PCV2、PCV3和PCV4均能正确识别，对不同型PCV检测具有良好的特异性，且对100copies/μL的目标基因在30分钟时内均能检出。
实施例2
本发明提供的猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒与基于TaqMan探针的qPCR检测方法的效果对比分析
选取某疑似发病猪场30份以上发病样本，按照本发明试剂盒所述检测步骤对临床样本进行检测。同时，所有样本均采用检测各基因的基于TaqMan探针的qPCR检测方法进行复检。
对目标基因PCV2、PCV3和PCV4，如表3所示，本发明提供的试剂盒的DSe值分别为100.0％、90.0％、100.0％，DSp值均为100％，kappa值分别为1.00、0.92、1.00。结果表明，与基于TaqMan探针的qPCR检测方法相比，本发明提供的PCV2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的Kappa＞0.75，即具有极好的可重复性。
表3本发明提供的诊断试剂盒和基于TaqMan的qPCR检测方法对PCV2型、3型、4型临床样品的测试比较结果
Figure BDA0003258434360000081
注：DSe＝TP/(TP+FN)；DSp＝TN/(TN+FP)，其中，TP代表阳性结果，FN代表假阴性结果，TN代表阴性结果，FP代表假阳性结果。Kappa＝(Po–Pe)/(1–Pe)，其中Po是观察符合率，Pe是机遇符合率。0＜Kappa≤0.40，则说明诊断试验的可重复性差；如果0.40＜Kappa＜0.75，则说明具有中、高度可重复性；如果Kappa≥0.75，那么该诊断试验就具有极好的可重复性。
实施例3
扩增检测管保存期试验
分别考察保存于56℃和室温(26-28℃)的有效期。结果详见表4和表5。
表4扩增检测管保存于56℃的测试结果
Figure BDA0003258434360000082
结果显示：检测体系保存于56℃，120小时内检测结果正常。
表5扩增检测管保存于室温(26-28℃)的测试结果
Figure BDA0003258434360000091
结果显示：检测体系保存于室温(26-28℃)，14个月内检测结果正常。该体系仍在持续测试中。
综上，本研究核酸恒温扩增技术，建立了一种针对猪圆环病毒2型、3型、4型的现场快速高灵敏鉴别诊断方法，并配套研制了相应的试剂盒，与之前的检测方法相比，具有特异性高、耗时短、检出率高、重复性好、成本低等优势，应用前景巨大。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的原理或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Figure BDA0003258434360000101
Figure BDA0003258434360000111
Figure BDA0003258434360000121
Figure BDA0003258434360000131
Figure BDA0003258434360000141
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法
<130> 2021-9-10
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaaaccac agtcagaacg 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> DNA
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atcagcatgg cggaccagga ttttgtccac acctgcacaa ag 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctggggctt tggagtgaa 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctagtccat catggcctcc aata 24

Claims (8)

1.猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，包括扩增检测管，其特征在于，所述扩增检测管预装检测试剂和冻干保护剂，所述扩增检测管的管盖采用石蜡预包埋pH指示剂；其中，检测试剂为：Bst 2.0DNA聚合酶、UDG、10×Bst buffer、10mM dNTPs、5MBetaine、100mM MgSO4和100mM dUTP以及表1所示的检测PCV2、PCV3和PCV4的特异性引物；冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.10-0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为0.01-0.02g/mL；
表1 PCV 2型、3型和4型的特异性引物序列
Figure FDA0003258434350000011
其中，所述石蜡的熔点为53-58℃，所述pH指示剂为甲酚红或酚磺酞的一种。
2.如权利要求1所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，还包括如表2所示的组分：
表2 PCV 2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分
编号 名称 数量 备注 1 核酸吸附材料 18个 常温避光保存 2 阳性对照膜片 3个 常温避光保存 3 阴性对照膜片 3个 常温避光保存 4 样品采集管 18个 常温避光保存 5 漂洗管A 18个 常温保存 6 漂洗管B 18个 常温保存 7 扩增检测管 24个 常温保存 8 复溶液 1管 常温保存 9 20μL定量吸管 3个 常温保存 10 采样拭子 18个 常温保存 11 镊子 3支 常温保存 12 滤纸条 18条 常温保存 13 说明书 1份 常温保存
。
3.如权利要求2所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，表2中所述样品采集管内预装50～100μL样品裂解液，样品裂解液为平衡酚、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和TRIzol的混合液，体积比为4:1:4:2，pH为8.0。
4.如权利要求2所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，表2中漂洗管A中预装100～500μL 95％～100％乙醇；漂洗管B中预装100～500μL 70％～80％乙醇。
5.如权利要求2所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述复溶液为ddH2O。
6.如权利要求2所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，PCV 2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为18N个样本使用量，其中N为正整数。
7.猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，采用如权利要求1-6任一所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，具体包括如下步骤：
S1样品裂解：取深咽拭子置于样品采集管中，搅动至白色浆状；
S2一次漂洗：取核酸吸附材料加入至上述样品采集管中，用镊子搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，用镊子夹至漂洗管A中，上下颠倒漂洗管A 6～8次；
S3二次漂洗：将步骤S2中处理后的核酸吸附材料转移至漂洗管B中，搅动核酸吸附材料10～30秒，用镊子夹至滤纸条吸干后晾置5～10秒；
S4扩增检测：将步骤S3中晾干的核酸吸附材料和阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内；然后，采用20μL定量吸管向扩增检测管中依次滴加复溶液，盖盖后用手指轻弹管底3～5下，将检测管盖置于63～65℃条件下，2分钟后迅速用力向下甩动扩增检测管3～5下，再迅速放回恒温器内保温30分钟；
S5结果判读：用眼睛观察反应液颜色；阳性对照显示为粉红色或红色，阴性对照显示为黄色，则阴阳性成立；样品检测结果的判断比对阳性和阴性对照进行；如果样品的反应液显示粉红色或红色则表示样品的病原检测结果为阳性，如果样品的反应液显示黄色则表示该样品的该病原检测结果为阴性。
8.如权利要求7所述的现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述核酸吸附材料购自美国GE Healthcare公司，牌号为FTA Cards，Whatman，所述核酸吸附材料的直径为2～3mm。
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