CN101818212B

CN101818212B - 一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒

Info

Publication number: CN101818212B
Application number: CN2010101463568A
Authority: CN
Inventors: 崔尚金; 陈长木
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2010-04-14
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-04-14
Also published as: CN101818212A

Abstract

本发明公开了一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，包括：等温反应缓冲液，DNA聚合酶，dNTP，硫酸镁，由3对引物所组成的混合物，甜菜碱，蒸馏水和荧光染料；其中，第1对引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第2对引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，第3对引物序列为SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明根据猪细小病毒的基因保守区设计了引物，采用LAMP技术进行检测，特异性强，灵敏度高，具有快速，准确性高、灵敏性好，现场应用方便等优点，解决了现有技术中存在的周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷。

Description

一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测猪细小病毒的试剂盒，尤其涉及一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，属于猪细小病毒的检测领域。

背景技术

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)感染是引起初产母猪繁殖障碍的主要原因之一。该病以初产母猪产出死胎，畸形胎，木乃伊胎以及病弱仔猪为特征，病原基因变异，毒力越来越强，造成持续感染的流行趋势，广泛分布于世界各地，给我国乃至世界各国养猪业带来巨大经济损失。

为了便于对PPV做出准确的诊断，已经建立多种实验室诊断方法，如：ELISA，RT-PCR，免疫荧光，原位杂交，病毒分离等，但这些诊断方法需要借助一些特殊仪器的辅助才能完成，稳定性较差、操作麻烦、效率低、需低温保存、储运不方便，限制了这些方法在基层单位的广泛使用。

环介导等温扩增(Loop-mediated lsothermal Amplification，LAMP)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于现场快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，以解决现有技术存在的需要借助一些特殊仪器的辅助才能完成检测，稳定性较差、操作麻烦、效率低、需低温保存、储运不方便的问题。

一种快速检测PPV的LAMP试剂盒，包括以下各组分：等温反应缓冲液，DNA聚合酶，dNTP，硫酸镁，由3对引物所组成的混合物，甜菜碱，蒸馏水和荧光染料；其中，第1对引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第2对引物序列为SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示，第3对引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

优选的，所述3对引物所组成的混合物是由各引物按照等摩尔的比例混合在一起组成；

优选的，所述等温反应缓冲液为10×等温反应缓冲液，其中含有200mM三羚基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通；

所述的DNA聚合酶优选为Bst DNA聚合酶；

所述的甜菜碱优选为5M甜菜碱；

所述的硫酸镁优选为100mM硫酸镁；

所述的dNTP优选为10mM dNTP；

所述的蒸馏水优选为三蒸处理水；

所述的荧光染料优选为1000×的荧光染料Gel-red。

本发明试剂盒在检测PPV的使用方法，包括：

(1)提取待检样品DNA；

(2)建立扩增反应体系：2.5ul 10×等温反应缓冲液、1.0ul DNA聚合酶(5U/ul)、1.5ul 10mM dNTP、1.5ul 100mM硫酸镁、2.0ul 3对引物的混合物、5.0ul 5M甜菜碱，6.5ul三蒸处理水，2ul待检样品DNA；于60-65℃恒温水浴箱中放置65min；

(3)扩增产物的显色检测：在上述反应管中加入1ul荧光染料，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为红色，则说明样品中含有PPV；如果颜色为无色，说明待检样品不含有PPV。

(4)扩增产物的电泳检测：电泳检测可以降低检测成本，在2％琼脂糖进行电泳，阳性结果出现LAMP特异的阶梯状条带，而阴性结果无阶梯状电泳条带。

本发明建立了PPV LAMP检测试剂盒，本试剂盒根据PPV的基因保守区的六个序列设计了引物，该保守基因序列为PPV所共有。

本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，可以使用荧光染料来观察，简单而快速。也可以用电泳的方法检验检测结果，可用于PPV的检测，特别适合于基层现场应用。

本发明解决了现有技术中检测PPV的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，提供的PPV的检测试剂盒，对PPV进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、出入境检疫等领域。

附图说明

图1本发明试剂盒检测PPV的特异性试验结果；1.PPV-BQ；2.PPV-ZJ；3.PCV1；4.PCV2；5.PRV；6.CSFV；7.PRRS；8阴性对照。

图2本发明试剂盒检测PPV的敏感性试验结果；1：1×10⁷copy/ul；2：1×10⁶copy/ul1；3：1×10⁵copy/ul；4：1×10⁴copy/ul；5：1×10³copy/ul；6：1×10²copy/ul；7：1×10¹copy/ul；8：1×10⁰copy/ul。

具体实施方式：

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明试剂盒的组装及具体应用方法：

(1)试剂盒组成及组分：

LAMP反应液A：含有10×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶(购自纽英伦生物技术(北京)有限公司)5u/ul、10mM dNTP、100mM硫酸镁、20uM3对引物混合物和5M甜菜碱，其中：10×等温反应缓冲液含有200mM甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通。反应液B：1000×的荧光染料Gel-red(购自北京美莱博医学科技有限公司)。

LAMP反应液A每管20uL的最佳组成为：2.5ul 10×等温反应缓冲液、1.0ul Bst DNA聚合酶(5U/ul)、1.5ul 10mM dNTP、1.5ul 100mM硫酸镁、2.0ul 3对引物混合物、5.0ul 5M甜菜碱和6.5ul三蒸处理水。

(2)试剂盒反应条件：PPV的环介导等温扩增在装有20ul反应液A的反应管中加入2ul待检DNA，于60-65℃恒温水浴箱中放置65min

(3)试剂盒扩增产物的显色检测

在上述反应管中加入1ul反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为红色，则说明样品中含有PPV病毒；如果颜色为无色，说明待检样品不含有PPV。也可以采用电泳的方法进行检测，电泳检测可以降低检测成本，在2％琼脂糖进行电泳，阳性结果出现LAMP特异的阶梯状条带，而阴性结果无阶梯状电泳条带。

试验例1本发明试剂盒在检测PPV中的实验室应用结果(敏感性和特异性试验)

一、特异性试验

1.1毒株：猪细小病毒PPV-BQ和PPV-ZJ，PCV1、PCV2、PRV、CSFV、PRRS等(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；

1.2提取待检测组织样品的DNA；

1.3检测体系各组分配比如下：

反应液A每管20uL的最佳组成为：2.5ul 10×等温反应缓冲液、1.0ul BstDNA聚合酶(5U/ul)、1.5ul 10mM dNTP、1.5ul 100mM硫酸镁、2.0ul 3对引物混合物、5.0ul 5M甜菜碱和6.5ul三蒸处理水。

试剂盒反应条件：PPV的环介导等温扩增在装有20ul反应液A的反应管中加入2ul待检DNA，于60-65℃恒温水浴箱中放置65min。

试剂盒扩增产物的显色检测：在上述反应管中加入1ul反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为红色，则说明样品中含有PPV病毒；如果颜色为无色，说明待检样品不含有PPV。也可以采用电泳的方法进行检测，电泳检测可以降低检测成本，在2％琼脂糖进行电泳，阳性结果出现LAMP特异的阶梯状条带，而阴性结果无阶梯状电泳条带。

2、试验结果

实验结果见图1.试验结果表明：采用本发明试剂盒可以特异性检出猪细小病毒PPV-BQ和PPV-ZJ，检测结果均为阳性，出现特异性红色荧光；而PCV1、PCV2、PRV、CSFV、PRRS检测结果为阴性，无特异性红色荧光。表明本发明试剂盒具有很高的特异性。

二、敏感性试验

1.1样本：PPV-PMD18T-NS1等(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；

1.2样品的处理：1×10⁷copy/ul PPV-PMD18T-NS1按照十倍逐步递减稀释。

1.3检测体系各组分配比如下：

2、试验结果见图2；试验结果表明：采用本发明试剂盒最低检测1×10¹copy/ul的质粒浓度(PPV-PMD18T-NS1)，表明采用本发明试剂盒进行检测具有很高的灵敏性。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒

<130>KLPI08078

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>artifical sequences

<400>1

ggacttttag aagaaactga atggcagcca ttgttgcttg gtaac 45

<210>2

<211>47

<212>DNA

<213>artifical sequences

<400>2

tggcagtttt ctggttaggt ttcagaacat acacaaccaa taagaga 47

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>artificel sequences

<400>3

gaataggatg cgaggaaaga c 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>artifical sequences

<400>4

tccccaatga tgcatatagc t 21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>artifical sequences

<400>5

gaataggatg cgaggaaaga c 21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>artifical sequences

<400>6

tccccaatga tgcatatagc t 21

Claims

1.一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，包括：等温反应缓冲液，DNA聚合酶，dNTP，硫酸镁，由3对引物所组成的混合物，甜菜碱，蒸馏水和荧光染料；其中，第1对引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第2对引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，第3对引物序列为SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示；

所述等温反应缓冲液为10×等温反应缓冲液，其中含有200mM三羚基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通。

2.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述3对引物所组成的混合物是由各引物按照等摩尔的比例组成。

3.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，其规格优选为5U/ul。

4.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的甜菜碱为5M甜菜碱。

5.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的硫酸镁为100mM硫酸镁。

6.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的dNTP为10mM dNTP。

7.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的蒸馏水为三蒸处理水。

8.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述的荧光染料为1000×的荧光染料Gel-red。

9.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述等温反应缓冲液为10×等温反应缓冲液，其体积大于或等于2.5ul；所述DNA聚合酶的规格为5U/ul，其体积大于或等于1.0ul；所述dNTP浓度为10mM，其体积大于或等于1.5ul；所述硫酸镁为100mM硫酸镁，其体积大于或等于1.5ul；所述内引物和外引物的混合物的体积大于或等于2.0ul；所述甜菜碱为5M甜菜碱，其体积大于或等于5.0ul；所述蒸馏水为三蒸处理水，其体积大于或等于6.5ul；所述荧光染料为1000×的荧光染料Gel-red，其体积大于或等于1ul。