CN105349702A - 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105349702A
CN105349702A CN201510869700.9A CN201510869700A CN105349702A CN 105349702 A CN105349702 A CN 105349702A CN 201510869700 A CN201510869700 A CN 201510869700A CN 105349702 A CN105349702 A CN 105349702A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pig parvoviral
lamp
loop
isothermal amplification
ppv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510869700.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈忠伟
何颖
赵武
卢冰霞
梁家幸
秦毅斌
段群棚
李斌
周英宁
蒋冬福
杨思仪
苏乾莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Veterinary Research Institute
Original Assignee
Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Veterinary Research Institute filed Critical Guangxi Veterinary Research Institute
Priority to CN201510869700.9A priority Critical patent/CN105349702A/zh
Publication of CN105349702A publication Critical patent/CN105349702A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst？DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细小病毒DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细小病毒病变组织样品和猪细小病毒病原定性研究。检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细小病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细小病毒带来便利。

Description

一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
猪细小病毒(PorcineParvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，其特征是孕猪在怀孕前期受到感染时，经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻，以及新生仔猪大量死亡。
PPV最早是从培养猪细小病毒病的细胞中发现的一种小DNA污染病毒，1967年Carwtright等从不妊症，流产和死产猪中分离出PPV，随后发现该病毒呈世界性分布,是引起猪胚胎和胎儿死亡的主要病原之一。我国在1953年首次从上海分离到该病毒，此后全国各地均有本病发生的报道。PPV对养猪业危害较大，感染率高，在我国经产母猪及种公猪感染率高达92%。近年来，随养猪业的发展，大型集约化猪场的相继出现，该病呈明显扩大上升的趋势，给我国乃至全球养猪业带来巨大的经济损失。
猪细小病毒病是危害我国养猪生产的重要疫病之一，对猪细小病毒病密切监测和快速诊断，有利于该病的防治。目前，PPV的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是病毒的分离鉴定，其结果准确可靠，但常规鉴定方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长的缺点，不利于猪细小病毒病的快速诊断。分子生物学的方法是通过聚合酶链式反应（PCR）方法检测猪细小病毒病病毒的特异性基因，虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需要设计特异性强的引物和昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪细小病毒的方法，公开一种快速、实时定量的检测猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细小病毒DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；；
其中引物的序列分别为：
F3GAAACCTAAATCCACCAACAT
B3GGAGGCAGTCCTAGAGATC
FIPACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC
BIPGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT
LFATGTCACTGTGTAGTCCTGTTTGT
LBTATCACTTTGACACAAAACCACTAA
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
所述的猪细小病毒DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒从疑似猪细小病毒病变组织或猪细小病毒培养物中提取的猪细小病毒基因组DNA。
所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgSO415-28mM、(NH4)2SO418-28mM、Tween200.5-1.5℅、Betaine1.3-3.5M和dNTPs2.4-4.8mM，其配制方法在pH为8.6左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似猪细小病毒病变组织或猪细小病毒培养物中是否含有猪细小病毒，具体检测步骤包括：
（1）LAMP引物的设计与合成
（2）猪细小病毒DNA模板的提取
（3）LAMP反应体系建立
（4）LAMP检测方法。
所述的LAMP反应体系建立以25μL计，
2×反应缓冲液12.5μL
BstDNA聚合酶1μL
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LP20pmol
猪细小病毒DNA2μL
超纯水补足25μL。
所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在10-15分钟间出现扩增。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的LAMP方法特异性检测出猪细小病毒，所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
2）灵敏度高
普通PCR检测方法的灵敏度为2.16×10-8ng/μL，而使用本发明的LAMP检测方法，检测限约为2.16×10-10ng/μL，是普通PCR的100倍。
3）迅速获得结果
普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在13分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
4）不造成污染
目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本发明的LAMP检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
5）可实时定量
本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪细小病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
附图说明
图1是本发明LAMP方法特异性检测结果；其中1：猪细小病毒；2：猪圆环病毒Ⅱ型；3：伪狂犬病毒；4：猪瘟病毒；5：蓝耳病病毒；6：口蹄疫病毒；7：传染性胃肠炎病毒；8：流行性腹泻病毒；9：空白对照（水）。猪细小病毒反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增，为阴性结果。
图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪细小病毒敏感性检测的结果，其中1：2.16×10ng/μL；2：2.16ng/μL；3：2.16×10-1ng/μL；4：2.16×10-2ng/μL；5：2.16×10-3ng/μL；6：2.16×10-4ng/μL；7：2.16×10-5ng/μL；8：2.16×10-6ng/μL；9：2.16×10-7ng/μL；10：2.16×10-8ng/μL；11：2.16×10-9ng/μL；12：2.16×10-10ng/μL；13：water。猪细小病毒原始DNA的起始浓度为2.16×10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限约为2.16×10-10ng/μL，而普通PCR方法检测限约为2.16×10-8ng/μL。
图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪细小病毒基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
图5是本发明猪细小病毒定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪细小病毒拷贝数。
具体实施方式
1、材料的准备
猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒；为市售疫苗毒或广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMPDNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0552。
2、LAMP引物的设计与合成
根据GenBank中的猪细小病毒VP2基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF和LB为环引物；其中F3、B3为猪细小病毒PCR检测引物，其中
F3GAAACCTAAATCCACCAACAT
B3GGAGGCAGTCCTAGAGATC
FIPACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC
BIPGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT
LFATGTCACTGTGTAGTCCTGTTTGT
LBTATCACTTTGACACAAAACCACTAA
3、病毒基因组DNA提取
使用康为世纪生物科技有限公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取猪细小病毒DNA或者疑似猪细小病毒感染的病变组织的基因组DNA，以及对照病毒的基因组RNA/DNA。
4、LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μL体系配置：
2×反应缓冲液12.5μL
BstDNA聚合酶1μL
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LP20pmol
猪细小病毒DNA2μL
超纯水补足25μL
LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。
5、LAMP检测方法
1）特异性检测
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒的基因组RNA/DNA，作为LAMP反应的模板，进行各LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验LAMP方法的特异性。
2）敏感性检测
提取的猪细小病毒基因组DNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成12个稀释度，以各DNA稀释度作为模板，进行本发明的LAMP方法扩增和常规PCR扩增，对比本发明的LAMP方法和普通PCR对检测猪细小病毒的敏感性。
3）荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
实施例1LAMP检测方法的特异性结果
对1株猪细小病毒、7株对照病毒和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，猪细小病毒反应管在13分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。
实施例2LAMP检测方法的敏感性结果
猪细小病毒原始DNA的起始浓度为2.16×10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的LAMP法检测限约为2.16×10-10ng/μL，而常规PCR法检测限为2.16×10-8ng/μL。
实施例3LAMP检测方法的荧光可视化检测结果
根据浊度仪监控优化的条件，反应器加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪细小病毒基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4猪细小病毒定量标准曲线的绘制
以猪细小病毒DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒pMD18-T-VP2的起始浓度，作为标准样品，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释12个稀释度，取各稀释度2μL作为模板进行LAMP扩增，
设置对照：浓度为2.155×101ng/μL、2.155ng/μL、2.155×10-1ng/μL、2.155×10-2ng/μL、2.155×10-3ng/μL、2.155×10-4ng/μL、2.155×10-5ng/μL、2.155×10-6ng/μL、2.155×10-7ng/μL、2.155×10-8ng/μL、2.155×10-8ng/μL、2.155×10-9ng/μL和2.155×10-10ng/μL的重组质粒pMD18-T-VP2标准样品各一个，因为样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.5136x-7.3876，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9898，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数2.155，即为2.155x10-yng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02x1023x(ng/ulx10-9)）/(DNAlengthx660)，DNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+204=2897bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02x1023x（2.155x10-yx10-9）/(2897x660)，简化之后为：6.78x108x10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为35分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于10.588，则浓度为10-10.588，再乘以基数2.155，即为该试验样品的浓度2.155×10-10.588ng/μL，则其拷贝数为：6.78x108x10-10.588=6.78x10-2.588copies/μL，从而达到定量的效果。
表1样品浓度负对数值与PPV-LAMP浊度值时间线性关系表
时 间 13 15 16 18 20 22 24 25 28 31
浓度负对数 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
<110>广西壮族自治区兽医研究所
<120>一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
<160>6
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GAAACCTAAATCCACCAACAT
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GGAGGCAGTCCTAGAGATC
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ATGTCACTGTGTAGTCCTGTTTGT
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
TATCACTTTGACACAAAACCACTAA

Claims (8)

1.一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细小病毒DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；
其中引物的序列分别为：
F3GAAACCTAAATCCACCAACAT
B3GGAGGCAGTCCTAGAGATC
FIPACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC
BIPGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT
LFATGTCACTGTGTAGTCCTGTTTGT
LBTATCACTTTGACACAAAACCACTAA
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
2.根据权利要求1所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪细小病毒DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪细小病毒培养物或疑似感染猪细小病毒的临床病变组织的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求1所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgSO415-28mM、(NH4)2SO418-28mM、Tween200.5-1.5℅、Betaine1.3-3.5M和dNTPs2.4-4.8mM。
5.一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，兽医临床上用于检测疑似猪细小病毒病变组织或猪细小病毒培养物中是否含有猪细小病毒，具体检测步骤包括：
（1）LAMP引物的设计与合成
（2）猪细小病毒DNA模板的提取
（3）LAMP反应体系建立
（4）LAMP检测方法。
6.根据权利要求5所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP反应体系建立以25μL计，
2×反应缓冲液12.5μL
BstDNA聚合酶1μL
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
猪细小病毒DNA2μL
超纯水补足25μL。
7.根据权利要求5所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8.根据权利要求5所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
CN201510869700.9A 2015-11-27 2015-11-27 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用 Pending CN105349702A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510869700.9A CN105349702A (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510869700.9A CN105349702A (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105349702A true CN105349702A (zh) 2016-02-24

Family

ID=55325761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510869700.9A Pending CN105349702A (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105349702A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435015A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒
CN110184283A (zh) * 2019-04-30 2019-08-30 吉林农业大学 一种检测虎细小病毒的lamp-lfd试剂盒
CN110438259A (zh) * 2019-07-26 2019-11-12 博奥生物集团有限公司 一种能区分猪细小病毒1-7型的分型检测的lamp的引物组合、检测方法及试剂盒
CN111663006A (zh) * 2019-07-24 2020-09-15 安徽农业大学 一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒
CN111961755A (zh) * 2020-08-20 2020-11-20 宁波爱基因科技有限公司 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒
CN112176101A (zh) * 2020-09-08 2021-01-05 华南农业大学 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101575651A (zh) * 2009-06-24 2009-11-11 中国兽医药品监察所 猪细小病毒lamp检测试剂盒及其检测方法
CN101818212A (zh) * 2010-04-14 2010-09-01 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN102002531A (zh) * 2010-11-23 2011-04-06 中国农业大学 一种弓形虫检测试剂盒及其应用
CN102676698A (zh) * 2012-05-17 2012-09-19 贵州省畜牧兽医研究所 Prv、pcv-2、ppv多重pcr检测试剂盒
CN102808038A (zh) * 2011-05-30 2012-12-05 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪细小病毒lamp快速检测引物、检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101575651A (zh) * 2009-06-24 2009-11-11 中国兽医药品监察所 猪细小病毒lamp检测试剂盒及其检测方法
CN101818212A (zh) * 2010-04-14 2010-09-01 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN102002531A (zh) * 2010-11-23 2011-04-06 中国农业大学 一种弓形虫检测试剂盒及其应用
CN102808038A (zh) * 2011-05-30 2012-12-05 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪细小病毒lamp快速检测引物、检测试剂盒及其检测方法
CN102676698A (zh) * 2012-05-17 2012-09-19 贵州省畜牧兽医研究所 Prv、pcv-2、ppv多重pcr检测试剂盒

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435015A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒
CN106435015B (zh) * 2016-08-30 2019-07-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒
CN110184283A (zh) * 2019-04-30 2019-08-30 吉林农业大学 一种检测虎细小病毒的lamp-lfd试剂盒
CN111663006A (zh) * 2019-07-24 2020-09-15 安徽农业大学 一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒
CN110438259A (zh) * 2019-07-26 2019-11-12 博奥生物集团有限公司 一种能区分猪细小病毒1-7型的分型检测的lamp的引物组合、检测方法及试剂盒
CN110438259B (zh) * 2019-07-26 2022-08-09 北京市动物疫病预防控制中心 一种能区分猪细小病毒1-7型的分型检测的lamp的引物组合、检测方法及试剂盒
CN111961755A (zh) * 2020-08-20 2020-11-20 宁波爱基因科技有限公司 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒
CN112176101A (zh) * 2020-09-08 2021-01-05 华南农业大学 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105349702A (zh) 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN101886138A (zh) 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒
CN105349707A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN111876502B (zh) 双重实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌s2疫苗株的方法及其使用的成套试剂
CN104651534A (zh) 一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN102286617B (zh) 斑疹伤寒群立克次体荧光定量pcr试剂盒
CN106521036B (zh) 一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重pcr检测方法
CN104651535A (zh) 一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN107460255A (zh) 一种检测猪丁型冠状病毒的rt‑lamp引物组、试剂盒及应用
CN106435033A (zh) 一种检测鉴别猪脐带血中猪瘟病毒野毒株与疫苗株的双重实时荧光rt‑pcr试剂盒及其用途
CN103627818B (zh) 检测主要亚型禽白血病病毒的lamp试剂盒
CN114774563B (zh) 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用
CN105349672A (zh) 一种猪肺炎支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105154584B (zh) 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针
CN104651519A (zh) 一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN108531660A (zh) 一种检测猪圆环病毒3型实时定量lamp引物、试剂盒及应用
CN105400902A (zh) 一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒
CN104031997B (zh) 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的lamp引物组、试剂盒及其检测方法
CN103205493B (zh) 一种检测布鲁氏菌的lamp方法
RU2761496C2 (ru) Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени
CN105821160A (zh) 一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105385789A (zh) 一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105256071A (zh) 一种快速检测鲤疱疹病毒iii型的方法
CN115786587A (zh) 一种用于同时检测4种病原体的多重pcr的引物组及其检测方法、试剂盒
CN105779656A (zh) 一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination