CN112176101A

CN112176101A - 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒

Info

Publication number: CN112176101A
Application number: CN202010936599.5A
Authority: CN
Inventors: 马静云; 陈咏辉; 周玲; 蓝天; 孙媛; 李倩妞; 卢先东; 刘艳红
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2021-01-05

Abstract

本发明属于分子检测技术领域，公开了一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒，本发明通过设计并筛选特异性引物，通过结合微流控芯片技术，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的PPV核酸检测方法；本发明提供的微流控芯片检测方法特异性高，不与猪其他病原交叉反应，且最低检测限可达到10¹copies/μL。该微流控芯片试剂盒，小巧便携，可以弥补针对PPV检测耗时、费力、高成本的缺陷，使得检测灵敏度和特异性提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期，满足现场检测的需求；本方法提供的快检技术可推广应用于猪细小病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

Description

一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，更具体的，涉及一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒。

背景技术

猪细小病毒病(porcine parvovirus infection，PPI)又称猪繁殖障碍病，是由猪细小病毒引起的一种猪的繁殖障碍病，该病的特征主要表现为受到感染的母猪，尤其是初产的母猪，使其产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。家猪、野猪、仔猪、后备猪、育肥猪等各类猪群均可感染，其中怀孕母猪会出现明显临床症状。

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)的细小病毒属(Parvovirus)，细小病毒属是目前动物病毒中最小最简单的一类单链线状DNA病毒。PPV的基因组大小约5Kb，包括两个开放性阅读框，分别编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP)。对于非结构蛋白大多学者认为有两种(NS1和NS2)，也有报道认为有NS3的存在，但目前尚没有足够的证据证明，其中NS1蛋白具有免疫原性和细胞毒性，对病毒早期、晚期的转录和复制起重要作用。目前，应用于PPV的诊断方法主要为：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光定量PCR，免疫荧光法，血凝和血凝抑制试验(HA-HI)，间接血凝试验等。以上检测手段，特异性和灵敏性均具有优势，但是这些检测方法的实施需要专业的人员操作，高价的检测设备且检测周期长，因此技术要求相对较高，无法推广使用。与标准实验室检测相比，即时检测(Point of care testing，POCT)对实验室基础设施的依赖程度较低，借助小型的桌面式设备或试剂即可对疾病进行现场快速诊断，具有快速、便捷，检测成本低等优点，且对专业人员要求低，可在实验室以外的现场环境使用。

微流控检测技术近年来在POCT相关领域得到了广泛的应用，微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)，微流控芯片可将常规实验室的样品制备，试剂加样，样本分离，反应进行和结果检测在内的全过程集合在一张几平方厘米的芯片中，自动完成多靶标的分析检测。规模集成、仪器微小化、高通量、节约试剂、操作简单等众多优点使微流控芯片技术特别适用于医学检测、疾病诊断、食品安全、环境监测等多个领域。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)自公布以来便发展迅速，其原理是针对靶基因的6个区域设计4或6种特异引物，利用具有活性的链置换DNA聚合酶，在恒温条件(60℃～65℃)下进行DNA模板的链置换扩增反应。其优点在于反应在等温条件下进行，无需复杂的变温程序；扩增效率高，1h内可达到10¹⁰倍扩增。灵敏度高，比传统PCR高2～5个数量级。微流控芯片和LAMP技术的结合，增加了仪器的便携性，节约了试剂和时间的同时能对多种病原体进行快速检测，展现了其在病毒、细菌、真菌等病原体快速诊断领域的广阔应用前景。

专利文献(CN201820112618.0)公开了一种用于恒温微流控芯片的分析装置，其基于微流控芯片技术，结合LAMP恒温扩增技术，采用荧光检测技术，将加热、离心、恒温扩增、反应、荧光检测及曲线结果显示集成于一个装置，依据可视化结果判断阴阳性，实现即时检测。

现有技术缺乏针对猪细小病毒病的POCT检测产品，不利于猪细小病毒病的快速检测。

发明内容

针对上述现有技术缺乏对猪细小病毒病的POCT检测技术，本发明首先提供一种用于猪细小病毒检测的特异性引物组。

本发明的第二个目的是提供一种用于猪细小病毒检测的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于猪细小病毒检测的特异性引物组，所述引物组序列如SEQ ID NO：1～5所示。

上述特异性引物组的序列如下：

SEQ ID NO：1：ATGGTCGCACTAGACACC；

SEQ ID NO：2：ACTGTGTAGTCCTGTTTGT；

SEQ ID NO：3

GGTAACCATGGATAAAAACCAAGTGATAACACACTTCCATACACACC；

SEQ ID NO：4

ATTACCTATCATGCACCAGAAACCTTCTGTTATTTGTTCTGATTGTCC；

SEQ ID NO：5：TTTCACTTCTAGGTGCTGC。

本发明还提供一种用于检测猪细小病毒的微流控芯片试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物组。

优选的，所述特异性引物组中，SEQ ID NO：1～5所示序列分别包括外引物、内引物和环引物，其中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：8：4。

更优选的，上述引物的浓度均为50μM。

更优选的，所述试剂盒还包括恒温扩增预混液、阳性标准品。

作为一种优选的技术方案，本发明上述试剂盒包括：微流控芯片、特异性引物组、恒温扩增预混液、阳性标准品。该试剂盒可以搭配市面上的恒温微流控芯片分析装置使用，其中微流控芯片需保存在-20℃。

优选的，上述试剂盒中，所述微流控芯片设有8个相互独立的检测模块，每一个检测模块包含有1个加样孔和1组反应池，每一个检测模块的1组反应池包括2个临床样品扩增池和2个阴性对照反应池，SEQ ID NO：1～5所示序列均经加热干燥包被固定在对应临床样品扩增池内。

具体的，上述引物包被在微流控芯片上的具体步骤为：将上述特异性引物组内每一种引物分别与蔗糖混合，配制成相应的混合溶液，蔗糖和引物组在所述混合液中的终浓度分别为0.5％(质量百分比)和0.15μM；取1.5μL混合液点入微流控芯片相应的临床样品扩增池内，于60℃干燥台上干燥，压片封膜，冲压抽真空后，引物组的包被完成。

优选的，上述试剂盒中，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶、50μM荧光染料SYBR Green的LAMP反应液。

具体的，上述阳性标准品的制备方法为：从PPV阳性病料抽提DNA，经PCR将PPV-VP2基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收后，经与pGEM-T easy载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，将pGEM-T-PPV质粒线性化后纯化，获得体外阳性标准品TPPV-VP2待用。

具体的，上述试剂盒应用LAMP的反应体系为：恒温扩增反应液10μL，待检样品的核酸15μL。

利用恒温微流控芯片分析装置和上述试剂盒进行分析的过程为：反应程序温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。反应时间设定为60min。

本发明还提供利用上述试剂盒检测PPV的过程，包括以下步骤：

S1、待测样本核酸抽提：采用磁珠法抽提核酸样品；

S2、LAMP反应：取恒温扩增反应液与待检样品核酸混匀后，转移至包被引物组的微流控芯片的储液池，封膜，放入检测装置，液体在离心力作用下流入扩增池内，开始环介导等温扩增反应；

其中，LAMP的反应体系为：恒温扩增反应液10μL，待检样品的核酸15μL；

S3、结果判定：微流控芯片检测分析装置在LAMP反应时实时收集反应池中每个孔位的荧光信号，根据显示屏结果，产生典型“S”型荧光扩增曲线的扩增池为阳性扩增，反之则为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计并筛选特异性引物，得到一种用于猪细小病毒的LAMP检测方法，通过结合微流控芯片技术，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的PPV核酸检测方法；本发明提供的微流控芯片检测方法特异性高，不与猪其他病原交叉反应，且最低检测限可达到10¹copies/μL。本发明提供的检测猪细小病毒的微流控芯片试剂盒，芯片分析装置小巧便携，可以弥补针对PPV检测耗时、费力、高成本的缺陷，使得检测灵敏度和特异性提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期，满足现场检测的需求；本方法提供的快检技术可推广应用于猪细小病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明使用的微流控芯片的结构示意图；其中标记为：反应检测区1；储液池2；扩增池3；毛细管微阀4；分配池5；

图2为本发明使用的微流控芯片包埋示意图；其中的附图标记为：样品检测孔A；阴性对照孔B；

图3为猪细小病毒LAMP检测体系的特异性，所用核酸分别为猪伪狂犬病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒阳性质粒、猪细小病毒，阴性对照；

图4为猪细小病毒LAMP检测体系灵敏性试验；

图5为猪细小病毒LAMP检测体系的重复性和稳定性试验。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例描述了本发明所采用的微流控芯片。

如图1所示，本发明所采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，该芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为4×8，其包括8个反应检测区1，每一反应检测区1包括依次连通的储液池2、分配池5、毛细管微阀4、扩增池3，储液池2通过一弧形通道与分配池5连通，储液池2中设有进样孔及排气孔；每一反应检测区1均设有4个扩增池。

其中储液池2的主要功能为装载反应液；分配池5的主要作用为均匀分配反应液至扩增池3；扩增池3具体实现LAMP反应；毛细管微阀4主要利用毛细管对液体的阻滞作用，来控制微流控芯片中流体的运动。

实施例2

本实施例为本发明所采用的用于检测猪细小病毒的LAMP引物组合物及阳性标准品制备。

其设计和合成的步骤如下：

首先从Genbank数据库中检索获得所有PPV的全长基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到PPV基因组相对保守的靶基因序列。根据所得靶序列，利用PrimerExplorer V5设计出上述LAMP引物，并进行合成；

再次是进行引物组合的筛选：将合成的引物溶解后进行引物筛选，最终得到用于微流控芯片所需的特异、灵敏的引物组合。引物分别为外引物F3/B3，内引物FIP/BIP，环引物LF，序列如SEQ ID NO：1～5。

上述特异性引物组的序列如下：

SEQ ID NO：1：ATGGTCGCACTAGACACC；

SEQ ID NO：2：ACTGTGTAGTCCTGTTTGT；

SEQ ID NO：3

GGTAACCATGGATAAAAACCAAGTGATAACACACTTCCATACACACC；

SEQ ID NO：4

ATTACCTATCATGCACCAGAAACCTTCTGTTATTTGTTCTGATTGTCC；

SEQ ID NO：5：TTTCACTTCTAGGTGCTGC。

利用筛选各得到的2组外引物F3/B3，做PCR扩增，经胶回收、连接T载、转化、挑单克隆、摇菌、测序鉴定得到正确的转化子，得到猪细小病毒LAMP方法阳性标准品质粒，质粒浓度为1×10⁹copies/μL。

实施例3

本实施例为用于检测猪细小病毒的微流控芯片试剂盒。

本发明所涉及的试剂盒，包括实施例1所述的微流控芯片，实施例2所述的猪细小病毒引物组，猪细小病毒LAMP方法阳性标准品，还包括恒温扩增预混液。

对于猪细小病毒的引物组，2种引物组优选的的摩尔比为外引物F3/B3：内引物FIP/BIP：环引物LF为1：8：4。

对于恒温扩增预混液，为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶和50μM荧光染料SYBRGreen的反应液(由上海速创诊断产品有限公司提供)。

实施例4

本实施例为采用实施例3所述的试剂盒检测猪细小病毒的方法。

核酸抽提：按照TIANGEN公司Magnetic Viral DNA/RNA Kit使用说明书进行。

引物组包被：如图2所示，将猪细小病毒引物组分别与蔗糖混合，配制成混合液，各引物组和蔗糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.15μM和1.0％(质量百分比)；各取1.5μL混合溶液点入微流控芯片相应的扩增池中，每一反应检测区设2个PPV检测池，2个阴性对照池，将微流控芯片于60℃干燥台干燥，压片封膜，冲压真空后，引物组被包被于各扩增池。

配制LAMP反应液：10μL恒温扩增预混液，15μL抽提的待检样品的核酸混合后，转移至包被引物组微流控芯片的储液池，储液池封膜，在所述恒温微流控芯片分析装置中(上海速创诊断产品有限公司，型号IGeneTechnoTM SC-MA2000)，反应程序温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。反应时间设定为60min。

结果判读：微流控芯片检测分析装置在LAMP反应时实时收集反应池中每个孔位的荧光信号，根据显示屏结果，产生典型“S”型荧光扩增曲线的扩增池为阳性扩增，反之则为阴性。

实施例5

本实施例用于对微流控芯片结合LAMP检测猪细小病毒方法的特异性试验。

本实施例的实验步骤如实施例4，待测样本包括猪伪狂犬病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒阳性质粒、猪细小病毒和阴性对照。检测结果如图3，建立的猪细小病毒LAMP检测方法与其他猪病原不发生交叉反应，故具有良好的检测特异性。

实施例6

本实施例用于对微流控芯片结合LAMP检测猪细小病毒方法的灵敏度试验。

本实施例的实验步骤如实施例4，将PPV阳性标准品10倍系列稀释作为模板进行微流控检测(l×10⁶～l×10⁰copies/μL)，共7个梯度，以确定它们的最低检出限。结果，以TPPV-VP2标准品为模板，微流控的最低检出限为1×10¹copies/μL(图4)。

实施例7

本实施例用于对微流控芯片结合LAMP检测猪细小病毒方法方法的重复性和稳定性试验。

本实施例的实验步骤如实施例4，将PPV阳性标准质粒10倍系列稀释作为模板进行检测(l×10⁶copies/μL，l×10⁴copies/μL，l×10¹copies/μL)，每个梯度重复8次，对3个梯度的阳性质粒进行重复性检验，结果如图5所示，且CV<5％，表明此方法重复性和稳定性良好。

以上实施例表明，本发明所述的微流控芯片结合LAMP技术用于猪细小病毒检测的引物组合及试剂盒，可快速、准确地检测猪细小病毒，以弥补针对上述病原检测技术存在的费时费力的缺陷，小巧可携带的仪器可有效降低检测成本和劳动强度，提高灵敏性和特异性，缩短检测周期。可视化的结果判定和简易的操作要求使得本发明适用于科学研究和生产实践中，并可广泛应用于现场即使检测。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒

<130> ZM201297ZL

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> virus

<400> 1

atggtcgcac tagacacc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> virus

<400> 2

actgtgtagt cctgtttgt 19

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> virus

<400> 3

ggtaaccatg gataaaaacc aagtgataac acacttccat acacacc 47

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> virus

<400> 4

attacctatc atgcaccaga aaccttctgt tatttgttct gattgtcc 48

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> virus

<400> 5

tttcacttct aggtgctgc 19

Claims

1.一种用于检测猪细小病毒的特异性引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQID NO：1～5所示。

2.一种用于检测猪细小病毒的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物组。

3.根据权利要求2所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述特异性引物组中，SEQID NO：1～5所示序列分别包括外引物、内引物和环引物，其中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：8：4。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括恒温扩增预混液、阳性标准品。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微流控芯片，所述微流控芯片设有8个相互独立的检测模块，每一个检测模块包含有1个加样孔和1组反应池，每一个检测模块的1组反应池包括2个临床样品扩增池和2个阴性对照反应池，SEQID NO：1～5所示序列均经加热干燥包被固定在对应临床样品扩增池内。

6.根据权利要求5所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增预混液含有800U/mL的Bst DNA聚合酶、50μM荧光染料SYBR Green的LAMP反应液。