CN112195272A - 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒 - Google Patents

一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子检测技术领域，公开了一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒，通过设计并筛选特异性引物，结合微流控芯片技术，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的JEV核酸检测方法；本发明提供的微流控芯片检测方法特异性高，最低检测限可达到101copies/μL。本发明提供的检测猪乙型脑炎病毒的微流控芯片试剂盒，芯片分析装置小巧便携，可以弥补针对JEV检测耗时、费力、高成本的缺陷，使得检测灵敏度和特异性提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期，满足现场检测的需求；本方法可推广应用于猪乙型脑炎病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

Description

一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型 脑炎病毒检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，更具体的，涉及一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒，尤其涉及一种微流控芯片、恒温微流控芯片分析装置及微流控检测方法结合LAMP技术检测猪乙型脑炎病毒的试剂盒。
背景技术
流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)又称日本脑炎，简称乙脑，是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种急性人兽共患传染病，该病毒以蚊虫为传播媒介，其中猪是JEV的主要储存宿主，对JEV有扩增作用，发病时可造成母猪流产、产死胎或木乃伊胎，也可引起公猪睾丸炎或不育，给养猪业带来巨大的经济损失。
JEV属于黄病毒科，黄病毒属。JEV全长11kb，为单股正链RNA病毒，除5’端95个核苷酸和3’端385个核苷酸为非编码区以外，其余10296个核苷酸编码1个开放阅读框(ORF)，依次编码C、PrM、E 3个结构蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5 7个非结构蛋白。其中NS5蛋白基因保守性好，适合作为分子检测靶基因。本病具有明显的季节性、地区性及临床病变，根据临床特性、病理剖检及流行病学可作初步诊断，但对JEV的诊断还需要借助实验室分子生物学方法。目前，应用于JEV的诊断方法主要为：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光定量PCR，补体结合试验，间接免疫荧光法，血凝抑制试验等。以上检测手段，特异性和灵敏性均具有优势，但是这些检测方法的实施需要专业的人员操作，高价的检测设备且检测周期长，因此技术要求相对较高，无法推广使用。与标准实验室检测相比，即时检测(Point of care testing，POCT)对实验室基础设施的依赖程度较低，借助小型的桌面式设备或试剂即可对疾病进行现场快速诊断，具有快速、便捷，检测成本低等优点，且对专业人员要求低，可在实验室以外的现场环境使用。
微流控检测技术近年来在POCT相关领域得到了广泛的应用，微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)，微流控芯片可将常规实验室的样品制备，试剂加样，样本分离，反应进行和结果检测在内的全过程集合在一张几平方厘米的芯片中，自动完成多标靶的分析检测。规模集成、仪器微小化、高通量、节约试剂、操作简单等众多优点使微流控芯片技术特别适用于医学检测、疾病诊断、食品安全、环境监测等多个领域。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)自公布以来便发展迅速，其原理是针对靶基因的6个区域设计4或6种特异引物，利用具有活性的链置换DNA聚合酶，在恒温条件(60℃～65℃)下进行DNA模板的链置换扩增反应。其优点在于反应在等温条件下进行，无需复杂的变温程序；扩增效率高，1h内可达到1010倍扩增。灵敏度高，比传统PCR高2～5个数量级。微流控芯片和LAMP技术的结合，增加了仪器的便携性，节约了试剂和时间的同时能对多种病原体进行快速检测，展现了其在病毒、细菌、真菌等病原体快速诊断领域的广阔应用前景。
专利文献(CN201820112618.0)公开了一种用于恒温微流控芯片的分析装置，其基于微流控芯片技术，结合LAMP恒温扩增技术，采用荧光检测技术，将加热、离心、恒温扩增、反应、荧光检测及曲线结果显示集成于一个装置，依据可视化结果判断阴阳性，实现即时检测。
现有技术缺乏针对猪乙型脑炎病毒相关的POCT检测产品，不利于猪乙型脑炎的快速检测。
发明内容
针对上述现有技术缺乏对猪乙型脑炎的POCT检测技术，本发明首先提供一种用于猪乙型脑炎病毒检测的特异性引物组。
本发明的第二个的目的是提供一种用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒。
本发明通过比对Genbank中JEV所有序列，在其相对保守的NS5基因设计LAMP引物，建立了一种特异、稳定、灵敏的JEV微流控芯片检测方法，方法操作简单、便携，可实现JEV临床样品快速、高效的即时检测。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于猪乙型脑炎病毒检测的特异性引物组，所述引物序列如SEQ ID NO：1～5所示。
上述特异性引物组的序列如下：
SEQ ID NO：1
F3:ATGAGCTTGTTGGACGGC；
SEQ ID NO：2
B3:TTTCTGCCCCGCTTGTTC；
SEQ ID NO：3
FIP:CTTGGTCGGGGCTAATGCTGTA-GAGGGCCAGTACGTTTYGTG；
SEQ ID NO：4
BIP:AGCRGTGGAAAAGAGTGTRGCA-ACGGCRTCAATGAGTGTTCC；
SEQ ID NO：5
LF:TTGAAGAACGTGATAAGAGCCAG。
本发明还提供一种用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物组。
优选的，所述特异性引物组包括外引物、内引物和环引物，其中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：8：4。
更优选的，上述引物的浓度均为50μM。
更优选的，所述试剂盒还包括恒温扩增预混液、阳性标准品。
更优选的，所述试剂盒还包括微流控芯片、逆转录酶溶液、RNase抑制剂。
作为一种优选的技术方案，本发明上述试剂盒包括：微流控芯片、特异性引物组、恒温扩增预混液、阳性标准品、逆转录酶溶液、RNase抑制剂。该试剂盒可以搭配市面上的恒温微流控芯片分析装置使用，其中微流控芯片需保存在-20℃。
优选的，上述试剂盒中，所述微流控芯片设有8个相互独立的检测模块，每一个检测模块包含有1个加样孔和1组反应池，每一个检测模块的1组反应池包括2个临床样品扩增池和2个阴性对照反应池，各引物组合物均经加热干燥包被固定在对应扩增池内。
具体的，上述引物包被在微流控芯片上的具体步骤为：将上述特异性引物组合内每一种引物分别与蔗糖混合，配制成相应的混合溶液，蔗糖和引物组在所述混合液中的终浓度分别为0.5％(质量百分比)和0.15μM；取1.5μL混合液点入微流控芯片相应的临床样品扩增池内，于60℃干燥台上干燥，压片封膜，冲压抽真空后，引物组的包被完成。
优选的，上述试剂盒中，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶、50μM荧光染料SYBR Green的LAMP反应液。
优选的，上述试剂盒中，所述逆转录酶溶液为5000U/mL的M-MLV，所述RNase抑制剂浓度为40U/μL，所述阳性标准品为TJEV-NS5-RNA。
具体的，上述阳性标准品的制备方法为：从JEV阳性病料抽提RNA，经逆转录成cDNA，再经PCR将JEV-NS5基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收后，经与pGEM-T easy载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，将pGEM-T-JEV质粒线性化后纯化，用体外转录试剂盒RibomaxTM Large Scale RNAProduction Systems(Promega)的说明书进行目的基因的转录，获得体外转录标准品TJEV-NS5-RNA待用。
具体的，上述试剂盒应用LAMP的反应体系为：恒温扩增反应液10μL，逆转录酶0.1μL和RNase抑制剂0.1μL，待检样品的核酸14.8μL。
利用恒温微流控芯片分析装置和上述试剂盒进行分析的过程为：反应程序为1600rpm瞬时离心10s以混匀反应液；再4600rpm离心30s使液体在离心力作用下流入扩增池内，在37℃下恒温反应20min。反应结束后，按照仪器程序显示顺序，温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。反应时间设定为60min。
本发明还提供利用上述试剂盒检测猪乙型脑炎病毒的过程，包括以下步骤：
S1、待测样本核酸抽提：采用磁珠法抽提核酸样品；
S2、LAMP反应：取恒温扩增反应液、逆转录酶溶液，RNase抑制剂与待检样品核酸混匀后，转移至包被引物组的微流控芯片的储液池，封膜，放入检测装置，液体在离心力作用下流入扩增池内，开始环介导等温扩增反应；
其中，LAMP的反应体系为：恒温扩增反应液10μL，逆转录酶0.1μL和RNase抑制剂0.1μL，待检样品的核酸14.8μL；
S3、结果判定：微流控芯片检测分析装置在LAMP反应时实时收集反应池中每个孔位的荧光信号，根据显示屏结果，产生典型“S”型荧光扩增曲线的扩增池为阳性扩增，反之则为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过设计并筛选特异性引物，得到一种用于猪乙型脑炎病毒的LAMP检测方法,通过结合微流控芯片技术，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的JEV核酸检测方法；本发明提供的微流控芯片检测方法特异性高，不与猪其他病原交叉反应，且最低检测限可达到101copies/μL。本发明提供的检测猪乙型脑炎病毒的微流控芯片试剂盒，芯片分析装置小巧便携，可以弥补针对JEV检测耗时、费力、高成本的缺陷，使得检测灵敏度和特异性提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期，满足现场检测的需求；本方法提供的快检技术可推广应用于猪乙型脑炎病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明使用的微流控芯片的结构示意图；其中标记为：反应检测区1；储液池2；扩增池3；毛细管微阀4；分配池5；
图2为本发明使用的微流控芯片包埋示意图；其中的附图标记为：样品检测孔A；阴性对照孔B；
图3为猪乙型脑炎病毒LAMP检测体系的特异性，所用核酸分别为猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒和非洲猪瘟病毒，阴性对照。
图4为猪乙型脑炎病毒LAMP检测体系灵敏性试验；
图5为猪乙型脑炎病毒LAMP检测体系的重复性和稳定性试验。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例描述了本发明所采用的微流控芯片。
如图1所示，本发明所采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，该芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为8×4，其包括8个反应检测区1，每一反应检测区1包括依次连通的储液池2、分配池5、毛细管微阀4、扩增池3，储液池2通过一弧形通道与分配池5连通，储液池2中设有进样孔，分配池5通过一弧形通道与废液池和排气孔相连通；每一反应检测区1均设有4个扩增池。
其中储液池2的主要功能为装载反应液；分配池5的主要作用为均匀分配反应液至扩增池3；扩增池3具体实现LAMP反应；毛细管微阀4主要利用毛细管对液体的阻滞作用，来控制微流控芯片中流体的运动。
实施例2
本实施例为本发明所采用的用于检测猪乙型脑炎病毒的LAMP引物组合物及阳性标准品制备。
其设计和合成的步骤如下：
首先从Genbank数据库中检索获得所有JEV的全长基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到JEV基因组相对保守的靶基因序列。根据所得靶序列，利用PrimerExplorer V5设计出上述LAMP引物，并进行合成；
再次是进行引物组合的筛选：将合成的引物溶解后进行引物筛选，最终得到用于微流控芯片所需的特异、灵敏的引物组合。引物分别为外引物F3/B3，内引物FIP/BIP，环引物LF，序列如SEQ ID NO：1～5所示。
上述特异性引物组的序列如下：
SEQ ID NO：1
F3:ATGAGCTTGTTGGACGGC；
SEQ ID NO：2
B3:TTTCTGCCCCGCTTGTTC；
SEQ ID NO：3
FIP:CTTGGTCGGGGCTAATGCTGTA-GAGGGCCAGTACGTTTYGTG；
SEQ ID NO：4
BIP:AGCRGTGGAAAAGAGTGTRGCA-ACGGCRTCAATGAGTGTTCC；
SEQ ID NO：5
LF:TTGAAGAACGTGATAAGAGCCAG。
利用筛选得到的外引物F3/B3，做PCR扩增，经胶回收、连接T载、转化、挑单克隆、摇菌、测序鉴定得到正确的转化子，体外逆转录得到猪乙型脑炎病毒LAMP方法阳性标准品质粒，质粒浓度为1×109copies/μL。
实施例3
本实施例为本发明所采用的用于检测猪乙型脑炎病毒的引物组合物及其试剂盒。
本发明所涉及的试剂盒，包括实施例1所述的微流控芯片，实施例2所述的猪乙型脑炎病毒引物组和猪乙型脑炎病毒LAMP方法阳性标准品，还包括恒温扩增预混液、逆转录酶溶液、RNase抑制剂。
对于猪乙型脑炎病毒的引物组，5种引物优选的的摩尔比为外引物F3/B3:内引物FIP/BIP:环引物LF为1：8：4。
对于恒温扩增预混液，为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶和50μM荧光染料SYBRGreen的反应液(由上海速创诊断产品有限公司提供)。
对于逆转录酶溶液，其溶剂为水，溶质及浓度为5000U/mL。
对于RNase抑制剂，其溶剂为水，溶质及浓度为40U/μL。
实施例4
本实施例为采用实施例3所述的试剂盒检测猪乙型脑炎病毒的使用方法。
核酸抽提：按照TIANGEN公司Magnetic Viral DNA/RNA Kit使用说明书进行。
引物组包被：如图2所示，将猪乙型脑炎病毒引物组分别与蔗糖混合，配制成相应的混合液，各引物组和蔗糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.15μM和1.0％(质量百分比)；取1.5μL混合溶液点入微流控芯片相应的扩增池，每一反应检测区设2个JEV检测池，2个阴性对照池，将微流控芯片于60℃干燥台干燥，压片封膜，冲压真空后，引物组被包被于各扩增池。
配制LAMP反应液：10μL恒温扩增预混液，0.1μL逆转录酶溶液，0.1μL RNase抑制剂，与14.8μL抽提的待检样品的核酸混合后，转移至包被引物组微流控芯片的进样池，进样池封膜，在所述恒温微流控芯片分析装置中(上海速创诊断产品有限公司，型号IGeneTechnoTM SC-MA2000)，1600rpm瞬时离心10s以混匀反应液；再4600rpm离心30s使液体在离心力作用下流入扩增池内，在37℃下恒温反应20min。反应结束后，按照仪器程序显示顺序，温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。反应时间设定为60min。
结果判读：微流控芯片检测分析装置在LAMP反应时实时收集反应池中每个孔位的荧光信号，根据显示屏结果，产生典型“S”型荧光扩增曲线的扩增池为阳性扩增，反之则为阴性。
实施例5
本实施例用于对微流控芯片结合LAMP检测猪乙型脑炎病毒方法的特异性试验。
本实施例的实验步骤如实施例4，待测样本包括猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒和阴性对照。检测结果如图3，建立的猪乙型脑炎病毒LAMP检测方法与其他猪病原不发生交叉反应，故具有良好的检测特异性。
实施例6
本实施例用于对微流控芯片结合LAMP检测猪乙型脑炎病毒方法的灵敏度试验。
本实施例的实验步骤如实施例4，将JEV阳性标准品10倍系列稀释作为模板进行微流控检测(l×106～l×100copies/μL)，共7个梯度，以确定它们的最低检出限。结果，以TJEV-NS5-RNA标准品为模板，微流控的最低检出限为1×101copies/μL(图4)。
实施例7
本实施例用于微流控芯片结合LAMP检测猪乙型脑炎病毒方法的重复性和稳定性试验。
本实施例的实验步骤如实施例4，将JEV阳性标准质粒10倍系列稀释作为模板进行检测(l×106copies/μL，l×104copies/μL，l×101copies/μL)，每个梯度重复8次，对3个梯度的阳性质粒进行重复性检验，结果如图5所示，且CV<5％，表明此方法重复性和稳定性良好。
以上实施例表明，本发明所述的微流控芯片结合LAMP技术用于猪乙型脑炎病毒检测的引物组合及试剂盒，可快速、准确地检测猪乙型脑炎病毒，以弥补针对上述病原检测技术存在的费时费力的缺陷，小巧可携带的仪器可有效降低检测成本和劳动强度，提高灵敏性和特异性，缩短检测周期。可视化的结果判定和简易的操作要求使得本发明适用于科学研究和生产实践中，并可广泛应用于现场即使检测。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒
<130> ZM201298ZL
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> virus
<400> 1
atgagcttgt tggacggc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> virus
<400> 2
tttctgcccc gcttgttc 18
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> virus
<400> 3
cttggtcggg gctaatgctg tagagggcca gtacgtttyg tg 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> virus
<400> 4
agcrgtggaa aagagtgtrg caacggcrtc aatgagtgtt cc 42
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> virus
<400> 5
ttgaagaacg tgataagagc cag 23

Claims (8)

1.一种用于猪乙型脑炎病毒检测的特异性引物组，其特征在于，所述引物序列如SEQID NO：1～5所示。
2.一种用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物组。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，特异性引物组包括外引物、内引物和环引物，其中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：8：4。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括恒温扩增预混液、阳性标准品。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微流控芯片、逆转录酶溶液、RNase抑制剂。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片设有8个相互独立的检测模块，每一个检测模块包含有1个加样孔和1组反应池，每一个检测模块的1组反应池包括2个临床样品扩增池和2个阴性对照反应池，各引物组合物均经加热干燥包被固定在对应扩增池内。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶、50μM荧光染料SYBR Green的LAMP反应液。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶溶液为5000U/mL的M-MLV，所述RNase抑制剂浓度为40U/μL，所述阳性标准品为TJEV-NS5-RNA。
CN202010935229.XA 2020-09-08 2020-09-08 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪乙型脑炎病毒检测的试剂盒 Withdrawn CN112195272A (zh)

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