CN102154514A - 甲型h1n1流感病毒一步实时荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针（FP）、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计引物：F：5'-ATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC-3'；R：5'-GATGCTGCCGTTACACCTTTGTC-3'；设计探针：FAM-AACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGT-BBQ。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定量分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应)试剂盒。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科，分节段单股负链RNA病毒。根据其核蛋白和基质蛋白抗原性不同，流感病毒主要分为A、B和C型或者为甲、乙和丙三种类型。其中A型流感病毒可以感染人类、禽类和其他一些哺乳动物，如猪等。而B型和C型流感病毒目前的证据显示主要是感染人类。据流行病学资料显示，目前引起人群流行性感冒流感的主要是A型和B型流感病毒。2009年4月在墨西哥暴发并导致全球广泛传播和数百人死亡的流感病毒被命名为甲型H1N1流感病毒，该病毒属于A型流感病毒的H1N1亚型，它是猪流感病毒，人流感病毒和禽流感病毒通过基因片段重组后产生的一种新型混合型病毒株。针对流感病毒建立快速高效的实验室检测技术，对于疑似病人的及时诊断和治疗以及卫生检疫部门和国家疾控部门开展有效的传染病监控和流行病学调查研究等都具有非常重要的意义。

2009年4月份，一种新的流感病毒——甲型H1N1流感病毒的毒株被鉴定。虽然做好了充分的防御准备，但是病毒还是继续传播着。随后2009年7月份，世界卫生组织宣布全世界进入防御流感病毒的紧急状态，预示着一种新型的全球流行病的大爆发。对比于季节性的流感病毒株，甲型H1N1流感病毒的传染性更高。在大多数病例中，病情状况是温和、低死亡率；尽管如此，担心仍然存在。由于北半球冬季流感疫情将要爆发第二次冲击，甲型H1N1流感病毒可能会获得更高的毒性。目前在感染的早期及时采用抗病毒类药物治疗流感患者效果显著、治愈率高，因此为了早诊断早治疗针对疑似患者的流感病毒实验室快速筛查技术显得非常重要且意义重大。实时荧光定量RT-PCR技术是一项快速、准确和特异的流感病毒核酸检测技术。实时荧光定量RT-PCR技术被证明能够胜任临床流感病毒的诊断，这种技术能代替传统的病毒培养和抗原检测等方法。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒(简称试剂盒)

本试剂盒是在对甲型H1N1流感病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量RT-PCR技术对甲型H1N1流感病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对流感病毒A型的检测。

本试剂盒包括甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；

①甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物(F和R)

依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计：

F：5’-ATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC-3’24bp

R：5’-GATGCTGCCGTTACACCTTTGTC-3’ 23bp；

②甲型H1N1流感病毒的一条特异性荧光探针(FP)

依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计：

FP：FAM-AACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGT-BBQ  29bp

荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BBQ；

③阳性对照

甲型H1N1流感病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、本试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取：

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液，滤柱仍放回收集管上，将步骤C剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤H一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

②一步实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。

A、一步实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

B、一步实时荧光定量PCR反应程序：

步骤d中60℃开始荧光检测

C、检测仪器：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。

D、结果判断：

在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，

a、当C_t≤35时，判断样品为H1N1阳性；

b、当35＜C_t≤40时，重复一次实验，如果C_t还是在此范围之内就判断样品为H1N1阳性；

c、当C_t＞40时，判断样品为H1N1阴性。

本发明具有下列优点和积极效果：

①检测时间周期短、检测效率高；

②检测病毒特异性高，准确率高；

③在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；

④检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；

⑤操作简单、易于推广；

⑥实验结果重复性好。

附图说明

图1是H1N1病毒标准品扩增曲线；

图2是H1N1病毒标准品浓度标准曲线；

图3是5例H1N1阳性标本扩增曲线；

图4是4例H1N1阳性标本扩增曲线。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例详细说明

一、实施例1

取已知道浓度的H1N1病毒标准品进行浓度梯度稀释，得到5×10⁶，5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10copies/μl这6个浓度梯度的标准品，各取200μl提取病毒核酸；同时检测疑似流感病毒感染患者咽拭子标本20份，各取标本液200μl进行病毒核酸提取。

1、试剂盒的组成：

一对特异性引物F/R、一条特异性荧光探针FP、流感病毒A(H1N1)型阳性对照、RNase Free H₂O阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer、Enzyme Mix。

2、流感病毒A(H1N1)型的特异性扩增基因序列设计的引物为：

依据流感病毒A(H1N1)型HA基因序列设计特异性引物：

F：5’-ATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC-3’24bp

R：5’-GATGCTGCCGTTACACCTTTGTC-3’ 23bp

依据流感病毒A(H1N1)型HA基因序列设计特异性探针：

FP：FAM-AACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGT-BBQ

3、一步5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

4、Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

5、病毒核酸的提取：

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

③将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min；重复步骤⑧一次；

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

6、一步实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。

a)一步实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

b)一步实时荧光定量PCR反应程序：

步骤④60℃开始荧光检测

c)检测：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。

d)检测结果：

图1是H1N1病毒标准品扩增曲线，图2是H1N1病毒标准品浓度标准曲线，20份疑似流感病毒感染患者咽拭子标本中检出流感病毒A(H1N1)型阳性5例，图3是这5例H1N1阳性标本的病毒扩增曲线，根据这5例阳性结果的C_t值结合扩增曲线，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这5例H1N1阳性标本的病毒浓度，具体结果见表1。

表1  5例H1N1阳性标本病毒浓度

二、实施例2

用上述方法对另外20份疑似流感病毒感染患者咽拭子标本进行检测，其中A型H1N1流感病毒阳性4例，病毒荧光定量PCR扩增曲线见图4，根据这4例阳性结果的C_t值结合扩增曲线，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这4例H1N1阳性标本的病毒浓度，具体结果见表2。

表2  4例H1N1阳性标本病毒浓度

序列表

<110> 武汉大学

<120> 甲型H1N1 流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

<140>

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 甲型H1N1 流感病毒上游引物

<400>

5'-ATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC-3'。      

                          

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213>甲型H1N1 流感病毒下游引物

<400>

5'-GATGCTGCCGTTACACCTTTGTC-3'。

                            

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 荧光探针序列

<400>

FAM-AACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGT-BBQ。

Claims (1)

1.一种甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：本试剂盒包括甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；

①甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物(F和R)

依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计：

F：5’-ATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC-3’  24bp

R：5’-GATGCTGCCGTTACACCTTTGTC-3’   23bp；

②甲型H1N1流感病毒的一条特异性荧光探针(FP)

依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计：

FP：FAM-AACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGT-BBQ  29bp

荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BBQ；

③阳性对照

甲型H1N1流感病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

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