CN107365684B - 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法 - Google Patents

一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107365684B
CN107365684B CN201710576618.6A CN201710576618A CN107365684B CN 107365684 B CN107365684 B CN 107365684B CN 201710576618 A CN201710576618 A CN 201710576618A CN 107365684 B CN107365684 B CN 107365684B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
paper
fluidic chip
sample
micro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710576618.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107365684A (zh
Inventor
叶辛
方雪恩
李新鑫
孔继烈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Fudan University
Original Assignee
Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd, Fudan University filed Critical Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Priority to CN201710576618.6A priority Critical patent/CN107365684B/zh
Publication of CN107365684A publication Critical patent/CN107365684A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107365684B publication Critical patent/CN107365684B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种纸微流控芯片，该纸微流控芯片可以实现将核酸的提取纯化、等温扩增和结果判读整合为一体，其检测全程时间仅需要30分钟，并且不需要泵，离心机或热循环仪等设备，结果以肉眼判读的方式实现。利用该纸微流控芯片检测A群轮状病毒感染标本的最低检测限为103copies/ml，利用48例临床标本验证其灵敏度和特异性达到了100％。本发明所述的微流控芯片具有便捷高效，低成本，检测性能良好等优点，其提取和纯化核酸仅需要5分钟，其可替代传统的核酸提取方法(如磁珠法，核酸提取需1小时)，有效缩短检测时间，本发明所述的纸微流控芯片可以在中心实验室或者床旁进行，可成为检测相关病原体(如A群轮状病毒)的有力工具。

Description

一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法；更具体的说，本发明涉及将该纸微流控芯片应用于A群轮状病毒的快速检测。
背景技术
儿童感染性腹泻是一类临床多发病和常见病，严重威胁着儿童的生命健康，常年居于造成儿童病死率的前三位，且在发展中国家该疾病的情况更为严重。造成儿童感染性腹泻的病原体类型十分繁多，其中A群轮状病毒是最常见的病原体，目前用于检测A群轮状病毒的方法主要包括免疫学方法及PCR的方法，这些方法常常需要繁琐的操作程序、较为昂贵的仪器设备以及专业的技术人员，且此类方法易出现假阳性或假阴性结果。
核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于疾病的诊断。然而核酸检测的第一步提取核酸仍然需要很长的时间及繁琐的步骤，现有的方法比如TRIZOL法，磁珠法，离心柱法等都需要近1小时才能完成核酸的提取及纯化，提取纯化后的核酸用于下游的扩增检测，这极大的限制了该方法在床旁快速诊断中的应用。
纸微流控芯片作为一种最新发展的技术手段，为疾病的快速诊断提供了一种新的工具。纸微流控芯片具有化学惰性，生物相容性及固有的毛细管拉力等优点，能够在一块简单的纸片上完成多种检测项目。
因此，开发一种简便、成本低廉、操作方便、检测性能指标好、适用于床旁检测的试剂及设备具有重要的临床意义，且对于在偏远地区实现疾病的早期快速诊断具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种纸微流控芯片芯片及其试剂盒，并提供基于该纸微流控芯片的核酸提取方法及等温扩增方法，可以在30分钟内完成核酸检测的全过程，且经临床标本验证其具有良好的特异性和敏感度，是一种简便、低成本、快速准确的核酸检测工具及方法，其可适用于多种类型的病原体的检测，较为适用的是A群轮状病毒的检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是一种纸微流控芯片，该纸微流控芯片为玻璃纤维纸片，所述玻璃纤维纸片的中间位置为加样区；其中，所述加样区的直径与玻璃纤维纸片的直径的比值为1:9～1:4。
优选地，所述玻璃纤维纸片SiO2的含量为100wt％。
优选地，所述加样区的直径为3.5～10mm，所述玻璃纤维纸片的直径为30～40mm；更优选地，所述加样区的直径为5mm，所述玻璃纤维纸片的直径为35mm。
优选地，上述纸微流控芯片的制作方法如下：利用切割机切割预定直径的圆形玻璃纤维纸片，中央画出预定直径的的加样区。
本发明的第二个目的是提供一种基于上述纸微流控芯片的用于非诊断和治疗目的的核酸提取方法，其包括如下步骤：
步骤1)吸附：将样本与样本裂解液混合后，直接滴加在纸微流控芯片的加样区；
步骤2)洗脱：采用洗涤液清洗加样区，进行核酸的提取和纯化。
优选地，所述步骤1)中的样本裂解液为盐酸胍-尿素裂解液，其中盐酸胍的浓度为3～4M，尿素裂解液的浓度为4～6M；所述步骤2)中的洗涤液为75％～85％无水乙醇。
优选地，所述吸附和洗脱可以采用单区域形式，即加样区和洗涤区为同一个区域，也可以采用双区域形式，即加样区和洗涤区为不同区域。
优选地，所述样本包括粪便、尿液、肛拭子、咽试纸、血液、血清、血浆、分泌物。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述纸微流控芯片的试剂盒。
优选地，该试剂盒还包括用于检测A群轮状病毒的引物组合物：如SEQ ID NO：1所示的F3引物、如SEQ ID NO：2所示的B3引物、如SEQ ID NO：3所示的FIP引物以及如SEQ IDNO：4所示的BIP引物。
进一步地，所述引物组合物用于扩增如SEQ ID NO：5所示的的A群轮状病毒NSP5基因序列。
优选地，该试剂盒还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、荧光染料、指示剂。
进一步地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20。
进一步地，所述荧光染料包括SYBR Green、Ever Green、Pico Green、SYTO系列。
进一步地，所述指示剂包括HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝。
更进一步地，所述荧光染料为SYBR green，所述指示剂为中性红染料。
上述引物及靶序列的碱基序列如表1所示。
表1A群轮状病毒NSP5基因及其引物序列
本发明的第四个目的是提供一种基于上述纸微流控芯片的用于非诊断和治疗目的等温扩增检测方法，其包括如下步骤：
步骤一、采用纸微流控芯片进行待测样本的核酸提取；
步骤二、配制LAMP反应体系，将步骤一提取的核酸模板加入LAMP反应体系，进行恒温扩增反应；
步骤三、结果判读：直接肉眼判读和/或利用核酸扩增曲线进行判读。
为了进一步优化上述等温扩增检测方法，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述步骤一的具体操作步骤如下：
步骤a)吸附：将样本与样本裂解液混合后，直接滴加在纸微流控芯片的加样区；
步骤b)洗脱：采用洗涤液清洗加样区，进行核酸的提取和纯化。
进一步地，所述步骤a)中的样本裂解液为盐酸胍-尿素裂解液，其中盐酸胍的浓度为3～4M，尿素裂解液的浓度为4～6M；所述步骤b)中的洗涤液为75％～85％无水乙醇。
进一步地，所述吸附和洗脱可以采用单区域形式，即加样区和洗涤区为同一个区域，也可以采用双区域形式，即加样区和洗涤区为不同区域。
进一步地，所述样本包括粪便、尿液、肛拭子、咽试纸、血液、血清、血浆、分泌物。
优选地，所述步骤二中的LAMP反应体系包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、荧光染料、指示剂和SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的引物。
进一步地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20。
更进一步地，所述LAMP反应体系中各成分的浓度如下：20mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，8mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.2μΜF3/B3引物，1.6μΜFIP/BIP引物，16U Bst DNA聚合酶，10U反转录酶，dNTPs(each 1.4mM)，1×SYBR green，0.1mM中性红染料。
优选地，所述步骤二中的恒温扩增反应的条件为：60～70℃，25～60mins。
优选地，所述步骤二中的核酸模板为从纸微流控芯片的加样区的中心处切割的圆片。
优选地，所述圆片的直径为1.5～4mm，更优选为2mm。
应当理解的是，在满足扩增反应的条件下，上述反应体系中采用的所有试剂的浓度及其用量均可进行适当的调整。可预知的是，上述反应体系中，可根据检测病原体的类型进行重新设计引物组，即可更换反应体系中的引物，病原体的种类包括病原体细菌、病毒、立克次氏体、真菌、寄生虫、微生物重组体等，在本发明的一实施例中，该病原体为A群轮状病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所采用的纸微流控芯片能够在5mins内实现临床标本中核酸的提取和纯化，然后将核酸模板进行25mins的等温扩增反应，最后可用肉眼直接进行结果的判断，全程不需要泵，离心机，热循环仪等设备，操作简单快捷，可以在中心实验室或者床旁进行，具有良好的检测性能，是病原体检测的有力工具，具体可为检测A群轮状病毒的有力工具。
附图说明
图1是纸微流控芯片的设计与操作流程图；
图2是基于纸微流控芯片的等温扩增检测方法的最低检测限验证。
图3是基于磁珠法核酸提取后LAMP扩增的最低检测限验证。
图4是核酸扩增曲线的结果示意图；
图5是在48例临床标本中基于纸微流控芯片的检测方法的特异性和敏感性验证。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例一
本实施例为本发明设计的纸微流控芯片。
纸微流控芯片的构造：利用切割机切割直径为35mm的圆形玻璃纤维纸片，中央画出直径为5mm的圆形加样区，玻璃纤维纸片的主要材料为SiO2，优选100wt％的SiO2。
上述纸微流控芯片可用于核酸的提取与纯化，如图1所示，将5-10μL临床样本与50μL样本裂解液混合后，直接滴加在加样区，然后用250μL洗涤液清洗加样区就可以在该纸芯片上实现核酸的提取和纯化，整个提取纯化过程可以在5mins内完成。上述的样本裂解液为盐酸胍-尿素裂解液，其中盐酸胍浓度为3～4M，尿素裂解液浓度为4～6M，上述的洗涤液为75％～85％无水乙醇。样本裂解后释放出核酸，可以被玻璃纤维纸片内部的细小纤维物理拦截，另外由于核酸带负电，还可以通过静电吸附在纸芯片上。这样可以实现核酸的提取，后续应用洗涤液加在加样区，由于纸芯片固有的毛细管拉力，一些后续扩增的抑制剂如蛋白质，粪胆原等会随着洗液从中心加样区向四周扩散，使中心加样区结合的核酸得到纯化的效果。
上述纸微流控芯片可应用于试剂盒中进行病原体的检测，例如A群轮状病毒，该试剂盒还包括用于检测A群轮状病毒的引物组合物：如SEQ ID NO：1所示的F3引物、如SEQ IDNO：2所示的B3引物、如SEQ ID NO：3所示的FIP引物以及如SEQ ID NO：4所示的BIP引物，以及恒温扩增反应体系(反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、荧光染料、指示剂)。
实施例二
本实施例为基于实施例一所述的纸微流控芯片的等温扩增检测方法，包括最低检测限验证以及特异性和敏感性验证，其用于检测A群轮状病毒。
A群轮状病毒LAMP体系的建立及扩增反应步骤包括：
(1)核酸的提取与纯化，其具体步骤参见实施例一；
(2)靶序列及引物的设计；
首先通过序列比对软件得到A群轮状病毒的保守区域，根据该保守序列在线设计LAMP引物(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)。靶序列为A群轮状病毒NSP5基因序列，其序列长度为220bp，其碱基序列如表1中的SEQ ID NO：1所示。LAMP特异性引物为F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物，各引物的碱基序列分别如表1中的SEQ ID NO：1～SEQID NO：4所示。
(3)LAMP扩增体系的建立；扩增体系为50μL，其中各成分浓度为：20mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，8mM MgSO4,0.1％Tween-20，0.2μΜF3/B3，1.6μΜFIP/BIP，16U Bst DNA聚合酶，10U反转录酶，dNTPs(each 1.4mM)，1×SYBR green，0.1mM中性红染料。(步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)顺序可互换)
(4)核酸模板的加入及LAMP恒温扩增反应：如图1所示，直接切割下第一步纸芯片的中心加样区2mm直径的圆片，放入配置好的LAMP反应体系即可进行恒温扩增反应，LAMP反应条件为：60～70℃，25～60mins。。
(5)结果判读方法：反应结束后，若反应液的颜色呈玫红色则表示阳性，若反应液的颜色呈棕色则表示阴性；也可采用相关仪器进行检测，利用核酸扩增曲线进行判读。
最低检测限验证：如图2所示，本实施例利用一个标准阳性样本，病毒浓度为107copies/mL，经过10倍梯度稀释，利用上述构建的纸微流控芯片的检测方法，验证了该方法的最低检测限为103copies/mL；如图3所示，采用了一种商业化的基于磁珠法的核酸提取试剂盒，提取上述梯度稀释后的标本，用同样的LAMP体系进行扩增，其最低检测限同样为103copies/mL，由上述结果说明，本发明所述的基于纸微流控芯片的等温扩增方法与传统方法具有相同的最低检测限，但是传统的磁珠法需要近1小时提取核酸，而本发明中提取核酸仅需要5分钟。
特异性和敏感性验证：在48例临床样本中验证了该纸微流控芯片的灵敏度和特异性，48例临床标本包括24例A群轮状病毒感染标本，8例诺如病毒感染标本，8例星状病毒感染标本及8例腺病毒感染标本。结果如图5所示，A群轮状病毒感染标本的反应液的颜色呈玫红色，判定为阳性结果；诺如病毒感染标本、星状病毒感染标本、腺病毒感染标本的反应液的颜色均呈棕色，判定为阴性。上述结果表明该纸微流控芯片一体化核酸提取扩增的方法在检测这48例临床标本中具有100％的特异性和敏感度，此也再次说明本发明所述的纸微流控芯片在诊断A群轮状病毒感染方面具有很高的可靠性。
利用核酸扩增曲线进行结果判读：对A群轮状病毒感染标本、诺如病毒感染标本、星状病毒感染标本、腺病毒感染标本以及超纯水阴性对照进行检测。结果如图4所示，A群轮状病毒感染标本均出现S型曲线，判定为阳性结果；诺如病毒感染标本、星状病毒感染标本、腺病毒感染标本以及超纯水阴性对照均没有出现S型曲线，判定为阴性结果。其结果与上述采用指示剂在反应液中的颜色变化而进行直接肉眼判读的结果一致。
由上述实施例可知，该发明能够在5mins内实现在临床标本中提取并纯化核酸，然后进行25mins的等温扩增，最后用肉眼判断结果，全程不需要泵，离心机，热循环仪等设备，操作简单快捷，可以在中心实验室或者床旁进行，具有良好的检测性能，是检测A群轮状病毒的有力工具。虽然本实施例采用的引物为检测A群轮状病毒的引物，但可理解的是，可通过针对不同病原体的靶序列而设计不同的引物，即本发明也可用于其他病原体的检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学；上海速创诊断产品有限有限公司
<120> 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3引物
<400> 1
agtcttccct caatttcttc t 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B3引物
<400> 2
gaaaagctgg tgagtgga 18
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP引物
<400> 3
ggtgaaatgt actgttcact cctactcgtc ttctacaacg tcaac 45
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP引物
<400> 4
gatgcagagg cattcaataa gtacagcaga atcagatggt ccaa 44
<210> 5
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 靶序列：A群轮状病毒NSP5基因序列
<400> 5
aagcgctaca gtgatgtctc tcagcattga cgtaacaagt cttccctcaa tttcttctag 60
tatctttaaa aatgaatcgt cttctacaac gtcaactctt tctggaaaat ctattggtag 120
gagtgaacag tacatttcac cagatgcaga agcattcaat aaatacatgt tgtcgaagtc 180
tccagaggat attggaccat ctgattctgc ttcaaacgat 220

Claims (3)

1.一种纸微流控芯片在用于检测A群轮状病毒的一体化核酸提取和扩增中的应用，其特征在于，所述纸微流控芯片为玻璃纤维纸片，所述玻璃纤维纸片的中间位置为加样区；其中，所述加样区的直径与玻璃纤维纸片的直径的比值为1:9～1:4；
其中，用于检测A群轮状病毒所采用的等温扩增方法包括如下步骤：
步骤一、采用纸微流控芯片进行待测样本的核酸提取；
步骤二、配制含有SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的引物组合物的LAMP反应体系，将步骤一提取的核酸模板加入LAMP反应体系，进行恒温扩增反应；
步骤三、结果判读：直接肉眼判读和/或利用核酸扩增曲线进行判读；
其中，所述步骤一的具体操作步骤如下：
步骤a)吸附：将样本与样本裂解液混合后，直接滴加在纸微流控芯片的加样区；
步骤b)洗脱：采用洗涤液清洗加样区，进行核酸的提取和纯化；
其中，所述步骤a)中的样本裂解液为盐酸胍-尿素裂解液，其中盐酸胍的浓度为3～4M，尿素裂解液的浓度为4～6M；所述步骤b)中的洗涤液为75％～85％无水乙醇；
其中，所述步骤二中的核酸模板为从纸微流控芯片的加样区的中心处切割的圆片。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玻璃纤维纸片中SiO2的含量为100wt％。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤二中的LAMP反应体系还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、荧光染料、指示剂。
CN201710576618.6A 2017-07-14 2017-07-14 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法 Active CN107365684B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710576618.6A CN107365684B (zh) 2017-07-14 2017-07-14 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710576618.6A CN107365684B (zh) 2017-07-14 2017-07-14 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107365684A CN107365684A (zh) 2017-11-21
CN107365684B true CN107365684B (zh) 2019-03-01

Family

ID=60308307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710576618.6A Active CN107365684B (zh) 2017-07-14 2017-07-14 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107365684B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108929897A (zh) * 2018-07-06 2018-12-04 上海速创诊断产品有限公司 一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法
CN111575354A (zh) * 2020-05-25 2020-08-25 广州新诚生物科技有限公司 一种核酸检测设备及其使用方法
CN111879922A (zh) * 2020-07-13 2020-11-03 东南大学 适用于核酸及免疫同步检测集成纸基芯片结构及制造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671746A (zh) * 2009-10-21 2010-03-17 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
CN106222300A (zh) * 2016-08-04 2016-12-14 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种精确定量检测a群轮状病毒的试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671746A (zh) * 2009-10-21 2010-03-17 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
CN106222300A (zh) * 2016-08-04 2016-12-14 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种精确定量检测a群轮状病毒的试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一种通用的基于NSP5基因的Ａ组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立;曾渊君等;《病毒学报》;20170331;第33卷(第2期);讨论，摘要

Also Published As

Publication number Publication date
CN107365684A (zh) 2017-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ye et al. Equipment-free nucleic acid extraction and amplification on a simple paper disc for point-of-care diagnosis of rotavirus A
JP5420256B2 (ja) 精製方法及びキット
Ji et al. Automated multiplex nucleic acid tests for rapid detection of SARS-CoV-2, influenza A and B infection with direct reverse-transcription quantitative PCR (dirRT-qPCR) assay in a centrifugal microfluidic platform
CN107365684B (zh) 一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法
CN101886138A (zh) 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒
CN102409079A (zh) 一种新型传染病核酸快速检测试剂盒及其检测方法
CN110453011A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用
CN107513575B (zh) 一种检测布鲁菌感染的预处理试剂盒及其应用
KR102245849B1 (ko) 코로나바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출용 키트
CN106868220A (zh) 一种用于扩增MERS‑CoV的LAMP引物组及试剂盒
CN104846122A (zh) 肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法)
CN102337351A (zh) 一种流感病毒分型检测试剂盒
CN101712973A (zh) 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法
CN110283935A (zh) 一种非洲猪瘟病毒lamp检测试剂盒及其应用
Zhang et al. An isothermal molecular point of care testing for African swine fever virus using recombinase-aided amplification and lateral flow assay without the need to extract nucleic acids in blood
CN102952896B (zh) 一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用
CN103937884A (zh) 一种用于结核分枝杆菌检测的环介导等温扩增试剂盒及其使用方法
Amiri et al. Accurate and rapid detection of Fasciola hepatica copro‐DNA in sheep using loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) technique
Quyen et al. Elimination of carryover contamination in real-time reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of the SARS-CoV-2 virus in point-of-care testing
Sun et al. Rapid and sensitive detection of hepatitis C virus in clinical blood samples using reverse transcriptase polymerase spiral reaction
CN109486973A (zh) 一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法
CN111719018B (zh) 新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片及制备和使用方法
CN105463131A (zh) 人博卡病毒lamp检测试剂盒
CN102146467A (zh) 检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及荧光定量pcr检测鼠疫耶尔森氏菌的方法
CN104278024B (zh) 用于鉴定人类腺病毒55型的引物组合物以及它们的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant