CN101665842A - 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法 - Google Patents

荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101665842A
CN101665842A CN200910089668A CN200910089668A CN101665842A CN 101665842 A CN101665842 A CN 101665842A CN 200910089668 A CN200910089668 A CN 200910089668A CN 200910089668 A CN200910089668 A CN 200910089668A CN 101665842 A CN101665842 A CN 101665842A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
influenza
probe
novel
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200910089668A
Other languages
English (en)
Inventor
姚李四
胡孔新
燕清丽
孙肖红
杨鹏飞
王静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Original Assignee
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ filed Critical Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority to CN200910089668A priority Critical patent/CN101665842A/zh
Publication of CN101665842A publication Critical patent/CN101665842A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Abstract

本发明公开了一种检测新型甲型流感病毒荧光定量PCR试剂盒，由引物和探针、Taqman 2×Universal PCR Master Mix、40×Multi ScribeTM and RNase Inhibitor Mix、无核酸酶水组成，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应，而且成本也大大降低。

Description

荧光定量PCR检测新型甲型H1N1病毒试剂盒及检测方法
技术领域
本发明提供一种对流行的甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法及检测引物和特异性探针。
背景技术
自09年4月以来，包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了人感染甲型H1N1流感病毒疫情，这是一种新的甲型流感病毒。随着感染甲型H1N1流感的人群不断的增加，疫情愈来愈严重，WHO已于6月11日将流感大流行警戒级别提升到6级，世界处在09年流感大流行的开端。甲型H1N1流感病毒属正黏液病毒科甲型流感病毒属的单股RNA病毒。根据其外部糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(nneuraminidase，NA)的不同抗原特性可将甲型流感病毒分为多个亚型。HA和NA具有高度变异性，但对于该流感病毒其它片段相比又极其保守。因此，HA、NA基因片段成为检测流感病毒的重要考察对象。
面对这突如其来的流感病毒，如何快速准确的检测已成为世界各国疾病预防控制中心最关心的问题。实时荧光定量法显然已经成为各国公认的检测标准。实时荧光定量RT-PCR(r RT-PCR)法检测新型甲型H1N1的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的
Figure G2009100896687D00011
探针，对呼吸道样本或体外培养的甲流感病毒进行定量检测鉴定。
WHO较早公布了用实时定量RT-PCR来检测甲流感的操作步骤。其中，InfA引物和探针组是通用于检测A型流感病毒，swInfA引物和探针组是特异检测所有甲流感A病毒，swH1引物和探针组是特异检测猪H1流感病毒。但是，当时NCBI公布的相关序列有限，WHO所公布的引物和探针对此次暴发的甲型H1N1流感病毒的检测特异性、灵敏度有限。
本发明就是针对于目前设计并公布的引物及探针存在的灵敏度检测相对较低，检测费用较高进行改进。
发明内容
本发明提供一种对甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法，本发明的方法包括利用一对新的引物和探针对病毒样本进行实时荧光定量监测。
本发明的检测方法检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应。本发明还在于设计且提供一对新的引物和探针，由此降低检测成本，实现了快速准确检测H1N1流感病毒。
本发明提供一种获得检测甲型H1N1流感病毒的引物和探针的方法，该方法包括：(1)筛选新型甲型H1N1流感HA全长序列，进行同源性比对，在其保守区只针对本次新型甲型流感设计引物；(2)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并提交GENEBANK检测探针的特异性；(3)对待检测物进行实时定量分析。
在本发明上述方法中，所筛选的新型甲型H1N1流感可以是NCBI公布的所有新型的甲型H1N1流感HA全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。比对结果见图1。图中阴影部分为HA基因序列高保守区。
在本发明引物和探针设计中，首先在比对的序列保守区设计上下游引物，根据引物设计原理，在保守区617bp-760bp之间设计上游和下游引物。引物和探针在合成时探针5′端连接FAM荧光基团和3′端连接BHQ非荧光基团。引物的特异性增强。序列见表1。
表1引物和探针序列
Figure G2009100896687D00021
表2为利用Beacon Designer 7.5软件分析设计的引物和探针的参数。
表2引物和探针信息
Figure G2009100896687D00022
Figure G2009100896687D00031
本发明提供一种检测新型甲流感的实时荧光定量PCR方法，该方法包括以下步骤：
(1)核酸提取
病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906病毒RNA提取试剂盒。
(2)RT-PCR扩增
选用的扩增试剂盒为ABI公司
Figure G2009100896687D00032
One-Step RT-PCR MasterMix Reagents。
反应体系组分及其体积见表3。
表3
Figure G2009100896687D00033
扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。
例如
48℃    30分钟
95℃    10分钟
Figure G2009100896687D00041
本发明所述的方法中，探针与荧光基团相连，所述荧光基团为FAM-BHQ，其它荧光基团也同样适用，比如，FAM-TAMARA等。
所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。
附图说明
图1为利用DNASTAR软件分析HA全长基因同源性区域。
图2和图3为YHANEW引物和WHO-SWH1引物灵敏度比较的检测结果。选用HA全长基因片段作为标准品。标准品各个浓度梯度扩增后荧光强度随反应循环数变化的曲线。其中，图2为SWH1引物扩增曲线，图3为YHANEW引物扩增曲线，图中横坐标为循环次数，纵坐标代表相应的校正后报告荧光强度(Rn)。
图4表示用本发明建立的方法对普通季节性流感H1N1、猪流感H1N1、禽流感H5N1、H9N2进行非特异性检测的结果。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。
图5表示用本发明建立的方法对可疑发热病人的咽拭子进行检测。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。
具体实施方式
实施例1：引物灵敏度检测
1)选择已知样本HA基因全长做为标准品，将其病毒RNA浓度从10-1依次稀释到10-10；
2)阴性对照：无核酸酶水；
3)反应体系按照表3进行配制。
检测结果如图2、3所示。
图2中1-6曲线分别为标准品浓度稀释度为10-4-10-10用引物WHO-SWH1扩增的曲线。图3中1-6曲线依次为标准品浓度稀释度为10-4-10-10用引物YHANEW扩增的曲线。我们从图2和图3中可以看出，YHANEW引物扩增出结果的曲线出线早于WHO-SWH1引物扩增出结果的曲线。
表4SWH1、YHANEW引物灵敏度检测结果
Figure G2009100896687D00051
表4数据表示，本发明中YHANEW引物和探针与WHO公布的SWH1引物和探针分别扩增HA基因片段病毒RNA的不同浓度梯度下的扩增CT值。CT值反应了每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。我们从数据中可以看到，引物WHO-SWH1扩增10-9CT值为37.84，而有效CT值为15≤Ct(阈值)≤36，在此我们可以判断其CT值为“-”。从而，我们得出结论：引物YHANEW相较于WHO-SWH1灵敏度要稍高些。
实施例2：引物非特性检测
1)对普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2，进行非特异性检测；
2)阳性对照：病毒HA片段RNA；
3)阴性对照：无核酸酶水；
4)反应体系按照表2进行配制。
检测结果见图4及表5。
图4结果显示，只有编号为1的阳性对照HA出现了扩增曲线。其余样品曲线均在基线以下，无扩增反应。
表5人、禽、猪流感病毒检测结果
Figure G2009100896687D00061
表5数据显示了该引物对普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2基因扩增CT值为“-”。表明该引物对其病毒RNA无扩增反应。
实施例3：对病人咽拭子检测
1)对采集的可疑病例咽拭子进行检测，筛选新型甲型H1N1流感病毒；
2)阳性对照：病毒HA片段RNA；
3)阴性对照：无核酸酶水；
4)反应体系按照表3进行配制。
检测结果见图5及表6。
图5中只出现了一条扩增曲线为阳性对照，其余样本均无扩增。反应结果为阴性。
表6咽拭子检测结果
表6中的数据结果显示，检测病人咽拭子结果均为阴性。
结果分析：
扩增反应完成40个循环之后，引物灵敏度检测到病毒RNA浓度稀释度为10-8；与普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2无交叉反应；从采集的病人咽拭子检测到6株均为阴性。
结果判断：
当待检测样本的15≤Ct(阈值)≤36时即判为阳性。

Claims (7)

1、一种甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法，该方法包括使用一对引物和探针对病毒样本进行实时定量监测，引物和探针序列如下：
Figure A2009100896680002C1
2.权利要求1所述的检测方法，其中，所述方法所检测的样本包括人血液、痰、鼻咽、口咽洗液或拭子；支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物。
3权利要求1所述的检测方法，其中，所述探针连接的荧光基团为FAM-BHQ，FAM-TAMARA等。
4.权利要求1所述的检测方法，其中，该方法包括步骤：
1)待检测样本核酸的提取；
2)RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系。
5.权利要求4中所述的检测方法，其中，所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。
6、一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中包括引物或者其他能与新型甲型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过10％，引物序列如下：
Figure A2009100896680002C2
7、一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中包括引物及能与H1N1流感HA全长序列特异性探针，探针序列如下：
Figure A2009100896680002C3
能与新型甲型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。
8、一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中包括引物：
Figure A2009100896680003C1
能与新型甲型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。
CN200910089668A 2009-07-28 2009-07-28 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法 Pending CN101665842A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910089668A CN101665842A (zh) 2009-07-28 2009-07-28 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910089668A CN101665842A (zh) 2009-07-28 2009-07-28 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101665842A true CN101665842A (zh) 2010-03-10

Family

ID=41802618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910089668A Pending CN101665842A (zh) 2009-07-28 2009-07-28 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101665842A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101864497A (zh) * 2010-04-13 2010-10-20 上海国际旅行卫生保健中心 一种人季节性流感h1n1的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法
CN101948934A (zh) * 2010-09-13 2011-01-19 中国医学科学院医学实验动物研究所 季节性流感病毒h1n1实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN102154514A (zh) * 2011-03-18 2011-08-17 武汉大学 甲型h1n1流感病毒一步实时荧光定量rt-pcr试剂盒
CN102296127A (zh) * 2011-08-26 2011-12-28 中国检验检疫科学研究院 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及非诊断检测方法
CN102621320A (zh) * 2012-03-20 2012-08-01 中国检验检疫科学研究院 一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法
CN111004869A (zh) * 2020-02-08 2020-04-14 吉林大学 一种用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101864497A (zh) * 2010-04-13 2010-10-20 上海国际旅行卫生保健中心 一种人季节性流感h1n1的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法
CN101864497B (zh) * 2010-04-13 2012-10-03 上海国际旅行卫生保健中心 一种人季节性流感h1n1的恒温扩增检测试剂盒
CN101948934A (zh) * 2010-09-13 2011-01-19 中国医学科学院医学实验动物研究所 季节性流感病毒h1n1实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN101948934B (zh) * 2010-09-13 2015-12-09 中国医学科学院医学实验动物研究所 基于染料法的季节性流感病毒h1n1实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN102154514A (zh) * 2011-03-18 2011-08-17 武汉大学 甲型h1n1流感病毒一步实时荧光定量rt-pcr试剂盒
CN102296127A (zh) * 2011-08-26 2011-12-28 中国检验检疫科学研究院 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及非诊断检测方法
CN102621320A (zh) * 2012-03-20 2012-08-01 中国检验检疫科学研究院 一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法
CN102621320B (zh) * 2012-03-20 2014-07-02 中国检验检疫科学研究院 一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法
CN111004869A (zh) * 2020-02-08 2020-04-14 吉林大学 一种用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法
CN111004869B (zh) * 2020-02-08 2023-05-23 吉林大学 用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量pcr引物和参考标准品

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 using reverse transcription RT-LAMP method
Zheng et al. Reverse transcription recombinase-aided amplification assay with lateral flow dipstick assay for rapid detection of 2019 novel coronavirus
CN100494402C (zh) 一种用于检测禽流感病毒h5n1亚型的液相芯片
CN101665842A (zh) 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法
CN103642945B (zh) 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒
CN103320544B (zh) 用于以rt-lamp法检测h7n9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法
CN102605106B (zh) 蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒的三重荧光pcr检测方法及试剂盒和引物、探针
CN101845517B (zh) 一种恒温快速检测甲型h1n1流感病毒核酸的方法及试剂盒
CN101360825A (zh) 甲型流感病毒的检测方法和用于检测甲型流感病毒的试剂盒
KR101209312B1 (ko) 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｂｖ 검출 방법
CN101649356B (zh) 甲型h1n1流感病毒荧光定量检测试剂盒及检测方法
CN105441586A (zh) 一种a型h5n6亚型禽流感病毒双通道实时荧光pcr检测试剂盒和检测方法
CN103614489A (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN106086236A (zh) 同时检测流感病毒h1、h3、h5、h7的试剂盒及方法
CN103255232B (zh) 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN103276109A (zh) 禽流感h7n9病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN101805802B (zh) 荧光定量pcr检测马秋波病毒的方法
Peng et al. Identification of serum MicroRNAs as diagnostic biomarkers for influenza H7N9 infection
CN103103287B (zh) 基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量rt-pcr检测试剂
Miao et al. Rapid detection of Nipah virus using the one-pot RPA-CRISPR/Cas13a assay
CN102071263B (zh) 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒
Deng et al. The use of pyrosequencer-generated sequence-signatures to identify the influenza B-lineage and the subclade of the B/Yamataga-lineage viruses from currently circulating human influenza B viruses
CN102230023B (zh) 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用
CN102912035B (zh) 一种通用型检测汉坦病毒实时荧光rt-pcr的非诊断性方法
CN103602756A (zh) 一种新城疫病毒的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20100310