CN102621320A - 一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法 - Google Patents
一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，用鼠单抗包被ELISA，用特异性兔多抗形成抗体抗原抗体复合物，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔形成检测抗体，通过采用双抗体ELISA法来进行检测人禽流感病毒。本发明用于快速检测禽流感病毒的双抗体夹心法，能够进行快速、有效的筛查诊断，有使用方便、检测准确的优点，适合在传染病防控领域推广应用，如用于入境人员筛查等。
Description
技术领域
本发明具体涉及人禽流感病毒酶联免疫吸附(ELISA)检测方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术
自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。其后，该病一直在亚洲区零星爆发，但在2003年12月开始，禽流感在东亚多国-主要在越南、韩国、泰国-严重爆发，并造成越南多名病人丧生。直到2005年中，疫症不但未有平息的迹象，而且还不断扩散。现时远至东欧多个国家亦有案例。
禽流感是由禽流感病毒引起的烈性人畜共患病。波及范围之广，危害程度之深引起了科学家的极大关注，各国投入大量的人力和财力对禽流感进行深入研究，但目前为止还不能完全控制和消除危害，因此对禽流感的检测预防显得非常关键。目前禽流感检测技术主要有分子生物学技术和血清学诊断技术，分子生物学检测方法需要专业理论知识和配套的昂贵实验仪器，不便于基层对禽流感病毒进行快速简便的检测。而ELISA方法具有灵敏度高、可标准化操作和结果易于分析等特点，能够帮助人们有效的检测和防控禽流感疫情，是世界卫生组织推荐的检测禽流感病毒的主要方法之一。
发明内容
针对现有情况存在的问题，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性好的用于快速检测禽流感病毒的双抗体夹心法。
为实现上述目的，本发明一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，该方法具体为：
1)人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因；
2)设计扩增表达人禽流感病毒HA基因引物；
3)禽流感病毒HA基因的PCR扩增；
4)将目的片段与载体pET100/D-TOPO连接，构建重组质粒；
5)转化表达细胞；
6)IPTG诱导重组蛋白的表达；
7)重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化；
8)重组蛋白免疫兔制备兔血清并纯化；
9)单克隆抗体用于ELISA包被，制备的多克隆抗体作为检测抗体，辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG作为二抗；
10)建立双抗体夹心检测禽流感病毒抗原的方法。
进一步，所述步骤1)中人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因序列为：
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc
attggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgtt
actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt
ccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaat
catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc aggggaagtc ctcctttttc
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ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg
ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatca ccatcgggga atgccccaaa
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactca gaaatgcccc tcaaagagag
agaagacgta aaaagaga。
进一步，所述步骤2)中HA基因引物序列为：
HA-F：5′-cacatggagaaaatagtgcttcttc-3′
HA-R：5′-tctctttttacgtcttctctc-3′。
进一步，所述步骤3)中PCR扩增条件为：
循环条件如下：
72℃延伸10分钟后，10ul产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
进一步，所述步骤4)中构建重组质粒具体步骤为：
①取一支无菌EP管，加入水2ul，胶条回收纯化产物2ul，Salt solution1ul，pET-100/D-TOPO载体1ul后混匀，室温静置5分钟；
②无菌操作台上取3ul该体系到一瓶top10细胞中，静止30分钟后，42℃热击40秒，立即放在冰上，2分钟后在无菌操作台上加入250ul的soc培养基；
③半盖紧盖子，37℃，225rpm，离心2小时，吸取200ul涂布于含有终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的固体平板上；
④将该固体平板放入37℃培养箱内倒置培养16小时。
进一步，所述步骤5)和6)中具体步骤为：将经过菌落PCR鉴定为阳性的单克隆接种于5ml终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的LB固体培养基中，37℃，225rpm，培养12小时，吸取3ml接种于200ml的LB液体培养基中，继续培养2小时，用单光束紫外可见分光光度计测定OD600为0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG继续诱导表达6小时。
进一步，所述步骤7)和8)中具体步骤为：去离子水清洗柱子，用五倍柱床体积的平衡缓冲液平衡柱子，待柱平衡后，将兔血清经0.45uM滤膜滤过以平衡缓冲液10倍体积稀释后以1mL/min流速上柱，至少用五倍柱床体积的平衡缓冲液以1mL/min流速洗脱杂蛋白，先在每个收集管中加入100μL的中和缓冲液，使pH恢复至7.4左右，以免失去活性。使用不同pH值洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，每管收集1mL；分别取5μL每个收集管中的液体作SDS-PAGE分析，纯化好的抗体以PB工作液4℃透析，10000r/min离心30分钟，收集上清。
进一步，所述步骤7)中具体步骤为：
①将制备的鼠单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为10ug/ml，100ul/孔，置于4℃冰箱孵育16小时；每孔加入300ul的Wash buffer洗涤3次，每次2分钟，然后甩干；用含5％牛血清白蛋白的Wash buffer加满孔，37℃孵育封闭2小时，洗涤；
②将纯化的HA蛋白用样品稀释液稀释，按10倍梯度稀释为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100ul/孔。每个稀释度重复一次；用HA3蛋白按10倍梯度稀释为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100ul/孔，作为阴性对照，重复3次；37℃孵育1小时，洗涤；另留3孔作为试剂空白对照；
③用0.01M的PBS将纯化的兔多抗稀释为10ug/ml，每孔100ul/孔；37℃，孵育1小时，洗涤；用pH7.4的样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔稀释为0.6ug/ml，每孔100ul/孔；37℃孵育1小时，洗涤；每孔加入100ul的TMB，室温避光，显色20分钟；每孔加入50ul的2MH2SO4，自动酶联检测仪OD450读数。
本发明的有益效果在于：提供了一种灵敏度高、特异性好的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法。该方法能够进行快速、有效的筛查诊断，有使用方便、检测准确的优点，适合在传染病防控领域推广应用，如用于进出口物品携带病原的筛查等，为基层对禽流感病毒进行快速检测提供了简便有效的方法。
附图说明
图1为HA蛋白的PCR扩增电泳图；
图2为重组表达质粒的PCR鉴定电泳图；
图3为重组蛋白表达电泳图；
图4为SDS-PAGE鉴定纯化蛋白电泳图；
图5为SDS-PAGE鉴定纯化多抗电泳图。
注：图1中1为DNA标准DL 2000；2为NP蛋白基因的PCR产物；3为阴性对照；
图2中1为DNA标准DL 2000；2为重组表达质粒的PCR产物；3为阴性对照；
图3中1为未加IPTG诱导表达的阴性对照；2为225KD的蛋白marker；3为IPTG诱导表达的重组蛋白；
图4中1为225KD的蛋白marker；2-3为纯化蛋白；
图5中1为225KD的蛋白marker；2为纯化的多抗。
具体实施方式
为了对本发明进行更全面的说明，以下为本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。
本发明是一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，关键技术之处在于：用基因工程方法制备禽流感病毒HA特异性重组抗原，以该抗原免疫小鼠，制备单抗，免疫兔，制备的兔血清，纯化后用于ELISA检测，辣根过氧化物酶标记的兔抗作为检测抗体，建立了双抗体夹心检测禽流感病毒的方法。用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，具体步骤为：
1.禽流感病毒HA蛋白引物设计：
从GenBank中调出人禽流感病毒(A/Ck/HK/31.4/02(H5N1))株HA基因序列GenBank：AY575875.1(13-1050bp)，为了获得更高的表达效率，将编码arg的agg突变为cgt，目的基因序列如下：
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc
attggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgtt
actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt
ccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaat
catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc aggggaagtc ctcctttttc
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacc caacaataaa gaagagctac
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccaccc taatgatgcg
gccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctata tttccgttgg aacatcaaca
ctaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga
agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ctatcaattt cgagagtaat
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg
ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatca ccatcgggga atgccccaaa
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactca gaaatgcccc tcaaagagag
agaagacgta aaaagaga。
2.禽流感病毒HA蛋白的PCR扩增：
禽流感病毒HA基因特异性引物的设计根据Directional
Cloning kit试剂盒说明，由于PET100/D-TOPO载体前端有gtgg四个突出碱基，设计的引物前端附加cacc四个碱基，使得扩增片段前端的gtgg四个碱基能被TOP10细胞中的top异构酶识别切割与连接。引物序列如下：
HA-F：5′-cacatggagaaaatagtgcttcttc-3′
HA-R：5′-tctctttttacgtcttctctc-3′。
3.禽流感病毒HA基因的PCR扩增：
以合成的基因序列为模板进行PCR扩增反应体系为：
循环条件如下：
72℃延伸10分钟后，10ul产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
4.重组质粒的构建：
①取一支无菌EP管，加入水2ul，胶条回收纯化产物2ul，Salt solution1ul，pET-100/D-TOPO载体1ul后混匀，室温静置5分钟；
②无菌操作台上取3ul该体系到一瓶top10细胞中，静止30分钟后，42℃热击40秒，立即放在冰上，2分钟后在无菌操作台上加入250ul的soc培养基；
③半盖紧盖子，37℃，225rpm，离心2小时，吸取200ul涂布于含有终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的固体平板上；
④将该固体平板放入37℃培养箱内倒置培养16小时。
5.菌落PCR鉴定重组质粒
随机挑选5个菌落，每个菌落一半用于PCR鉴定，另一半挑取接种于5ml含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，225rpm，培养12小时。菌落PCR鉴定体系：
循环条件如下：
72℃延伸10分钟后，1％琼脂糖鉴定，结果都为阳性。表明目的基因也成功亚克隆至pET-100/D载体。
6.重组蛋白的诱导表达
将经过菌落PCR鉴定为阳性的单克隆接种于5ml终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，225rpm，培养12小时，吸取3ml接种于200ml的LB固体培养基中(氨苄终浓度为50ug/ml)。继续培养2小时，用单光束紫外可见分光光度计测定OD600为0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)继续诱导表达6小时。
7.重组蛋白的提取纯化
吸取2ml诱导表达6小时的菌液做SDS-PAGE，初步确定蛋白是否表达及表达量，4℃，12000r/min离心30分钟，收集细胞沉淀，用0.01MpH7.4的PBS洗涤三次，加入pH8.0裂解液(Tris-Nacl)悬浮，超声，离心后分别取10ul上清和沉淀做SDS-PAGE，电泳后用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色，脱色液进行脱色后检查特异性目的蛋白条带。结果表明重组蛋白以包涵体的形式表达，收集超声离心后的细胞沉淀(主要含有一些细胞碎片和包涵体)，加入pH8.0的尿素悬浮，置于冰上摇2小时溶解包涵体，12000r/min，离心30分钟，上清液经0.22um的滤膜过滤后用His TrapTMHP(组氨酸)亲和吸附柱纯化系统进行纯化，SDS-PAGE鉴定纯度，最后将纯化的蛋白透析到0.01M，pH7.4的PBS中，PEG-20000浓缩。取2mg纯化的蛋白制备多抗。
8.双抗体夹心ELISA检测禽流感病毒步骤如下：
8.1鼠单抗包被：
将制备的鼠单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为10ug/ml，100ul/孔，置于4℃冰箱孵育12-16小时；
8.2洗涤：
每孔加入300ul的Wash buffer洗涤3次，每次2分钟，然后甩干；
8.3封闭：
用含5％牛血清白蛋白的Wash buffer加满孔，37℃孵育封闭2小时，洗涤；
8.4加检测样品-纯化的禽流感病毒HA蛋白：
将纯化的HA蛋白用样品稀释液稀释，按10倍梯度稀释为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100ul/孔。每个稀释度重复一次；用HA3蛋白按10倍梯度稀释为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100ul/孔，作为阴性对照，重复3次；37℃孵育1小时，洗涤；另留3孔作为试剂空白对照；
8.5加纯化的兔多抗
用0.01M的PBS将纯化的兔多抗稀释为10ug/ml，每孔100ul/孔；37℃，孵育1小时，洗涤同步骤2)；
8.6加二抗-羊抗兔：
用0.01M的PBS将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔稀释为0.6ug/ml，每孔100ul/孔；37℃孵育1小时，洗涤；
8.7显色：
每孔加入100ul的TMB，37℃室温避光，显色20分钟；
8.8终止反应：
每孔加入50ul的2M H2SO4，自动酶联检测仪OD450读数。
本发明是一种用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，关键技术之处在于：用鼠单抗包被ELISA，用特异性兔多抗形成抗体抗原抗体复合物，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔检测抗体，建立了双抗体夹心检测禽流感病毒的方法。
本发明采用双抗体夹心法检测抗原，将抗体结合到固相载体上，即蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基到固相载体表面。
9.双抗体夹心检测禽流感抗原的敏感性
用鼠单抗10ug/ml 4℃包被过夜，初始抗原蛋白浓度为1mg/ml，10倍梯度稀释，实验步骤同上，当A450≥0.26时，结果判为阳性，否则判为阴性。通过实验结果显示初步确定该方法最低检测的病毒量为1mg/mlX 10-6＝1ng/ml。
表1.双抗体夹心法检测的病毒量
10.双抗体夹心检测禽流感抗原的特异性
脑炎病毒(E1-ecto)，委内瑞拉马脑炎病毒(E2-19AA)，马秋波病毒(GP2)，蜱传脑炎病毒(TBE-E-D3)，Q热立克次体(coml)，普氏立克次体(120C)，西尼罗病毒这六株病毒进行所建立的方法的检测，HA蛋白作为阳性对照。在特异性试验中，六株病毒不显色，为阴性反应，具体结果见表2。
表2.ELISA检测禽流感病毒
本发明中，实施例中所采用的数据，如溶液的使用量，制备溶液时采用的原料的量，处理的时间、次数、温度等，本领域技术人员均可根据实际情况进行调整，本具体实施方式中的实施例只是对权利要求中所要求保护的技术方案进行示例性说明，其不能用于限定权利要求所要求保护的范围。
本发明公开的检测方法并非以人体和动物为对象，只是为了检测是否具有病毒，如检测粉末、食品、海关进出口物品等，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。
除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。
除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学院
<120> 一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法
<130> 发明
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1038
<212> DNA
<213> HA
<400> 1
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60
attggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120
actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta 180
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt 300
ccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaat 420
catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc aggggaagtc ctcctttttc 480
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacc caacaataaa gaagagctac 540
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccaccc taatgatgcg 600
gccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctata tttccgttgg aacatcaaca 660
ctaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720
agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ctatcaattt cgagagtaat 780
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900
ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatca ccatcgggga atgccccaaa 960
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactca gaaatgcccc tcaaagagag 1020
agaagacgta aaaagaga 1038
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> HA-F
<400> 2
cacatggaga aaatagtgct tcttc 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> HA-R
<400> 3
tctcttttta cgtcttctct c 21
Claims (8)
1.一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，该方法具体为：
1)人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因；
2)设计扩增表达人禽流感病毒HA基因引物；
3)禽流感病毒HA基因的PCR扩增；
4)将目的片段与载体pET100/D-TOPO连接，构建重组质粒；
5)转化表达细胞；
6)IPTG诱导重组蛋白的表达；
7)重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化；
8)重组蛋白免疫兔制备兔血清并纯化；
9)单克隆抗体用于ELISA包被，制备的多克隆抗体作为检测抗体，辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG作为二抗；
10)建立双抗体夹心检测禽流感病毒抗原的方法。
2.如权利要求1所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤1)中人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因序列为：
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc
attggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgtt
actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt
ccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaat
catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc aggggaagtc ctcctttttc
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacc caacaataaa gaagagctac
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccaccc taatgatgcg
gccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctata tttccgttgg aacatcaaca
ctaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga
agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ctatcaattt cgagagtaat
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg
ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatca ccatcgggga atgccccaaa
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactca gaaatgcccc tcaaagagag
agaagacgta aaaagaga。
3.如权利要求1所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤2)中HA基因引物序列为：
HA-F：5′-cacatggagaaaatagtgcttcttc-3′
HA-R：5′-tctctttttacgtcttctctc-3’。
4.如权利要求1所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增反应体系为：
循环条件：
72℃延伸10分钟后，10ul产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
5.如权利要求1所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤4)中构建重组质粒具体步骤为：
①取一支无菌EP管，加入水2ul，胶条回收纯化产物2ul，Salt solution1ul，pET-100/D-TOPO载体1ul后混匀，室温静置5分钟；
②无菌操作台上取3ul该体系到一瓶top10细胞中，静止30分钟后，42℃热击40秒，立即放在冰上，2分钟后在无菌操作台上加入250ul的soc培养基；
③半盖紧盖子，37℃，225rpm，离心2小时，吸取200ul涂布于含有终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的固体平板上；
④将该固体平板放入37℃培养箱内倒置培养16小时。
6.如权利要求1所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤5)和6)中具体步骤为：将经过菌落PCR鉴定为阳性的单克隆接种于5ml终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的LB固体培养基中，37℃，225rpm，培养12小时，吸取3ml接种于200ml的LB液体培养基中，继续培养2小时，用单光束紫外可见分光光度计测定OD600为0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG继续诱导表达6小时。
7.如权利要求1所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤7)和8)中具体步骤为：去离子水清洗柱子，用五倍柱床体积的平衡缓冲液平衡柱子，待柱平衡后，将兔血清经0.45uM滤膜滤过以平衡缓冲液10倍体积稀释后以1mL/min流速上柱，至少用五倍柱床体积的平衡缓冲液以1mL/min流速洗脱杂蛋白，先在每个收集管中加入100μL的中和缓冲液，使pH恢复至7.4左右，以免失去活性。使用不同pH值洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，每管收集1mL；分别取5μL每个收集管中的液体作SDS-PAGE分析，纯化好的抗体以PB工作液4℃透析，10000r/min离心30分钟，收集上清。
8.如权利要求7所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤7)中具体步骤为：
①将制备的鼠单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为10ug/ml，100ul/孔，置于4℃冰箱孵育16小时；每孔加入300ul的Wash buffer洗涤3次，每次2分钟，然后甩干；用含5％牛血清白蛋白的Wash buffer加满孔，37℃孵育封闭2小时，洗涤；
②将纯化的HA蛋白用样品稀释液稀释，按10倍梯度稀释为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100ul/孔。每个稀释度重复一次；用HA3蛋白按10倍梯度稀释为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100ul/孔，作为阴性对照，重复3次；37℃孵育1小时，洗涤；另留3孔作为试剂空白对照；
③用0.01M的PBS将纯化的兔多抗稀释为10ug/ml，每孔100ul/孔；37℃，孵育1小时，洗涤；用pH7.4的样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔稀释为0.6ug/ml，每孔100ul/孔；37℃孵育1小时，洗涤；每孔加入100ul的TMB，室温避光，显色20分钟；每孔加入50ul的2M H2SO4，自动酶联检测仪OD450读数。
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| CN102621320B (zh) | 2014-07-02 |
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