CN102288769A

CN102288769A - 一种检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片及其应用

Info

Publication number: CN102288769A
Application number: CN2011101199697A
Authority: CN
Inventors: 韩雪清; 王慧煜; 梅琳
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-05-10
Filing date: 2011-05-10
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了一种检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片及其应用。本发明提供的液相芯片，其包括包被抗Bt cry1 Ac单克隆抗体的荧光微球、生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体和链霉亲和素藻红蛋白。本发明还提供用所述的液相芯片检测植物是否为转Bt cry1 Ac植物。本发明利用一对抗Bt cry1 Ac的单克隆抗体，采用双抗体夹心法，建立了一种液相芯片检测转基因作物(GMO)中Btcry1 Ac蛋白的方法，该方法的敏感性高、特异性强、重复性好。

Description

一种检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片及其应用

技术领域

本发明属于蛋白检测领域，特别涉及一种检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片及其应用。

背景技术

随着转基因技术的日渐成熟，转基因作物产业化已呈现出较好的势头。转基因作物在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也存在潜在的环境和食品安全风险。出于对转基因作物安全性考虑，中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因作物和加工食品进行标识，以对人、动物的健康和生态环境多样性进行保护。由于转基因作物及其产品对人类健康和生态环境可能存在潜在的不利影响，在转基因作物及其产品是否有害没有定论之前，转基因作物及其产品的检测是非常重要的。因此，加大对转基因作物及其产品的检测监管非常必要，这就需要建立一套简便、快速、准确的检验技术，以满足日常检测的要求。

目前关于转基因作物的检测方法分为三类：基于蛋白质的检测方法；基于核酸的检测方法；其他检测方法。基于蛋白质的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。这些检测方法已经在日常检测工作中广泛应用，取得了良好的效果。

转基因产品的检测要求快速、准确、灵敏、适应样品量大、目标基因种类繁多等特点。虽然国内外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。

基于Luminex技术的液相芯片技术是新近发展起来的一种检测方法。用荧光染料将聚苯乙烯微球分别染成不同的荧光色进行编码，在微球表面以共价键方式连接抗待检测蛋白的抗体，捕获样品中相应的抗原，另一生物素化的检测抗体与抗原结合，再将荧光素标记的链霉亲和素与生物素化单抗结合进行识别分析。不同微球可以通过荧光波谱相互区别，类似于微阵列蛋白质芯片的方法，可以实现多种指标同时检测，给作物不同转基因成分的检测提供了新的检测途径。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片，其制备方法和应用。

本发明提供的检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片，其包括包被抗Bt cry1 Ac单克隆抗体的荧光微球、生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体和链霉亲和素藻红蛋白。

其中，所述的荧光磁性微球优选为聚苯乙烯荧光磁性微球或聚苯乙烯无磁性荧光微球。

其中，所述的荧光磁性微球为羧基化荧光磁性微球。

本发明的液相芯片中，所述的荧光磁性微球包被单克隆抗体的量为5～15μg/1.25×10⁶个微球，优选为10μg/1.25×10⁶个微球。

本发明的液相芯片中，所述的生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体浓度为1～20μg/μL，优选为2～5μg/μL，更优选为2μg/μL。

本发明还提供制备上述液相芯片的方法，其包括如下步骤：

1)包被抗Bt cry1 Ac单克隆抗体的荧光磁性微球的制备：

对荧光磁性微球进行活化；

用EDC和S-NHS将抗Bt cry1 Ac单克隆抗体偶联到活化后的荧光磁性微球上；

终止偶联反应，获得包被抗Bt cry1 Ac单克隆抗体的荧光磁性微球；

2)制备生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体：

用生物素标记针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体，再将生物素化的单克隆抗体进行透析，去除未结合的生物素。具体步骤如下所述：

将冷冻生物素从冰箱中取出达到室温，准备抗体溶液，并准备10mM生物素溶液(现配现用)，然后加一定体积的生物素溶液于抗体溶液中(生物素和抗体的量为试剂盒推荐用量)，冰上孵育2h。透析过程为：将透析袋放入预处理液中，煮沸10min，用蒸馏水洗涤三次后，放入蒸馏水中煮沸10min，处理好的透析袋放入蒸馏水中4℃保存。将抗体溶液放入透析袋中，不间断的更换PBS缓冲液，一般至少透析一天。最后将生物素化的抗体透析过夜(PBS，PH 7.4)，目的是去除未结合的生物素，分装保存于-20℃备用。

本发明还提供应用所述的液相芯片检测转Bt cry1 Ac植物，其包括如下步骤：

1)植物样品总蛋白的提取；

2)用所述的液相芯片对步骤1)提取的蛋白进行检测；

3)分析检测结果。

其中，具体为：96孔板的相应孔中加入50μL包被好单抗1的微球(约5000个微球)，加入待检蛋白样品，50μL/孔，作3重复孔，600r/min振荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μL(5μg)生物素化的识别不同抗原表位的单抗2，600r/min振荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μL的SA-PE(50μg/mL)，600r/min振荡30min；洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μL PBS缓冲液重悬；采用Bio-Plex悬浮芯片系统检测荧光值并计算样品中Bt cry1 Ac浓度。

本研究建立的液相蛋白芯片方法，检测线性范围可以达到18.35pg/mL～8150.48pg/mL，该检测方法的最低检测限为12.0075pg/mL，批内和批间变异系数(CV)＜10％。与EPSPS蛋白、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白等其他常见转基因目标蛋白无交叉反应。

附图说明

图1为抗体加入量和MFI的关系柱状图。其中，C1为阴性对照；X1为Ig-G抗体加入量为10μg；X2为Ig-G抗体加入量为15μg。

图2为检测抗体加入量和MFI关系柱状图。其中，B为空白对照；C1：检测抗体的浓度为20μg/μL；C2：检测抗体的浓度为2μg/μL。

图3为Bt cry1 Ac蛋白液相芯片检测标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1Bt cry1 Ac单克隆抗体的制备

根据文献“乔艳红，张维，林敏，张杰，潘家荣；分泌抗Bt Cry1 Ac蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[J]；高技术通讯；2005，02，91-93”公开的方法，以Bt cry1 Ac为抗原免疫BALB/c小鼠，用SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合，筛选出三对识别不同抗原表位的单克隆抗体，选自其中一对进行蛋白液相芯片的制作，将这一对单抗命名为AB3和AE3。

实施例2Bt cry1 Ac单抗AB3的聚苯乙烯荧光磁性微球的包被

采用Bio-Plex^TM蛋白氨基偶联试剂盒和37号空白羧基荧光磁性微球将Bt cry1 Ac单抗包被到聚苯乙烯荧光磁性微球上，具体步骤如下：

选择37号羧基化磁性荧光微球(Bio-Rad)(1.25×10⁷个/mL)，漩涡混合30秒，超声波震荡30秒，取100μL微球到反应管中(采用进口的1.5mL eppendorf管)，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，加入100μL微球清洗液，漩涡混合10秒，超声波震荡10秒，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，加入80μL微球活化缓冲液重悬微球，漩涡混合30秒，超声波震荡30秒，准备EDC(50mg/mL)(购自Pierce公司)和S-NHS(50mg/mL)(购自Pierce公司)，在这要注意：EDC必须确保新鲜，反复冻融不得超过5次，最好分装后一次性使用。加入10μL EDC后迅速加入10μL S-NHS到微球中，漩涡混合30秒，用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合20min，加150μLPBS，pH7.4，漩涡混合10秒，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，加100μL PBS，pH 7.4重悬微球，漩涡混合30秒，超声波震荡15秒。加10μg抗Bt cry1 Ac的单克隆抗体AB3(2.2mg/mL)到活化的微球中，用100μL PBS，pH 7.4定容到500μL，用铝箔盖住反应管，4℃过夜，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，用500μL PBS，pH 7.4清洗偶联的微球，14000×g离心4分钟，小心移除上清液(不要超声波清洗)，用250μL封闭缓冲液重悬微球，漩涡混合15秒，用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合30分钟，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，用500μL储存缓冲液清洗微球，16000×g离心6分钟，小心去除上清，加入150μL储存缓冲液保存微球，可用血球计数器计算微球的浓度，盖上铝箔，4℃保存偶联的微球，可稳定保存1年。1.25×10⁶个微球包被的抗体量为10μg。

实施例3AE3(1.5mg/mL)抗体的生物素化

此步骤依据Pierce公司的试剂盒说明书进行，最后将生物素化的抗体透析过夜(PBS，PH 7.4)，目的是去除未结合的生物素，分装保存于-20℃备用。具体步骤为：将冷冻生物素从冰箱中取出达到室温，准备抗体溶液，并准备10mM生物素溶液(现配现用)，然后加一定体积的生物素溶液于抗体溶液中，冰上孵育2h。透析过程为：将透析袋放入预处理液中，煮沸10min，用蒸馏水洗涤三次后，放入蒸馏水中煮沸10min，处理好的透析袋放入蒸馏水中4℃保存。将抗体溶液放入透析袋中，不间断的更换PBS缓冲液，一般至少透析一天。

实施例4转Bt Cry1 AC植物液相蛋白芯片的检测

以通过我国生物安全性评价，允许作为加工原料进口的转基因玉米MON810、BT11、BT176、T25、GA21、NK603，和我国自行开发的抗虫棉国抗(GK22)、石远321为样品，以Bt cry1 Ac标准品为阳性对照，以市售的非转基因的玉米和棉花种子为阴性对照，采用本发明制备的液相芯片方法进行检测。步骤如下：

参照Plant Total Protein Extraction Kit(Sigma-Aldrich)说明书提取阳性对照、阴性对照和样品总蛋白；在96孔板的相应孔中加入50μL实施例1包被好单抗1的微球(约5000个微球)，加入待检蛋白样品，50μL/孔，作3重复孔，600r/min振荡1h；用洗涤缓冲液PBST洗涤3次，加入50μL(5μg)实施例2制备的生物素化的单抗2，600r/min振荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μL的SA-PE(50μg/mL)，600r/min振荡30min；洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μL PBS缓冲液重悬；采用Bio-Plex悬浮芯片系统检测荧光值并计算样品中Bt cry1Ac浓度。

检测结果表明，对于GK-22和石远321物种，检测出转基因成分Bt cry1 Ac。对于MON810、BT11、BT176、T25、GA21、NK603、非转基因玉米和棉花，未检测出转基因成分Bt cry1 Ac。

试验例1蛋白质偶联微球效率验证

标记2个小离心管，其中1个用于阴性对照，偶联的微球漩涡混合15秒，每管加入约10000个偶联的微球，稀释生物素标记的抗体至20μg/mL，加50μL到测试管中，阴性对照管加50μL稀释缓冲液，14000g离心4分钟，移除上清，加入50μL的2μg/mL Streptavidin-PE，阴性对照管加50μL稀释缓冲液。盖上铝箔，室温旋转混合30分钟，14000×g离心4分钟，小心移除上清，用125μL的储存缓冲液重悬微球，漩涡混合15秒，取125μL样品到平底96孔板中，开始用Bio-Plex仪器检验微球。阴性对照(背景)的荧光值不得超过100MFI。偶联微球的荧光值超过2000MFI可认为偶联成功。

结果如表1所示，背景的荧光值小于100MFI，而偶联验证实验的荧光值超过20000MFI，说明单抗与荧光磁性微球偶联成功，可进行后续试验。

表1单克降抗体AB3与37号微球偶联效率验证

试验例2液相蛋白芯片检测方法的建立及优化

包被抗体的编码微球用于捕获抗原，生物素化二抗与抗原结合，SA-PE与生物素结合，形成微球-抗体-待检抗原-二抗-生物素-链霉亲和素藻红蛋白复合物，通过Bio-Plex液相芯片系统检测得到的荧光信号，通过判断荧光信号强弱来判断待检样品的阴、阳性。

捕获抗体浓度优化

图1是用分别用10μg、15μg抗鼠的Ig-G来进行实验条件的优化。最终得出，包被微球的抗体随着抗体量的增加荧光信号值不断升高，当在1.25×10⁶个微球上包被量为10μg抗体时，荧光信号达到20000MFI以上，包被量为15μg抗体时，信号增加200多个MFI，但不是很明显，且考虑到节省抗体的原因，最适量选择1.25×10⁶个微球上包被量为10μg抗体。

检测抗体浓度优化

检测抗体加入量选择两个浓度进行实验，从图2中可以看出随着检测抗体浓度升高，荧光值也越高，当检测抗体的浓度为2μg/μL时，荧光值已经超过2000MFI，当检测抗体的浓度为20μg/μL时，荧光值已经达到20000MFI，所以最适量采用检测抗体浓度为2μg/μL。

试验例3Bt cry1 Ac标准曲线的建立和Cut Off值的确定

Bt cry1 Ac抗原标准品(购自上海佑隆生物技术有限公司)按15000，1500，150，15，1.5，0.15pg/mL的浓度制作标准曲线，96孔板中每孔加入50μL包被好的微球(10μg单抗/1.25×10⁶个荧光磁性微球)，加入50μL各梯度浓度的Bt cry1 Ac抗原标准品，作3重复孔，600r/min振荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入生物素化的检测抗体50μL(5μg)，600r/min振荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μL的SA-PE(50μg/mL)，600r/min振荡30min；洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μL PBS缓冲液重悬；采用Bio-Plex悬浮芯片系统(Luminex公司)检测荧光值并计算Bt cry1 Ac浓度。图3所示为Bt cry1 Ac蛋白液相芯片检测标准曲线。

用Bio-Plex液相蛋白质芯片分析仪直接得出的标准曲线方程为：

F1＝33.1966+(145.769-33.1966)/{〔1+(Conc/485.303)^-19773〕}^0.39813

Cut Off值是对检测结果定性的重要指标。测定10个空白孔的荧光值，计算其平均值(MFI_blank)及标准差(SD)，即Cut off值为：MFI_blank+3×SD。将Cut off值作为F1代入Bt cry1 Ac的标准曲线方程中计算出“Conc”值，即为最低检测限。实验结果得出，本发明建立的液相芯片方法检测Bt cry1 Ac蛋白的线性范围为18.35pg/mL～8150.48pg/mL，最低检测限为12.0075pg/mL。

试验例4特异性实验

用本研究建立的液相芯片检测方法，检测EPSPS、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白等其他常见转基因目标蛋白，以验证本方法的特异性。

从表2可以看出，本研究建立的液相芯片检测方法在检测Bt cry1 Ac蛋白时具有较高的荧光值，而与EPSPS、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白等其他常见转基因目标蛋白反应后的荧光值接近空白对照的荧光值，说明本研究建立的方法特异性强，与EPSPS、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白其他常见转基因目标蛋白无交叉反应。

表2特异性试验结果

试验例5重复性实验

用不同批次标记的微球，在不同的时间检测3个浓度的(100，500和1000pg/mL)Bt cry1 Ac(同一时间检测所用的微球是同一批次的)，计算批内和批间变异系数(CV％)。

对实验研制的Bt cry1 Ac液相蛋白芯片的检测方法，用不同批次标记的微球，在不同的时间检测3个浓度的(100，500和1000pg/mL)Bt cry1 Ac(同一时间检测所用的微球是同一批次的)，每孔做3次重复，计算批内和批间变异系数(CV％)。从结果可以看出，批内和批间变异系数(CV％)均小于10％，说明该方法具有很好的可重复性。

表3批内精密度测试结果

表4批间精密度测试结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测Bt cry1 Ac蛋白的液相芯片，其包括包被抗Bt cry1 Ac单克隆抗体的荧光微球、生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体和链霉亲和素藻红蛋白。

2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述的荧光微球为聚苯乙烯荧光磁性微球或聚苯乙烯无磁性荧光微球。

3.根据权利要求1或2所述的液相芯片，其特征在于，所述的荧光磁性微球为羧基化荧光磁性微球。

4.根据权利要求3所述的液相芯片，其特征在于，所述的荧光磁性微球包被单克隆抗体的量为5～15μg/1.25×10⁶个微球。

5.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于，所述的荧光磁性微球包被单克隆抗体的量为10μg/1.25×10⁶个微球。

6.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述的生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体浓度为1～20μg/μL。

7.根据权利要求6所述的液相芯片，其特征在于，所述的生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体浓度为2～5μg/μL。

8.一种制备权利要求1～7任一项所述的液相芯片的方法，其包括如下步骤：

1)包被抗Bt cry1 Ac单克隆抗体的荧光磁性微球的制备：

对荧光磁性微球进行活化；

2)制备生物素化的针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体：

用生物素标记针对Bt cry1 Ac不同抗原表位的单克隆抗体，再将生物素化的单克隆抗体进行透析，去除未结合的生物素。

9.应用权利要求1～7任一项所述的液相芯片检测转Bt cry1 Ac植物，其包括如下步骤：

1)植物样品总蛋白的提取；

2)用权利要求1～7任一项所述的液相芯片对步骤1)提取的蛋白进行检测；

3)分析检测结果。