CN102675472B

CN102675472B - 用于检测猪繁殖与呼吸综合症患猪的试剂盒

Info

Publication number: CN102675472B
Application number: CN201210138548.3A
Authority: CN
Inventors: 杨利敏; 陈才伟; 牟身芸; 刘亭见; 李晶
Original assignee: BEIJING NEWPEP BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING NEWPEP BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2032-05-07
Also published as: CN102675472A

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症患猪的试剂盒。本发明提供了包括序列表的序列4自N末端第1至122位氨基酸残基所示N蛋白片段和序列4自N末端第135至207位氨基酸残基所示Gp5蛋白片段的融合蛋白。本发明还提供了包括所述的融合蛋白的试剂盒及其检测猪繁殖与呼吸综合征患猪中的应用。在保证特异性、敏感性的前提下，采用本发明提供的试剂盒按照相应方法进行检测与现有技术中的IDEXX试剂盒的检测符合率为94%以上。本发明试剂盒便于操作，使用成本低（每份血清样本的费用在20元左右），重复性好，适合推广应用，为临床上快速检测PRRS患猪提供了可靠的手段，为PRRS的免疫防控监测提供技术支撑，应用前景良好。

Description

用于检测猪繁殖与呼吸综合症患猪的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症患猪的试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又称为猪蓝耳病，是由PRRS病毒（PRRS virus,PRRSV）引起的猪的一种高发传染病，可引起母猪的繁殖障碍、各年龄猪发生呼吸道症状以及仔猪死亡，此外还可以导致免疫抑制从而诱发继发感染。我国于1995年首次报道了该病的发生，尤其是2006年下半年以来，我国25个省份爆发了由毒力变异的高致病性PRRSV毒株为主要病原的“猪高热病”（HP-PRRS），本病的传染性极强，一旦感染，发病猪将持续高温41℃以上并出现急性死亡；妊娠母猪流产率高达30%以上；仔猪则100%发病并伴随着50%以上的死亡率风险，给我国的养猪业造成严重的经济损失。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，分为2个型，即欧洲型（I型，以LV株为代表）和美洲型（II型，以VR2332株为代表）。目前在我国流行的主要是II型毒株。该病毒的病毒粒子中含有一个核衣壳，核衣壳由正链RNA基因组和核衣壳蛋白(N)组成，核衣壳外边被一层囊膜包裹；病毒的囊膜含有6种病毒结构蛋白：小囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）以及N-糖基化蛋白GP2、GP3、GP4和GP5。M、N和GP5三种蛋白是PRRS病毒的主要结构蛋白，E、GP2、GP3和GP4是次要结构蛋白。M蛋白和GP5以二硫键相连的异源二聚体的形式存在于囊膜中，而次要结构蛋白E、GP2、GP3和GP4则可能是以非共价键结合在一起形成异源多聚体。

目前，国内外已经建立了许多检测PRRSV的方法，包括抗原检测和抗体检测。RT-PCR法、病毒分离培养法、免疫组化法等主要是检测PRRSV抗原，但这些方法具有操作复杂，成本高，耗时长等等不足之处，不利于基层的应用和推广。间接免疫荧光（IFA）、ELISA、免疫过氧化物酶单层细胞实验以及中和实验等方法属于检测PRRSV抗体，其中ELISA操作最方便，应用最广泛。通过对当前国内外市场研究和使用的PRRSV血清抗体ELISA检测试剂盒的调查发现，主要有PRRSV全病毒、N蛋白、Gp5蛋白、Nsp7或Nsp10为包被抗原的ELISA检测试剂盒。目前针对PRRS诊断方法应用最为广泛的是美国IDEXX公司生产的间接ELISA试剂盒，它是以全病毒作为包被抗原。但是，PRRSV病毒需由细胞培养物中大量增殖，成本过高；而其他的单一蛋白作为包被抗原，则可能出现漏检感染个体，造成猪场PRRSV监控不完善，给养猪业带来不可估量的损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症患猪的试剂盒。

本发明提供的融合蛋白，包括N蛋白片段和Gp5蛋白片段；所述N蛋白片段如序列表的序列4自N末端第1至122位氨基酸残基所示；所述Gp5蛋白片段如序列表的序列4自N末端第135至207位氨基酸残基所示。

所述融合蛋白还包括位于所述N蛋白片段和所述Gp5蛋白片段之间的连接肽。所述连接肽具体如序列表的序列4自N末端第123至134位氨基酸残基所示。

所述融合蛋白具体可如序列表的序列4或序列表序列5所示。

编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因包括所述N蛋白片段的编码序列和所述Gp5蛋白片段的编码序列。所述基因还可包括位于N蛋白片段的编码序列和所述Gp5蛋白片段的编码序列之间的所述连接肽的编码序列。所述N蛋白片段的编码序列具体可如序列表的序列3自5’末端第1至366位核苷酸所示。所述Gp5蛋白片段的编码序列具体可如序列表的序列3自5’末端第403至621位核苷酸所示。所述连接肽的编码序列具体可如序列表的序列3自5’末端第367至402位核苷酸所示。

所述基因具体可如序列表的序列3或序列表的序列6所示。

含有所述基因的重组质粒、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组质粒具体可为将序列表的序列3所示基因插入pET-28a载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组质粒更具体可为将序列表的序列3所示基因插入pET-28a载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21。

本发明还保护一种制备所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，当培养体系的OD₆₀₀=0.4-0.6时加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为1.5mmol/L，继续培养，得到所述融合蛋白。

所述继续培养的时间具体可为5小时。

所述方法具体包括如下步骤：（1）将所述重组菌的菌液接种至LB液体培养基（含50μg/ml氨苄青霉素），37℃、200rpm振荡培养，当培养体系的OD₆₀₀=0.4-0.6时加入IPTG（使其在培养体系中的浓度为1.5mmol/L），再37℃、200rpm振荡培养5小时；（2）将完成步骤（1）的培养体系离心（200rpm，5min），收集菌体沉淀；（3）将步骤（2）的菌体沉淀用PBS缓冲液重悬并进行超声破碎（超声破碎的参数具体可为：超声探头为6Φ，功率400W，全程工作时间30分钟，其中，每个循环超声3秒间隔5秒钟），离心（1200rpm，5min）收集上清（含包涵体蛋白）；（4）将步骤（3）得到的上清按照Novagen公司包涵体蛋白纯化方法进行包涵体蛋白纯化和蛋白质复性（Novagen公司的Ni-NTA His·BindR Resin试剂盒,货号：70666-5），收获所述融合蛋白。

本发明还保护所述融合蛋白在制备用于检测猪繁殖与呼吸综合征患猪的试剂盒中的应用。

本发明还保护一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征患猪的试剂盒，包括所述融合蛋白。

所述试剂盒具体可包括包被有所述融合蛋白的酶标板。

所述包被有所述融合蛋白的酶标板具体是通过如下方法制备得到的：用包被稀释液稀释所述融合蛋白，得到抗原浓度为1000ng/ml的包被液，在酶标板中加入所述包被液（每孔100微升），4℃包被24小时；所述包被稀释液为Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)。

所述试剂盒还可包括PBST缓冲液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照中的至少一种。

所述PBST缓冲液具体如下：含0.05%体积百分含量TritonX-100的PBS缓冲液（0.05M，pH7.4)。

所述封闭液具体如下：含0.5g/100ml BSA的所述PBST缓冲液。

所述样品稀释液具体如下：含1g/100ml BSA的所述PBST缓冲液。

所述酶标二抗具体如下：辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG(Santa Cruz，货号sc-2914)按照说明书进行1：4000稀释)。

所述显色液具体如下：将200mg/100ml四甲基联苯胺水溶液与30%H₂O₂混合得到；每10毫升显色液含有15μL 30% H₂O₂；30% H₂O₂：默克化工技术（上海）有限公司，货号：1.06097.1001。

所述终止液具体如下：2M H₂SO₄水溶液。

所述阳性对照具体如下：PRRSV阳性血清（购于IDEXX，货号：99-09418）。

所述阴性对照具体如下：PRRSV阴性血清（购于IDEXX，货号：99-09418）。

本发明提供的融合蛋白，采用包涵体表达的方式，表达量大，易于规模化生产。将本发明提供的融合蛋白作为包被抗原包被酶标板，可以用于检测猪繁殖与呼吸综合征患猪，具有便于操作、使用成本低（每份血清样本的费用在20元左右）、重复性好等优点，非常适合推广应用。本发明为临床上快速检测猪繁殖与呼吸综合征患猪提供了可靠的手段，为猪繁殖与呼吸综合征的免疫防控监测提供技术支撑，应用前景良好。

附图说明

图1为诱导前后融合蛋白乙在大肠杆菌中的表达、纯化及复性的结果。

图2为Western-Blot检测融合蛋白乙的结果。

图3为实施例3中应用融合蛋白乙检测PRRS阳性血清和阴性血清的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大肠杆菌BL21：购自北京博凌科为生物科技有限公司，货号CC0503。IPTG中文品名：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

PRRSV病毒VR2332毒株:购于ATCC（VR-2332^TM）（http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=VR-2332&Template=animalVirology）；公众也可从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：Yu,M.,X.Liu,L.Sun,C.Chen,G.Ma,Y.Kitamura,G.F.Gao and W.Liu,2010.Subcellular localization and topology of porcinereproductive and respiratory syndrome virus E protein.Virus Res 152,104-114.。

实施例1、重组质粒pET-28a/N-Gp5c的获得

1、设计并合成如下引物：

N-P1：5’-GATGAATTCCCAAATAACAACGGC-3’(下划线标注EcoRI酶切识别序列)；

Linker-P2：5’- TGCTGAGGGTGATGC-3’；

Linker-P3：5’- GCGAAGAACTGCATG-3’；

Gp5c-P4：5’-GATCTCGAGGAGACGACCCCATTG-3’(下划线标注XhoI酶切识别序列)。

Linker-P2和Linker-P3中方框标记的是反向互补序列（编码序列为“GGGSGGGSGGGS”的连接肽）。

2、提取PRRSV病毒VR2332毒株的基因组DNA。

3、以步骤2提取的基因组DNA为模板，用N-P1和Linker-P2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物EcoRI酶切识别序列下游的测序结果如序列表的序列1所示，自5’末端第1至366位核苷酸为N蛋白片段（C端）的编码序列，第367至402位核苷酸为连接肽的编码序列。

4、以步骤2提取的基因组DNA为模板，用Linker-P3和Gp5c-P4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物XhoI酶切识别序列上游的测序结果如序列表的序列2所示，自5’末端第1至36位核苷酸为连接肽的编码序列，第37至255位核苷酸为Gp5蛋白片段（C端）的编码序列。

5、同时将步骤3的PCR扩增产物和步骤4的PCR扩增产物作为模板，用N-P1和Gp5c-P4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物EcoRI酶切识别序列和XhoI酶切识别序列之间的测序结果如序列表的序列3所示。序列3中，自5’末端第1至366位核苷酸为N蛋白片段的编码序列，第367至402位核苷酸为连接肽的编码序列，第403 至621位核苷酸为Gp5蛋白片段的编码序列。序列表的序列3所示的DNA分子编码序列表的序列4所示的N-Gp5c融合蛋白（融合蛋白甲），该融合蛋白自N末端第1至122位氨基酸残基为N蛋白片段，第123至134位氨基酸残基为连接肽，第135至207位氨基酸残基为Gp5蛋白片段。

6、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切步骤5的PCR扩增产物，回收酶切产物。

7、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切pET-28a载体（Invitrogen），回收约5320bp的载体骨架。

8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pET-28a/N-Gp5c。根据测序结果，对重组质粒pET-28a/N-Gp5c进行结构描述如下：在pET-28a载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的DNA分子。在重组质粒中，N-Gp5c融合蛋白的编码序列与载体上的His-Tag标签的编码序列融合，形成序列表的序列6所示的融合蛋白（融合蛋白乙）编码序列，编码序列表的序列5所示的融合蛋白（融合蛋白乙），该融合蛋白自N末端第37至243位氨基酸残基为N-Gp5c融合蛋白，N-Gp5c融合蛋白的上游和下游均具有His-Tag标签。

实施例2、融合蛋白的制备、纯化和鉴定

一、融合蛋白的制备和纯化

1、将重组质粒pET-28a/N-Gp5c导入大肠杆菌BL21感受态细胞，得到重组菌。

2、挑取重组菌单菌落接种至5毫升LB液体培养基（含浓度为50μg/ml的氨苄青霉素），37℃、200rpm振荡培养12小时。

3、将5ml步骤2得到的菌液接种至495ml LB液体培养基（含浓度为50μg/ml的氨苄青霉素），37℃、200rpm振荡培养，培养体系的OD₆₀₀=0.4-0.6时加入IPTG（使其在培养体系中的浓度为1.5mmol/L），再37℃、200rpm振荡培养5小时。

4、将完成步骤3的培养体系离心（200rpm，5min），收集菌体沉淀。

5、将步骤4的菌体沉淀用PBS缓冲液重悬并进行超声破碎（超声探头为6Φ，功率400W，全程工作时间30分钟，其中，每个循环超声3秒间隔5秒钟），离心（1200rpm，5min）收集上清（含包涵体蛋白）。

6、将步骤5得到的上清按照Novagen公司包涵体蛋白纯化方法进行包涵体蛋白纯化和蛋白质复性（Novagen公司的Ni-NTA His·BindR Resin试剂盒,货号：70666-5），收获融合蛋白乙。

二、融合蛋白的鉴定

1、将步骤一中加入IPTG前的全菌、加入IPTG后的全菌、超声破碎后收集的上清和步骤6纯化后得到的融合蛋白乙分别进行SDS-PAGE电泳图，结果见图1（泳道M为蛋白分子量Marker，泳道1为加入IPTG前的全菌，泳道2为加入IPTG后的全菌，泳道3为超声破碎后收集的上清，泳道5为包涵体蛋白纯化后产物，泳道6为蛋白质复性后的产物）。泳道2以后的各个泳道均在28KD左右处出现一条蛋白条带，与融合蛋白乙的预期大小相符，且纯化后显示单一条带。

2、将步骤一中加入IPTG前的全菌、加入IPTG后的全菌、超声破碎后收集的上清和步骤6纯化后得到的融合蛋白乙分别进行Western-Blot，采用的一抗为His-tag小鼠单抗（购于Santa Cruz公司），结果见图2（泳道M为蛋白分子量Marker，泳道1为加入IPTG前的全菌，泳道2为加入IPTG后的全菌，泳道3为包涵体蛋白纯化后产物，泳道4为蛋白质复性后的产物）。泳道2以后的各个泳道均在28KD左右具有阳性信号。

三、对照蛋白的制备和纯化

将pET-28a载体代替重组质粒pET-28a/N-Gp5c进行步骤一的操作，得到对照蛋白。

四、对照蛋白的鉴定

将对照蛋白进行SDS-PAGE电泳，未显示28KD左右的蛋白条带。

将对照蛋白进行Western-Blot，未显示阳性信号（His-Tag标签太小，已跑出凝胶）。

实施例3、应用融合蛋白乙检测PRRS阳性血清和阴性血清

PRRSV阳性血清：购于IDEXX，货号：99-09418。

PRRSV阴性血清：购于IDEXX，货号：99-09418。

将实施例2的步骤一的6得到的融合蛋白乙进行Western-Blot，分别采用PRRSV阳性血清和PRRSV阴性血清作为一抗，结果见图3（泳道M为蛋白分子量Marker，泳道5为PRRSV阳性血清，泳道6为PRRSV阴性血清）。采用PRRSV阳性血清作为一抗时，显示阳性信号。采用PRRSV阴性血清作为一抗时，则没有阳性信号产生。

实施例3、以融合蛋白乙为包被抗原的间接ELISA方法反应条件的确定

PRRSV阳性血清：购于IDEXX，货号：99-09418。

PRRSV阴性血清：购于IDEXX，货号：99-09418。

将实施例2的步骤一的步骤6得到的融合蛋白乙（抗原）和PRRSV阳性血清进行如下实验（均将PRRSV阴性血清作为PRRSV阳性血清的阴性对照）：

1、正交法确定抗原包被浓度以及血清样本最佳稀释倍数

用包被液将融合蛋白乙梯度稀释，然后包被96孔板（每孔加100μL稀释液）。设置不同的包被浓度，融合蛋白乙的含量分别为800ng/孔、400ng/孔、200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔和25ng/孔；设置不同的血清稀释度，阳性血清的稀释度分别为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200。将包被浓度和血清稀释度组成方阵，进行ELISA，然后采用分光光度计测定OD450nm吸光值。选择阳性血清OD450nm在1左右且阴性OD450nm值小于0.2，同时阳性OD450nm值/阴性OD450nm值（即P/N）比值最大时的抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。结果见表1。

表1 ELISA方阵确定抗原包被浓度及血清最佳稀释度结果

表1的方阵滴定结果显示，当抗原100ng/孔包被，一抗100倍稀释时，P/N值最大，此时的阴性OD450nm小于0.2；因此确定融合蛋白乙的包被最佳浓度为100ng/孔，血清最佳稀释度为1∶100。

2、确定酶标二抗最佳稀释倍数

将抗原100ng/孔包被，一抗100倍稀释，兔抗猪酶标二抗按照1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000共4个稀释倍数，进行ELISA，然后采用分光光度计测定OD450nm吸光值。选择阳性血清OD450nm在1左右且阴性OD450nm值小于0.2，同时阳性OD450nm值/阴性OD450nm值（即P/N）比值最大时的酶标二抗稀释倍数为最佳工作浓度。结果见表2。

表2酶标二抗最佳工作浓度的确定

表2的结果显示，当兔抗猪酶标二抗在1∶4000倍稀释时，P/N值最大，此时的阴性OD450nm小于0.2；因此确定酶标二抗的最佳工作浓度为1∶4000。

3、确定最佳的包被稀释液和封闭液

分别用0.1M NaOH水溶液（NaOH，pH13）、0.05M碳酸盐缓冲液(CB，pH9.6)、0.05MTris-HCl缓冲液(TB，pH8.5)、0.05M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)、生理盐水(NaCl，pH7.2)和蒸馏水(H₂O，pH6.5)为包被稀释液稀释抗原（100ng/孔）；再分别以含5%和2%脱脂奶的PBST缓冲液以及分别含3%和0.5% BSA的PBST缓冲液作为封闭液，进行 ELISA，然后采用分光光度计测定OD450nm吸光值。选择阳性血清OD450nm在1左右且阴性OD450nm值小于0.2，同时阳性OD450nm值/阴性OD450nm值（即P/N）比值最大时的包被稀释液和封闭液为最佳工作液。结果见表3。

表3最佳抗原包被液和封闭液的确定

表3的结果显示，当包被稀释液为50mM Tris-HCl(pH8.0)，封闭液为0.5%BSA-PBST时，P/N值最大，此时的阴性OD450nm小于0.2。

4、确定最佳的样品稀释液与显色反应时间

根据上述确定的最佳的抗原包被液和封闭液、最佳抗原包被浓度及血清稀释度，最佳稀释倍数酶标二抗，分别以生理盐水（NaCl，pH7.2）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）、含0.05%TritonX-100的PBS缓冲液（PBST缓冲液）、含0.1%TritonX-100的PBS缓冲液（PBS-2*T）、含0.1%BSA的PBST缓冲液（0.1%BSA-PBST）和1%BSA的PBST缓冲液（1%BSA-PBST）作为样品稀释液稀释血清样品，再分别选择2.5分钟、5分钟、7.5分钟、10分钟、15分钟以及20分钟作为显色反应的作用时间，进行ELISA，然后采用分光光度计测定OD450nm吸光值。选择阳性血清OD450nm在1左右且阴性OD450nm值小于0.2，同时阳性OD450nm值/阴性OD450nm值（即P/N）比值最大时的样品稀释液和显色反应时间为最佳的样品稀释液和最佳显色反应时间。结果见表4。

表4最佳样品稀释液与显色反应时间的确定

表4的结果显示，当以1%BSA-0.05%PBST缓冲液作为样品稀释液最佳；显示反应最佳作用时间为常温反应10min。

5、确定最佳的一抗和二抗结合时间

用上述选定50mM Tris-HCl(pH8.0)为包被液稀释抗原至100ng/孔包被96孔板，以0.5%BSA-PBS为封闭液37℃封闭2小时，以1%BSA-PBST作为样品稀释液1∶100稀释血清样本，分别选择血清样本（一抗）和酶标二抗的作用时间为8、15、30、45、60和90分钟。进行ELISA操作，分光光度计测定OD450nm吸光值。选择阳性血清OD450nm在1左右且阴性OD450nm值小于0.2，同时阳性OD450nm值/阴性OD450nm值（即P/N）比值最大时的一抗和二抗结合时间为最佳一抗和二抗结合时间。结果见表5。

表5最佳一抗和二抗结合时间的确定

表5的结果显示，当一抗37℃结合45min，二抗37℃结合60min效果最佳。

6、ELISA临界值的判定：

将已知的45份阳性血清和58份阴性血清进行ELISA检测，计算S/P值（S为待测样本的OD450nm读值，P为阳性血清样本的OD450nm读值），利用SPSS软件作二者S/P值的相关性分析，确定最大程度符合的临界点为S/P=0.19，因此，当样本OD450nm值≥0.19时为阳性，<0.19时的样本为阴性。

7、抗原保存期的确定

将抗原以最佳工作浓度包被酶标板并封闭，用包装袋封好抽真空密闭保存于4℃，以后每个1月取出用已知的阴性、阳性血清按照所建立的方法进行检测，共检测6次（合计6个月）。结果显示抗原保存6个月仍可用于检测。

实施例4、试剂盒的组成

试剂盒包括如下组份：

（1）包被稀释液：Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)；

（2）PBST缓冲液：含0.05%体积百分含量TritonX-100的PBS缓冲液（0.05M，pH7.4)；

（3）封闭液：含0.5g/100ml BSA的PBST缓冲液；

（4）样品稀释液：含1g/100ml BSA的PBST缓冲液；

（5）酶标二抗：辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG(Santa Cruz，货号sc-2914)按照说明书进行1∶4000稀释)；

（6）显色液：将200mg/100ml四甲基联苯胺水溶液与30%H₂O₂混合得到；每10毫升显色液含有15μL 30% H₂O₂；30% H₂O₂：默克化工技术（上海）有限公司，货号：1.06097.1001；

（7）终止液：2M H₂SO₄水溶液；

（8）阳性对照（PRRSV阳性血清）：购于IDEXX，货号：99-09418；

（9）阴性对照（PRRSV阴性血清）：购于IDEXX，货号：99-09418。

实施例5、试剂盒的应用

分别将采集自猪的已知H1N1型猪流感病毒（H1N1-IV）阳性血清、已知H3N2型猪流感病毒（H3N2-IV）阳性血清、已知II型猪圆环病毒（PCV-2）阳性血清、已知猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、已知猪瘟病毒（CSFV）阳性血清和已知猪繁殖与呼吸综合症（PRRSV）阳性血清作为待测血清样本，用实施例4制备的试剂盒进行如下检测：

（1）用包被稀释液稀释抗原（实施例2的步骤一的步骤6得到的融合蛋白乙），得到抗原浓度为1000ng/ml的包被液，在96孔板中加入包被液（每孔100微升），4℃包被24小时；

（2）用PBST缓冲液洗板3次；

（3）每孔加入100微升封闭液，37℃孵育2小时；

（4）加入用样品稀释液1∶100倍稀释的待测血清样本（每孔100微升），37℃孵育45分钟；

（5）用PBST缓冲液洗板5次；

（6）每孔加入100微升酶标二抗，37℃孵育60分钟；

（7）用PBST缓冲液洗板5次；

（8）每孔加入100微升显色液，常温避光孵育10分钟；

（9）每孔加入100微升终止液，终止反应后用酶标仪测定OD450nm值，读值，计算S/P值并判定结果（当S/P值≥0.19时为阳性，当S/P值<0.19时为阴性）。S为待测血清样本的OD450nm读值，P为阳性对照的OD450nm读值。

结果见表6（均为三个重复样本的平均值±标准差）。PRRSV阳性血清结果为阳性，其它几个血清样本的结果均为阴性，表明融合蛋白乙与其它病毒阳性血清不存在交叉反应，具有较好的特异性。

表6特异性实验结果

	OD450值(±SD)	^aS/P比值
			CSFV阳性血清	0.0655±0.0064	-0.349
H1N1-IV阳性血清	0.248±0.0390	0.116
			H3N2-IV阳性血清	0.12±0.0080	-0.210
PCV-2阳性血清	0.148±0.0032	-0.172
			PRV阳性血清	0.0912±0.0791	-0.291
PRRSV阳性血清	0.912±0.1023	0.573

实施例6、重复性试验

选取10份已知PRRSV阳性血清，用不同批次的实施例4制备的试剂盒（采用不同批次制备的抗原）进行如下检测，方法同实施例5，每份血清重复3次，分别计算每份血清的S/P值平均值（X)、标准差（SD）和变异系数（CV），测得结果后计算同批抗原和不同批次抗原间的变异系数。同批抗原检测10份阳性血清的OD450值变异系数介于1%-13%之间，表明抗原的批内重复较好（见表7）；不同批次的抗原检测的10份阳性血清的OD450值变异系数介于5%-22%之间，表明抗原的批间重复较好（见表8）。由于间接ELISA试剂盒采用盒内对照判定结果，因此，上述数据表明所组装的试剂盒具有重复性和稳定性。

表7批内重复实验的S/P值平均值

样品编号	20100614-04	20100614-07	20100604-10	X	SD	CV
							1-1-0	1.1407	0.9566	1.0651	1.0541	0.0926	8.78%
1-3-0	1.0107	1.1374	0.8960	1.0147	0.1207	11.90%
							2-2-0	0.7910	0.6754	0.8405	0.7690	0.0847	11.02%
2-3-0	0.8933	0.9980	0.8292	0.9068	0.0852	9.39%
							3-4-0	1.1153	0.8887	0.9501	0.9847	0.1172	11.90%
5-6-0	1.0458	0.8165	0.9628	0.9417	0.1161	12.33%
							1-5-I	0.7351	0.7608	0.7963	0.7641	0.0307	4.02%
7-6-I	0.5741	0.5188	0.6348	0.5759	0.0580	10.08%
							8-1-I	1.2684	0.9914	1.2198	1.1599	0.1479	12.75%
D8	1.1887	1.0282	1.0363	1.0844	0.0904	8.34%

表8批间重复实验的S/P值平均值

样品编号	20100614-04	20100618-08	20100619-03	X	SD	CV
							1-1-0	1.0651	1.5018	1.6398	1.4022	0.3000	21.40%
1-3-0	0.8960	1.1427	1.3302	1.1230	0.2178	19.39%
							2-2-0	0.8405	1.2189	1.2291	1.0962	0.2215	20.21%
2-3-0	0.8292	1.0359	1.1971	1.0207	0.1844	18.07%
							3-4-0	0.9501	0.8100	0.6522	0.8041	0.1490	18.53%
5-6-0	0.9628	1.3660	1.3604	1.2297	0.2312	18.80%
							1-5-I	0.7963	0.9396	1.0485	0.9281	0.1265	13.63%
7-6-I	0.6348	0.7609	0.5717	0.6558	0.0963	14.69%
							8-1-I	1.2198	0.9886	1.2439	1.1508	0.1409	12.25%
D8	1.0363	0.9527	1.2477	1.0789	0.1520	14.09%

实施例7、对比试验

用实施例4制备的试剂盒（采用实施例5的方法）和美国公司的IDEXX检测试剂盒（按说明书操作）分别检测同样的103份猪血清样本，比较二者的符合率。结果见表9。

表9N-Gp5c/iELISA和IDEXX检测样本符合率比较

用IDEXX检测试剂盒判断为阴性的58份血清样本中有55份用实施例4制备的试剂盒检测也为阴性，即阴性符合率为94.83%。用IDEXX检测试剂盒判断为阳性的45份血清样本中有43份用实施例4制备的试剂盒检测也为阳性，即阳性符合率为95.56%。

实施例8、临床应用

用实施例4制备的试剂盒（采用实施例5的方法）对北京市大兴区某猪场2010-2011年采集的血清样本中的1000份血清（其中种猪血清200头份，仔猪血清800头份）进行检测，结果见表10。

表10临床应用的结果

Claims

1.融合蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列4或序列表中序列5所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因如序列表的序列3或序列表的序列6所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组质粒、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：培养将权利要求4所述重组质粒导入大肠杆菌BL21得到的重组菌，当培养体系的OD₆₀₀=0.4-0.6时加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为1.5mmol/L，继续培养，得到所述融合蛋白。

6.权利要求1所述的融合蛋白在制备用于检测猪繁殖与呼吸综合征患猪的试剂盒中的应用。

7.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征患猪的试剂盒，包括权利要求1所述的融合蛋白。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被有权利要求1所述融合蛋白的酶标板。