CN105092853A

CN105092853A - 检测多种Bt蛋白的液相芯片及检测方法

Info

Publication number: CN105092853A
Application number: CN201410188887.1A
Authority: CN
Inventors: 王慧煜; 韩雪清; 欧江涛; 林祥梅
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2014-05-06
Filing date: 2014-05-06
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明涉及蛋白检测，具体公开了一种检测多种Bt蛋白的液相芯片，主要包括偶联多种Bt蛋白抗原的微球、生物素化的检测抗体以及链亲和素藻红蛋白。检测时将生物素化的检测抗体加入96孔板中，将偶联抗原的微球和待检物同时加入各孔共同孵育，再分别加入链亲和素藻红蛋白，通过Bio-Plex液相芯片系统检测得到的荧光信号，通过判断荧光信号强弱来判断待检样品的阴、阳性。

Description

检测多种Bt蛋白的液相芯片及检测方法

技术领域

本发明属于蛋白检测领域，具体地说，涉及检测多种Bt蛋白的液相芯片及检测方法。

背景技术

随着转基因技术的日渐成熟，转基因作物产业化已呈现出较好的势头。转基因作物在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也存在潜在的环境和食品安全风险。出于对转基因作物安全性考虑，中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因作物和加工食品进行标识，以对人、动物的健康和生态环境多样性进行保护。由于转基因作物及其产品对人类健康和生态环境可能存在潜在的不利影响，在转基因作物及其产品是否有害没有定论之前，转基因作物及其产品的检测是非常重要的。因此，加大对转基因作物及其产品的检测监管非常必要，这就需要建立一套简便、快速、准确的检验技术，以满足日常检测的要求。

目前关于转基因作物的检测方法分为三类：基于蛋白质的检测方法；基于核酸的检测方法；其他检测方法。基于蛋白质的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。这些检测方法已经在日常检测工作中广泛应用，取得了良好的效果。

转基因产品的检测要求快速、准确、灵敏、适应样品量大、目标基因种类繁多等特点。虽然国内外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分/部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。

生物芯片根据其反应体系状态的不同，可分为固相芯片(flatmicroarrays)和液相芯片(liquidchipormicrospherearrays)，根据检测对象的不同又可分为基因芯片和蛋白芯片。传统的固相生物芯片存在操作繁琐、信息质量的稳定性和可重复性差的致命弱点，极大地限制了生物芯片的临床应用。液相芯片，也称为微球体悬浮芯片(suspensionarray，liquidchip)，是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术，也可称为灵活的多种被分析物质的检测(flexiblemulti-analyteprofiling，xMAP)技术，是集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术，这种技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起，使生物芯片反应体系由液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，因此也被称为液相芯片技术。

液相芯片技术是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应。它不但具有普通生物芯片高通量的特性，又有优于固相芯片的操作简便、经济实惠、重复性好、灵敏度高、信噪比好、灵活性大的特点，这使它在科研和临床中有着广泛的应用。可用作蛋白质和核酸等生物分子的高通量检测，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。液相芯片技术具有高效性：因为上百种颜色的微球可以放在同一个反应体系内，所以一小份标本(血，或其它体液，组织)可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术具有高敏感性：每个微球上都可以满满地包被上抗原、抗体或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。迄今为止十年时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。近年来，液相芯片以其独特的优点及临床实用性，正受到越来越多的重视。不同微球可以通过荧光波谱相互区别，类似于微阵列蛋白质芯片的方法，可以实现多种指标同时检测，给作物不同转基因成分的检测提供了新的检测途径。

中国专利申请号为201110119969.7的专利申请公开了一种检测Btcry1Ac蛋白的液相芯片及其应用，其是根据双抗体夹心法的原理，建立的检测Btcry1Ac蛋白的液相芯片方法，但该发明只能检测一种蛋白，即Btcry1Ac蛋白。若根据双抗体夹心法建立多种Bt蛋白的液相芯片方法，针对某一个蛋白，须制备或购买不同抗原表位的两个单抗，难度较大。而选用竞争法建立液相芯片方法，每个蛋白只需要1个单抗即可。

中国专利公开号为CN101526535A的发明专利公开了一种多种肿瘤标志物联合检测液相芯片，其检测原理是双抗夹心免疫反应，需要有两个抗体(包括捕获抗体和检测抗体)，这两个抗体是对应的，必须是针对同一抗原的。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测多种Bt蛋白的液相芯片及检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种检测多种Bt蛋白的液相芯片，主要包括下列成分：

1)偶联抗原的微球；

所述抗原为BtCry1Aa、BtCry1Ab、BtCry1Ac、BtCry1Ah、BtCry1B、BtCry1C、BtCry1F、BtCry2A、BtCry3B和BtCry9C蛋白；

2)生物素化的检测抗体；

所述检测抗体为上述10种蛋白的单克隆抗体；

3)链亲和素藻红蛋白。

作为优选，抗原蛋白与微球的偶联浓度为5μg/100μL。

进一步地，所述偶联抗原的微球的制备方法为：

将Bt蛋白加到活化的微球中，用100μLPBS，pH7.4定溶到500μL，用铝箔盖住反应管，4℃过夜，14000×g离心4分钟，移除上清液；用500μlPBS，pH7.4清洗偶联的微球，14000×g离心4分钟，移除上清液；用250μL封闭缓冲液重悬微球，漩涡混合15秒，用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合30分钟，14000×g离心4分钟，移除上清液；用500μL储存缓冲液清洗微球，16000×g离心6分钟，去除上清，加入150μL储存缓冲液保存微球，可用血球计数器计算微球的浓度，盖上铝箔，4℃保存偶联的微球。

本发明还提供了利用前述液相芯片检测多种Bt蛋白的方法，其是将50μL生物素化的检测抗体(0.2mg/L)加入96孔板中，将50μL偶联抗原的微球和50μL待检物同时加入各孔共同孵育，再分别加入50μL链亲和素藻红蛋白(50μg/mL)，通过Bio-Plex液相芯片系统检测得到的荧光信号，通过判断荧光信号强弱来判断待检样品的阴、阳性。

作为优选，生物素化的检测抗体加入量为10μg。

作为优选，所述孵育时间为60min。

本发明的有益效果在于：

本发明建立了同时检测多种Bt蛋白的液相蛋白芯片检测方法，可同时检测包括BtCry1Aa、BtCry1Ab、BtCry1Ac、BtCry1Ah、BtCry1B、BtCry1C、BtCry1F、BtCry2A、BtCry3B和BtCry9C在内的Bt蛋白。本发明建立的液相蛋白芯片方法检测转基因作物中的Bt蛋白的最低检出极限在10-50ng/mL之间，批内和批间变异系数(CV)<10％。与EPSPS蛋白、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白其他常见转基因目标蛋白无交叉反应。结果表明，该方法的敏感性高、特异性强、重复性好。经过保存期试验表明，组装的试剂盒至少经过6个月后，性状仍然稳定，检测效果也没有降低。

附图说明

图1为偶联抗原浓度和MFI的关系图。

图2为生物素化检测抗体加入量和MFI的关系图。

图3为孵育时间和MFI的关系图。

图4为Bt蛋白标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1液相蛋白芯片检测方法的建立及优化

1.试剂和耗材

S-NHS，EDC均购自Pierce公司，美国；

Bt蛋白标准品(包括BtCry1Aa、BtCry1Ab、BtCry1Ac、BtCry1Ah、BtCry1B、BtCry1C、BtCry1F、BtCry2A、BtCry3B和BtCry9C)和单克隆抗体(上海佑隆生物技术有限公司，进口)；

Bio-Plex^TM蛋白氨基偶联试剂盒和空白羧基荧光微球，Bio-Bad公司，美国；

抗体的生物素化试剂盒购自Pierce公司，美国。

透析袋：5mm，MW：8000-14000，北京鼎国生物科技有限公司。

2.主要仪器

Bio-Plex^TM200悬浮芯片系统(Luminex公司)，Bio-Bad公司，美国；

制冷恒温落地摇床，Eppendorf，德国；

涡旋混合器，北京昊诺斯科技有限公司。

3.方法

3.1抗原偶联于磁珠

3.1.1磁珠的活化

选择10种羧基化磁性荧光微球(Bio-Rad)(1.25×10⁷个/mL)，漩涡混合30秒，超声波震荡30秒，取100μL微球到反应管中(采用进口的1.5mLeppendorf管)，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，加入100μL微球清洗液，漩涡混合10秒，超声波震荡10秒，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，加入80μL微球活化缓冲液重悬微球，漩涡混合30秒，超声波震荡30秒，准备EDC(50mg/mL)(购自Pierce公司)和S-NHS(50mg/mL)(购自Pierce公司)，在这要注意：EDC必须确保新鲜，反复冻融不得超过5次，最好分装后一次性使用。加入10μLEDC后迅速加入10μLS-NHS到微球中，漩涡混合30秒，用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合20min，加150μLPBS，pH7.4，漩涡混合10秒，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，加100μLPBS，pH7.4重悬微球，漩涡混合30秒，超声波震荡15秒。

3.1.2抗原偶连反应

将Bt蛋白(BtCry1Aa、BtCry1Ab、BtCry1Ac、BtCry1Ah、BtCry1B、BtCry1C、BtCry1F、BtCry2A、BtCry3B和BtCry9C)加到活化的微球中，用100μLPBS，pH7.4定溶到500μL，用铝箔盖住反应管，4℃过夜，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，用500μlPBS，pH7.4清洗偶联的微球，14000×g离心4分钟，小心移除上清液(不要超声波清洗)，用250μL封闭缓冲液重悬微球，漩涡混合15秒，用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合30分钟，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，用500μL储存缓冲液清洗微球，16000×g离心6分钟，小心去除上清，加入150μL储存缓冲液保存微球，可用血球计数器计算微球的浓度，盖上铝箔，4℃保存偶联的微球，可稳定保存1年。

3.2检测抗体的生物素化

此步骤依据Pierce公司的试剂盒说明书进行，最后将生物素化的检测抗体透析过夜(PBS，PH7.4)，目的是去除未结合的生物素，分装保存于-20℃备用。

具体步骤为：将冷冻生物素从冰箱中取出已达到室温，准备检测抗体溶液，并准备10mM生物素溶液(现配现用)，然后加一定体积的生物素溶液于检测抗体溶液中，冰上孵育2h。

透析过程为：将透析袋放入预处理液中，煮沸10min，用蒸馏水洗涤三次后，放入蒸馏水中煮沸10min，处理好的透析袋放入蒸馏水中4℃保存。将检测抗体溶液放入透析袋中，不间断的更换PBS缓冲液，一般至少透析一天。

3.3液相蛋白芯片检测方法的建立及优化

将抗原包被在活化的微球上，将检测抗体与生物素结合，制成生物素化检测抗体；将生物素化的检测抗体加入96孔板中，将偶联到磁珠上的抗原和待检物同时加入各孔，再分别加入藻红蛋白(SA-PE)。通过Bio-Plex液相芯片系统检测得到的荧光信号，通过判断荧光信号强弱来判断待检样品的阴、阳性。

偶联抗原浓度、生物素化抗体加入量、孵育时间等均对检测结果有影响，需确定最佳反应条件。

3.3.1偶联抗原浓度的优化

图1是用分别用1μg、2μg、5μg、8μg、10μg抗原与磁珠进行偶联后进行实验条件的优化。最终得出，随着抗原量的增加荧光信号值不断升高，当偶联的量为5μg时，各个蛋白的荧光信号值都较高，最适量选择微球包被5μg标准抗原。

3.3.2生物素化抗体加入量的优化

生物素化抗体加入量的优化选择1μg、2μg、5μg、10μg、15μg、20μg进行实验。从图2中可以看出随着生物素化抗体加入量升高，荧光值也越高，当检测抗体的浓度为10μg时，各个蛋白的荧光信号值都较高，所以生物素化抗体的最适量选择为10μg。

3.3.3孵育时间的优化

从图3可以看出，不同蛋白孵育10min、30min、60min和90min后，在60min时，检测的荧光信号较高，考虑到本发明的检测时间成本，选择最佳孵育时间为60min。

3.4Bt蛋白标准曲线的建立和CutOff值的确定

将抗原标准品按15000，1500，150，15，1.5，0.15pg/mL的浓度制作标准曲线，96孔板中每孔加入50μL生物素化的检测抗体50μL，加入50μL偶联抗原的微球和50μL各梯度浓度的Bt抗原标准品，作3重复孔，600r/min震荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μL的SA-PE(50μg/mL)，600r/min震荡30min；洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μLPBS缓冲液重悬；采用Bio-Plex悬浮芯片系统检测荧光值并计算蛋白浓度。

根据荧光值计算出的标准曲线见图4，本发明检测方法的最低检测极限为10-50ng/mL之间。

实施例2特异性实验

用本研究建立的液相芯片检测方法，检测EPSPS、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白等其他常见转基因目标蛋白，以验证本方法的特异性。

本研究建立的液相芯片检测方法在检测Bt蛋白时具有较高的荧光值，而与EPSPS、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白等其他常见转基因目标蛋白反应后的荧光值接近空白对照的荧光值，说明本研究建立的方法特异性强，与EPSPS、植酸酶蛋白和耐盐IrrE蛋白其他常见转基因目标蛋白无交叉反应。同时各个Bt蛋白之间也无交叉反应。

实施例3重复性实验

用不同批次标记的微球，在不同的时间检测3个浓度的(100，500和1000pg/mL)Bt蛋白(同一时间检测所用的微球是同一批次的)，计算批内和批间变异系数(CV％)。

对实验研制的Bt蛋白液相芯片检测方法，用不同批次标记的微球，在不同的时间检测3个浓度的(100，500和1000pg/ml)Bt蛋白(同一时间检测所用的微球是同一批次的)，每孔做3次重复，计算批内和批间变异系数(CV％)。从结果可以看出，批内和批间变异系数(CV％)均小于10％，说明该方法具有很好的可重复性。

实施例4保存期试验

将组装好的试剂盒分别保存0天，1月，3月，6月，对Bt蛋白标准品的不同稀释度溶液进行检测，以便验证试剂盒的保存期。

利用保存不同时期的试剂盒，对Bt蛋白标准品进行检测。结果表明，在-20℃避光保存0天、1月、3月、6月后，试剂盒性状稳定，没有发生任何变质现象，试剂盒检测效果也没有降低。

实施例5田间样品检测

以通过我国生物安全性评价，允许作为加工原料进口的转基因玉米MON810、BT11、BT176、T25、GA21、NK603、CBH-351，和我国自行开发的抗虫棉国抗(GK22)、石远321为样品，以Bt标准品为阳性对照，以市售的非转基因的玉米和棉花种子为阴性对照，采用本发明制备的液相芯片进行检测。

参照PlantTotalProteinExtractionKit(Sigma-Aldrich)说明书提取阳性对照、阴性对照和样品总蛋白；将50μL生物素化的检测抗体(0.2mg/L)加入96孔板中，将50μL偶联抗原的微球和50μL待检物同时加入各孔，作3重复孔，600r/min振荡1h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μL的SA-PE(50μg/mL)，600r/min振荡30min；洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μLPBS缓冲液重悬；通过Bio-Plex液相芯片系统检测得到的荧光信号，通过判断荧光信号强弱来判断待检样品的阴、阳性。

检测结果表明，对于GK-22和石远321物种，检测出Btcry1Ac；BT11、BT176、MON810检出含Btcry1Ab；CBH-351检出含Btcry9C；对于T25、GA21、NK603、非转基因玉米和棉花，未检测出Btcry蛋白。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种检测多种Bt蛋白的液相芯片，其特征在于，主要包括下列成分：

1)偶联抗原的微球；

2)生物素化的检测抗体；

所述检测抗体为上述抗原的单克隆抗体；

3)链亲和素藻红蛋白。

2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，抗原蛋白与微球的偶联浓度为5μg/100μL。

3.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述偶联抗原的微球的制备方法为：

4.利用权利要求1-3任一项所述的液相芯片检测多种Bt蛋白的方法，其特征在于，其是将50μL生物素化的检测抗体(0.2mg/L)加入96孔板中，将50μL偶联抗原的微球和50μL待检物同时加入各孔共同孵育，再分别加入50μL链亲和素藻红蛋白(50μg/mL)，通过Bio-Plex液相芯片系统检测得到的荧光信号，通过判断荧光信号强弱来判断待检样品的阴、阳性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，生物素化的检测抗体加入量为10μg。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，孵育时间为60min。