CN103454412B

CN103454412B - 一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法

Info

Publication number: CN103454412B
Application number: CN201310420276.0A
Authority: CN
Inventors: 程爱阳
Original assignee: NANJING BOMINDA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING BOMINDA BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-16
Filing date: 2013-09-16
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-09-16
Also published as: CN103454412A

Abstract

本发明公开了一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其主要组成包括：(1)多种常见过敏原探针：含有分别包被了螨、蟑螂、豚草、艾蒿、狗毛、猫毛、大豆、花生、牛奶、鸡蛋、虾以及蟹过敏原提取物的12种荧光编码微球；(2)生物素标记的检测抗体；(3)链亲和素藻红蛋白；以及在对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量检测时才需要使用的(4)总IgE探针，即包被了小鼠抗人IgE单克隆抗体的荧光编码微球。本发明还公开了上述液相芯片探针的制备方法。本发明所述液相芯片主要用于检测血清样品中的过敏原特异性IgE抗体，也可以用于检测过敏原特异性IgG4抗体和总IgE抗体，具有使用样品少，多个指标平行检测，高通量，灵敏度高等优点。

Description

一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药类免疫化学领域，涉及一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法。

背景技术

过敏是一种常见病，世界卫生组织的数据表明，20-40%的人都曾罹患过敏性疾病。它是由过敏原（或称变应原）诱发，并由结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE抗体所介导的变态反应，即所谓的Ⅰ型变态反应。过敏原是一些外源性蛋白质，在进入人体后可以与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表面的IgE抗体结合，并引起过敏反应。

过敏诊断包括临床病史、皮肤试验和过敏原特异性IgE检测三部分，只有在三者一致的情况下，才能确诊。过敏原特异性IgE抗体检测，又称为体外过敏原检测，其目的是了解血液中针对某一特定过敏原的IgE抗体含量，从而推断患者体内的相关细胞是否可以与该过敏原结合，以便于过敏性疾病的诊断和治疗。

目前广为接受的过敏原特异性IgE抗体检测方法均采用“夹心法”，其检测流程和基本原理为：首先，将过敏原与固相支持物结合；之后，将患者血清样品与固相支持物孵育，样品中的过敏原特异性IgE抗体与固相支持物上的过敏原结合，形成“过敏原-IgE”复合物；然后，与携带有抗IgE抗体的报告分子孵育，形成“过敏原-IgE-报告分子”夹心复合物；最后，通过测量报告分子得到固相支持物上IgE的含量。

根据固相支持物和报告分子的不同，过敏原特异性IgE抗体检测的方法可以分成三类：（1）ImmunoCAP法，由瑞典的Phadia公司开发，使用纤维素衍生物为固相支持物，具有过敏原种类多，结果准确的优点，也是过敏原特异性IgE检测的金标准，不过价格相对昂贵；（2）酶联免疫法或化学发光法，通常采用酶标微孔板为固相支持物，报告分子分别为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，也是最常见的方法；以及（3）免疫印迹法及蛋白质芯片法是将过敏原吸附到膜或玻璃上，通过过敏原在固相支持物上不同的位置来区分不同种的过敏原。方法（1）和（2）可以进行定量或半定量地检测过敏原特异性IgE抗体，但是它们主要的技术缺点是每次反应只能检测一种指标，并且使用血清样品量较大。而方法（3），虽然理论上一次可以检测多个指标，但是免疫化学反应发生在固相-液相之间，重复性差，灵敏度低，结果不稳定，只能进行定性检测，并且使用样品量大。

在体内除了IgE抗体，IgG4抗体也可以特异性地结合过敏原。IgG4抗体在人IgG抗体的四个亚型中含量最低，通常只占IgG抗体总数的6%左右。与其它的IgG亚型相比较，IgG4诱导补体能力和细胞活化性偏低，因此过敏原特异性IgG4抗体具有免疫调节功能，对过敏原特异性IgG4抗体进行检测也具有重要的临床意义。

过敏原的种类繁多，已知的过敏原超过两万种；最常见的过敏原就有六十多种，可以大致分为：（1）食物类过敏原，包括肉蛋奶、粮食和水果等；以及（2）吸入类或接触类过敏原，包括花粉、动物皮毛、昆虫、霉菌孢子等。由于过敏原种类繁多，过敏的确诊比较困难，所以理想的体外过敏原检测应当具有筛查性质，即对十几种或几十种过敏原进行系统性筛查，这样才能有助于疾病的确诊。但是通常的过敏原特异性IgE抗体检测方法，例如ImmunoCAP法、酶联免疫法和化学发光法，每次反应只能获得一个指标；如果要检测多个指标，则需要多个反应来完成，不仅浪费时间与劳动力，同时消耗了大量的样品与试剂，检测成本相对较高。因此，从医疗需求看，体外过敏原检测迫切需要采用多重检测技术，也就是每个检测反应，可以同时检测多个指标，从而降低成本，省力，省时。

液相芯片技术（或称xMAP技术）是由美国Luminex公司开发的一种多功能多重检测技术平台，可以对生物分子进行高通量、多重检测。液相芯片技术中，固相支持物是带有荧光物质编码的羧基化聚苯乙烯微球，根据平台的不同，微球分别有100种（双色编码）或500种（三色编码）。使用时，首先将微球与相关生物分子进行化学偶联获得探针；检测时，将探针与待测物反应。反应产物通过液相芯片仪的检测通道，使用不同波长的激光分别读取微球的编码以及待测样本上的报告分子（藻红蛋白），实现对样品中待测分子的定量分析。同经典的免疫化学方法相比较，液相芯片法有三点优势：（1）使用微米直径的微球，将免疫化学反应体系由传统的液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的液相反应体系，具有反应速度快、重复性好、灵敏度高的优点；（2）多个指标的并行检测，可以同时检测数百个指标；由于常见的过敏原有六十余种，该技术适合于体外过敏原筛查；以及（3）使用样本少，每次反应只需要数十微升的血清。

发明内容

目的：针对现有体外过敏原检测手段一次只能检测一种指标的技术不便和未能满足的临床诊断需求，本发明提供一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法，该液相芯片主要用于检测样品中的过敏原特异性IgE抗体，也可以用于检测过敏原特异性IgG4抗体以及总IgE抗体，为过敏性疾病的诊断提供了一种全面、准确、方便的临床检测手段。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一、一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括：

A：过敏原探针：所述过敏原探针为一种单独使用或多种选择性地组合使用；每种过敏原探针为分别包被了一种过敏原提取物的荧光微球，不同种类的过敏原探针分别具有不同的荧光编码；一般常用的为12种过敏原探针：含有分别包被了螨、蟑螂、豚草、艾蒿、狗毛、猫毛、大豆、花生、牛奶、鸡蛋、虾、蟹过敏原提取物的12种微球。

B：生物素标记的抗IgE检测抗体或生物素标记的抗IgG4检测抗体，分别用来检测结合到过敏原探针探针上的IgE抗体或IgG4抗体；当对人血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗人IgE或抗人IgG4检测抗体；当需要对动物（例如犬类）的血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗该种动物IgE的检测抗体或抗该种动物相当于人IgG4的IgG亚类的检测抗体；

C：报告分子：链亲和素藻红蛋白（SA-PE）或链亲和素Cy3。

所述液相芯片用于半定量或定量检测过敏原特异性IgE抗体时，还包括：D：总IgE探针，即抗人IgE单克隆抗体包被的荧光微球，用于准备IgE标准曲线。

由于液相芯片本身的技术特点，即（1）探针可以自由选择和组合；（2）检测抗体可以更换；（3）报告分子也可以更换，因此本发明所述液相芯片在使用时可以根据具体情况灵活地加以组合和简化。例如，a）如果只检测部分过敏原特异性抗体，可以只使用一种过敏原探针或多种过敏原探针的任意组合；b）当对样品中的过敏原特异性IgE进行定性测量时，可以不使用IgE标准曲线，此时可以单独使用过敏原探针，不使用总IgE探针；c）当对样品中的过敏原特异性IgG4进行定性测量时，可以单独使用过敏原探针和生物素标记的抗IgG4检测抗体；d）如果只检测样品中的总IgE抗体含量，可以单独使用总IgE探针，不使用过敏原探针。

二、本发明也提供一种上述用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片中过敏原探针和/或总IgE探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）1a：当制备过敏原探针时，准备过敏原溶液：将过敏原提取物完全溶解于缓冲溶液中形成过敏原溶液，并测定其蛋白质含量；缓冲溶液为0.05M的MES缓冲液，其pH值为5.5-6.5；或者为0.01M磷酸盐PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；

1b：当制备总IgE探针时，准备抗体溶液：将抗人IgE抗体对缓冲溶液反复透析，并测定其蛋白质含量；

（2）微球活化：

－取适量羧基化荧光编码微球，在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；

－将微球重新悬浮于超纯水中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理20-60秒，在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；

－将微球悬浮于pH值为5.5-6.5，0.05M-0.2M的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液（MES缓冲液）中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理20-60秒，在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理20-60秒后，分别加入过量新鲜配置的50mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐(Sulfo-NHS)溶液和过量新鲜配置的50mg/ml水溶性碳二亚胺（EDC）溶液；在室温下，避光孵育20-30分钟，每5分钟将其温和地颠倒混匀；孵育完成后在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；重复该步骤；

（3）微球包被：

－在包被过敏原探针时，将活化后的微球悬浮于与过敏原溶液相同的缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理20-60秒；

－在包被总IgE探针时，将活化后的微球悬浮于与抗体溶液相同的缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理20-60秒；

－向微球中加入设定量的过敏原或者抗体，室温下避光混匀2-4小时，其后在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；

－将包被后的微球悬浮于上述缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理，在≥8000g离心2-3分钟，吸弃上清；重复该步骤；

（4）微球的封闭与保存：

－将微球悬浮并避光保存于含有牛血清白蛋白的贮存液中；

－本发明中将经过包被与封闭并可以在后续检测中使用的微球称为探针，将各种探针通过血球计数板计数，使用时依据检测需求混合。

作为优选方案，所述步骤（1）中的缓冲溶剂为50-100mM的MES缓冲液，其pH值为5.5-6.5；或者为0.01M PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4。

作为优选方案，所述步骤（1）中的过敏原为过敏原提取物冻干粉，先将其溶解于上述MES缓冲液中，获得蛋白质浓度≥0.1mg/ml的过敏原溶液；如果过敏原提取物冻干粉在上述条件下不溶解，可将其溶解于上述PBS缓冲液中，获得蛋白质浓度≥0.1mg/ml的过敏原溶液。

作为优选方案，所述步骤（1）中，将抗人IgE抗体对上述PBS缓冲液透析三次，如果有必要，将抗体溶液浓缩到蛋白质浓度≥0.1mg/ml。

作为优选方案，所述步骤（2）中如果使用1×10⁶-6.25×10⁶个荧光微球，应将其悬浮于0.48ML的50mM MES缓冲液（pH5.5-6.5）中，经超声分散处理后，加入10μl的50mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐（Sulfo-NHS）溶液，混匀后加入10μl的50mg/ml水溶性碳二亚胺（EDC）溶液；和/或，超声分散处理的时间为20-60秒，超声波频率为20KHz。

作为优选方案，所述步骤（3）中活化后的荧光微球首先应当悬浮于与制备过敏原溶液/抗体溶液相同的缓冲溶液中，再向悬浮的微球中加入一定量的过敏原/抗体。如果使用1×10⁶-6.25×10⁶个荧光微球，偶联反应体积为0.5ml。

作为优选方案，所述步骤(3)中，微球数量与加入的过敏原溶液的对应关系为：每1×10⁶个微球对应含有1.0-2.0μg蛋白质的过敏原溶液；微球数量与加入的抗体溶液的对应关系为：每1×10⁶个微球对应含有1.0-2.0μg蛋白质的抗体溶液；

作为优选方案，所述步骤(4)中，贮存液的溶剂为pH值为7.2-8.0，浓度为0.01M-0.05M的PBS缓冲溶液；其中含有0.1-1.0wt％牛血清白蛋白，0.01-0.05wt％吐温-20和0.1-0.5wt％叠氮钠；所述PBS缓冲溶液为含0.8wt％NaCl的磷酸盐缓冲液。

三、本发明还提供了一种将上述液相芯片用于过敏原特异性抗体或总IgE抗体的检测方法，包括以下步骤：

步骤（a）微球与待测抗体结合：

－如果需要检测血清中的多种过敏原特异性抗体（IgE或IgG4），将2-50μl血清与过敏原探针混合孵育。如果样品中存在过敏原特异性抗体，它们与相应的过敏原探针结合，洗去没有与探针结合的抗体和杂质蛋白质；

－如果需要检测血清中的总IgE抗体，将0.5-2μl血清与总IgE探针孵育，样品中的IgE抗体被总IgE探针捕获，洗去杂质蛋白质；

步骤（b）准备总IgE抗体标准曲线：

－当对样品中的过敏原特异性IgE抗体或者总IgE抗体进行定量或半定量检测时，需要准备总IgE抗体标准曲线：将IgE标准品与总IgE探针孵育，IgE标准品与总IgE探针结合，洗去杂质蛋白质；

－如果对样品中的过敏原特异性IgE抗体或者过敏原特异性IgG4抗体进行定性检测时，则步骤（b）可以省略；

步骤（c）探针与检测抗体和报告分子的结合：

－将步骤（a）（b）中得到的探针与生物素标记的检测抗体孵育，检测抗体与探针所捕获的待测抗体结合，洗去没有结合的检测抗体；

－将结合了检测抗体的探针与链亲和素藻红蛋白(SA-PE)孵育，通过生物素与链亲和素的高度特异性的结合，SA-PE与探针结合，洗去没有与探针结合的SA-PE；

按照上述流程，将样品与多种过敏原探针反应，如果加入抗IgE检测抗体/SA-PE，最终形成多种“过敏原探针－过敏原特异性IgE－检测抗体/SA-PE”复合物；将样品与多种过敏原探针反应，如果加入抗IgG4检测抗体/SA-PE，最终形成多种“过敏原探针－过敏原特异性IgG4－检测抗体/SA-PE”复合物；将IgE标准品与总IgE探针反应，加入抗IgE检测抗体/SA-PE，形成“总IgE探针－IgE标准品－检测抗体/SA-PE”复合物；将样品与总IgE探针反应，加入抗IgE检测抗体/SA-PE，形成“总IgE探针－样品IgE－检测抗体/SA-PE”复合物。

步骤（d）使用Luminex系列液相芯片仪读取微球数据：

－将上述各探针微球悬浮于分析缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理；

－仪器读取微球的颜色编号以及SA-PE的荧光强度中位值（MFI）；

作为优选方案，所述步骤(a)（b）中，每种过敏原探针和总IgE探针的使用数目均在500个-5000个之间，并且每种过敏原探针和总IgE探针的使用数目相等。如果需要对检测指标进行定量或半定量检测，则每种探针的使用数目应当保持恒定，更优选地，每种探针的使用数目应当相等。

作为优选方案，所述步骤(a)中，如果检测血清中的过敏原特异性IgE抗体含量，血清量用量为20μl，如果进行过敏原特异性IgG4检测，血清量用量为5μl，如果检测总IgE含量，血清量用量为1μl；所述步骤(c)中，抗IgE检测抗体和抗IgG4检测抗体的使用浓度均为0.2-1.0μg/ml，SA-PE的使用浓度是1.0-2.5μg/ml；

四、本发明还提供一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法，包括以下步骤：

1）以IgE标准品的浓度为横坐标，对应的微球荧光强度中位值MFI为纵坐标作图，获得五参数拟合曲线（5PL），即MFI=A+(D/(1+(X/C)^B)^E)，其中MFI为微球荧光强度中位值，A、B、C、D、E为方程式参数，可通过相关软件计算得到；

2）将待测IgE的MFI值代入方程式，就可计算得到待测IgE的含量（X值），所用公式为X=C{[D/(MFI-A)]^(1/E)-1}^(1/B)；

3）根据上述计算得到的IgE的含量-X值和血清样品稀释倍数，计算出样品中过敏原特异性IgE抗体或总IgE抗体的浓度。

微球的MFI值与待测指标的含量符合五参数拟合曲线（5PL），由于该曲线为非线性方程，因此仅凭MFI值只能进行定性测量。如果要对待测指标进行半定量或定量检测，应当首先建立标准曲线。通常情况下，标准曲线采用与待测指标一致的已知浓度的标准品获得，但是在过敏原特异性IgE检测中，过敏原特异性IgE抗体标准品难以获得。本发明中，为了获得标准曲线，使用总IgE探针和IgE标准品替代过敏原探针和过敏原特异性IgE抗体标准品，这一方法是基于以下认知，

－首先，通过微球的颜色编号可以辨别检测项目；例如，使用艾蒿过敏原提取物包被21号微球，则21号微球反映的指标是艾蒿过敏原特异性抗体；

－每个微球的MFI值取决于该微球结合了多少检测抗体和报告分子，所以MFI值与微球捕获抗体的量呈正相关，而与微球捕获抗体的方式无关。换句话说，在同一检测中，如果一个过敏原探针微球与一个总IgE探针微球的MFI值相等，则过敏原探针所结合过敏原特异性IgE分子的数目等于总IgE探针所结合的IgE分子数目；

－当标准品反应中探针的使用数目与待测反应中每种探针的使用数目相等时，IgE标准品和待测IgE抗体被等分于相同数目的微球上，则可以通过IgE标准曲线计算出待测探针上IgE的量。

有益效果：本发明提供了一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方案，1）在探针制备（微球包被）上，现有的探针制备方案普遍使用纯化的蛋白质为偶联原料，而本发明使用的偶联原料是蛋白质粗提物：其蛋白质含量只占总质量的1/5-1/8，杂质成分复杂且含量高，因此制备过敏原探针的技术难度较大；2）采用本发明所述的液相芯片，使用数十微升血清样品就可以检测12种过敏原特异性IgE抗体、IgG4抗体和总IgE抗体，为过敏性疾病的诊断提供了一种全面、准确、方便的临床检测手段。由于可以通过指尖采血的方式获得足够量的血清完成各种指标的检测，本发明极大地方便了婴幼儿患者。

与金标准ImmunoCap法相比较，本方案除了可以一次同时检测多个指标的优点外，检测中使用的试剂量少，其成本远低于ImmunoCap法。与常见的酶联免疫法、化学发光检测等方法相比较，本方案除了具有使用样品量少，可以一次同时检测多个指标的优点外，反应环境均接近体内环境，有利于保持生物大分子的天然空间构象，抗原－抗体反应更快更完全，所以检测灵敏度更高，线形范围更宽，重复性更好。

本发明所公布的技术方案中的各项工艺参数，例如多种过敏原探针和总IgE探针的制备、反应过程等均建立于大量的试验数据基础上，为制备过程与反应过程的最佳的参数值。

附图说明

图1为本发明具体实施例2和3中的IgE标准曲线，其中以IgE标准品的浓度的对数值为横坐标，以微球MFI的对数值为纵坐标。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：本发明所述的用于检测过敏原特异性抗体的液相芯片的组成

本实施例中，各种溶液的配方如下：

分析缓冲液，即PBS中含0.1%BSA，0.025%Tween-20，0.05%NaN3，pH7.4。

(一)用于检测12种过敏原特异性抗体的液相芯片，组成如下

（1）探针：12种过敏原探针和总IgE探针的制备方法见实施例2；各种探针的包被物与微球的荧光编码如下，

（2）检测抗体：a）生物素标记的山羊抗人IgE抗体，用来检测过敏原特异性IgE、IgE标准品以及总IgE；或b）生物素标记的小鼠抗人IgG4抗体，用于过敏原特异性IgG4抗体的检测；

（3）链亲和素标记藻红蛋白（SA-PE）；如果结果的信号较强，也可以使用链亲和素标记Cy3替代SA-PE。此外，按照现有技术常规配套设有：

（4）人IgE标准品，100ng/ml；

（5）质控液；

（6）96孔滤板。

实施例2：一种制备用于本发明所述液相芯片的12种过敏原探针和总IgE探针的方法

（一）本实施例中，各种溶液的配方如下：

1、50mM的MES缓冲液，pH6.0

2、磷酸盐缓冲液，即PBS，pH7.4

3、贮存缓冲液，即PBS中含0.5%BSA，0.05%Tween-20，0.1%NaN3，pH7.4。

溶液配制后经0.22μM滤器过滤，2-8摄氏度避光保存。

（二）本实施例中，主要试剂和耗材来源如下，

12种过敏原冻干粉：螨、蟑螂、豚草、艾蒿、狗毛、猫毛、大豆、花生、牛奶、鸡蛋、虾、蟹过敏原提取物冻干粉购自美国Greer实验室；

不同荧光编码的羧基化微球购自美国Luminex公司；

（三）上述12种过敏原探针的方法，包括如下步骤：

（1）过敏原溶液：

－蟑螂和花生过敏原冻干粉使用上述PBS缓冲液溶解，其余十种（螨、豚草、艾蒿、狗毛、猫毛、大豆、牛奶、鸡蛋、虾、蟹）过敏原冻干粉使用上述MES缓冲液溶解；

－分别称取12种过敏原冻干粉，分别完全溶解于上述缓冲溶液中，其蛋白质浓度范围是0.1-2mg/ml，在零下负18至负20度保存。

（2）微球的活化：

－分别选取不同编码的荧光微球，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒，将100μl荧光微球（约1.25×10⁶个），转移到1.5ml的离心管中，≥8000g离心3分钟，将微球与液体分离并吸弃上清；

－将微球重新悬浮于500μl超纯水中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒，≥8000g离心3分钟，吸弃上清；

－将微球重新悬浮于500μl上述MES缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒，≥8000g离心3分钟，吸弃上清；

－将微球悬浮于480μl上述MES缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒，加入10μl50mg/ml的Sulfo-NHS溶液，混匀后加入10μl50mg/ml的EDC溶液并混匀。以上两种溶液均使用超纯水新鲜配置。在室温下，避光孵育20min，每5分钟将其温和地颠倒混匀；孵育完成后，≥8000g离心3分钟，吸弃上清。

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒，≥8000g离心3分钟，吸弃上清；重复该步骤；

（3）微球的包被：

－本步骤中使用的包被缓冲液应当与过敏原溶液保持一致，即在包被蟑螂和花生过敏原探针时，使用上述PBS缓冲液；在包被螨、豚草、艾蒿、狗毛、猫毛、大豆、牛奶、鸡蛋、虾、蟹过敏原探针时，使用上述MES缓冲液；

－将微球悬浮于400μl缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒；

－向微球中加入含有2μg蛋白质的过敏原溶液，并用缓冲液将总体积补至500μl；室温下避光混匀孵育3小时后，在≥8000g离心3分钟，吸弃上清；

－将微球悬浮于500μl上述贮存缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒，≥8000g离心3分钟，吸弃上清；重复该步骤；

（4）微球的封闭与保存：

－将每种微球悬浮并保存于500μl贮存缓冲液中，置于2-8℃避光保存；

－将每种微球计数，使用时依据检测需求确定使用的种类与数目；

－在完成过敏原包被和封闭后，所述微球可以用于检测过敏原特异性抗体，在本发明中简称为过敏原探针；

（四）制备上述总IgE探针的方法，主要步骤包括：

（1）将小鼠抗人IgE单克隆抗体对上述PBS缓冲液透析三次，将其蛋白质浓度调至1mg/ml，并保存在零下负18至负20度；

（2）微球活化：

－与实施例2第(三)部分步骤(2)完全相同；

（3）微球包被：

－将微球悬浮于500μl上述PBS缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒；

－向微球中加入2μg抗体，室温避光混匀3小时，≥8000g离心3分钟，吸弃上清；

－将微球悬浮于500μl上述贮存缓冲液中，涡旋震荡30秒，超声波处理30秒，≥8000g离心3分钟，吸弃上清；重复该步骤；

（4）微球的封闭与保存：

－将探针悬浮并保存于500μl贮存缓冲液中，置于2-8℃避光保存；

－将探针计数，使用时依据检测需求确定使用数目；

实施例3：将本发明所述液相芯片用于检测血清中的12种过敏原特异性IgE抗体

（一）其步骤如下，

1、使用前先取出所有试剂，放置平衡到室温（20-25摄氏度）。

2、标准品的稀释：IgE标准品的原液浓度为100ng/ml；使用分析缓冲液，将标准品按照1:2比例进行梯度稀释，获得所需的终浓度。各管稀释方案、预期浓度以及反应体系中IgE的含量如下，

编号	标准品系列	稀释液体积	IgE预期浓度	IgE量/100μL
					Std1	原液	无	100ng/mL	10ng
Std2	200μL原液	400μL分析缓冲液	33.3ng/mL	3.33ng
					Std3	200μL Std2	400μL分析缓冲液	11.1ng/mL	1.11ng
Std4	200μL Std3	400μL分析缓冲液	3.70ng/mL	0.370ng
					Std5	200μL Std4	400μL分析缓冲液	1.23ng/mL	0.123ng
Std6	200μL Std5	400μL分析缓冲液	0.41ng/mL	41pg
					Std7	200μL Std6	400μL分析缓冲液	0.137ng/mL	13.7pg
Std8	200μL Std7	400μL分析缓冲液	0.046ng/mL	4.6pg

3、待测样品：在检测过敏原特异性IgE抗体时，将血清用分析缓冲液作1:4稀释；在检测总IgE抗体含量时，将血清用分析缓冲液作1:100稀释；

4、取出探针，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒；使用分析缓冲液，将总IgE探针稀释到100个微球/μl；将12种过敏原探针混合，使用分析缓冲液将探针稀释到1200个微球/μl，即每种过敏原探针的浓度是100个微球/μl。

5、检测时采用96孔板，在液相芯片仪控制软件上设置空白、标准品以及待测样品的参数。

6、按照设置好的96孔板布局，

1)向空白孔加入100μl分析缓冲液，向标准品孔和待测样品孔中依次加入100μl标准品和100μl待测样品；

2)将稀释后的探针涡旋震荡30秒，将探针悬浮；

3)向标准品孔中加入10μl总IgE探针；向空白孔和待测样品孔中加入10μl过敏原探针；如果需要测定血总IgE含量，则向待测样品孔中加入10μl总IgE探针；

4)用铝箔包裹96孔滤板以避光，放置于在微孔板摇床上，在室温下振荡孵育60分钟，转速为500-700转/分钟；用真空抽滤去掉反应液，每孔使用250μl分析缓冲液洗涤两次；

5)用分析缓冲液将生物素标记的检测抗体稀释到0.5μg/ml；每孔加入100μl检测抗体稀释液；用铝箔包裹96孔滤板以避光，放置于在微孔板摇床上，在室温下振荡孵育30分钟，转速为500-700转/分钟；

6)用真空抽滤去掉反应液，每孔使用250μl分析缓冲液洗涤两次；

7)用分析缓冲液将SA-PE稀释到2.5μg/ml，每孔加入100μl的SA-PE稀释液；用铝箔包裹96孔滤板以避光，放置于在微孔板摇床上，在室温下振荡孵育30分钟，转速为500-700转/分钟；

8)用真空抽滤去掉反应液，每孔使用250μl分析缓冲液洗涤一次；

9)向每孔加入150μl分析缓冲液，用铝箔包裹96孔滤板以避光，放置于在微孔板摇床上，在室温下振荡2-5分钟，转速为500-700转/分钟，将微球悬浮；

10)于液相芯片仪以上读取结果，仪器软件可以自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的数值。

（二）数据分析的原理与步骤

本发明所述方法中，将总IgE标准曲线用于过敏原特异性IgE抗体的半定量或定量检测，其基本原理如下，

1)在液相芯片检测中，探针的MFI值与待测指标的含量符合五参数拟合曲线，该曲线为非线性方程；只有建立标准曲线并得到该曲线的各个参数后，才能进行定量或半定量检测。

2)每个微球的MFI值取决于该微球结合了多少检测抗体及报告分子，所以MFI值与微球捕获的待测抗体的量呈正相关，而与微球捕获该抗体的方式无关。换句话说，在检测IgE抗体时，如果一个过敏原探针微球与一个总IgE探针微球的MFI值相等，则这两个微球捕获了同等数目的IgE抗体分子。

3)如果标准品反应中探针的使用数目与待测反应中每种探针的使用数目相等，并且当检测反应中的IgE数量低于探针可结合的IgE数量时，反应中绝大多数的IgE标准品和待测IgE抗体被等分于相同数目的微球上，则可以通过IgE标准曲线对待测样品中的过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量检测。

数据分析的具体步骤如下：

1)以IgE标准品的预期浓度(x)为横坐标，对应的微球荧光强度中位值(MFI)为纵坐标作图，获得五参数拟合曲线(5-PL)及其方程式参数值，即MFI=A+(D/(1+(X/C)^B)^E)，其中A、B、C、D、E为方程式参数；

2)将待测样品的每个MFI值减去空白孔中与之对应的MFI值，获得MFI净值，将其代入方程式X=C{[D/(MFI-A)]^(1/E)-1}^(1/B)，就可计算得到待测探针上IgE的含量(X值)；

3)根据上述IgE含量(X值)和稀释倍数，对样品中过敏原特异性IgE抗体进行半定量获定量检测。

（三）实验结果如下：

1、IgE标准曲线：

通过仪器的数据分析软件，绘制五参数拟合标准曲线（见图-1），即F(x)=A+(D/(1+(X/C)^B)^E)，其中F(x)是MFI，X是IgE浓度。软件计算出的各个参数值为A=25.5148；B=-0.955744；C=89.7428；D=33197.1；E=1.18279。

结果的具体数值见下表。

实验结果显示，在采用上述标准反应条件时，对总IgE检测的灵敏度≤5pg，其线形范围（Std1-Std6)为0.4ng/mL-10ng/ml，在此范围内，实测浓度与预期浓度的相对误差不超过5%。

2、对血清样品的总IgE抗体进行定量检测：

对10份血清样品进行总IgE检测，样品量为1μl血清。按照仪器软件指令，输入样品及标准品的稀释倍数，软件自动生成五参数拟合曲线（5PL），并自动计算出IgE的浓度。实验结果如下，

上表中，MFI为待测样品的实际MFI值减去空白MFI值，IgE浓度为血清中的总IgE浓度。

3、对28份血清样品进行12种过敏原特异性IgE抗体检测，结果如下：

上述结果单位为荧光强度的中位值(MFI)。在对样品中的过敏原特异性IgE抗体进行定量时，将相关MFI值代入方程式X=C{[D/(MFI-A)]^(1/E)-1}^(1/B)就可以计算得到抗体浓度（X值）；其中各个参数值为A=25.5148；B=-0.955744；C=89.7428；D=33197.1；E=1.18279。以28号样品为例子，其螨过敏原特异性IgE的MFI值为10887，将该值代入即可获得的X值＝55.98ng/ml；该样品的稀释倍数为5，因此，28号样品中螨过敏原特异性IgE的抗体浓度是280ng/ml。

实施例4：采用本发明所述液相芯片检测血清中的过敏原特异性IgG4抗体

（一）其步骤如下，

2、待测样品：将5μl血清与95μl分析缓冲液混匀；

3、取出探针，涡旋震荡30秒，超声波分散处理30秒；使用分析缓冲液，将探针稀释到1200个微球/μl，即每种过敏原探针的浓度是100个微球/μl。

4、检测时采用96孔板，在液相芯片仪控制软件上设置空白孔以及待测样品的位置。

5、按照设置好的96孔板布局，

1)向空白孔加入100μl分析缓冲液，向待测样品孔中100μl待测样品；

2)将稀释后的探针涡旋震荡30秒，将探针悬浮。

3)向空白孔和待测样品孔中加入10μl过敏原探针；

5)用分析缓冲液将检测抗体稀释到0.5μg/ml；每孔加入100μl检测抗体稀释液；用铝箔包裹96孔滤板以避光，放置于在微孔板摇床上，在室温下振荡孵育30分钟，转速为500-700转/分钟；

10)于Luminex系列液相芯片仪以上读取结果。

（二）实验结果如下：

对12份血清样品进行过敏原特异性IgG4检测，结果如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括：

A:过敏原探针：所述过敏原探针为一种单独使用或多种选择性地组合使用；每种过敏原探针为分别包被了一种过敏原提取物的荧光微球，不同种类的过敏原探针分别具有不同的荧光编码；

B:生物素标记的抗IgE检测抗体或生物素标记的抗IgG4检测抗体，分别用来检测结合到过敏原探针上的IgE抗体或IgG4抗体；当对人血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗人IgE或抗人IgG4检测抗体；当需要对动物的血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗该种动物IgE的检测抗体或抗该种动物相当于人IgG4的IgG亚类的检测抗体；

C:报告分子：链亲和素藻红蛋白SA-PE或链亲和素Cy3；

其中，所述过敏原探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备过敏原探针时，准备过敏原溶液：将过敏原提取物冻干粉完全溶解于缓冲溶液中形成过敏原溶液，并测定其蛋白质含量；所述缓冲溶液为0.05M的MES缓冲液，其pH值为5.5-6.5；或者为0.01M磷酸盐PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；

(2)微球活化：

－取适量羧基化微球，离心并吸弃上清；将微球重新悬浮于超纯水中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理，离心并吸弃上清；将微球悬浮于pH值为5.5-6.5，含0.05M-0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，离心并吸弃上清；

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，分别加入过量新鲜配置的50mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐即Sulfo-NHS和过量新鲜配置的使用的50mg/mL水溶性碳二亚胺即EDC溶液；在室温下，避光孵育20-30min，每5分钟将其温和地颠倒混匀；孵育完成后离心并吸弃上清；

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，离心并吸弃上清；重复该步骤；

(3)微球包被：将活化后的微球悬浮于对应的MES缓冲液或PBS缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理；

－向微球中加入设定量的过敏原溶液或者抗体溶液，室温下避光孵育2-4h，其后离心移去上清；

－将包被后的微球悬浮于MES缓冲液或PBS缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理，离心并吸弃上清；重复该步骤；

(4)微球的封闭与保存：

－将包被好的微球悬浮并保存于含有牛血清白蛋白的贮存液中；

－每种包被与封闭好并可以在后续检测中使用的微球称为探针，探针通过血球计数板计数，使用时依据检测需求比例混合。

2.根据权利要求1所述的用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片用于对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量检测时，还包括：D:总IgE探针：抗人IgE单克隆抗体包被的荧光微球，用于准备IgE标准曲线。

3.根据权利要求2所述的用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述总IgE探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备总IgE探针时，准备抗体溶液：将抗人IgE抗体对0.01M磷酸盐缓冲液反复透析，并测定其蛋白质含量；

(2)微球活化：

(4)微球的封闭与保存：

4.一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法，包括以下步骤：

1)以IgE标准品浓度为横坐标，对应的微球荧光强度中位值MFI为纵坐标作图，获得五参数拟合曲线，即MFI＝A+(D/(1+(X/C)^B)^E)，其中MFI为微球荧光强度中位值，A、B、C、D、E为方程式参数，可通过相关软件计算得到；

2)将待测血清样品的MFI值代入方程式，就可计算得到待测IgE的含量，即X值，所用公式为X＝C{[D/(MFI-A)]^(1/E)-1}^(1/B)；

3)根据上述计算得到的IgE的含量-X值和血清样品稀释倍数，计算出样品中过敏原特异性IgE抗体或总IgE抗体的浓度。

5.根据权利要求4所述的一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法其特征在于：

－使用总IgE探针和IgE标准品获得标准曲线，并使用该标准曲线计算过敏原特异性IgE抗体的含量；

－在检测反应中，总IgE探针的使用数目和每种过敏原探针的使用数目相等或为已知比例。

6.根据权利要求5所述的一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法其特征在于：每种过敏原探针和总IgE探针的使用数目均在500个-5000个之间，并且每种过敏原探针和总IgE探针的使用数目相等。