CN109613271A - 一种检测常见室内吸入过敏原抗体的芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够同时检测常见室内吸入过敏原抗体浓度的蛋白芯片，所述芯片通过如下步骤制得：（1）黑玻片预处理；（2）点样过敏原蛋白溶液；（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。本发明芯片用于检测病人的血液中过敏原抗体的浓度，由此判断病人对待测过敏原是否过敏以及程度高低。本方法形成的试剂盒使用方便，检出率高，而且还可以实现过敏原抗体检测的全自动化操作。

Description

一种检测常见室内吸入过敏原抗体的芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测常见室内吸入过敏原抗体浓度的芯片及其制备方法。

背景技术

随着全球经济水平的快速发展、人们的生活方式及居住环境条件的巨大变化，疾病谱也随之发生变化。2013年由世界卫生组织召开的世界卫生大会上已经明确提出：以过敏性疾病为代表的慢性非传染性疾病(NCD)，由于起病早、病情易波动反复、临床表型复杂多样等特点，已成为全球公共卫生关注的热点。

过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体对接触的某些致敏物质初次应答致敏后，再次接触相同致敏物质刺激时，所出现的一种以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的异常免疫应答的疾病。过敏性疾病从新生儿到老年人的各个年龄阶段都可能发生，往往具有明显的遗传倾向。儿童过敏性疾病主要有过敏性休克、皮肤荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠炎等。而对于过敏性疾病的诊治，较对症治疗更重要的是检测出具体的致敏物质，并避免与之接触，以达到预防的目的。因此，检测过敏原抗体、分析其检测结果对儿童过敏性疾病的诊断、治疗及预防具有重要意义。

吸入性过敏原的种类繁多，主要分室内过敏原和室外过敏原。室内过敏原包括尘螨、真菌、屋尘、宠物皮毛和蟑螂等。目前已知吸入性过敏原达3000多种，其中较为重要的室内过敏原主要有以下几类：(1)屋尘螨/粉尘螨：屋尘螨是全球性的过敏原，通过临床观察、尘螨浸液皮试、鼻黏膜和支气管激发试验、尘螨特异性IgE、IgG测定，已经证实了尘螨是引起世界各地过敏性疾病的主要过敏原，以屋尘螨最为重要。屋尘螨以人体脱落的皮屑为食物，主要寄生于卧室的床铺、地毯或沙发上，在沿海潮湿地区的尘螨较易滋生，而高原和干燥地区尘螨则较少。(2)屋尘：屋尘是成分非常复杂的吸入性过敏原，屋尘中所含的有机成分如人类皮肤脱屑、尘螨及分泌物、真菌及代谢产物、花粉、棉花或丝纤维、植物纤维、羊绒毛、狗毛等动物皮毛和脱屑、蟑螂排泄物以及食物残渣等可引起过敏。(3)宠物皮毛等：猫毛和狗毛是比较重要的过敏原，来自宠物猫的过敏原已成为令人关注的强烈致敏原，其脱落的皮毛、皮脂腺的分泌物、唾液和尿液均含有过敏原成分。来自宠物狗的过敏原蛋白主要有Can f1和Can f2，这些过敏原的特征与猫的过敏原是相似的。此外，许多儿童在室内豢养小鼠、兔子等的皮毛也可以引起过敏。

此外，目前过敏原抗体检测方法包括体内方法和体外方法，体内检测方法主要包括皮肤点刺试验(SPT)、真皮内皮肤试验(IST)、过敏原激发试验、班贴试验。其中SPT和IST方法对患者痛苦大且有一定危险性，每检测一个过敏原患者就要多承受一次痛苦，过敏原激发试验及班贴试验因试验操作复杂、易诱发强烈的过敏反应，在临床上较少使用；体外检测方法一般检测的是血清中的总IgE(tIgE)，特异性IgE(sIgE)和IgG。过敏性疾病的体外诊断最初是进行血液tIgE抗体的检测，但tIgE水平的影响因素较多，除了过敏性疾病外，寄生虫感染、种族、年龄等因素均可影响tIgE水平，且tIgE也仅能指示患者致敏状态的概率。sIgE检测是Ⅰ型变态反应中最常用和最有价值得体外检测方法，血清sIgE水平的临界值为0.35kU/L，超过该值即为阳性，提示机体处于致敏状态。体外检测方法主要包括放射过敏原吸附试验(RAST)、免疫印记法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中RAST成本高，免疫印记和ELISA操作复杂，对操作人员有一定的要求。这些方法普遍每次只能检测一种过敏原抗体，效率低下，成本高昂。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种一次性检测常见室内吸入过敏原抗体的芯片及其制备方法。本发明芯片用于检测过敏原抗体，检出率高，无痛苦，无危险性，成本低，操作简便，只需少量血就可检测许多个项目，并且还实现了过敏原抗体检测的全自动化操作。

本发明的技术方案如下：

本发明所述芯片通过如下步骤制得：

(1)黑玻片预处理；

(2)点样过敏原蛋白溶液；

(3)对芯片进行封闭，制得所述芯片。

步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为：

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16～24h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05～1wt％的硅烷溶液中浸泡20～60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0.2～0.6h。

步骤(2)中所述过敏原蛋白溶液包括屋尘螨、粉尘螨、屋尘、猫毛皮屑、狗毛皮屑过敏原蛋白溶液。

步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样，在黑玻片上点成4×9的矩阵；每列为同一过敏原蛋白溶液形成的点。

步骤(3)中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1～4h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片。

所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。

一种所述芯片的应用，将所述芯片制成试剂盒。

所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶的第二抗体溶液、检测液A和检测液B。所述检测液A含有1％鲁米诺和2％Tris，检测液B含有1％过氧化氢。

本发明的检测基本原理为：

本发明产品检测过敏原抗体的免疫学方法为间接法，在玻璃为载体的芯片基质上固定过敏原蛋白(抗原)，这些抗原可以捕获被测样本中特异性的抗体，被捕获的抗体与标记有HRP酶或碱磷酶的第二抗体相结合，酶催化化学发光底物，产生化学发光。其光信号通过CCD摄像头采集，并进行智能分析。根据信号浓度定量曲线，通过光信号的强弱计算被测样本中过敏原特异性抗体的浓度，进一步判定检测结果为阴性或阳性。

本发明有益的技术效果在于：

本方法是利用化学发光技术获得高灵敏度且集约式、高通量地同时检测多个过敏原抗体的方法，不同于以往多数方法只能定性测定。本方法可以实现定量测定，从而推断出病人的过敏严重程度。本方法还有一个巨大优点是可以利用全自动化的芯片阅读仪，实现高速，简便的检测，比其他需要大量手工操作及人工判读的方法更加适合医院大量开展。

本发明与国外进口试剂(Phadia ImmunoCAP)相比，过敏原的检出率高度一致，性能良好。

本发明过敏原蛋白均采购于美国过敏原提取物标准品供应商Greer。

附图说明

图1为本发明制备方法中过敏原蛋白点样示意图。

图中，列1：阳性质控列；列2和列8：空白；列3：屋尘螨过敏测定列；列4：粉尘螨过敏测定列；列5：屋尘过敏测定列；列6：猫毛过敏测定列；列7：狗毛过敏测定列；列9：阴性质控列。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种检测常见室内吸入过敏原的芯片，所述芯片通过如下步骤制得：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为1wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于180℃条件下烘烤0.2h。

(2)点样过敏原蛋白溶液；

参照图1，采用机器自动化点样，在黑玻片上点成4×9的矩阵；每列为同一过敏原蛋白溶液形成的点；所述过敏原蛋白溶液包括屋尘螨、粉尘螨、屋尘、猫毛皮屑、狗毛皮屑过敏原蛋白溶液。

(3)封闭过敏原蛋白溶液；

将点样好的黑玻片没入封闭液(含3％牛血清白蛋白的Tris缓冲液)中3h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片。

(4)试剂盒

将芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(鼠抗人IgE)、检测液A(含有1％鲁米诺和2％Tris)、检测液B(1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

实施例2

一种检测常见室内吸入过敏原的芯片，所述芯片通过如下步骤制得：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡24h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于140℃条件下烘烤0.4h。

(2)点样过敏原蛋白溶液；

参照图1，采用机器自动化点样，在黑玻片上点成4×9的矩阵；每列为同一过敏原蛋白溶液形成的点；所述过敏原蛋白溶液包括屋尘螨、粉尘螨、屋尘、猫毛皮屑、狗毛皮屑过敏原蛋白溶液。

(3)封闭过敏原蛋白溶液；

将点样好的黑玻片没入封闭液(含6％卵清蛋白的PBS缓冲液)中4h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片。

(4)试剂盒

将芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(鼠抗人IgE)、检测液A(含有1％鲁米诺和2％Tris)、检测液B(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

实施例3

一种检测常见室内吸入过敏原的芯片，所述芯片通过如下步骤制得：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡20h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.5wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡30min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100℃条件下烘烤0.6h。

(2)点样过敏原蛋白溶液；

参照图1，采用机器自动化点样，在黑玻片上点成4×9的矩阵；每列为同一过敏原蛋白溶液形成的点；所述过敏原蛋白溶液包括屋尘螨、粉尘螨、屋尘、猫毛皮屑、狗毛皮屑过敏原蛋白溶液。

(3)封闭过敏原蛋白溶液；

将点样好的黑玻片没入封闭液(含4％牛血清白蛋白的MOPS缓冲液)中1h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片。

(4)试剂盒

将芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(鼠抗人IgE)、检测液A(含有1％鲁米诺和2％Tris)、检测液B(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

测试例：

使用本公司生产的SLXP-001型生物芯片阅读仪对临床血清进行检测，SLXP-001型生物芯片阅读仪的工作过程如下：

仪器自动吸取200ul的待测血清样本至反应杯中，仪器将本发明实施例制得的蛋白芯片自动地放入待测血清中，30℃孵育40分钟，随后仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液(200ul，仪器自动提前吸好)，再次孵育40分钟后，仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中(由100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成，由仪器自动吸取和混合)，最后对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果。以国外进口试剂(Phadia ImmunoCAP)的检测结果为参比值。检测结果如表1及表2所示。

表1

表2

由上表可见，本发明所提供的检测过敏原的芯片与国际著名厂商PhadiaImmunoCAP比对结果相似，在灵敏度，线性范围等方面也没有明显差异。本实验采用的参比试剂是世界知名的进口品牌。使用本发明提供的检测过敏原的芯片可以实现高效率，简操作，低成本，用时短等多个优点，具有较好的应用前景。

Claims (9)

1.一种检测常见室内吸入过敏原抗体的芯片，其特征在于所述芯片通过如下步骤制得：

（1）黑玻片预处理；

（2）点样过敏原蛋白溶液；

（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。

2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（1）中所述黑玻片预处理的方法为：

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h，之后采用纯化水清洗2~8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1wt%的硅烷溶液中浸泡20~60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。

3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（2）中所述过敏原蛋白溶液包括屋尘螨、粉尘螨、屋尘、猫毛皮屑、狗毛皮屑过敏原蛋白溶液。

4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（2）中所述点样的方法为机器自动化点样，在黑玻片上点成4×9的矩阵；每列为同一过敏原蛋白溶液形成的点。

5.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（3）中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1~4h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片。

6.根据权利要求5所述的芯片，其特征在于所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。

7.一种权利要求1~6任一项所述芯片的应用，其特征在于将所述芯片制成试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述试剂盒还包括标记有HRP酶或者碱磷酶的第二抗体溶液、检测液A和检测液B。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述检测液A含有1%鲁米诺和2%Tris，检测液B含有1%过氧化氢。